CN116622826A - 脊髓性肌萎缩症检测方法和试剂盒 - Google Patents

脊髓性肌萎缩症检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基于荧光PCR方法来检测受试者的脊髓性肌萎缩症(SMA)的方法和试剂盒,其中包括检测SMN1外显子7和8，SMN2外显子7和8以及多个突变位点的特异性引物对和探针组合。本发明提供的检测SMA的方法具有简单、快速、低成本，高通量的优点，能够同时在同一PCR反应程序下可同时检测SMA多个相关基因和突变位点，判断SMA相关基因的突变类型，缺失、转换、插入突变等，可判断SMA临床严重程度，实现对SMA的分型。

Description

脊髓性肌萎缩症检测方法和试剂盒
发明领域
本发明涉及分子生物学和病毒检测领域。具体的，本发明涉及脊髓性肌萎缩症(SMA)的检测领域。
发明背景
脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,临床特征是脊髓前角细胞变性退化、导致对称性肌无力和肌萎缩，为一种常见的运动神经元疾病，主要表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱、病理征阴性。
SMA通常根据疾病严重程度与发病年龄分为三个亚型。I型患者在出生时或在6个月之前开始发病，不能独自坐或走，并且通常在两年内死于呼吸功能不全；II型患者在6个月之后发病，可以独坐但在没有任何辅助设备帮助的情况下不能走路，并且寿命会大大减少；III型患者通常在1岁半后发病，可以独立的坐或走路，但在青春期或成人后一般行走能力有所退步，需要靠轮椅行动。脊髓性肌萎缩症在人群中的携带率约为1/35-1/50左右，发病率约为1/6000-1/10000左右。
SMA最常见的形式是由定位于5q13.2的运动神经元存活基因1(motor neuronsurvival gene1，SMN1，OMIM#600354)致病性变异所导致的5q-SMA，约占所有SMA病例的95％，呈常染色体隐性遗传。
现有的对SMA的基因检测方法包括各种基于DNA扩增的方法，如荧光定量PCR、PCR-DHPLC和多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)等。其中MLPA是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。该技术在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，针对c.840C>T位点设计不同的探针序列，SMN1基因扩增子和SMN2基因扩增子可以扩增出不同的片段长度，而峰的高度可以反映拷贝数变异。
临床上，很多肌肉疾病和SMA的表型容易混淆，难以鉴别，传统的MLPA等检测方法仅能定向检测SMA。NGS可以作为初筛诊断SMA和其他肌病的有效方法，但初筛疑似阳性的结果还需要进行MLPA或Sanger测序的验证。另外在SMN2拷贝数分析方面，NGS还有待更多的证据证明其准确性和可靠性。
在本领域仍然需要操作简单，成本低的对脊髓性肌萎缩症(SMA)进行检测的方法和试剂盒。
发明内容
本发明涉及对受试者进行脊髓性肌萎缩症(SMA)检测的方法。具体的，本发明提供了基于荧光定量PCR技术的对SMA相关基因和突变的核酸检测的方法以及用于所述方法的特异性引物和探针组，实现了快速、方便和准确地检测脊髓性肌萎缩症。
具体的，本发明提供了用于检测脊髓性肌萎缩症(SMA)的试剂盒,其包括检测SMN1外显子7和8，以及SMN2外显子7和8的特异性引物对和探针组合。
在本发明的其中一个方面，其中特异性检测SMN1外显子7的引物及探针序列如下:
上游引物SMN1E7F：核苷酸序列如SEQ ID NO:1，
下游引物SMN1E7R：核苷酸序列如SEQ ID NO:2，
探针SMN1E7P：核苷酸序列如SEQ ID NO:3。
在本发明的其中一个方面，其中特异性检测SMN1外显子8的引物及探针序列如下:
上游引物SMN1E8F：核苷酸序列如SEQ ID NO:5，
下游引物SMN1E8R：核苷酸序列如SEQ ID NO:6，
探针SMN1E8P：核苷酸序列如SEQ ID NO:7。
在本发明的其中一个方面，其中特异性检测SMN2外显子7的引物及探针序列如下:
上游引物SMN2E7F：核苷酸序列如SEQ ID NO:9，
下游引物SMN2E7R：核苷酸序列如SEQ ID NO:10，
探针SMN2E7P：核苷酸序列如SEQ ID NO:11。
在本发明的其中一个方面，其中特异性检测SMN2外显子8的引物及探针序列如下:
上游引物SMN2E8F：核苷酸序列如SEQ ID NO:13，
下游引物SMN2E8R：核苷酸序列如SEQ ID NO:14，
探针SMN2E8P：核苷酸序列如SEQ ID NO:15。
在本发明的其中一个方面，其中检测SMN1外显子7和8，以及SMN2外显子7和8的所述特异性引物对和探针组合中还独立包括封闭探针(Blocker)。
在本发明的其中一个方面，其中在检测SMN1外显子7和8，以及SMN2外显子7和8的四个所述特异性引物对和探针组合中，所述封闭探针分别为：
探针SMN2E7B：核苷酸序列如SEQ ID NO:12；
探针SMN2E8B：核苷酸序列如SEQ ID NO:16；
探针SMN1E7B：核苷酸序列如SEQ ID NO:4；
探针SMN1E8B：核苷酸序列如SEQ ID NO:8。
人基因组有两个高度同源的SMN基因(同源性>99.9％)，即位于5q13.2端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，两者仅存在5个碱基差异，其中位于第7外显子第6位c.840的C/T(SMN1为c.840C，SMN2为c.840T)导致90％的SMN2 mRNA第7外显子被选择性剪接，仅有10％的SMN2表达全长有功能的SMN蛋白。SMN1决定脊髓性肌萎缩症(SMA)的发生，而SMN2影响SMA的严重程度和进展。
SMN1(NG_008691.1)全长约20kb，共包含8个外显子，转录产物长1.7kb，编码由294个氨基酸组成的SMN蛋白(SMN，NP_000335.1)，在各组织细胞广泛表达，参与剪接体蛋白复合体的组装，是真核细胞生物生存所必须的管家蛋白。
