CN207816777U - 用于对生物液体中的微粒进行计数以及分类计数的设备 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种用于对生物液体中的微粒进行计数以及分类计数的设备，包括壳体，在所述壳体中定位有至少三个液体透镜，所述液体透镜位于透镜中，芯片设置成具有圆形形状的CD盘状芯片，微流体腔室形成在所述芯片上，位于所述芯片的外围，所述芯片直接连接驱动电动机，所述发光器位于所述CD盘状芯片所在的平面上方，并且以一角度定位成提供具有最小反射的照射角度，计数部件执行为微处理器，与控制所述液体透镜的发电机连接。

Description

用于对生物液体中的微粒进行计数以及分类计数的设备

技术领域

本实用新型涉及一种用于对悬浮在液体中的生物细胞进行计数的设备，该设备能够用作用于细胞计数的荧光自动化系统，以及能够应用于对生物液体(诸如牛奶、血液、尿)中的微粒进行计数以及分类，包括将细胞与其他粒子进行分类，对原料奶样本中的不同类型细胞进行分类。

背景技术

在定义牛奶质量的许多参数之中，细菌参数(BCC)和体细胞(SCC) 的数量具有非常高的重要性，这是由于它们对奶制品的质量具有巨大影响，基于此因为它们给予奶牛的健康条件的实际信息。

体细胞(SCC)的总数量是奶牛健康以及牛奶治疗的公认指示剂。体细胞是白血球，公知为白细胞(淋巴细胞、粒细胞、单核细胞以及巨噬细胞)，它们源自动物的乳腺，它们的数量取决于细胞免疫防疫。作为细菌感染的响应，这些细胞的数量能够增加，这会引起乳腺炎。基于该原因，计数体细胞，分类计数以及识别牛奶中的白细胞对乳腺炎诊断是非常重要的。SCC是用于感染存在以及奶牛的乳腺发炎(称为乳腺炎)的指示器。

通常，健康奶牛的牛奶中少于100,000细胞/ml，高于300,000细胞/ml 的值表明奶牛感染，超过1,000,000细胞/ml的值是奶牛病变的典型指示。较宽值用于人类消耗或者用于进一步处理用于人类消耗的食品产品，在欧洲低于400,000细胞/ml，但是在美国该值会更高。总的来讲，具有高于300,000 细胞/ml的SCC的奶牛被认为受到感染(史密斯、KL，牛奶中体细胞的标准：生理与调控(1996)，国际牛奶乳腺炎联盟，时事通讯9月，第7页)。

为了评定牛奶质量，需要使用设备，该设备允许对体细胞进行可靠、精确的计数。近些年期间，基于用于体细胞计数的显微荧光方法，发展了便携式自动分析器，尤其荧光图像血细胞计数器，其中更著名的为：“ADAM SCC”，其使用数字技术用于计数以及分析的目标；Chemometec公司的细胞计数仪SCC 100；利拉伐公司的DCC及荧光设备，其基于流式细胞仪：本特利仪器公司的Somacount 150；Delta仪器公司的Somascope ^TM，福斯电气公司的FossoMic 4000^TM。

上述提到的流量自动分析器是基于单色荧光并且仅确定细胞的总数。利用它们，流量样本穿过非常小的直径，这允许仅一个单个细胞通过并且执行计数(GunasekeraТ.S.等人，2003年，Feng W.等人，2004年)。在上述提到的分析器中，标记是使用的荧光燃料：溴化乙锭，碘化丙啶和6二脒基2苯基吲哚(GonzaloВ等人，2004年，WallenСА等人，1982年)。

样本取自农场的各个动物，并且发送至集中的实验室，实验室装备有流量细胞计数器来计数体细胞的总数。

昂贵的分析器主要关联于当前可获得的技术以及自动分析设备，它们基于光学或者电测量而构建。

存在公知的设备，其进行光学测量，关于该目的初始必要的是，在分析之前，要给细胞加标签，由于此，通常这些设备使用昂贵的化学试剂或者旨在用于单次使用。

还存在公知的其他设备，它们根据电器测定的原理工作，通过耐药分析获得结果，由此其他细胞牛奶粒子的存在会产生阻碍，因此它们必须通过施加若干离心阶段而被移除。基于该原因，这种设备不能够直接在现场使用，不能在牛奶生产者处使用，要进行更大努力来简化方法以及降低分析成本。

公知的以及实践中使用的电子仪器，例如所谓的Coulter计数器，其能够读取细胞并且识别它们的尺寸。由于原料奶容纳了许多粒子，主要是脂肪球，其具有的尺寸类似于白细胞(510μm)，这些仪器不能够确保可靠的细胞计数，这是由于这些粒子多于体细胞，它们使精确测量变得非常困难。因此，这些粒子必须在测量之前与体细胞进行分离。这是通过离心实现的，在离心时细胞沉淀并且将脂肪球与清液分离。

