CN116622881A - 一种烟草全基因组snp位点组合、探针、芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种烟草全基因组SNP位点组合、探针、芯片及其应用，所述应用包括基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定中的任一项；所述烟草全基因组SNP位点组合包括18981个SNP位点，所述18981个SNP位点的物理位置是基于烟草品种K326基因组序列比对确定的；所述18981个SNP位点的物理位置信息见表1。本发明能够进行烟草种质资源或育种群体材料规模化、高通量、低成本的基因分型检测工作，满足烟草种质资源鉴定及进一步育种利用的需求，加快烟草种质资源利用和分子育种的选择效率。

Description

一种烟草全基因组SNP位点组合、探针、芯片及其应用

技术领域

本发明属于烟草遗传育种技术领域，具体涉及一种烟草全基因组SNP位点组合探针、芯片及其应用。

背景技术

普通烟草是重要的经济作物之一，为了培育出优质、适产、抗逆性强的烟草品种，多年来研究者们多年来坚持不懈的进行着烟草的良种培育工作，并推广出云烟87、K326和红花大金元等栽培品种。

而在烟草的育种工作中，主要经历了如下几个阶段：1)农家育种阶段：该阶段主要依赖于农民经验，有意识、偶然发现并选择品种变异的育种阶段；2)杂交育种阶段：通过配置杂交组合创造变异，利用田间试验设计和生物统计知识提高选择效率的育种阶段；3)分子育种阶段：包括分子标记辅助选择、转基因和基因编辑育种等，主要是一个综合利用遗传、基因组信息，借助分子生物学等手段加速变异产生且选择效率大幅提升的育种阶段。其中，分子辅助育种技术的关键环节即是开发遗传变异相关的DNA分子标记，并利用检测手段研究利用遗传变异，提高育种的选择效率；而SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)技术作为第三代分子标记，因其在全基因组范围内数量多，分布均匀，易于基因分型，适合规模化高通量检测等特点，已成为当前遗传研究中主流分子标记被开发利用。

SNP技术是借助高通量测序平台和SNP芯片是检测基因组范围内SNP变异并利用的有效途径。经过多年的技术发展，当前SNP芯片技术所采用的测序平台主要分为AffymetrixSNP基因分型平台(Affymetrix 技术)、Illumina SNP基因分型平台(包括技术和/>技术)、液相SNP基因分型平台(Genotyping by TargetedSequencing,GBTS、靶向测序技术)，三类平台的技术原理存在较大差异，其中靶向测序技术主要是基于目标探针与靶向序列互补结合进行定点捕获，借助二代高通量测序平台获取序列信息，并利用基因组重测序数据分析挖掘出变异信息，该技术对数据分析水平需求较高；Illumina和Affymetrix SNP基因分型平台二者均可划为固相芯片，主要是利用光蚀刻技术，通过不同方式将探针序列固定在玻璃载体上，如Illumina采用微珠技术，将DNA探针序列偶联到微珠的表面，再将各种微珠均匀地撒在已经通过光蚀刻技术蚀刻出很多微孔的玻璃基片上，而Affymetrix的技术则是直接在玻璃载体表面通过光蚀刻的方法植上探针序列。从产品类别和应用市场规模看，Affymetrix SNP基因分型平台有较大优势，在水稻、小麦、玉米、大豆、棉花等主要作物中均有相对成熟的商业化产品，包括目录芯片和定制芯片，如中国农业科学研究院基于该平台，设计开发了660K、55K和55K等不同规格的小麦SNP芯片等。

然而在烟草SNP芯片的研究和利用上，当前国内及国际上尚无成熟的目录芯片可用，国内科研单位虽然基于EST(表达序列标签)、GBS(基因组简约法)、RAD(限制性内切酶位点标签)、RNAseq(转录组测序)等手段开发了一些SNP标记，但是这些标记在基因组覆盖度方面存在明显的不足，因此，急需开发一种适用于规模化烟草种质资源鉴定、功能基因挖掘和育种材料背景分析等方面的烟草全基因组SNP芯片，以弥补当前烟草SNP芯片的不足。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种烟草全基因组SNP位点组合探针、芯片及其应用，其能够进行烟草种质资源或育种群体材料规模化、高通量、低成本的基因分型检测工作，满足烟草种质资源鉴定及进一步育种利用的需求，加快了烟草种质资源利用和分子育种的选择效率。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：