SMN1基因在表型正常人中的拷贝数为1～4个，可包括不同基因型：正常人基因型包括常见的[1+1]型，罕见3～4拷贝SMN1基因的[2+1]型和[2+2]型；携带者通常无异常表型，其中一条染色体含1或2拷贝功能正常的SMN1基因，另一条染色体含缺失或微小变异的功能异常SMN1基因，基因型可为杂合缺失型[1+0]型、[2+0]型、[1+1d]和[2+1d]型(d代表SMN1基因内含有微小点突变而功能异常，如无义突变、移码突变、错义突变等)。SMA突变基因型主要有两类，95％由SMN1双等位基因纯合缺失所致，即[0+0]基因型；5％由SMN1复合杂合突变所致，即一个等位基因缺失，另一个等位基因发生微小致病性变异，即[0+1d]基因型。
SMN2全长mRNA编码与SMN1相同的SMN蛋白。SMN2的拷贝数从0到多个不等。SMN2拷贝数是目前公认的SMA修饰因子。
在本发明中，由于SMN1与SMN2高度同源，在反应体系中加入了封闭探针。例如，在检测SMN1外显子7的体系中加入SMN2外显子7的封闭探针(SEQ ID NO.12)，将SMN2封闭，避免了模板的互相干扰，从而避免出现非特异性扩增。
在本发明的其中一个方面，本发明的方法和试剂盒中的特异性引物或探针的寡核苷酸为核苷酸类似物(例如硫代磷酸酯,烷基硫代磷酸酯或肽核酸)或修饰的核苷酸(例如锁核酸修饰或小沟结合物修饰核苷酸)。特别是选择在识别SMN1外显子7或8以及SMN2外显子7或8的关键碱基位点(如SMN1与SMN2不同的碱基及其附近1-3个碱基)上进行修饰(如锁核酸修饰)。在本发明的其中又一个方面，本发明的方法和试剂盒中检测SMN1外显子7和8以及SMN2外显子7和8的所述特异性引物对和探针组合中的探针或封闭探针具有锁核酸修饰，优选的，其在识别SMN1外显子7或8以及SMN2外显子7或8的关键碱基位点(如SMN1与SMN2不同的碱基和/或其附近1-3个碱基)上进行修饰。例如，在所述特异性引物对和探针组合中的探针SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15的序列中第6和7个碱基(其中第7个碱基是SMN1与SMN2不同的碱基位点)进行了锁核酸修饰。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中还包括检测SMA相关突变位点的特异性引物对和探针组合。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.22dupA的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.22dupA-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:20，
下游引物c.22dupA-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:21，
探针c.22dupA-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:22。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.835-5T>G的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.835-5T>G-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:23，
下游引物c.835-5T>G-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:24，
探针c.835-5T>G-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:25。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.400G>A的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.400G>A-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:26，
下游引物c.400G>A-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:27，
探针c.400G>A-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:28。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.689C>T的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.689C>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:29，
下游引物c.689C>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:30，
探针c.689C>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:31。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.463_464delAA的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.463_464delAA-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:32，
下游引物c.463_464delAA-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:33，
探针c.463_464delAA-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:34。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.683T>A的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.683T>A-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:35，
下游引物c.683T>A-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:36，
