CN116621989A - 一种多聚化结构单体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的多聚化结构单体,以及该多聚化结构单体的用途。本发明的多聚化结构单体中的多聚化元件可与治疗性抗体及其片段融合用于药物,以增强其对个体的治疗性能;或将病毒刺突蛋白及其片段与多聚化元件融合用于疫苗,以稳定病毒刺突蛋白多聚体,增强个体对其的免疫应答。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种多聚化结构单体及其用途。
背景技术
大量的蛋白质天然存在的生理形式为三聚体形式。例如在肿瘤发生、移植排斥、病毒复制、骨吸收、类风湿性关节炎和糖尿病中起作用的TNF家族配体(也称为细胞因子)。TNF配体家族的成员以自组装非共价三聚体的形式发挥其生物学功能。因此,TNF家族配体需要形成能够结合并激活TNFR超家族的相应受体的三聚体。此外,目前全世界大流行的新型冠状病毒(Covid-19)是通过病毒刺突蛋白(S)三聚体与细胞表面表达的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合,随后S胞外域三聚体发生构象变化和膜融合,从而进入细胞。因此,S蛋白三聚体是疫苗的主要靶标。
此外,为了增强生物学活性,可将治疗性抗体及其片段与多聚化元件融合形成多聚化结构单体用于药物的多聚化,以增强其对个体的治疗性能;或将病毒刺突蛋白及其片段与多聚化元件融合用于疫苗,以稳定病毒刺突蛋白多聚体,增强个体对其的免疫应答。
然而,目前大量多聚体的多聚化结构单体通常具有分子量大、多聚化效率低和稳定性低等缺点。因此,本领域迫切需要开发一种新型三聚化结构单体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型多聚化结构单体及其用途。
在本发明的第一方面,提供了一种多聚化结构单体,所述的多聚化结构单体为结构如式I或式II所示的融合蛋白:
Z0-Z1-L1-Z2-L2-Z3 (I)
Z0-Z2-L1-Z1-L2-Z3 (II),
其中,
Z0为无、信号肽、或分泌肽;
Z1为目标蛋白元件;
L1为无或连接肽;
Z2为多聚化元件;
L2为无或连接肽;
Z3为无或纯化标签;
“-”为键;其中,
所述的多聚化元件选自下组:
(1)GRGGEEKIKELEKKVQELLEKITHLENEVARLKKLVG(SEQ ID NO.1);
(2)GRGGEEKIKELEKKIQELLEKITHLENEIARLKKLIG(SEQ ID NO.2);
(3)GRGGEEKIKEIEKEIQEILETITKIEKEIKRIKELIG(SEQ ID NO.3);
(4)GRGGEEKIKEIEKKIQEILEKITHIENEIARIKKLIG(SEQ ID NO.4)。
在另一优选例中,所述的多聚化元件为三聚化元件,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
在另一优选例中,所述的多聚化元件为二聚化元件,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
在另一优选例中,所述多聚化元件还包括SEQ ID NO.1、2、3或4中任意一种的氨基酸序列任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留多聚化能力的衍生序列。
在另一优选例中,所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留多聚化能力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少80%的氨基酸序列;较佳地,为至少85%;更佳地,为至少90%;最佳地,为至少95%。
在另一优选例中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-7个(如1-3个,较佳地1-2个,更佳地1个)。
在另一优选例中,所述Z1选自下组:SUMO蛋白、病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体或其片段。
在另一优选例中,所述SUMO蛋白的序列如SEQ ID NO.13所示。
在另一优选例中,所述病毒刺突蛋白为新型冠状病毒(Covid-19)的病毒刺突蛋白。
在另一优选例中,所述L1为连接肽,较佳地为S(G4S)n,其中n为1-5;更佳地n为2。
在另一优选例中,所述L2为连接肽;较佳地S(G4S)n,其中n为1-5;更佳地n为1。
在另一优选例中,所述Z3为His标签;较佳地为6His标签。
在本发明的第二方面,提供了一种如本发明第一方面所述的多聚化结构单体的用途,用于多聚化目标蛋白。
在另一优选例中,所述目标蛋白选自下组:SUMO蛋白、病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体或其片段。
在另一优选例中,所述多聚化包括二聚化或三聚化。
在本发明的第三方面,提供了一种多聚化目标蛋白的方法,包括步骤:
(a)提供一如本发明第一方面所述的多聚化结构单体,其中所述的多聚化结构单体包含目标蛋白和多聚化元件;
(b)表达和纯化所述的多聚化结构单体,获得目标蛋白的多聚体。
在另一优选例中,所述目标蛋白选自下组:SUMO蛋白、病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体或其片段。
在本发明的第四方面,提供了一种目标蛋白的多聚体,所述目标蛋白的多聚体是通过如本发明的第三方面所述的方法制备的。
在另一优选例中,所述目标蛋白的多聚体包括二聚体或三聚体。
在另一优选例中,所述目标蛋白的多聚体包括同三聚体或异三聚体。
在本发明的第五方面,提供了一种分离的核酸分子,所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的多聚化结构单体。
在本发明的第六方面,提供了一种载体,所述载体含有如本发明的第五方面所述的核酸分子。
在本发明的第七方面,提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞含有如本发明的第六方面所述的载体,或染色体中整合有外源的如本发明的第五方面所述的核酸分子。
在另一优选例中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中,所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞。
在另一优选例中,所述原核细胞为大肠杆菌。