一种烟草全基因组SNP位点组合在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用，所述烟草全基因组SNP位点组合包括18981个SNP位点，所述18981个SNP位点的物理位置是基于烟草品种K326基因组序列比对确定的，所述烟草品种K326基因组序列的获取网址为：https://solgenomics.net/ftp/genomes/Nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017/；依据其在参考基因组物理位置及基因型进行编号，且按照参考基因组Chromosome(染色体/连锁群)和Scaffold(框架序列)，以及位置顺序从小至大依次排列，编号范围为Nt01:122369:T/G～Nitab4.5_0941907:351:A/G(具体见表1，其中“:”为分割符，将每个SNP位点编号分为三部分，第一部分表示位点所在参考基因组中Chromosome或Scaffold名称，第二部分表示位点所在参考基因组中Chromosome或Scaffold中位置，第三部分表示位点变异的基因型，A、T、G、C为脱氧核糖核苷酸的缩写，分别表示腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)和胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)

因此，所述18981个SNP位点的物理位置信息见表1，在表1中，所述SNP位点的物理位置采用Chromosome或Scaffold名称：位点所在参考基因组中Chromosome或Scaffold中位置：位点变异的基因型的形式表示，其中Ni为Nitab4.5的简写。

表1烟草18981个SNP位点的信息

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作为进一步的技术方案，所述烟草为普通烟草；所述普通烟草指的是不包含烟属中烟草野生种的烟草。所述烟草野生种包括林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)等。

一种检测所述烟草全基因组SNP位点组合的探针组合在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用。

一种检测所述烟草全基因组SNP位点组合的芯片在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用，所述芯片包含所述的探针组合。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明在SNP位点的筛选过程中，采用原始SNP位点来自于150个涵盖烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、雪茄烟、香料烟、药烟等多种类型烟草代表性品种材料；各位点多态性指数较高(平均PIC为0.34，最小为0.2)；在烟草全基因组范围内，特别是非重复序列区，每200Kb区间含有1～5个SNP位点，均匀度好，且重点选择位于外显子区SNP位点，并参考了该SNP位点和临近位点连锁不平衡信息；确定的SNP位点基因组信息选择国际上公开的K326参考基因组，并兼顾了国内烟草参考基因组信息，各位点所在序列片段在参考基因组上均为唯一匹配，便于后期各位点位置信息随参考基因组优化升级而更新，此外，相较于现有技术而言，本发明不仅位点得到极大的丰富，而且检测成本实现了大幅降低，满足了烟草分子育种对育种材料规模化、大批量基因分型的需要。

本发明通过利用公开的烟草K326参考基因组，筛选获得的一批覆盖烟草全基因组，且分布均匀、多态性好、位置明确、经过试验验证确定质量可靠的SNP位点集合，可以满足烟草分子遗传研究中烟草种质资源基因型鉴定、分子指纹图谱构建、育种材料基因分型、全基因组关联分析/连锁分析、分子标记辅助选择育种等相关的研究需求。

本发明开发的检测烟草全基因组SNP位点组合的芯片(Ta-LD-SC)可进行商业化，对烟草全基因组选择育种、分子设计育种及育种芯片的开发等具有重要经济价值和良好应用前景。

附图说明

图1为18981个SNP位点在烟草品种K326参考基因组Chromosome区的分布；

图2为实施例2中1105个烟草材料的进化发育树；

图3为实施例4中烟草EigenGWAS分析的曼哈顿图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：烟草全基因组19K SNP芯片位点筛选以及探针和芯片的设计

本发明利用150份烟草重测序数据，并选择公开的烟草品种K326参考基因组(获取网址：https://solgenomics.net/ftp/genomes/Nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017/)作为参考基因组序列，进行SNP位点的挑选和确定，具体步骤如下：

步骤1.数据质控：选择150份烟草基因组重测序数据(Tobacco.vcf),该数据包含有1216749个原始SNP位点；利用plink软件和perl脚本程序，按照最小等为基因频率(MAF)>0.05、确失率(MR)<0.1、杂合率<0.1、哈迪温伯格平衡校验(HWE)<0.05、多态性(PIC)>0.2作为初步挑选条件，筛选出1179154个SNP位点。