借助于特异性抗体，已经发展了显著数量的用于分类确定细胞的方法，但是，这些方法已经应用在人类医学领域，尤其应用在血液样本的处理中。这些方法给予了更好的选择性以及测量的选择性，这是由于具体的抗体抗原免疫反应。赫岑伯格和洛肯开发了一种用于利用单克隆抗体计数细胞的方法 (赫岑伯格、洛肯等人，1976和1977年)，称为双色免疫荧光。

存在许多已知的设备以及专利，它们基于图像血细胞，用于对生物液体 (诸如牛奶、血液、尿等)中的微粒进行计数以及分类。例如专利 US6919960B2。这些设备使用微流体摄像头或者滑道，例如专利US4513438，其用于样本，以及荧光微显微镜，用于通过CCD或者CMOS传感器采集微粒的图像。借助于处理设备，能够进行图像的分析、计数以及分类分析样本中的微粒。例如专利US4513438A。

当使用若干发光器时，通常需要周期性地改变透镜轴中的滤光片以确保要求的波长传递至传感器。过滤块能够人工地或者借助于机械设备替换，过滤块替换透镜中的过滤器，并且过滤块通常由电气方式控制，正如描述以及示出在专利公开US9046489B2的图7中的。

而且，这些设备的一部分仅从样本采集一个图像，这导致变异系数低。根据泊松分布，变异系数取决于样本中所计数的粒子的数量。对于具有低粒子含量的样本即每ml血中低于10000(例如AIDS患者)或者对于强稀释样本，在样本的不同位置上采集一个、两个或者三个图像，正如在 US20120223260以及US20120314092描述的，这不足以获得可接受的变异系数。因此，为了获得更高准确度的测量，适当的是，采集样本中更高数量的区段，为了该目的，必须移动带有所分析的样本的芯片。

在公知设备中使用光学系统，其具有的焦深为20-100μm，由此，如果样本不在该范围中，则不能够采集聚焦的图像。同时，在微流体摄像头的最佳深度处(50μm内或者更小)，有必要使用一种聚焦系统。取决于设备的具体实施例，它们能够具有微电动机或者人工系统，能够使用具有人工或者机械聚焦的系统。提供必要的微米精度的机械聚焦系统的劣势是它们的高值。

众所周知的出版物(具有可变焦点显微物镜的扩展显微镜成像，DOI： 10.1364/OE.19.000353；来自：PubMed)是已知的，其公开了用于聚焦显微镜图像的方法和装置，其中使用一个液体透镜，目的是聚焦图片。

如果需要采集、计数和分析不同类型的生物液体以用于计数的精度，则必须为相应样本图像的图像增强和动态自动聚焦提供条件。

公知的是，根据泊松分布，变异系数取决于计数的粒子的数量。在较大放大倍数下，例如10倍，在透镜前方样本的扫描体积不足以用于获得需要的变异系数。在该情形下，需要增加所采集的区段的数量。这导致不可接受的增加了分析时间。另一方面，在细胞形态分析中和/或白细胞的双色分类计数中，例如在血液或者牛奶中，必须使用10倍或更大的光学放大。当利用低变异系数精确计数而无需分类时，使用1至4倍的放大倍数。通常，公知系统使用可替换的具有固定放大倍数或者昂贵机械变焦系统的光学透镜。

公知的专利公开US20120223260涉及一种用于确定液体样本中的粒子的方法和系统，其中，仅采集样本的一个区段，正如实践中，在这种系统中不需要自动聚焦图像。当分析样本时，其必须被移动，这自动要求聚焦图像。当通过XY工作台移动具有样本的芯片时，需要聚焦要提供的图像，由于事实上在移动具有样本的芯片时会一直观察到轴线Z上的误差累积，该误差累积是通过移动XY工作台的误差以及塑料微流控芯片的变形误差形成，轴线Z上的误差最通常超过100μm，这又导致计数细胞中的不准确。用于在显微镜透镜的前方移动样本的连续分区的XY工作台的一个例子包含在专利公开 US7327901B2中。

在公知专利公开US7411680(CN100520374С)中，描述了一种用于计数微粒的设备，其由以下组成：光源；芯片，其包含具有微粒的样本；显微镜的透镜；微流体腔室；采集用CCD摄像头；计数部件以及用于移动芯片的位置的机构。移动具有芯片的样本是通过工作台进行的，该工作台具有在 XY轴线上通过螺栓或者其他机构移动的可能性。所描述的设备的劣势是由于缺乏聚焦图像的技术可能性而不足以精确进行微粒的计数，导致在XY工作台移动期间的误差，这进一步因塑料微流控芯片的变形而增加，其中，所述误差积聚作为Z轴线上的误差，沿着Z轴线通常超过100微米。

借助于上述提到的螺栓机构，通过初步确定的时间段将芯片的位置移动至初步确定的坐标，因此靠近采集区域的芯片的单独区段能够被移动至光从光源降下的点并且处于透镜的视野范围内。以该方式，芯片中的各单独分区一次被采集，接下来，计算每个分区中微粒的数量，然后计算总和，因此将计算出样本中微粒的总数。