探针c.683T>A-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:37。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.863G>T的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.863G>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:38，
下游引物c.863G>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:39，
探针c.863G>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:40。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点11bp-dup的特异性引物及探针序列如下:
上游引物11bp-dup-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:41，
下游引物11bp-dup-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:42，
探针11bp-dup-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:43。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点Y272C：的特异性引物及探针序列如下:
上游引物Y272C-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:44，
下游引物Y272C-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:45，
探针Y272C-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:46。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点4bp-delAGAG的特异性引物及探针序列如下:
上游引物4bp-delAGAG-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:47，
下游引物4bp-delAGAG-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:48，
探针4bp-delAGAG-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:49。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.280G>T的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.280G>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:50，
下游引物c.280G>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:51，
探针c.280G>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:52。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.835G>C的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.835G>C-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:53，
下游引物c.835G>C-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:54，
探针c.835G>C-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:55。
在本发明的其中一个方面，其中检测突变位点c.*3+3A>T的特异性引物及探针序列如下:
上游引物c.*3+3A>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:56，
下游引物c.*3+3A>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:57，
探针c.*3+3A>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:58。
在本发明的其中一个方面，其中所述探针进行了标记，可以被各种测试手段检出。例如采用同位素或荧光标记。在本发明的其中一个方面，其中所述探针为荧光探针，例如为Taqman荧光探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
本发明还提供了采用上述试剂盒用于检测受试者的脊髓性肌萎缩症(SMA)的方法。其中，所述方法包括采用所述特异性引物对和探针组合中的引物来扩增来自受试者的核苷酸片段；所述特异性引物对和探针组合中的探针可识别和结合模板(包括扩增产物)中对应所述探针序列的片段；通过检测探针与模板结合的情况，判断生物样品中是否存在SMA相关基因或突变。
其中，所述方法中可检测探针释放的荧光信号，判断生物样品中是否存在SMA相关基因或突变。优选的，本发明使用的探针为Taqman荧光探针。Taqman荧光探针法是一种实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法，发展成熟，已经有广泛的应用。Taqman荧光探针法的探针的两端分别具有荧光报告基团和荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
在本发明的上述方法中，还包括对阳性对照样品和阴性对照样品的测试。在本发明的上述方法中，还可以包括对内参物的测试。内参物是指目标测试物种，例如人类的样品中固有表达的，丰度较高的基因。在本发明中，内参物可采用β-肌动蛋白(β-actin)或球蛋白(β-globin)或内参基因例如ALB。在本发明的其中一个方面，检测ALB的特异性引物对和探针为：
上游引物ALB-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:17，
下游引物ALB-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:18，
