CN116622750A - 优化的人法布里转基因表达盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于治疗法布里病的优化的转基因表达盒、重组AAV载体以及药物。本公开还涉及优化的编码α‑半乳糖苷酶A的原始信号肽的多核苷酸。本发明的转基因表达盒、重组AAV载体和药物可以高效表达GLA蛋白，在法布里患者的受损器官中疗效更强，能更有效地缓解疾病表型，由此实现对法布里病的良好治疗效果。

Description

优化的人法布里转基因表达盒及其用途
技术领域
本公开属于基因工程技术领域。本公开涉及可用于治疗法布里病的优化的转基因表达盒、重组AAV载体以及药物。本公开还涉及优化的编码α-半乳糖苷酶A的原始信号肽的多核苷酸。
背景技术
法布里病(Fabry disease，FD，OMIM#301500)是一种罕见的伴X染色体连锁隐形遗传的溶酶体储积症(LSD)，也被称为安德森-法布里病(Anderson-Fabry disease)。由于法布里病临床表现多样且无特异性，导致早期诊断较为困难，很难获得准确的发病率。据国外报道，在普通人群中的患病率为1/40000-117000，新生儿法布里患病率高达1/1250。在我国，在对终末期肾衰竭透析患者的筛查中发现，法布里病的患病率为0.12％。根据残余酶活性和临床症状表现，法布里患者可被分为经典型或迟发型。法布里病的典型临床症状有胃肠道紊乱、血管角质瘤、角膜涡状浑浊、神经性疼痛及少汗或无汗。这些症状通常在儿童时期比较明显。随着年龄增大，病情逐渐加重，会出现蛋白尿、肾功能丧失、脑白质病变、心电图改变和左心室肥厚等症状。由于该疾病是X染色体连锁遗传模式，通常对男性患者的影响比女性更严重。在没有治疗干预情况下，经典法布里患者的男性预期寿命约为60岁，女性约为75岁，最常见的死亡原因是心源性猝死、肾衰竭和中风。
法布里病是由GLA基因突变所导致的。GLA基因位于X染色体Xq22.1区域，含7个外显子，基因编码序列的长度约为1290bp，转录翻译含429个氨基酸的α-半乳糖苷酶A(α-GalA酶，又名GLA蛋白，EC 3.2.1.22)(Simonetta I等，Genetics and Gene Therapy ofAnderson-Fabry Disease[J].Curr Gene Ther，2018，18(2)：96-106)，随后再加工成含370个氨基酸的糖蛋白，并作为同源二聚体存在于溶酶体中。目前在法布里病患者中已经发现了1000多种GLA基因突变(参见人类基因突变数据库，http://www.hgmd.cf.ac.uk)。其中最常见的几种类型包括错义突变(57％)、无义突变(11％)、片段缺失(6％)、片段插入(6％)、以及由于RNA加工缺陷所导致的剪接突变(6％)。这些突变会破坏GLA开放阅读框，导致转录翻译出的α-Gal A部分或完全失活。在正常情况下，α-Gal A能够水解体内多种糖结合物末端α-1,3和α-1,4键连接的半乳糖残基。因此α-Gal A酶活性的缺失或者完全缺乏将导致其代谢底物神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide，Gb3)及衍生物去乙酰化Gb3(globotriaosylsphingosine，Lyso-Gb3)等鞘糖脂类化合物无法被分解代谢，并在血管内皮上皮细胞、足细胞、心肌细胞、系膜细胞和肾小管细胞等细胞中累积，进而引起心脏、肾脏和脑血管等多脏器病变，最终导致患者死亡。
对于法布里病患者，临床上主要采用外源性注射重组半乳糖苷酶A的酶替代疗法(ERT)进行特异性治疗。目前国际上批准上市使用的两款ERT药物是注射用阿加糖酶α(Replagal,Shire)和注射用阿加糖酶β(Fabrazyme,Sanofi Genzyme)，其注射剂量分别为0.2毫克/千克体重和1.0毫克/千克体重。两款药物具有相同的基因来源，其结构和功能高度相似，具有与天然人类α-Gal A酶相同的氨基酸序列。酶替代疗法治疗法布里病已经有二十多年的历史，具有较好的安全性和有效性，长期治疗可以显著减少体内储积的Gb3及Lyso-Gb3等代谢底物，有效减轻患者神经性疼痛，减缓疾病进展及改善患者生活质量。但是，大多数患者仍会出现心脏、肾脏和大脑并发症。此外，患者需要终生每两周静脉输注治疗一次，其治疗负担较重。
因此，在过去的十多年里，研究人员不断探索出了几种新的治疗策略，如第二代酶替代疗法、分子伴侣疗法、底物减少治疗(SRT)、基于mRNA及干细胞疗法以及AAV介导的基因替代疗法等(Van Der Veen S J等，Developments in the treatment of Fabry disease[J].J Inherit Metab Dis，2020，43(5)：908-921)，这些方法有望为治愈法布里病提供新的替代方案。其中，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体介导的基因疗法被认为是最有前景的治疗方法之一。AAV能够在多种器官组织中长期高效率表达目的基因产物，而且具有低免疫原性和相对较高的安全性。这些特性使AAV在基因治疗载体选择中具有明显的优势。
目前针对法布里病的AAV基因替代疗法已经有多项进入I/II期临床人体试验阶段，其中包括Freeline Therapeutics的FLT190项目(NCT04040049)、SangamoTherapeutics的ST-920项目(NCT04046224)以及4D Molecular Therapeutics的4D-310项目(NCT04519749)。FLT190载体包含AAVS3衣壳和由FRE1启动子驱动的GLA转基因表达盒。ST-920载体包含AAV2/6衣壳和由肝脏特异性启动子及WPRE增强子驱动的GLA转基因表达盒。4D-310载体包含4D-C102衣壳和由CAG启动子驱动的GLA转基因表达盒。这些项目展示了AAV介导的基因疗法在治疗法布里病方面的巨大潜力。对于法布里病的治疗，仍需开发出更高效的AAV基因替代疗法和药物，以实现更好的治疗效果。
发明内容
鉴于本领域中存在的上述情况和需求，本发明人设计并构建了多种新的转基因表达盒，其可以高效表达GLA蛋白，优选同时具有器官/组织(特别是肝脏)特异性。本发明人进一步用具有器官/组织(特别是肝脏)特异性的AAV病毒衣壳对转基因表达盒进行包装，由此构建了可用于预防或治疗法布里病的重组AAV载体。
在第一方面，本公开提供一种转基因表达盒，其包括：启动子、信号肽的编码序列、编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸、PolyA；所述编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸选自SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：3。