描述的用于连续观察或者采集仅一个照片以及后续计算各个连续区段及样本中微粒数量的方法总的来说是公知的，以可接受且可应用的方式详细发展成为使用Neuber摄像头的标准ISO133666方法。

这种微粒采集以及计数的方法还公开于专利公开RU02147123，尤其在第一独立权利要求中，第一独立权利要求描述了按顺序执行的操作，目的是统计包含在一个采集区段中的微粒，作为主权利要求的一部分，该专利公开的优先权日期为1998年，还公开于美国专利4513438，即“一种用于定位以及重新定位图像中的物体的自动显微镜系统和方法”。

众所周知，所描述的采集以及计数粒子的方法还关联的缺陷为，主要显示出不足的微粒计数精度，这是由于以下原因：正如已经概述的，采集单个连贯样本图像的方法未向精确地计数微粒提供必要条件，这是由于在不存在机械聚焦系统时，通过使用用于移动XY工作台上的聚合物芯片的移位机构所采集的单个图像未分别被聚焦，不允许定性的精确统计。为了应对该基本不准确性，正确的是要从焦面添加固有偏差，偏差超过100μm，其结果是，在统计的精度方面，对尤其溶液中的微粒的计数以及分析受到严重阻碍或者影响。

而且，当对具有不同折射率和固定机械焦距的液体介质中的微粒进行计数时，已经发现的是，当介质改变时焦点改变。结果，在样本的连贯单镜头帧中，它们中的一些“离开焦点”，这将妨碍或者阻碍统计。例如，在对全脂奶的体细胞计数时，在633nm时折射率为1.460，在对水溶液中的啤酒酵母的酵母计数中,折射率为1.340。

通过使用公知设备以及应用上述方法计数的另一劣势涉及使用的荧光染料的类型。当同时使用两个或多个具有不同发射的荧光染料(例如，FITC为 530nm，用于第一染料；碘化丙啶为620nm，用于第二染料)用于标记液体或者干燥的单层细胞样本时，如果在波长530nm时发光的粒子处于焦点中，那么由于透镜中的色差，在波长620nm时发光的粒子不被聚焦，结果，对样本的连续区段中的大多数单帧图像中的细胞的统计在计数时将被影响。

在所描述的设备的另一种类中采集更多图像，当具有所分析样本的微流体腔室在显微镜的透镜的前方移动时，为了采集样本的较大体积，通过可移动的XY工作台进行移动。通过XY工作台移动带微粒的样本还公知于专利 RU02147123以及美国专利4513438。

来自专利US7411680(CN100520374С)的用于计数微粒的公知设备具有若干构造上的劣势，其无法获得精确测量以及计数微粒是由于以下原因：即使在用于芯片的移动的机构的非常精确实施例中，XY工作台的表面与透镜的偏差超过10μm，这连同微流控芯片的技术一起确定偏差，该偏差通常超过50μm。这种与透镜平面的偏差将导致这样的图像，该图像不聚焦并且会影响对微粒的软件计数，这将显著降低精度。在所评论的该设备中并未提供用于聚焦图像的机构。

描述在US7411680(CN100520374С)中的公知设备的另一劣势关联于共同布置一些重要元件，即，发光器位于透镜的前方并且位于微流体腔室的后方。光源朝向部件的剩余部分的这种布置确定这样的劣势，其必须使用由两个透明表面组成的微流控芯片。

需要注意的情况是，为了在发光器和透镜的该配置中获得品质图像，必须使用微流体腔室，微流体腔室对于激发发光器的长度是透明的。使用设置有两个透明表面的微流体腔室将显著增加可消耗的值，因为使用了昂贵的、复杂的以及不可靠的联接方法来联接上述提到的透明表面，通常是利用液体或者干式粘着剂进行胶合，正如专利公开US20040145805、US20120223260、 US7842157B2以及US8808642描述的。

用于计数微粒的公知设备的另一劣势还关联于已描述元件的相互布置以及它们的外观。例如，当发射光的一部分以90度角落入透镜的平面时，其将分别落入通过CCD或者CMOS矩阵的过滤器，信号噪声比显著降低。考虑到这样的事实：一些荧光染料(例如普遍的碘化丙啶)在溶液中具有高的自身荧光性，这预先确定了不良的采集质量，相应使得难以对图像进行进一步软件处理。

此外，设备的构造实施例有关用于移动分析样本的XY工作台，这是复杂的。为了确保光通过XY工作台和芯片，必须射向微流控芯片下方的整个采集区域。当需要利用不同波长的若干发光器照亮时，从技术角度看这种移位的执行是特别复杂的，包括需要实现设备的紧凑尺寸构造。