探针ALB-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:19。
在本发明的其中一个方面，前述试剂盒和方法中用于检测SMA相关基因或突变的特异性引物对和探针组合分为五组，其中第一组为检测SMN1外显子7的特异性引物对和探针组合，第二组为检测SMN1外显子8的特异性引物对和探针组合，第三组为检测检测SMN2外显子7的特异性引物对和探针组合，第四组为检测检测SMN2外显子8的特异性引物对和探针组合，第五组为检测所述相关突变位点的特异性引物对和探针组合。
在本发明的其中又一个方面，在检测SMN1外显子7或8，以及在SMN2外显子7或8的所述第一至第四组中还分别包括检测内参基因的特异性引物对和探针组合，例如为如前所述的检测ALB的特异性引物对和探针。
本发明涉及对受试者是否存在患脊髓性肌萎缩症(SMA)的风险进行检测和评估的方法，所述方法包含下述步骤：将含有受试者核酸的样品与特异性引物对和探针组合混合，采用所述特异性引物对和探针组合中的引物对含有目标基因的片段进行扩增，并检测所述特异性引物对和探针组合中的探针识别和结合模板(包括扩增产物)的情况，以确定样品中是否存在SMA相关基因或突变，以及它属于何种类型。在其中一种实施方式中，所述方法中可检测探针释放的荧光信号，判断生物样品中是否存在SMA相关基因或突变。优选的，在其中一种实施方式中，使用的探针为Taqman荧光探针。
所述特异性引物(通常是引物对，包括上游引物和下游引物)可以特异性地杂交于SMA相关基因或突变的特定区域并在可扩增的条件下扩增所述核酸片段。
所述特异性探针能特异性地杂交于SMA相关基因或突变的特定区域。所述探针可识别和结合SMA相关基因或突变，以及所述特异性引物以目标靶核酸为模板得到的扩增产物中对应所述探针的片段。
在本发明的其中一个方面，所述Taqman荧光探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在本发明的其中一个方面，其中所述报告基团为荧光报告基团。在本发明的其中一个方面，所述报告基团选自荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，和花青染料(例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)。
在本发明的其中一个方面，其中所述淬灭剂选自荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬灭剂2(Black Hole Quencher 2，BHQ2)或黑洞淬灭剂3(Black Hole Quencher 3，BHQ3)。
本发明公开的引物和探针可以用于定量PCR方案或定量杂交。定量PCR允许定量DNA,cDNA，或RNA模板的起始量。定量PCR可以基于荧光报道分子的检测，所述荧光报道分子随着PCR产物在每个扩增循环中的积累而增加。
本发明的方法和试剂盒中提供的引物和探针可以在有固体支持物存在下，进行探针和靶基因之间的杂交。可以固定探针和靶核酸中的一种或多种，例如，固定到珠子、平板、载玻片、或微量滴定板上。
本发明的方法和试剂盒中提供的引物和探针也可以在引物、探针都不固定的情况下进行检测，例如杂交可以在液体介质背景下进行。
本发明的方法和试剂盒可用于基于磁珠的检测系统。用于本发明的磁珠，例如为适用于流式细胞术分析的珠子。珠子能偶联到探针上，以检测探针和靶标之间的相互作用。在一个方面，用独特的荧光分子或分子的组合标记珠子。通过使用激光激发珠子内的一种或多种荧光染料，能鉴别出在珠子上或内部的标记。结合的检测也可以在微阵列的背景下进行。这样的技术是本领域技术人员众所周知的。
下面的定义和解释有助于更好地理解本发明。
待分析的样品中的靶材料可以是DNA或RNA,例如基因组DNA,信使RNA,病毒RNA或其扩增形式。现在已有各种提取和纯化操作，可以用于从样品分离RNA或DNA(例如Sambrook等,1989)。RNA可通过逆转录变为DNA以进行引物和探针杂交反应。
根据本发明的术语“探针”通常指单链寡核苷酸，其设计用于特异性地杂交于HPV的核酸。
术语“引物”通常指能作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与要复制的核酸链互补。优选地，引物的长度是约10-50个核苷酸。具体长度和序列取决于需要的DNA或RNA靶的复杂性，以及使用引物的条件，例如温度和离子强度。
表述“引物对”在本发明中指一对引物，其允许扩增目标多核酸片段的一部分或全部，探针能与所述部分结合。
本发明的探针或引物的"靶"或"靶序列"是目标核酸的序列，探针或引物与其完全互补或部分互补(其中部分互补允许一定程度的错配)。应当理解，在有些情况下，所述靶序列的互补序列也是合适的靶序列。本发明的探针适当地至少与它们的靶序列的中央部分互补。在大多数情况下，探针与它们的靶序列完全互补。
探针与目标多核酸区域的"特异性地杂交"，指所述探针与该区域的一部分或整个区域在使用的实验条件下形成双链体，且在这些条件下，所述探针不与待分析样品中存在的多核酸的其它区域形成双链体。应当理解，设计用于特异性地杂交于目标多核酸区域的探针，可以完全落入所述区域内，或可以在很大程度上与所述区域重叠(即与所述区域之外和之内的核苷酸形成双链体)。
适当地，探针与核酸靶区域的特异性的杂交，发生在严格杂交条件下，例如，3XSSC,0.1％ SDS,50℃。
技术人员知道如何改变温度、探针长度和盐浓度等参数，以便实现特异性的杂交。杂交和洗涤条件是众所周知的，且示例在Sambrook,等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),尤其是其中的第II章。在需要时，可以轻微修改探针的长度或序列，以维持在给定环境下需要的特异性和灵敏度。优选的严格条件适当地是允许类型特异性的探针结合仅一种HPV类型的条件。
引物与HPV多核酸区域的"特异性杂交"指，在扩增步骤中，所述引物与该区域的一部分或整个区域在使用的实验条件下形成双链体，且在这些条件下，所述引物不与待分析样品中存在的多核酸的其它区域形成双链体。
用作引物或探针的寡核苷酸也可以包含核苷酸类似物，例如，硫代磷酸酯,烷基硫代磷酸酯或肽核酸，或可以含有嵌入剂，例如为锁核酸修饰或小沟结合物修饰核苷酸。这些修饰的导入有利于杂交动力学，杂交体形成的可逆性，寡核苷酸分子的生物稳定性等。
附图说明
图1显示采用本发明的示例性方法和试剂盒检测SMN1外显子7和8及SMN2外显子7和8的扩增效率与内参基因ALB一致。
图2显示采用本发明的示例性方法和试剂盒检测SMN1外显子7、SMN1外显子8是否存在缺失的方法和结果。