在一些实施方式中，启动子选自：CB启动子、Lxp2.1启动子、Lxp2.3启动子、CAG启动子、EF1启动子、泛素启动子、T7启动子、SV40启动子、VP16、VP64启动子、Tuj1启动子、GFAP启动子、波形蛋白启动子、RPE65启动子、VMD2启动子、突触蛋白启动子、VGAT启动子、DAT启动子、TH启动子、骨钙蛋白启动子、CMV启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、TRE启动子、UAS启动子、Ac5启动子、CaMKIIa启动子、GDS启动子和ADH1启动子。在一个优选实施方式中，启动子选自CB启动子和Lxp2.1启动子。在一个更优选实施方式中，启动子为CB启动子。
在一些实施方式中，信号肽选自α-半乳糖苷酶A的原始信号肽、BM40信号肽、FIB信号肽、白蛋白信号肽、CD40原始信号肽、YfkN信号肽、Bpr信号肽、Mpr信号肽、PhoB信号肽、WapA信号肽、AbnA信号肽、α因子信号肽、酸性磷酸酶(PHO5)信号肽、蔗糖酶(SUC2信号肽)、蚕丝蛋白LC信号肽、人胰岛素信号肽、流感血凝素信号肽、Gaussia luc信号肽、人IL-2信号肽、人胰蛋白酶原-2信号肽、人IgG2 H信号肽、小鼠Igκ信号肽、VSV-G信号肽和人OSM信号肽。在一个优选实施方式中，信号肽选自BM40信号肽和FIB信号肽。在一个更优选实施方式中，信号肽为BM40信号肽。
在一些实施方式中，信号肽为α-半乳糖苷酶A的原始信号肽，所述信号肽的编码序列选自如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：22所示的序列。
在一些实施方式中，转基因表达盒的核苷酸序列选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
在第二方面，本公开提供一种编码α-半乳糖苷酶A的原始信号肽的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。
在第三方面，本公开提供一种重组AAV载体，其包含：根据第一方面所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。
在一些实施方式中，AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白。在一个优选实施方式中，AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
在第四方面，本公开提供根据第三方面所述的重组AAV载体在制备用于预防或治疗法布里病的药物中的应用。
在第五方面，本公开提供一种药物，其包含：根据第三方面所述的重组AAV载体和可选的赋形剂。
在一些实施方式中，药物为注射剂。
在一些实施方式中，药物的单位剂量为5E12vg/kg以上。在一个优选实施方式中，药物的单位剂量为5E12vg/kg至5E13vg/kg。
在第六方面，本公开提供一种治疗法布里病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第五方面所述的药物。
在一些实施方式中，药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。在一个优选实施方式中，药物通过全身途径施用，例如静脉内施用。
在一些实施方式中，受试者是非人动物。在一些实施方式中，受试者是小鼠。在一些实施方式中，药物以5E12vg/kg以上的剂量施用。在一个优选实施方式中，药物以5E12vg/kg至5E13vg/kg的剂量施用。
在第七方面，本公开提供一种将编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸递送至靶细胞中的方法，包括：1)将根据第一方面所述的转基因表达盒包装于AAV衣壳蛋白中，形成根据第三方面所述的重组AAV载体；以及2)使所述靶细胞与所述重组AAV载体接触。
在一些实施方案中，靶细胞是离体细胞。在一些实施方案中，靶细胞是体内细胞。
附图说明
图1是B109表达盒的结构示意图。
图2A显示了用B109载体治疗后法布里疾病模型小鼠肝脏中的GLA表达水平(Western blot检测)。
图2B至图2C显示了用B109载体治疗后法布里疾病模型小鼠肝脏、肾脏中的GLA相对表达水平(RT-qPCR检测)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2D至图2E显示了用B109载体治疗后法布里疾病模型小鼠组织中的α-GalA酶活水平。
图3是B101、B109、B110、B111、B112和B188表达盒的结构示意图。
图4显示了图3所示的表达盒在Huh7细胞裂解液和Huh7上清液中的GLA表达水平(Western blot检测)。
图5是B190、B187、B191、B192和B193表达盒的结构示意图。
图6显示了图5所示的表达盒在Huh7细胞裂解液和Huh7上清液中的GLA表达水平(Western blot检测)。
图7显示了B109、B187和B188表达盒在Huh7细胞裂解液和Huh7上清液中的GLA表达水平(Western blot检测)。
图8显示了B109、B187和B188表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，30周内小鼠血浆中α-Gal A酶的活性变化。
图9显示了B109、B187和B188表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，第30周小鼠肝脏、肾脏、心脏和脾脏中的α-Gal A蛋白表达水平。*p<0.05，**p<0.01。
图10显示了B109、B187和B188表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，第30周小鼠肝脏、肾脏、心脏和脾脏中的α-Gal A酶活性水平。各病毒载体组与Fabry组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。各病毒载体组与WT组比较，#p<0.05，##p<0.01。
图11显示了B109、B187和B188表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，第30周小鼠肾脏的病理学变化。
图12是B229和B251表达盒的结构示意图。
图13显示了B109、B187、B188、B229和B251表达盒在Huh7细胞裂解液和Huh7上清液中的GLA表达水平(Western blot检测)。
图14显示了B229和B251表达盒在Huh7细胞裂解液和Huh7上清液中的α-Gal A酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图15显示了B188和B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，30周内小鼠血浆中α-Gal A酶的活性变化。