实用新型内容

所考虑的技术中到目前为止所描述的公知水平表明，需要提供一种用于对生物液体中的微粒进行分类计数的宽频谱设备，其将允许高准确度的微粒计数以及详细分析包含生物微粒的不同样本：牛奶、发酵性液体、血压、精液等，包括分类计数生物微粒，例如牛奶中的体细胞、血液中的白细胞、身体细胞、藻类以及酵母。实用新型的另一任务是提议一种设备，其在技术上由便宜及可获得的元件制成，这些元件的相互布置允许优化光学系统在自动聚焦以及放大图像方面的质量，这在采集、计数以及分析具有不同类型以及成分的生物液体期间是非常重要的，还使用芯片，芯片的移动确保将样本的模型相对于透镜以及用于采集的摄像头准确定位。

该任务利用用于对生物液体中的微粒进行计数以及分类计数的设备解决，该设备包括壳体，在壳体中安置有透镜、采集用CCD或CMOS摄像头、计数部件以及用于移动样本的机构，具有微流体腔室的芯片位于透镜的下方，在芯片中存在作为要检查的物体的生物液体，其中，存在指向样本的发光器。

根据实用新型，在透镜中存在光学过滤器和至少一个液体透镜，芯片实施为CD盘状芯片(CD based chip)，具有圆形形状，微流体腔室形成在芯片上，位于芯片的外围，芯片直接连接至驱动电动机，发光器为至少一个并且位于CD盘状芯片所在的平面的上方，定向成提供具有最小反射的照射角度，计数部件实施为微处理器，连接至控制液体透镜的发电机。

根据设备的一个实施例，在透镜的顶部定位有两个液体透镜，并且其中的一个液体透镜位于另一个液体透镜的下方，即第一和第二液体透镜，在透镜的底部定位有一个第三液体透镜，其中，光学过滤器以及由两个消色差透镜构成的透镜装配在上方的第一和第二液体透镜和下方的第三液体透镜之间。

优选的是，光学过滤器是单通道或者多通道光学过滤器。

液体透镜连接至发电机，发电机具有0-70V的可变阶梯电压并且频率为 1kHz。

发光器包括一个位于另一个前面接连布置的光源、校准透镜、光学过滤带以及聚焦透镜。

优选的是，LED用作光源，例如是Luxeon或者二极管激光器光源。

根据一个优选实施例，CD盘状芯片包括上部分和下部分，上部分具有光学透明表面并且由PMMA聚合物实施，下部分是非透明部分并且由黑色 ABS聚合物实施。这两个部分是利用800-1050nm波长的激光通过激光焊接所连接的，其中，它们之间的空间中存在50μm高度的微流体通道，微流体通道中存在：样本混合物、荧光染料或者标记的抗体。

当使用具有两个部分即透明上部分以及非透明下部分的矩形形状的芯片时，设备也能够有效地工作。这两个部分是通过激光焊接所连接的，在连接之后，它们之间形成空间，腔室形成在该空间中，腔室包含干式的荧光染料或者标记的抗体，样本被吸取在其中，矩形芯片放置在可移动的XY工作台上，XY工作台位于发光器和透镜下方，多通道光学过滤器和液体透镜安装在透镜中。

根据一个版本实施例，CD盘状芯片包括两个部分，分别为具有透明表面的上部分以及具有非透明表面的下部分，并且在这两个部分的表面之间形成混合腔室。提到的混合腔室设置有样本和干式荧光染料和/或标记的抗体，其中在该混合腔室处，混合腔室通过疏水性通道连接微流体腔室，CD盘状芯片安装在与驱动电动机连接的旋转轴线上。

驱动电动机优选是步进电动机，并且直接连接至CD基芯片。

根据实用新型用于对生物液体中的微粒进行分类计数的设备，其特征在于紧凑的设计，元件的相互布置允许精确测量以及分析所处理的样本中的微粒。使用具有高质量以及低值的元件，其结果是存在一种设备，该设备提供了当采集以及样本处理时用于获得品质图像的技术能力。为了改善图像质量而使用小尺寸的液体透镜，液体透镜位于显微镜的透镜中使得它们同时确保图像的聚焦以及放大。同时，控制液体透镜允许用于自动聚焦的时间在毫秒的范围内。液体透镜的尺寸还允许其嵌入用于测量小粒子的活动手持设备的构造中。

提议的设备使用一种具有CD盘状微流体腔室的芯片的原理全新以及不同的模型，其定位在用于采集图像的透镜的前方，仅取决于微流体腔室的处理准确度，这又自动导致降低了对自动聚焦系统的要求。同时，显著简化了将微流体腔室定位在透镜的前方–仅通过旋转CD盘状芯片，仅在少数情形下需要在X轴线上的最小移动，这能够利用可获得的技术器件进行，例如：用于旋转轴线的微型步进电动机NEMA8以及轴线X上的微型伺服电动机 DS-5001HV，以该方式移动X轴线能够确保移动高达10mm。