图3显示采用本发明的示例性方法和试剂盒检测SMN1外显子7和SMN1外显子8是否杂合缺失，是否为SMN1基因缺失携带者的方法和结果。
图4显示采用本发明的示例性方法和试剂盒检测SMN1外显子7和SMN1外显子8是否纯合缺失的方法和结果。
图5显示采用本发明的示例性方法和试剂盒检测SMN2外显子7和SMN2外显子8拷贝数的方法和结果。
图6显示采用本发明的示例性方法和试剂盒探对探针位点做LNA修饰的影响。
图7显示采用本发明的示例性方法和试剂盒检测检测SMN1基因的13个突变位点，包括中国常见的7个致病突变位点，分别是c.22dupA、c.835-5T>G、c.400G>A、c.689C>T、c.463_464delAA、c.683T>A和c.863G>T；全球范围内常见的高频率突变位点3个，分别是11bp-dup、Y272C和4bp-delAGAG；以及c.280G>T、c.835G>C和c.*3+3A>T的方法和结果。
具体实施方式
实施例1探针和引物、DNA模板的合成
人工合成探针和引物、DNA模板，序列信息见表1和表2。
表1探针和引物序列
表2 DNA模板序列
实施例2对照品的制备：
共有2组对照品，第一组对照品含有SMN1外显子7、SMN1外显子8和内参ALB的基因片段，拷贝数比例为1:1:2。第二组对照品含有SMN2外显子7、SMN2外显子8和内参ALB的基因片段，拷贝数比例为1:1:2。
实施例3PCR反应
将上述检测SMN1外显子7和8、SMN2外显子7和8以及所述突变分为5个反应体系，具体反应体系如表3所示，其中第五反应体系包括13个致病突变位点。13个突变点中包括中国SMA较常见的微小致病性变异7个，分别是c.22dupA、c.835-5T>G、c.400G>A、c.689C>T、c.463_464delAA、c.683T>A、c.863G>T；全球范围内常见的高频率突变位点3个，分别是11bp-dup、Y272C、4bp-delAGAG；以及c.280G>T、c.835G>C、c.*3+3A>T。
表3PCR反应体系
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其中，阴性对照不加DNA模板，用无核酸酶水代替。DNA模板包括提取的DNA基因组和人工合成的模板。
反应体系中所用引物和探针的工作浓度范围均为100nmol/L～200nmol/L。SMN1E7B、SMN2E7B、SMN1E8B、SMN2E8B封闭探针的浓度分别为40-80nmol/L、10-50nmol/L、0-20nmol/L、20-200nmol/L。
所有反应体系均在上海宏石96S荧光定量PCR仪中扩增，具体反应程序见表4。
表4PCR反应程序
实施例4结果分析
拷贝数检测结果分析：在样本中，在同一荧光定量PCR体系中分别加入目的基因和内参基因的特异性探针及引物，计算两者Ct值的差值ΔCt1＝Ct目的基因-Ct内参；对照品中，在同一荧光定量PCR体系中分别加入目的基因和内参基因的模板、特异性探针和引物，其中目的基因与内参基因模板拷贝数比例是1:2，计算两者Ct值的差值ΔCt2＝Ct目的基因-Ct内参。计算ΔΔCt＝ΔCt1-ΔCt2。根据2-ΔΔCt值范围判断拷贝数。
碱基突变位点的定性检测结果分析:内参基因荧光通道有信号，目的基因荧光通道有信号且Ct值<35，则说明存在碱基突变；内参基因荧通道有信号，目的基因荧光通道无信号或Ct值>35，则说明不存在碱基突变。阴性对照荧光通道都无信号。
1.扩增效率检测
本次实验共有2组对照品，第一组对照品含有SMN1外显子7和8及内参ALB的基因模板(SEQ ID NO.59)，拷贝数比例为1:1:1。第二组对照品含有SMN2外显子7和8及内参ALB的基因模板(SEQ ID NO.60),拷贝数比例1:1:1。
按照1:5:25:125:625的稀释比例稀释对照品，用于比较4种外显子与内参ALB的扩增效率。其中SMN1外显子7的上下游引物和探针组合序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，SMN1外显子8的上下游引物和探针序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，SMN2外显子7上下游引物和探针序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，SMN2外显子8上下游引物和探针序列分别为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，内参ALB上下游引物和探针序列分别为为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。
结果如图1所示，SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7、SMN2外显子8和内参ALB的扩增效率均在90％以上，说明PCR反应体系的高稳定性。此外，SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7、SMN2外显子8和内参ALB的扩增效率基本一致，说明相对定量方法的可靠性。
2.检测SMN1外显子7、SMN1外显子8与ALB基因Ct值的差异，判断是否存在缺失
本组实验所需SMN1外显子7的引物探针序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3及ALB的探针引物引物探针序列分别为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19，基因模板核苷酸序列为SEQ ID NO.59。
SMN1外显子8的引物探针序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7及ALB的上下游引物和探针序列分别为为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，基因模板核苷酸序列为SEQ ID NO.59。
结果如图2所示：SMN1外显子7、SMN1外显子8与ALB基因的Ct值相同，证明SMN1外显子7和SMN1外显子8无缺失且拷贝数与ALB基因相同。
3.检测对照品中(目的基因拷贝数:ALB基因拷贝数＝1:2)目的基因与内参基因的ΔCt值，从而判断样本是否为杂合缺失，是否为SMN1基因缺失携带者。