步骤2.利用perl脚本，提取各位点上下游50bp碱基序列，作为检索序列，使用Blastn方法，将各位点序列与已公开的烟草品种K326全基因组核酸序列进行比对，按照唯一匹配的原则进行筛选，获得烟草基因组非重复序列区SNP位点数，为92894个。

步骤3.研究表明烟草全基因组连锁不平衡(LD)平均衰减距离约为200Kb，据此将烟草参考基因组按照200Kb区间窗口(Bin)进行切割，统计各区间SNP位点分布。根据均匀分布原则，首先提取区间内SNP位点数目小于5的位点列表，随后按照50Kb的步长移动区间窗口，移动3次，尽可能保证位于各区间窗口SNP位点数目均匀且数目小于5，同时对区间窗口中SNP位点数目大于5的位点列表进行人工优选，重点考虑原则(1)SNP位点位于基因外显子区；(2)SNP位点PIC最大，且和临近SNP位点PIC一致；(3)SNP位点具有KASP引物设计序列；(4)已经试验验证过的SNP位点；将该步骤筛选获得的位点作为VIP位点，优先级别最高。

步骤4.对步骤3筛选获得的VIP位点在参考基因组分布进行再次分析，从原始SNP位点数据中尽可能再次挑选烟草参考基因组Uniq区的SNP位点，以满足对Chromosome区空洞(Gap)和每个Scaffold的覆盖，该步骤结束，共获得21389个VIP SNP位点。

步骤5.将烟草参考基因组Uniq区未被选择为VIP SNP的作为重要(Important)位点，其余重测序数据分析结果数据作为一般(stand)位点，按照Affymetrix 技术标准对各位点进行评估，结合上述各步骤信息，最终选择了20236个SNP位点。

步骤6.将选择的20236个SNP位点使用Affymetrix SNP基因分型平台进行探针设计及芯片定制。

步骤7.选择1007个烟草自交系样本(包含重复测试样品)进行样品检测，根据基因分型效果，最终确定了18981个SNP位点，见表1，其在烟草品种K326参考基因组Chromosome区的分布情况，见图1，其不仅准确，而且质量高；最后，将定制化芯片命名为Ta-LD-SC(烟草低密度SNP芯片)。

该Ta-LD-SC芯片可同时检测96个样品，兼顾了检测通量、效率和成本等因素，相较于其他芯片而言，更为适宜于进行种质资源基因型鉴定，基因分型检测、初步功能基因挖掘定位、分子育种材料遗传背景分型等方面的应用。

实施例2：检测烟草全基因组SNP位点组合的Ta-LD-SC芯片在烟草基因分型中的应用

本实施例选择贵州省烟草科学研究院种质资源库收集保存的1031份烟草种质样品材料(包括烟草农家种、培育品种、育种高代系、定向改良材料等，主要为烤烟、晒烟，包含少数代表性白肋烟、香料烟和雪茄烟品种材料)，利用实施例1制备的Ta-LD-SC芯片，检测实施例1筛选的18981个SNP位点所在基因型，所有样品检出率(Call rate)平均为97.79％，最小等位频率(MAF)平均为0.36，对其中90份样品重复测样，检出位点一致性平均为99.31％。基因分型的具体流程如下：

步骤1.提取样本基因组DNA，质控

采用CTAB法等方法提取样本DNA，对样本DNA分别进行Picogreen精确定量，Nano检测DNA纯度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。检测合格样品DNA置于4℃冰箱保存，备用。

基因组DNA质量要求：

1)双链定量浓度≥10ng/ul，总量≥600ng；

2)OD260/OD280介于1.7至2.1之间，OD260/OD230≥1.4；

3)1％琼脂糖电泳90％DNA片段大小大于10Kb。

基因组DNA质检结果说明：

1)合格：完全符合质量要求。

2)风险上机：5ng/ul≤浓度＜10ng/ul，300ng≤总量＜600ng，DNA轻微降解，蛋白或RNA轻微污染。

3)不合格：浓度＜5ng/ul，总量＜300ng，DNA严重降解，蛋白或RNA污染严重。

步骤2.DNA样品片段化

对合格的DNA样本均一化，DNA扩增，然后将扩增产物片段化、沉淀，随后进行DNA干燥、重悬，用紫外吸收法检测浓度，用3％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化产物质量。