附图说明

将进一步描述用于对生物液体中的微粒进行分类计数的设备的示例实施例，借助于附图提出示例实施例，其中：

图1是根据实用新型的设备的外观；

图2是根据实用新型的设备的示意图，示出带微流体腔室的CD盘状芯片的局部视图；

图3是具有混合腔室及微流体腔室的CD盘状芯片的局部视图的设备的方案；

图4是根据实用新型的设备的方案，具有矩形芯片，矩形芯片具有上部分透明表面以及下部分非透明表面。

图5是具有微流体腔室的CD盘状芯片的轴侧投影图；

图6是图5的CD盘状芯片的截面；

图7是具有微流体腔室的CD盘状芯片的版本实施例的轴侧投影图；

图7a是图7的CD盘状芯片的轴侧投影图，在步进电动机旋转时将样本定位；

图7b是具有设置成用于采集样本的微流体腔室的CD盘状芯片的轴侧投影图；

图8是设备的前方的示意图，在透镜中安装有用于自动聚焦的液体透镜；

图9是根据本实用新型的设备的示意图，该设备具有两个额外的液体透镜，适用于同时扫描10μl的大样本体积，即每ml样本中的细胞<10000，以及具有分类形态量；

图10a是根据本实用新型的设备的示例实施例，使用膜渗透染料并且适用于计数单个样本中的活/死细胞；

图10b是根据本实用新型的设备的示例实施例，使用BOPRO3以及FITC 染料，适用于计数单个样本中的活/死细胞；

图11是设备的示范实施例，适用于分类计数牛奶中的体细胞，在透镜中具有一个发光器以及二向色反射镜；

图12是根据实用新型的设备的“手持”版本的总体外观；

图13示意地示出了图12的设备；

图14a、图14b、图14c是来自样本分析以及它们在设备的显示器上的可视化结果的图形示意图。

图15示出了用于3D连贯采集的平面。

具体实施方式

详细地提出了根据实用新型的设备的示范实施例，由于描述的建设性方案不限制使用其他技术部件，其具有类似结构设计以及等同功能影响，设备的总体结构将维护本实用新型的观点和精神。

用于对生物液体中的微粒进行分类计数的设备包括以下部件：壳体1，以一个在另一个下方的方式，在壳体1中定位有具有透镜2的垂直定向显微镜，在透镜2的侧面安装有具有两个发光器3的系统，发光器3以一角度位于微流控芯片所在平面的上方，微流控芯片包含来自生物学材料的样本5。微流控芯片是CD盘状芯片4，当然也可以使用矩形芯片4’。

透镜2设置有：光学过滤器6，其优选为单通道薄层过滤器；以及第一液体透镜7，其位于其下部分中，由发电机8供能及控制，发电机具有优选 0-70V的可变电压以及频率为1kHz。通过嵌入以及由发电机8控制，透镜2 的第一液体透镜7执行自动聚焦，深度为1mm，用于自动聚焦的时间非常短，在毫秒的范围内。

在设备的一个版本实施例中，透镜2设置有两个额外的液体透镜，即第二液体透镜7’、第三液体透镜7”(图9)，两个额外的液体透镜位于透镜2 的上部分中并且一个位于另一个的下方。透镜2的这种构造设计(即总共具有3个液体透镜，即第一液体透镜7、第二液体透镜7’、第三液体透镜7”) 确保了在1至10倍的范围中可变、可调节的放大及自动聚焦的可能性，例如 2倍放大(图9)和10倍放大(图9)，适于当计数以及分类的样本每ml具有较小数量的细胞时应用在设备中。

正如上文提到的，发光器3位于透镜2的侧面，定向成使得它们能够确保照射角度，该角度提供了对激发光的最小反射，例如接近布鲁斯特角。每个发光器3包括接连定位的LED类型光源9(例如Luxeon)、校准透镜10、光学过滤带11以及聚焦透镜12。

该设备所描述的结构允许放置多于一个的发光器，还能够使用二极管激光器光源，由于这是需要适合于多色荧光采集，例如分类计数生物学微粒，诸如牛奶中的体细胞、血液中的白细胞、身体细胞以及酵母。将发光器3定位在CD盘状芯片4所在平面的上方，这确保大部分光将指向并且通过CD 盘状芯片4的透明的上部分13落在样本5上，从CD盘状芯片的上部分13 反射的仅非常小部分的光将穿过第一液体透镜7、透镜2而落入采集用摄像头2a CCD或者CMOS传感器中。

CD盘状芯片4位于低于发光器3下方，CD盘状芯片4包含具有要检查的微粒的样本5。根据一个优选实施例，CD盘状芯片4包括两个部分，分别为上部分13和下部分14，上部分13由具有光学透明表面的PMMA聚合物提供，下部分14由优选非透明的黑色ABS聚合物提供。上部分13和下部分 14通过它们表面的激光焊接并且轴向施加压缩力所连接，激光优选具有 1050nm的激光波长。上部分13和下部分14形成为在焊接这两个部分于一起之后，在上部分13和下部分14之间的空间中形成具有50μm高度的微流体通道15，初步混合的样本5被吸取在微流体通道15中，初步混合的样本5 包含荧光染料16(例如干式荧光染料)和其他被分析物，诸如标记的抗体。描述的CD盘状芯片4适用于分析包含生物微粒的不同样本：牛奶、发酵性液体、血液、精液等。