本组实验所需SMN1外显子7的上下游引物和探针组合序列为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3及内参ALB上下游引物和探针序列分别为为SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19，基因模板核苷酸序列分别为SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.61。
SMN1外显子8的上下游引物和探针序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7及内参ALB上下游引物和探针序列分别为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19，基因模板核苷酸序列分别为SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.61。
结果如图3所示：SMN1外显子7、SMN1外显子8与内参ALB基因的Ct值相差(ΔCt)1左右，证明SMN1外显子7和SMN1外显子8为杂合缺失。
4.通过检测SMN1外显子7和外显子8的扩增情况，判断是否为纯合缺失，从而辅助诊断脊髓性肌萎缩症(SMA)。
检测SMN1外显子7的纯合缺失，所需SMN1外显子7的上下游引物和探针组合序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3,内参ALB上下游引物和探针序列分别为为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，基因模板序列为SEQ ID NO.60。
检测SMN1外显子8缺失，SMN1外显子8的引物探针序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7,内参ALB上下游引物和探针序列分别为为SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19，基因模板序列为SEQ ID NO.60。
结果如图4所示:SMN1外显子7荧光通道无信号，SMN1外显子8与ALB的ΔCt值为10左右，可说明SMN1外显子7和SMN1外显子8为纯合缺失。
5.检测SMN2的拷贝数，辅助判断SMA的临床严重程度
检测SMN2外显子7的上下游引物和探针序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，内参ALB上下游引物和探针序列分别为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQID NO.19，基因模板序列为SEQ ID NO.60。
检测SMN2外显子8的上下游引物和探针序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQID NO.15，内参ALB上下游引物和探针序列分别为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19，基因模板序列为SEQ ID NO.60。
结果如图5所示：SMN2外显子7和8拷贝数与内参ALB拷贝数相同，均为2拷贝。
6.比较SMN1外显子8和SMN2外显子8探针位点修饰LNA前后与ALB基因的Ct值的差异
比较SMN1外显子8探针修饰前后的特异性，所需SMN1外显子8引物序列为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6，未修饰LNA探针的序列为5'FAM-CCCACCCCAGTCTT-3'MGB；修饰LNA的探针序列为5'FAM-CCCACC(LNA)C(LNA)CAGTCTT-3'MGB。ALB的引物和探针序列分别为SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。
比较SMN2外显子8探针修饰前后的特异性，所需SMN2外显子8引物序列为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，未修饰LNA探针的序列为5'FAM-CCCACCTCAGTCTT-3'MGB，修饰LNA的探针序列为5'FAM-CCCACC(LNA)T(LNA)CAGTCTT-3'MGB。ALB的引物和探针序列分别为SEQID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。
结果如图6所示：经LNA修饰的SMN1外显子8和SMN2外显子8探针的特异性显著提高。
7.检测SMN1基因的13个突变位点，包括中国常见的7个致病突变位点，分别是c.22dupA、c.835-5T>G、c.400G>A、c.689C>T、c.463_464delAA、c.683T>A和c.863G>T；全球范围内常见的高频率突变位点3个，分别是11bp-dup、Y272C和4bp-delAGAG；以及c.280G>T、c.835G>C和c.*3+3A>T，判断SMA相关基因的突变类型，缺失、转换、插入突变等。
结果如图7所示：c.835-5T>G、c.400G>A、c.689C>T、c.683T>A、c.863G>T、c.280G>T、c.835G>C、c.*3+3A>T和Y272C为碱基置换突变，c.463_464delAA、4bp-delAGAG为缺失突变，c.22dupA和11bp-dup为重复突变。每个突变位点对应的上下游引物、探针及基因模板序列如表3所示。
实施例5临床样本验证
从中信湘雅生殖与遗传专科医院收集脊髓性肌萎缩症(SMA)患者、携带者和正常人的血液样品。该研究得到了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会批准。
使用QIAGEN公司的核酸提取或纯化试剂DSP DNA Blood Mini Kit从血液样品中提取基因组DNA，制备检测样品，其中DNA浓度调为约10ng/μl。
用如实施例1中表1公开的探针和引物，以及和实施例3中公开的反应体系和条件对其进行扩增和检测。
同时，对所述样品采用荷兰MRC公司的Probemix P060 SMA检测试剂盒和配套试剂盒/>Reagent kit进行检测。结果如下表5-表7所示。
表5SMA患者(31例)临床样本的检测结果及与MLPA检测结果比较
表6携带者(127例)样本的检测结果及与MLPA检测结果比较
表7正常人(60例)样本的检测结果及与MLPA检测结果比较
另外，采用如实施例1中表1公开的探针和引物，以及和实施例3中公开的反应体系和条件对3例点突变临床样本进行扩增和检测。
同时，对所述样品采用Sanger法进行测序。