图16显示了B188和B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，第30周小鼠肝脏、肾脏、心脏和脾脏中的α-Gal A酶活性水平。各病毒载体组与Fabry组比较，*p<0.05，***p<0.001。各病毒载体组与WT组比较，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。
图17显示了B188和B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，第30周小鼠肾脏的病理学变化。
图18显示了B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，不同剂量注射后4周内小鼠血浆中α-Gal A酶的活性变化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图19显示了B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，不同剂量注射后第4周小鼠肝脏、肾脏、心脏和大脑中的AAV分布水平。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图20显示了B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，不同剂量注射后第4周小鼠肝脏、肾脏、心脏和大脑中α-Gal A酶的活性变化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图21显示了B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，不同剂量注射后小鼠血液中Lyso-Gb3含量变化。*p<0.05，**p<0.01。
图22显示了B229表达盒包装到AAV病毒(T02衣壳)中并向小鼠注射后，不同剂量注射后小鼠行为的改善情况。*p<0.05。
图23显示了密码子优化的α-半乳糖苷酶A的原始信号肽编码核酸序列(SP优化1)(SEQ ID NO：4)
图24显示了密码子优化的α-半乳糖苷酶A的原始信号肽编码核酸序列(SP优化2)(SEQ ID NO：5)
图25显示了B190表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。
图26显示了B187表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。
图27显示了B191表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。
图28显示了B192表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。
图29显示了B193表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。在本文中的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明。
除非另有说明，否则本文列出的核酸或多核苷酸序列是单链形式，方向是从5'至3'，从左至右。本文提供的核苷酸和氨基酸采用IUPACIUB生化命名委员会建议的格式，对于氨基酸采用单字母代码或三字母代码。
术语
在本文中，术语“多核苷酸”是“核酸”的同义词，指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们的混合序列或类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化或限制的核苷酸和核苷酸类似物。
在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。
在本文中，术语“密码子优化”是指从其天然形式修饰的多核苷酸序列。这样的修饰导致一个或多个碱基对的差异，其相应的氨基酸序列中有或没有改变，可能增强或抑制基因的表达和/或对修饰的多核苷酸序列的细胞应答。
在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物(例如，啮齿动物或其他哺乳动物)。
在一些实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。
在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。
在本文中，术语“治疗有效量”或“有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗眼部疾病的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与该眼部疾病相关的一种或多种症状的量。
在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。
在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。
在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。
在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指将外源核酸递送到宿主细胞中，然后多核苷酸产物的转录和翻译的过程，该过程包括使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。
在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。
在本文中，术语“靶向”是指载体优先进入一些细胞或组织，然后进一步在细胞中表达病毒基因组或重组转基因携带的序列。
在本文中，术语“载体”指封装多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送至靶细胞。载体的种类包括但不限于质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。
在本文中，术语“表达盒”、“转基因盒”和“转基因表达盒”可互换地使用，指编码特定蛋白质、多肽或RNAi元件的多核苷酸片段，其可以克隆到质粒载体中，也可以包装到病毒颗粒(如AAV)中以将转基因产物递送到靶细胞中。
在本文中，术语“可选”或“可选的”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