在用于分类计数的设备的一个版本实施例中能够使用具有矩形形式的矩形芯片4”(图4)，其包括两个部分，即通过激光焊接相互连接的透明上部分13’以及非透明下部分14’，微流体腔室形成在透明上部分13’以及非透明下部分14’的表面之间并且包含干式的荧光染料16，样本5被吸取在腔室中。矩形芯片4”安置以及通过XY工作台被移动而用于采集样本，XY工作台位于发光器3和透镜2下方，多通道式的光学过滤器6和第一液体透镜7安装在透镜2中。

在用于分类计数的设备的一个版本实施例中能够使用CD盘状芯片4，图7、图7a、图7b中详细提出了该建设性实施例。芯片是CD盘状芯片4，其包括两个部分，分别为上部分13和下部分14，混合腔室17形成在它们的表面之间，并且包含干式荧光染料或者其他被分析物，样本5被吸取在混合腔室17中。通过疏水性通道18将混合腔室17与用于采集样本5的一部分的微流体腔室19连接。微流体腔室19具有额外开口20，当其提供有通过离心力加压的液体样本5时，开口20设计成释放微流体腔室19中包含的空气。 CD盘状芯片4放置在旋转轴线21上并且连接驱动电动机22(优选是步进电动机)，当其旋转时样本5在透镜2平面的前面移动。步进电动机连接微处理器设备23，数据和坐标输入其存储器，这些数据和坐标确定样本5的移动，存储器中保存采集的样本5的图像。

图10a、图10b中提出了一种用于分类计数生物液体中的细胞的设备的示范实施例，该构造对应于到目前为止描述的设备的结构，适用于计数包含细胞的生物液体的单个样本中的活细胞和死细胞。在透镜2中使用双通道薄层光学过滤器6，优选SemrockFF01527/645-25，两个发光器3以一定角度定位在透镜2的侧面，具有LED类型光源LUXEON，波长为475nm(图10a)，具有参数470/30的光学过滤带11，也可具有LED类型的可选光源9(LUXEON，波长565nm)以及参数560/30的光源9的光学过滤带11(图 10b)，用于双色染料。在样本中使用膜渗透染料16，即FITC，该染料对活细胞和死细胞5a的DNA进行染色(图10a)，以及使用BO-PRO3染料(一种荧光染料16)，该染料仅对死细胞5b的DNA进行染色(图10b)。

图11中提出了设备的示例实施例，其适用于用来对牛奶中的体细胞进行分类计数，在液体中的细胞同时从布朗运动进行移动的情况下是非常有用的。该设备构造为专门用于分析使用，在分析使用中确定牛奶或者血液中的中性白细胞和淋巴细胞的比例。

透镜2设置有：透镜2的一个光学过滤带6，位于透镜2的上部分中；以及一个第一液体透镜7，位于透镜2的下部分中。靠近光学过滤带6并且在其下方，二色反射镜24以一角度安装在透镜2的轴线中，第二摄像头2a (例如CCD或者CMOS传感器)定位成垂直于透镜2的轴线。一个发光器 3位于透镜2的一侧并且设置有675nm波长的光源，即LED型LUXEON 675。在CD盘状芯片4中使用荧光染料吖啶橙，其使用仅一个激发波长，对活细胞和死细胞5a的DNA和RNA进行染色，DNA和RNA发射具有不同的波长。当利用675nm的波长照射来自样本5的细胞5b时，与细胞核中的DNA 有关的染料，“吖啶橙”发射530nm的绿光，与细胞的细胞质中的RNA有关放射620nm波长的红光。以该方式，利用设备的上述构造，无需使用任何昂贵的活动机械设备，就能够同时制备具有不同波长的样本的两个图像。随后，图像由微处理器23通过使用软件进行结合，基于强度和绿色和红色发射之比，进行细胞的分类。

取决于所分析的生物液体的类型以及需要更快以及更精确的分析，能够实现一种根据本实用新型用于分类计数的“手持式”单个设备，其实质上是一种图像细胞仪，正如图12、图13示出的。该设备的供电装置25位于壳体1 的下部分中，其通过电池供能。透镜2(类型为SUNEX-М12х0.5)也位于壳体1中，因为其适合于使用液体透镜类型Arctic16F，具有X4放大倍数，这允许构造出转向透镜2，用于具有自动聚焦的CCD或者CMOS摄像头。该透镜专门设计为具有从显著较大角度收集光的能力，由于其包含高达6个非球面玻璃微小透镜(图中未示出)，这允许利用具有大对角线的百万像素传感器作业，结果，透镜2具有大约2μm的空间分辨率能力，具有最小像差。一般来讲，这种透镜使用在显微镜中，允许高达10倍放大。使用CD盘状芯片 4，其直接连接微型步进电动机(NEMA8类型)，芯片安装在步进电动机的转子上，在其上部分具有非透明表面14。连同保护性非透明板一起，将环境光隔绝于透镜，以该方式该设备能够不设置保护顶盖。