结果如下表8所示。
表8点突变临床样本的检测结果及与Sanger测序结果比较
本申请的发明人发现并通过实验证明，在荧光PCR检测反应体系中，采用本发明的方法和试剂盒能够非常方便、高效和低成本地检测样品中的脊髓性肌萎缩症(SMA)相关基因和突变。本发明的优点还包括：
1.本发明的方法和试剂盒能够同时在同一PCR反应程序下可同时检测4个外显子的拷贝数及13个突变位点，判断SMA相关基因的突变类型，缺失、转换、插入突变等。通过检测SMA患者SMN2的拷贝数，可判断其临床严重程度，实现对SMA的分型。
2.本发明的方法和试剂盒检测的致病突变位点比现有商业产品全面，能覆盖中国和全球其它地区的最主要的高频率突变位点。
3.本发明提供的方法和试剂盒中采用的检测SMN1外显子7和8，以及SMN2外显子7和8和多个致病突变位点的特异性引物对和探针组合探针和引物的特异性高。
4.在对SMN外显子8探针(SEQ ID NO.7)第6和7个碱基(第7个碱基是SMN1与SMN2不同的碱基位点)进行了LNA(锁核酸)修饰后，进一步显著提高了探针的特异性。
5.由于SMN1与SMN2高度同源，在反应体系中加入了封闭探针，有效地避免了模板的互相干扰和出现非特异性扩增。实验证明，当SMN2(或SMN1)拷贝数为2时，能准确地对SMN1(或SMN2)拷贝数进行检测。当SMN2高拷贝(>2)时，加入封闭探针可显著减少对SMN1检测的干扰，进一步增加检测的准确性。
除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。

Claims (10)

1.用于检测脊髓性肌萎缩症(SMA)的试剂盒,其包括检测SMN1外显子7和8，以及SMN2外显子7和8的特异性引物对和探针组合。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中各特异性引物及探针序列如下:
SMN1外显子7：
上游引物SMN1E7F：核苷酸序列如SEQ ID NO:1，
下游引物SMN1E7R：核苷酸序列如SEQ ID NO:2，
探针SMN1E7P：核苷酸序列如SEQ ID NO:3；
SMN1外显子8：
上游引物SMN1E8F：核苷酸序列如SEQ ID NO:5，
下游引物SMN1E8R：核苷酸序列如SEQ ID NO:6，
探针SMN1E8P：核苷酸序列如SEQ ID NO:7；
SMN2外显子7：
上游引物SMN2E7F：核苷酸序列如SEQ ID NO:9，
下游引物SMN2E7R：核苷酸序列如SEQ ID NO:10，
探针SMN2E7P：核苷酸序列如SEQ ID NO:11；
SMN2外显子8：
上游引物SMN2E8F：核苷酸序列如SEQ ID NO:13，
下游引物SMN2E8R：核苷酸序列如SEQ ID NO:14，
探针SMN2E8P：核苷酸序列如SEQ ID NO:15。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中检测SMN1外显子7和8，以及SMN2外显子7和8的所述特异性引物对和探针组合中还分别包括封闭探针(Blocker)，
优选的，其中在检测SMN1外显子7和8，以及SMN2外显子7和8的四个所述特异性引物对和探针组合中，所述封闭探针分别为：
探针SMN2E7B：核苷酸序列如SEQ ID NO:12；
探针SMN2E8B：核苷酸序列如SEQ ID NO:16。
探针SMN1E7B：核苷酸序列如SEQ ID NO:4；
探针SMN1E8B：核苷酸序列如SEQ ID NO:8。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述引物或探针的寡核苷酸为核苷酸类似物(例如硫代磷酸酯,烷基硫代磷酸酯或肽核酸)或修饰的核苷酸(例如锁核酸修饰或小沟结合物修饰核苷酸)。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中检测SMN1外显子7和8以及SMN2外显子7和8的所述特异性引物对和探针组合中的探针或封闭探针具有核苷酸修饰，优选的，其在识别SMN1外显子7或8以及SMN2外显子7或8中SMN1与SMN2不同的碱基和/或其附近1-3个碱基上进行修饰(如锁核酸修饰)。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中还包括检测SMA相关突变位点的特异性引物对和探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中检测各突变位点的特异性引物及探针序列如下:
c.22dupA：
上游引物c.22dupA-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:20，
下游引物c.22dupA-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:21，
探针c.22dupA-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:22；
c.835-5T>G：
上游引物c.835-5T>G-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:23，
下游引物c.835-5T>G-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:24，
探针c.835-5T>G-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:25；
c.400G>A：
上游引物c.400G>A-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:26，
下游引物c.400G>A-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:27，
探针c.400G>A-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:28；
c.689C>T：
上游引物c.689C>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:29，
下游引物c.689C>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:30，
探针c.689C>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:31；