在本文中，术语“人工重组的病毒基因组”或“重组基因组”是指替代ITR之间天然AAV基因组的人为设计或人工合成的外源DNA序列。包含人工重组的病毒基因组的AAV称为“重组AAV”。其中，重组AAV可基于其中所包含的重组基因组的表达实现不同的功能。
在本文中，术语“赋形剂”是指药物中附着于有效成分的天然或合成物质，例如溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些赋形剂可以帮助病毒颗粒的储存和对受试者的给药。赋形剂可以包括任何合适的组分，例如但不限于盐水。盐水的说明性例子包括但不限于缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液和聚山梨醇酯溶液。
在本文中，术语“反向末端重复(ITR)”包括形成发夹结构并用作顺式元件以介导病毒复制、包装和整合的任何AAV病毒末端重复或合成序列。本文的ITR包括但不限于来自1-11型AAV(禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV)的末端重复序列。此外，AAV末端重复序列不必具有天然末端重复序列，只要该末端重复序列可用于病毒复制、包装和整合即可。
编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸
本发明人对编码α-半乳糖苷酶A的核酸序列进行了优化，由此获得了高效表达α-半乳糖苷酶A的基因片段。
本公开的编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
此外，本发明人还通过在编码α-半乳糖苷酶A蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：1)中插入内含子(rGlobin)形成SEQ ID NO：3所示的序列。
编码α-半乳糖苷酶A的原始信号肽的多核苷酸
本发明人还对编码α-半乳糖苷酶A的原始信号肽的核酸序列(SEQ ID NO：22)进行了优化。本公开的编码α-半乳糖苷酶A的原始信号肽的多核苷酸的核苷酸序列与SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。
转基因表达盒
本公开的转基因表达盒包括：启动子、信号肽的编码序列、编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸、PolyA。
在一些实施方式中，信号肽的编码序列位于编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸的N末端。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、α-半乳糖苷酶A信号肽的原始编码序列、α-半乳糖苷酶A的原始编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQID NO：6所示，命名为B101。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、如SEQ ID NO：4所示的优化的信号肽编码序列、如SEQ ID NO：1所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，命名为B109。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、如SEQ ID NO：5所示的优化的信号肽编码序列、如SEQ ID NO：2所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，命名为B110。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、α-半乳糖苷酶A信号肽的原始编码序列、如SEQ ID NO：1所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，命名为B111。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、α-半乳糖苷酶A信号肽的原始编码序列、如SEQ ID NO：2所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，命名为B112。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、如SEQ ID NO：4所示的优化的信号肽编码序列、如SEQ ID NO：3所示的序列(通过在SEQ ID NO：1中插入内含子(rGlobin)而形成)以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，命名为B188。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括Lxp2.1启动子、α-半乳糖苷酶A信号肽的原始编码序列、α-半乳糖苷酶A的原始编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，命名为B190。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括Lxp2.1启动子、如SEQ ID NO：4所示的优化的信号肽编码序列、如SEQ ID NO：1所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，命名为B187。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括Lxp2.1启动子、如SEQ ID NO：5所示的优化的信号肽编码序列、如SEQ ID NO：2所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，命名为B191。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括Lxp2.1启动子、α-半乳糖苷酶A信号肽的原始编码序列、如SEQ ID NO：1所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，命名为B192。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、α-半乳糖苷酶A信号肽的原始编码序列、如SEQ ID NO：2所示的优化的α-半乳糖苷酶A编码序列以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，命名为B193。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、BM40信号肽(编码序列)、如SEQID NO：3所示的序列(通过在SEQ ID NO：1中插入内含子(rGlobin)而形成)以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，命名为B229。