质控说明：

1)100倍稀释后片段化DNA产物的浓度＞80ng/uL，判定为：符合要求；片段化DNA产物浓度在60-80ng/uL，判定为：风险上机。

2)片段化产物跑3％琼脂糖凝胶电泳结果主带明显，且分布于25-125bp。

步骤3.利用Ta-LD-SC芯片进行检测

按照Affymetrix SNP基因分型平台标准操作流程，完成DNA片段杂交、清洗、染色、扫描，获得所测样品Ta-LD-SC芯片扫描结果CEL文件。

步骤4.数据分析统计

采用软件AxiomTM Analysis Suite v5.2，按照软件操作的标准化流程，对芯片扫描结果CEL文件进行处理，获得各样本基因型数据。

由于烟草(Nicotiana tabacum L.)为四倍体物种，且为常自交作物，因此，在结果分析参数选择注意Inbred Penalty(自交罚分)和Species type(物种类型)参数选择，本实施例中Inbred Penalty设置成4，Species type选择为Polyloid(多倍体)。

根据分析的基因型文件，对收集种质材料进行遗传相似性、群体进化等分析，并确定了其中485份种质材料可作为烟草核心种质资源，其中系统发育树见附图2；筛选获得485份烟草种质可以代表1031份样品95％以上的遗传多态性。

实施例3：检测烟草全基因组SNP位点组合的Ta-LD-SC芯片在烟草模块化育种定向改良材料遗传背景分析中的应用

红花大金元是国内早期栽培的一个品质优良烤烟品种，但该品种黑胫病和青枯病抗性差，近年来种植面积逐渐萎缩。为此，从红花大金元和Beninhart1000-1构建的模块化育种材料(染色体片段代换系)中选择一个田间性状抗病性好，品质优的高世代株系FY-31，利用实施例2的试验步骤进行基因分型，获得基因分型结果，然后对此株系进行遗传背景分析，结果显示：FY-31与红花大金元相比，其Ta-LD-SC芯片基因分型结果中差异位点数目为945，估计遗传背景恢复率为95.03％，其中有641个位点位于Nt01～Nt24，具体见表2；随后根据选择的候选区段，结合参考基因组注释信息，筛选获得重要候选基因；如本实施例中Nt21:65.29Mb～76.43Mb和Nt24:22.84Mb～30.96Mb候选区间可作为重要功能基因进行研究，以进一步阐明FY-31与红花大金元抗性及品质性状差异原因。

表2烟草定向改良材料FY-31与红花大金元遗传背景分析结果

实施例4：检测烟草全基因组SNP位点组合的Ta-LD-SC芯片在烟草功能基因挖掘定位中的应用

本发明检测烟草全基因组SNP位点组合的Ta-LD-SC芯片，还可以用于烟草全基因组关联分析、全基因组连锁分析等需要涉及烟草品种或材料基因分型、定位候选基因等项目的研究；例如选取实施例3中1031份烟草样品SNP基因分型结果，参考陈国波等人建立的EigenGWAS(Chen，G.B.et al.,2016)，对基因组范围内育种进程中重要候选位点进行扫描，结果见图3，初步获得了Nt06、Nt01、Nt02等全基因组范围内重要候选位点，进一步为挖掘验证育种可用功能基因提供了支撑。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (4)

1.一种烟草全基因组SNP位点组合在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用，其特征在于，所述烟草全基因组SNP位点组合包括18981个SNP位点，所述18981个SNP位点的物理位置是基于烟草品种K326基因组序列比对确定的，所述18981个SNP位点的物理位置信息见表1。

2.根据权利要求1所述的一种烟草全基因组SNP位点组合在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用，其特征在于，所述烟草为普通烟草。

3.一种检测如权利要求1所述烟草全基因组SNP位点组合的探针组合在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用。

4.一种检测如权利要求1所述烟草全基因组SNP位点组合的芯片在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用，其特征在于，所述芯片包含权利要求3所述的探针组合。