描述的手持式设备(血细胞计数器)能够在自动模式中工作，此时通过第一液体透镜7所提供的自动聚焦、定位、控制LED发光器3是由微处理器 23控制的，其设置有光学过滤带11和半球形校准透镜10、二色反射镜24，在处理图像之后结果示出在显示器26上。该血细胞计数器还设置有标准通信引导件(USB)，附图未示出，见图12，设备通过该引导件能够连接至外部小型计算机27，利用专门开发的程序用于该设备的工作控制，包括图形处理以及可视化来自所处理的样本5的分析的结果。通过描述的界面，设备能够被远程控制，经由移动通信设备(智能手机、平板、基于已经安装控制程序的Windows或者安卓系统)，见图14a、图14b、图14c，所有信息在云服务中可获得。该设备的软件允许处理从采集用摄像头CMOS或者CCD所获得的图像，确定每μl中生物微粒(牛奶中的体细胞、血液中的白细胞、身体细胞以及酵母)的数量，并且还进行评估粒子尺寸以及它们的图形分配。使用分类计数以及评估尺寸的方法，还能够通过局部直方图分析确定出图像强度的局部最大数量。最后进行的目的是通过消除图像的背景不规则性来增加信号/噪声。

根据本实用新型用于分类计数的设备以下列方式使用：准备带要分析样本的CD盘状芯片4。当启动步进电动机时，样本5与荧光染料和被分析物混合，当步进电动机的速度增加至500-1000rpm时，离心力施加在混合的样本5和荧光染料16上。结果，液体样本5(图7a)克服疏水性通道18(图 7a)的阻力而落入微流体采集腔室19(图7b)，从而通过额外开口20释放因样本5移动而移位的空气。结果，通过步进电动机的旋转，样本5在透镜2 的前面在先前输入微处理器设备23的存储器中的精确确定的坐标下移动，用于采集样本5图像的位置相对于透镜2并不移动或者不偏离。在该情况下，从来自样本5的微粒至透镜2之间的距离在很大程度上取决于制作微流体腔室19的精度，结果，对自动聚焦系统的要求显著降低。同时，信噪比显著增加，这对于检测以及软件计数低照明的微粒样本是决定性的。

正如已经概述的，在显著更精确扫描样本的条件下，执行从被XY工作台或者旋转轴线在透镜轴线的前面移动的样本的连续区段单个采集的图像对粒子进行计数，样本由XY工作台或者由旋转轴线在透镜轴线前面移动，随后对包含微粒的样本进行统计以及分析，我们按以下顺序进行：将高速液体透镜引入主光学轴线，这允许将包含在CD盘状微流体室的微流体通道中或者常规矩形微流体腔室中的样本布置在移动设备的载体架中，移动设备为 XY工作台或步进电动机的直联轴线。

在该情况下，在透镜轴线的前面在初步设定的坐标，执行对样本的第一分析区段进行定位，使用发射发光器，在该区段采集一系列图像，例如在对图像所在的设备平面进行校准期间初步设定5个图像(图15)，在期望图像平面之下5个图像，推荐的是平面之间的距离选择为0.05mm，以该方式以相等间隔扫描轴线Z上的图像(图15)。

由微处理设备处理所获得的图像，选择在位置1微粒聚焦的图像(图15)。在这之后粒子被进行计数和/或形态分析。如果在分析期间清楚的是，图像例如被空气泡影响，空气泡占据图像的非常大部分，则所采集的区段被排除于接下来的计数或者分析，结果被保存在该设备的存储器中。

同时，当使用具有不同发射波长的两种荧光染料时(例如FITC为530nm 和TO-PRO3为660nm)，首先利用470nm的LED发射器，制备顺序的5个图像，在该图像上有发射530nm的聚焦的粒子，其被保存在接下来的计数中。在这之后，利用630nm的LED发射器制备相同的图像，在该阶段的结尾从样本获得两个图像，这两个图像被保存在存储器中用于处理。在完成采集提到的图像之后，移动机构将样本移向下一区段用于采集，程序重复，直到用于扫描样本的移动的初步设定顺序结束。在完成扫描之后，通过公式计算样本中微粒的平均数量，例如称为ISO13366的公式，样本的单独区段中的粒子数量的总和除以所计数的区段的数量，在计数牛奶中的体细胞时转换为 ml。

工业应用性

血细胞计数器的一个版本移动实施例适用于被农民直接使用在农场中，例如为了通过计数牛奶中的体细胞而发现隐形乳腺炎的目的。

该设备的移动版本的另一应用是在远程医疗中，尤其在紧急救治中，当在适当地方有必要对患者计数以及分类血液中的白细胞时。由于低价格、电池能量和由非专业人员使用的能力，其实际上方便应用于农村，在农村可以进行大量检查以及疾病诊断，诸如AIDS。这种设备实际上有必要使用在现场条件下，由于其能够扫描高达10μl的血液样本，在这种血液检查中白细胞减少至每μl有500个。结果能够被地球上任何地方的专家远程观察，专家具有快速以及精确确定诊断的能力。该设备还能够应用于血液收集中心，通常血液首先被收集在血液收集中心，然后被送到实验室用于集中检查。当从捐赠人手指取20μl血液时，能够在现场检查样本，并且能够立即被检查以评估患者是否适合于作为血液捐献人。