在一个实施方式中，转基因表达盒包括CB启动子、FIB信号肽(编码序列)、如SEQID NO：3所示的序列(通过在SEQ ID NO：1中插入内含子(rGlobin)而形成)以及PolyA；所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示，命名为B251。
在一些实施方式中，转基因表达盒还包含其他调控元件以使转基因包装到病毒中，例如两侧的反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方式中，两侧的两个ITR各自独立地为正常ITR或缩短的ITR，例如长度约145bp的正常ITR或长度约100bp的缩短ITR。
在一些实施方式中，转基因表达盒还包含用于控制蛋白质产物表达的多核苷酸元件，例如增强子、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、2A信号(例如P2A、T2A、F2A)。
在一些实施方式中，转基因表达盒编码的蛋白质产物连接寡肽标签(例如，Flag、6×His、2×HA、Myc)，其有助于蛋白质产物的纯化。本领域技术人员理解与蛋白质纯化有关的技术和程序。
重组AAV载体
在一个具体实施方式中，使用包含5’ITR、重组基因组和3’ITR的DNA质粒来生产AAV病毒载体，其中5’ITR和3’ITR分别位于重组基因组的两侧。可以通过使用已知的技术，例如通过转染，将DNA质粒、编码AAV cap/rep基因的质粒和由腺病毒或疱疹病毒提供的辅助质粒同时引入合适的宿主细胞，由此生产AAV病毒载体。DNA质粒可以在宿主细胞中表达，并被包装成病毒颗粒。
在一些实施方式中，AAV衣壳蛋白可以为任何AAV血清型衣壳蛋白，包括天然AAV衣壳蛋白(例如，天然的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)和其他人工改造的AAV衣壳蛋白(例如，人工改造的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)。
不同AAV血清型的基因组序列、ITR序列、Rep和Cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如GenBank数据库、UniProt蛋白质数据库。
药物
药物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药物的药代动力学参数例如药物组织分布、生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
在一些实施方式中，药物的剂型可以为注射剂、片剂、胶囊剂或散剂。
在一些实施方式中，药物可以以单剂量或多剂量递送。
在一些实施方案中，可以使用多于一次给药(例如两次、三次、四次或更多次给药)以在各个间隔的时间段内(例如每天、每周、每月、每年等)实现期望水平的蛋白表达。
在一些实施方案中，药物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如在密封的安瓿瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即加入无菌液体，例如盐水或注射用水。
在一些实施方式中，药物的有效量/单位剂量为5E12vg/kg以上，例如5E12vg/kg至1E15vg/kg。在一个优选实施方式中，药物的有效量/单位剂量为5E12vg/kg至5E13vg/kg，例如1E13vg/kg。
下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中所用细胞、试剂等均可通过商业渠道获得。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例
在本公开的实施例中，所有数据均以均值±标准差(SD)表示。采用GraphPadPrism软件进行统计分析并作图。用t检验计算。
实施例1：B109载体的构建以及在模型小鼠体内的GLA蛋白表达
首先，对原始人源GLA基因和信号肽编码序列进行密码子优化，得到经优化的GLA和信号肽编码序列(分别命名为opti-GLA1(SEQ ID NO：1)和opti-SP1(SEQ ID NO：4))，选择合适的酶切位点，构建到实验室现有保存的载体骨架pAAV2.1-CB-MCS中，从而得到B109载体，结构如图1所示。
接着，将构建完成的B109载体通过三质粒共转染的方法包装到AAV病毒(T02衣壳)中。为了验证B109载体在法布里模型小鼠体内的表达，通过尾静脉注射的方式分别向3月龄法布里雄性小鼠体内注射剂量为5E12vg/kg(低剂量组)和1E13 vg/kg(高剂量组)的病毒(剂量单位：病毒基因组数/千克体重)。注射后4周和12周处死小鼠，收集小鼠各组织器官进行分析检测。
对各组小鼠的肝脏进行Western blot分析。结果显示，成功在模型小鼠肝脏中检测到人源GLA的表达(图2A)，且在治疗12周后的Western blot检测中发现GLA仍持续表达。
观察了B109载体注射进入小鼠体内后，在不同组织中GLA的分布情况mRNA表达水平，结果如图2B和图2C所示。在注射后第4周，与未治疗组(Fabry)相比，低剂量组和高剂量组在小鼠肝脏中的GLA表达均显著提高(分别提高了339倍和1762倍)，两个剂量组在小鼠肾脏中的GLA表达也有一定程度的提高(提高了约3-4倍)。在治疗12周后，观察到GLA仍持续表达且表达水平明显高于未治疗组(Fabry)，高、低两个剂量组在小鼠肝脏中的GLA表达分别高于未治疗组(Fabry)1600倍和3200倍，在肾脏中分别高出2倍和5倍，说明GLA在体内长时间持续高效表达。图2D和2E显示，与其他组相比，高剂量组在小鼠肝脏和脾脏中的α-Gal A酶活性显著更高。
综上，B109载体可有效提高法布里模型小鼠的GLA蛋白表达及α-Gal A的酶活水平，在模型小鼠体内的表达得到初步验证。
实施例2：B101、B110、B111、B112和B188载体的构建以及在细胞中的GLA蛋白表达
在经初步验证的B109载体基础上，本发明人对GLA表达盒进行了进一步设计和优化。首先，对原始人源GLA基因和信号肽编码序列再次进行密码子优化，得到经优化的GLA和信号肽编码序列(分别命名为opti-GLA2(SEQ ID NO：2)和opti-SP2(SEQ ID NO：5))。接着，分别采用GLA蛋白的原始信号肽的编码序列(orig-SP，SEQ ID NO：22)、opti-SP1和opti-SP2，构建基于GLA原始序列(orig-GLA)、opti-GLA1序列和opti-GLA2序列的载体B101、B110、B111、B112和B188(插入了1个嵌合内含子(rGlobin))。各载体结构如图3所示。