c.463_464delAA：
上游引物c.463_464delAA-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:32，
下游引物c.463_464delAA-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:33，
探针c.463_464delAA-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:34；
c.683T>A：
上游引物c.683T>A-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:35，
下游引物c.683T>A-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:36，
探针c.683T>A-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:37；
c.863G>T：
上游引物c.863G>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:38，
下游引物c.863G>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:39，
探针c.863G>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:40；
11bp-dup：
上游引物11bp-dup-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:41，
下游引物11bp-dup-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:42，
探针11bp-dup-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:43；
Y272C：
上游引物Y272C-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:44，
下游引物Y272C-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:45，
探针Y272C-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:46；
4bp-delAGAG：
上游引物4bp-delAGAG-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:47，
下游引物4bp-delAGAG-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:48，
探针4bp-delAGAG-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:49；
c.280G>T：
上游引物c.280G>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:50，
下游引物c.280G>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:51，
探针c.280G>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:52；
c.835G>C：
上游引物c.835G>C-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:53，
下游引物c.835G>C-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:54，
探针c.835G>C-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:55；
c.*3+3A>T：
上游引物c.*3+3A>T-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:56，
下游引物c.*3+3A>T-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:57，
探针c.*3+3A>T-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:58。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中用于检测的特异性引物对和探针组合分为五组，其中第一组为检测SMN1外显子7的特异性引物对和探针组合，第二组为检测SMN1外显子8的特异性引物对和探针组合，第三组为检测检测SMN2外显子7的特异性引物对和探针组合，第四组为检测检测SMN2外显子8的特异性引物对和探针组合，第五组为检测所述相关突变位点的特异性引物对和探针组合。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中在检测SMN1外显子7或8，以及在SMN2外显子7或8的所述第一至第四组中还分别包括检测内参基因的特异性引物对和探针组合，
优选的，其中所述内参基因为ALB、或编码β-肌动蛋白或β-球蛋白的基因，
例如，所述内参基因为ALB，以及检测ALB的特异性引物对和探针为：
上游引物ALB-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:17，
下游引物ALB-R：核苷酸序列如SEQ ID NO:18，
探针ALB-P：核苷酸序列如SEQ ID NO:19。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的试剂盒用于检测受试者的脊髓性肌萎缩症(SMA)的方法，其中包括采用所述特异性引物对和探针组合中的引物来扩增来自受试者样本的核苷酸片段；所述特异性引物对和探针组合中的探针可识别和结合模板(包括扩增产物)中对应所述探针序列的片段；通过检测探针与模板结合的情况，判断生物样品中是否存在SMA相关基因或突变，
优选的，所述探针为Taqman荧光探针，通过检测探针释放的荧光信号，判断所述受试者的受试者样本中是否存在所述探针可识别和结合的SMA相关基因或突变。
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