附图标记

1-壳体

2-透镜

3-发光器

4-CD盘状芯片

4’-矩形芯片

5-样本

6-透镜2的光学过滤器

7-第一液体透镜

7’-第二液体透镜

7”-第三液体透镜

8-发电机

9-光源

10-校准透镜

11-光学过滤带

12-聚焦透镜

13-上部分

14-下部分

15-微流体通道

16-荧光染料，可以为干式荧光染料

17-混合腔室

18-疏水性通道

19-微流体腔室

20-开口

21-旋转轴线

22-驱动电动机，可以为步进电动机

23-微处理器

24-二色反射镜

25-供电装置

26-显示器

27-外部小型计算机。

Claims (10)

1.一种用于对生物液体中的微粒进行计数以及分类计数的设备，包括：

壳体，在所述壳体中定位有透镜、采集用CCD或CMOS摄像头，计数部件以及用于移动样本的机构，具有微流体腔室的芯片放置在所述透镜下方；来自生物液体的待分析的样本安置在所述芯片中，至少一个发光器在计数粒子或在分类计数时指向所述样本，

其特征在于，

光学过滤器(6)和至少一个液体透镜位于所述透镜(2)中，所述芯片设置成具有圆形形状的CD盘状芯片(4)，所述微流体腔室(19)形成在所述CD盘状芯片(4)上，位于所述CD盘状芯片(4)的外围，所述CD盘状芯片(4)直接连接驱动电动机(22)，所述发光器(3)位于所述CD盘状芯片(4)所在的平面上方并且以一角度定位成提供具有最小反射的照射角度，所述计数部件执行为微处理器(23)，与控制所述液体透镜的发电机(8)连接。

2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述至少一个液体透镜包括第一液体透镜(7)、第二液体透镜(7’)和第三液体透镜(7”)，在所述透镜(2)的上部分中以一个在另一个下方的方式定位有第二液体透镜(7’)和第三液体透镜(7”)，在所述透镜(2)的下部分中定位有第一液体透镜(7)，在上方的第二液体透镜(7’)和第三液体透镜(7”)和下方的第一液体透镜(7)之间安装有光学过滤器(6)。

3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述光学过滤器(6)是多通道过滤器。

4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述液体透镜由发电机(8)供能，所述发电机(8)具有0-70V的可变阶梯电压以及频率为1kHz。

5.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述发光器(3)包括一个位于另一个前面接连定位的光源(9)、校准透镜(10)、光学过滤带(11)以及聚焦透镜(12)。

6.根据权利要求5所述的设备，其特征在于，所述光源(9)是LED或者二极管激光器光源。

7.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述CD盘状芯片(4)包括上部分(13)和非透明的下部分(14)，所述上部分(13)由具有光学透明表面的PMMA聚合物提供，所述非透明的下部分(14)由黑色ABS聚合物提供，所述上部分(13)和所述下部分(14)形成为使得在通过800-1050nm激光波长的激光焊接之后，在所述上部分(13)和所述下部分(14)之间的空间中形成50μm高度的微流体通道(15)，样本(5)和荧光染料(16)的混合物位于所述微流体通道(15)中。

8.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，使用矩形芯片(4’)，所述矩形芯片(4’)包括两个部分，即透明上部分(13’)和非透明下部分(14’)，腔室形成在所述两个部分的表面之间并且包含干式的荧光染料(16)或者其他被分析物，所述样本(5)被吸取在所述腔室中，所述矩形芯片(4’)放置在可移动的XY工作台上，所述XY工作台位于所述发光器(3)和透镜(2)下方，多通道式的所述光学过滤器(6)和液体透镜安装在所述透镜(2)中，为了更精确计数微粒的目的，在一个分区中执行采集多于一个图像，选择这些图像中最佳聚焦的一个图像，在所选择的该图像上执行计数，在这之后对下一个分区执行移动以及同样的采集，所选用于计数的图像保存在所述设备的存储器中。

9.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述CD盘状芯片(4)包括两个部分，即具有透明表面的上部分(13)和具有非透明表面的下部分(14)，所述上部分(13)和所述下部分(14)形成为使得在通过800-1050nm激光波长的激光焊接之后，混合腔室(17)形成在所述上部分(13)和所述下部分(14)之间，并且设置有样本(5)和干式的荧光染料(16)，所述混合腔室(17)通过疏水性通道(18)连接所述微流体腔室(19)，所述CD盘状芯片(4)安装至与驱动电动机(22)连接的旋转轴线(21)。

10.根据权利要求1或4所述的设备，其特征在于，所述驱动电动机(22)是步进电动机，直接连接至所述CD盘状芯片(4)。