然后，在细胞水平验证上述各载体的表达。使用PEI转染试剂将质粒转染至Huh7细胞，在转染48h之后收取细胞上清液和细胞，进行Western blot分析。结果如图4所示，GLA条带大小为49kDa，GAPDH为内参(条带大小为36kDa)。可以看出，在Huh7上清液中，B109、B112和B188载体分泌出来的GLA蛋白含量相对更高；在Huh7细胞裂解液中，B188载体的蛋白表达量最高。综合而言，在上述载体中，B188载体具有明显优势。
实施例3：B190、B187、B191、B192和B193载体的构建以及在细胞中的GLA蛋白表达
在本实施例中，本发明人分别在B101、B109、B110、B111和B112的基础上继续进行优化设计，用肝脏特异性启动子Lxp2.1替代CB启动子，得到5个新的优化载体：B190、B187、B191、B192和B193。各载体的结构如图5所示。
然后，在细胞水平验证上述各载体的表达。使用PEI转染试剂将质粒转染至Huh7细胞，在转染48h之后收取细胞上清液和细胞，进行Western blot分析。结果如图6所示，在Huh7上清液中，B187和B191载体分泌出来的GLA蛋白含量相对更高；在Huh7细胞裂解液中，B187载体的蛋白表达量最高。综合而言，在上述载体中，B187载体具有明显优势。
实施例4：比较B188、B187和B109载体在细胞中的GLA蛋白表达
在本实施例中，选择B188载体和B187载体进行实验。首先，将B188载体、B187载体与B109载体在细胞水平进行比较。将3个质粒载体同时转染Huh7细胞，转染48h之后收取细胞上清液和细胞，进行Western blot分析。结果如图7所示，在Huh7上清液中，经过优化改造的B187和B188载体分泌出来的GLA蛋白含量高于B109载体；在Huh7细胞裂解液中，B187和B188载体的蛋白表达量更远高于B109载体。上述结果表明，B188和B187载体都明显优于B109载体。
实施例5：B109、B187和B188载体(T02衣壳)对法布里病的治疗作用
为了在法布里模型小鼠体内进一步对比载体的治疗效果，并验证能否长期表达GLA蛋白，本发明人将B109、B187和B188载体通过三质粒共转染的方法包装到AAV病毒(T02衣壳)中，通过尾静脉注射的方式分别向3月龄法布里雄性小鼠体内注射相同剂量(1E13vg/kg)的病毒，长期监测，并于注射30周后处死，收集小鼠各组织器官进行分析检测。
在注射后不同时间点收集小鼠血浆，进行α-Gal A酶活性检测，结果如图8所示。在注射后1周，模型小鼠血浆中的α-Gal A酶活性迅速表现出显著升高，B109T02、B187T02和B188T02组的酶活性水平均远高于WT组，表明三个载体组均可以在小鼠体内长期稳定表达。在注射后30周内，三个载体组的血浆中α-Gal A酶活性均未出现明显下降，其中B188T02载体组的小鼠血浆中酶活性最高(约1.5×105nmol/hr/ml)，其次是B187T02载体组(约1.5×104nmol/hr/ml)，B109T02载体组的酶活性最低(约185nmol/hr/ml)。B188和B187载体在体内的血浆酶活性分别为B109载体的约800倍和约80倍。综上，在上述载体中，B188载体的酶活性最佳。
对各载体组小鼠的肝脏、肾脏、心脏和脾脏进行Western blot分析，成功在注射后30周的模型小鼠多个组织中检测到人源GLA的表达(图9)。在相同的曝光条件下，B188T02和B187T02载体在各组织中的GLA蛋白表达水平远高于B109T02载体。结果显示(图9，部分)，B188T02和B187T02组的肝脏组织样品在49kDa处均有条带，表明在治疗30周后仍持续表达GLA，并且B188T02组GLA的表达水平明显高于B187T02组。在法布里病主要受累的靶器官肾脏和心脏中，也检测到了GLA蛋白的表达，其中B188T02组的GLA蛋白水平明显高于B187T02组。脾脏中的Western blot结果与上述组织一致。本实验使用的抗α-Gal A抗体特异性识别人源α-Gal A蛋白，理论上野生型小鼠和未治疗的模型小鼠都观察不到相应大小的条带，因此本实验不另外设置野生型对照组。同一组小鼠GLA条带深浅不一致可能是由小鼠之间存在个体差异造成的。
上述结果表明，B188和B187载体均可以高效感染法布里疾病模型小鼠肝脏、肾脏等重要组织，使得人源GLA能够在各组织中高表达且持续较长时间，其中B188载体在不同组织的蛋白表达水平最高。
在用B109T02、B187T02和B188T02治疗法布里模型小鼠的第30周，取小鼠各组织检测α-Gal A酶活性。图10显示，在肝脏中，三个载体治疗组α-Gal A酶活性都得到显著升高，均高于野生型水平，其中B109T02组酶活性达到野生型水平的1.3倍，B187T02组酶活性达到野生型水平的94.9倍，B188T02组酶活性达到野生型水平的351.8倍。在肾脏中，三个载体治疗组α-Gal A酶活性得到不同程度的恢复，其中B187T02组酶活性达到野生型水平的4.0倍，B188T02组酶活性达到野生型水平的21.2倍。在心脏中，三个载体治疗组α-Gal A酶活性得到不同程度的恢复，其中B187T02组酶活性达到野生型水平的5.7倍，B188T02组酶活性达到野生型水平的84.5倍。在脾脏中，三个载体治疗组α-Gal A酶活性均呈现出明显的上升趋势，其中B109T02组酶活达到野生型水平的1.3倍，B187T02组酶活性达到野生型水平的104倍，B188T02组酶活性达到野生型水平的203.8倍。
上述结果表明，在T02衣壳中，B188和B187载体治疗的小鼠组织中α-Gal A酶活性远高于B109载体，B188相较于B187载体组对α-Gal A酶活性水平提高的效果更为显著。
在治疗后第30周，观察法布里疾病影响严重的器官肾脏的病理表型变化情况(HE染色和PAS染色)。图11上图为小鼠肾脏的HE染色结果，未治疗组(Fabry)小鼠的肾小球有明显的空泡样变性、鲍曼氏囊增生和肾小管变性(如箭头所示)；B109T02组肾脏病理学表现为中度的肾小管变性、蛋白管型和鲍曼氏囊增生，个别动物出现肾小球萎缩；B188T02和B187T02组肾脏病理学表现为轻度的肾小管变性、轻度蛋白管型和轻度的鲍曼氏囊增生。从肾脏病理学变化的情况来看，经各载体组治疗后，法布里模型小鼠肾小管萎缩和空泡样变性等肾脏病变的情况均有所减少。图11下图为小鼠肾脏的PAS染色结果，各组的肾小球系膜区域系膜细胞有不同程度节段性增生，其中未治疗组(Fabry)小鼠表现出中度至重度的系膜细胞增生，B109T02组表现出轻度至中度的系膜细胞增生，而B188T02和B187T02组均呈现轻度的系膜细胞增生。
综合肾脏病理学表现来看，B188和B187载体可以长期有效纠正肾脏病变，表现出更佳的治疗效果。
实施例6：B229和B251载体的构建以及在细胞中的GLA蛋白表达
在B188载体的基础上，本发明人对GLA表达盒进行了分泌肽的优化和筛选。将B188载体中的opti-SP1分别替换为工程化的分泌肽BM40和FIB，从而得到B229和B251载体(载体结构如图12所示)。
然后，在细胞水平验证载体的表达。使用PEI转染试剂将B109、B188、B187、B229和B251质粒转染至Huh7细胞，在转染48h之后收取细胞上清液和细胞，进行Western blot分析。结果如图13所示，在Huh7上清液中，B229和B251载体分泌出来的GLA蛋白含量相对更高；在Huh7细胞裂解液中，B229和B251载体的蛋白表达量远高于其他载体组，其中B229载体的表达水平更高。综合而言，在上述载体中，B229和B251载体具有明显优势。
接下来，在细胞水平进一步对比B229和B251载体。使用PEI转染试剂将B229和B251质粒转染至Huh7细胞，同时设置未转染的空白对照。在转染48h之后收取细胞上清液和细胞，分别检测α-Gal A酶活性。结果如图14所示，在Huh7上清液中，B229载体分泌出来的α-Gal A酶活性水平明显高于B251载体；在Huh7细胞裂解液中，B229载体表达的α-Gal A酶活性也显著高于B251载体；且B229载体的分泌效率同样显著高于B251载体。综上所述，与B251载体相比，B229载体更具优势。
实施例7：B229载体(T02衣壳)对法布里病的治疗作用
通过对比B229与B188载体在法布里模型小鼠体内的治疗效果，研究B229载体在体内的长期表达情况以及治疗效果。将B229与B188载体通过三质粒共转染的方法包装到AAV病毒(T02衣壳)中，通过尾静脉注射的方式分别向3月龄法布里雄性小鼠体内注射相同剂量(1E13 vg/kg)的病毒，长期监测，并于注射30周后处死，收集小鼠各组织器官进行分析检测。
血浆中α-Gal A酶活性的检测结果如图15所示。在注射后第1至3周，各治疗组的模型小鼠血浆中的α-Gal A酶活性水平达到峰值，随后略有下降但仍持续稳定在较高水平。B188T02和B229T02治疗组的酶活性水平均远高于WT组，表明2个载体组均可以在小鼠体内长期稳定表达。其中，B229T02载体组的血浆酶活性最高，解剖终点时约为3.2×105nmol/hr/ml，B188T02载体组的血浆酶活性约为1.5×105nmol/hr/ml。相比之下，B229载体在体内活性更佳。
在B188T02和B229T02治疗法布里模型小鼠的第30周，取小鼠各组织检测α-Gal A酶活性。结果如图16所示，在多个组织中，两个载体治疗组的α-Gal A酶活性均显著升高，高于野生型。在肝脏中，B188T02组的酶活性达到野生型的350.8倍，B229T02组的酶活性达到野生型的452.4倍。在肾脏中，B188T02组的酶活性达到野生型的21.2倍，B229T02组的酶活性达到野生型的47.5倍。在心脏中，B188T02组的酶活性达到野生型的84.5倍，B229T02组的酶活性达到野生型的803.7倍。在脾脏中，B188T02组的酶活性达到野生型的203.8倍，B229T02组的酶活性达到野生型的686.8倍。综上，在不同的组织中，B229载体的表达均优于B188载体。
在治疗后第30周，观察法布里疾病影响严重的器官肾脏的病理表型变化情况(HE染色和PAS染色)。图17上图为小鼠肾脏的HE染色结果，未治疗组(Fabry)小鼠的肾小球有明显的空泡样变性、鲍曼氏囊增生和肾小管变性(如箭头所示)，B188T02和B229T02组的肾脏病理学均表现为轻度的肾小管变性、轻度蛋白管型和轻度的鲍曼氏囊增生。图17下图为小鼠肾脏的PAS染色结果，模型小鼠表现出中度至重度的系膜细胞增生，而B188组和B229组均表现为轻度系膜细胞增生。
综合肾脏病理学表现来看，B188和B229载体均可以长期有效纠正肾脏病变，改善模型小鼠的疾病表型，两者之间无明显差异。
实施例8：B229载体在法布里模型小鼠体内呈现剂量依赖性表达
在本实施例中，选择B229载体，进行剂量研究实验。设置5个不同的治疗剂量组，从低到高依次为：1E12vg/kg、5E12vg/kg、1E13vg/kg、5E13vg/kg，同时设置模型对照组和野生型对照组。治疗后4周，对全部小鼠安乐死，收集小鼠血样及组织样本，进行后续的检测和分析。
血浆酶活性水平如图18右图所示，治疗后5E13vg/kg组的血浆平均酶活性约为WT组的2×105倍，1E13vg/kg组的血浆平均酶活性约为WT组的3×104倍，5E12vg/kg组的血浆平均酶活性约为WT组的5×103倍，1E12vg/kg组的血浆平均酶活性约为WT组的50倍，表明存在明显的剂量依赖性。对所有组的血浆酶活性数值取LOG后结果如图18左图所示，可以看出B229载体在体内的表达存在明显的剂量依赖性。
法布里小鼠主要靶器官肝脏、心脏、肾脏和大脑中AAV组织分布的结果如图19所示。B229载体在模型小鼠不同组织中的分布具有明显的剂量依赖性，其中在肝脏中分布水平最高，其次是心脏，在肾脏中分布水平较低，另外由于血脑屏障的存在，AAV在大脑中几乎无分布。
当给药剂量为1E12vg/kg时，在肝脏、肾脏和心脏中仅能检测到较低的AAV水平，在大脑中检测不到分布，表明该剂量下AAV无法有效感染模型小鼠的各组织并表达有活性的α-Gal A蛋白。当给药剂量在5E12vg/kg-1E13vg/kg之间时，AAV在肝脏、肾脏和心脏中的分布显著提高，在大脑中仍检测不到AAV的分布。当给药剂量为5E13vg/kg时，可在肝脏、肾脏和心脏中检测到非常高的AAV水平，并在大脑中也检测到了AAV的分布。
整体而言，剂量依赖性的研究表明，B229载体在模型小鼠体内的感染和分布具有明显的剂量依赖性，5E12vg/kg是起始有效感染剂量，在该剂量下可以在外周组织肝脏、肾脏和心脏中检测到高水平的AAV分布，当给药剂量继续提高时，AAV在各组织的分布也有不同水平的增加。
法布里小鼠主要靶器官肝脏、心脏、肾脏和大脑中的α-Gal A酶活性结果如图20所示。在肝脏中，所有治疗组的α-Gal A酶活性均恢复至高于正常野生型(WT)，从低到高依次恢复至WT水平的3.7、199.4、437.2和1206.4倍。在肾脏中，1E12vg/kg治疗组的α-Gal A酶活性相比未治疗组(Fabry)有所提高，但仍低于正常水平。当给药剂量≥5E12vg/kg时，α-GalA酶活性均有效恢复至超生理水平，5E12vg/kg、1E13vg/kg和5E13vg/kg治疗组的α-Gal A酶活性分别恢复至WT水平的43.5、109.8和797.7倍。在心脏中，当给药剂量为1E12vg/kg时，α-Gal A酶活性仅恢复至正常水平的29.4％。当剂量提高至5E12vg/kg时，α-Gal A酶活性就得到了迅速显著的提升，达到WT水平的46.6倍，恢复至超生理水平；给药剂量为1E13vg/kg时，α-Gal A酶活性达到WT水平的240.4倍；当剂量继续提高至5E13vg/kg时，α-Gal A酶活性达到了WT水平的439.5倍。在脑中，由于血脑屏障的存在，5E12vg/kg治疗组的α-Gal A酶活性恢复至略高于Fabry组水平，但远低于WT水平。当治疗剂量≥1E13vg/kg时，α-Gal A酶活性恢复至超生理水平，1E13vg/kg和5E13vg/kg治疗组α-Gal A酶活性分别恢复至WT水平的5.8和82.6倍。
整体而言，剂量依赖性研究表明，B229载体在模型小鼠体内表达具有明显的剂量依赖性，5E12vg/kg是起始有效治疗剂量，能在肝脏中高效表达α-Gal A，同时将重要靶器官肾脏和心脏的α-Gal A酶活性提升至WT水平的45倍左右，也能在一定程度上提高大脑中的α-Gal A酶活性。在5E12vg/kg的基础上，当给药剂量继续提高时，各组织中的α-Gal A酶活性仍有不同程度的提高。
结合组织分布的数据分析，从起始有效剂量5E12vg/kg起，肾脏、心脏和大脑中约有<30％的酶来源于自身细胞的表达，而>70％的酶均从外周血液循环中摄取而来。
对模型小鼠血液中的有毒代谢底物Lyso-Gb3含量进行检测，结果如图21所示，Fabry模型小鼠血液中Lyso-Gb3含量高达248.03ng/mL，WT小鼠血液中Lyso-Gb3含量约为未治疗模型小鼠的0.40％。不同剂量的B229载体治疗后，Lyso-Gb3含量有不同程度的下降，其中1E12vg/kg组模型小鼠血液中Lyso-Gb3含量降低至未治疗模型小鼠的31.56％；5E12vg/kg和1E13vg/kg组模型小鼠血液中Lyso-Gb3含量分别降低至未治疗模型小鼠的1.51％和1.39％；5E13vg/kg组模型小鼠血液中Lyso-Gb3含量降低至未治疗模型小鼠的0.80％。以上数据表明，当剂量≥5E12vg/kg时，B229载体具有显著的治疗效果，能有效降低有毒底物Lyso-Gb3的累积，而当剂量再提升10倍时，进一步降低底物的效果不显著。
实施例9：B229载体对法布里模型小鼠行为学的改善效果
研究表明，GLA KO小鼠与WT相比存在热超敏反应。为了探究B229载体对模型小鼠行为学的改善，我们对所有小鼠进行热敏实验，小鼠被放置在玻璃板上的丙烯酸玻璃盒中。后爪用热刺激(25IR)刺激达16秒，每只后爪测量3次抬爪潜伏期，计算平均值以确定每只动物的平均潜伏期。
结果如图22所示，WT小鼠对热辐射很敏感，平均潜伏期约5.2s。未治疗模型小鼠对热辐射不敏感，平均潜伏期在11s左右，而治疗后模型小鼠对热辐射敏感度提高，平均潜伏期在3.7s-6s不等，接近于WT小鼠。以上数据表明，治疗后模型小鼠伤害性感受的能力得到恢复，剂量依赖效应不明显。
虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

Claims (15)

1.转基因表达盒，其包括：启动子、信号肽的编码序列、编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸、PolyA；
所述编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3。
2.根据权利要求1所述的转基因表达盒，其中，所述启动子选自：CB启动子、Lxp2.1启动子、Lxp2.3启动子、CAG启动子、EF1启动子、泛素启动子、T7启动子、SV40启动子、VP16、VP64启动子、Tuj1启动子、GFAP启动子、波形蛋白启动子、RPE65启动子、VMD2启动子、突触蛋白启动子、VGAT启动子、DAT启动子、TH启动子、骨钙蛋白启动子、CMV启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、TRE启动子、UAS启动子、Ac5启动子、CaMKIIa启动子、GDS启动子和ADH1启动子；优选地，所述启动子选自CB启动子和Lxp2.1启动子；更优选地，所述启动子为CB启动子。
3.根据权利要求1或2所述的转基因表达盒，其中，所述信号肽选自α-半乳糖苷酶A的原始信号肽、BM40信号肽、FIB信号肽、白蛋白信号肽、CD40原始信号肽、YfkN信号肽、Bpr信号肽、Mpr信号肽、PhoB信号肽、WapA信号肽、AbnA信号肽、α因子信号肽、酸性磷酸酶(PHO5)信号肽、蔗糖酶(SUC2信号肽)、蚕丝蛋白LC信号肽、人胰岛素信号肽、流感血凝素信号肽、Gaussia luc信号肽、人IL-2信号肽、人胰蛋白酶原-2信号肽、人IgG2 H信号肽、小鼠Igκ信号肽、VSV-G信号肽和人OSM信号肽；优选地，所述信号肽选自BM40信号肽和FIB信号肽；更优选地，所述信号肽为BM40信号肽。
4.根据权利要求1或2所述的转基因表达盒，其中，所述信号肽为α-半乳糖苷酶A的原始信号肽，所述信号肽的编码序列选自如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：22所示的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒的核苷酸序列选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
6.编码α-半乳糖苷酶A的原始信号肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。
7.重组AAV载体，其包含：权利要求1至5中任一项所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。
8.根据权利要求7所述的重组AAV载体，其中，所述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白；优选地，所述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
9.权利要求7或8所述的重组AAV载体在制备用于预防或治疗法布里病的药物中的应用。
10.药物，其包含：权利要求7或8所述的重组AAV载体和可选的赋形剂。
11.根据权利要求10所述的药物，其中，所述药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用；优选地，所述药物通过全身途径施用，例如静脉内施用。
12.根据权利要求10或11所述的药物，其中，所述药物为注射剂。
13.根据权利要求12所述的药物，其中，所述药物的单位剂量为5E12vg/kg以上，优选为5E12vg/kg至5E13vg/kg。
14.将编码α-半乳糖苷酶A的多核苷酸递送至靶细胞中的方法，包括：
1)将权利要求1至5中任一项所述的转基因表达盒包装于AAV衣壳蛋白中，形成权利要求7或8所述的重组AAV载体；以及
2)使所述靶细胞与所述重组AAV载体接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述靶细胞是离体细胞。
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