在本发明的第八方面,提供了一种制备目标蛋白的多聚体的方法,包括步骤:
(a)培养如本发明的第七方面所述的宿主细胞,从而得到如本发明的第四方面所述的多聚体。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:(b)纯化和回收步骤(a)中得到的多聚体。
在另一优选例中,所述纯化在中性或近中性条件下进行。
在另一优选例中,所述中性或近中性条件为pH为6.2-7.8,较佳地为6.5-7.6。
在另一优选例中,所述纯化使用的缓冲液包含15-25mM HEPES,150-250mM NaCl。
在另一优选例中,所述纯化通过0-0.5M咪唑梯度洗脱吸附的蛋白。
在另一优选例中,所述纯化通过尺寸排阻色谱Superdex 200色谱柱(GEHealthcare)分离目标蛋白的多聚体。
在本发明的第九方面,提供了一种药物组合物,包含
(a)如本发明的第一方面所述的多聚化结构单体,或如本发明的第四方面所述的多聚体;和
(b)药学上可接受的载体。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示尺寸排阻色谱Superdex 200 10/300 GL评估小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的融合蛋白寡聚状态。其中TH-E和TH-F形成三聚体,DH-A和DH形成二聚体。
图2为Native-PAGE检测纯化分离的小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的融合蛋白。TH-D或DH-B(对照单体)比TH-E或TH-F三聚体具有更快的泳动速度。不同的tube为同一次纯化不同样品管中的样品。
图3为多聚化元件为三聚化元件时,形成的三聚体结构示意图。其中,三聚体中的每个三聚化结构单体包含目标蛋白、连接肽和多聚化元件(三聚化元件)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,首次意外发现一种多聚化结构单体,所述的多聚化结构单体包含的多聚化元件可与其它生物学功能分子融合形成三聚体或二聚体。具体地,本发明的多聚化元件可广泛与病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体等或其片段融合形成三聚体或二聚体的功能衍生物。该三聚体或二聚体衍生物可用于疫苗组合物、体外诊断试剂或药物组合物中。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开,首先定义某些术语。如本申请中所使用的,除非本文另有明确规定,否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
术语“一”、“一个”和“该”包括它们相应的复数引用。
术语“或”用来指术语“和/或”,并可与术语“和/或”互换使用。
多聚化元件
本发明人发现,α螺旋coiled-coil结构可作为多聚化元件。选取IgD铰链区α螺旋片段进行工程化设计,获得本发明的多聚化元件。
术语“三聚化元件”指多肽内通过与两个其它三聚化元件联合以形成三聚体而促进自我组装的氨基酸序列。典型地,该三聚化元件包含能够形成α螺旋卷曲螺旋域或异亮氨酸拉链域的氨基酸序列。
其中,所述的多聚化元件选自下组:
(1)GRGGEEKIKELEKKVQELLEKITHLENEVARLKKLVG(SEQ ID NO.1);
(2)GRGGEEKIKELEKKIQELLEKITHLENEIARLKKLIG(SEQ ID NO.2);
(3)GRGGEEKIKEIEKEIQEILETITKIEKEIKRIKELIG(SEQ ID NO.3);或
(4)GRGGEEKIKEIEKKIQEILEKITHIENEIARIKKLIG(SEQ ID NO.4)。
其中,多聚化元件可与其它生物学功能分子(目标蛋白元件)融合形成三聚体或二聚体。较佳地,通过融合小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)进行筛选可形成多聚体的多聚化元件
优选地,有助于促进目标蛋白元件三聚化的多聚体元件的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示;
有助于促进目标蛋白元件二聚化的多聚体元件的序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。
在另一优选例中,所述多聚化元件包含的氨基酸序列与SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%的同一性。
在另一方面中,本发明的多聚化元件可用于与其它生物学功能分子融合形成多聚体。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用,系指任意长度的氨基酸聚合物。
除非另有说明,否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可以参考Benjamin Lewin,Genes X,Jones&Bartlett Publishers出版,2009年和Meyerset al.,The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine,Wiley-VCH出版,16卷,2008年及其它类似参考。
本发明所用氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话,达到最大序列同一性百分比,并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分)之后候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对,例如,利用可公开获得的计算机软件,如BLAST,BLAST-2,ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
如本文所用,术语“融合”或“连接”意指构件通过肽键直接连接或经由一个或多个连接肽连接。
术语“连接肽(linker)”是指包含一个或多个氨基酸,通常是约2至20个氨基酸的肽。优选地,所述连接肽为柔性的连接肽。合适的连接肽实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基,连接肽中氨基酸残基的标识和序列可随着连接肽中需要实现的次级结构要素的类型而变化。适合的非免疫原性连接肽可以是,(GS)n、(G4S)n、S(G4S)n连接肽,其中“n”通常为1至10之间的数字,通常为1至4。
如本文所用,“纯化标签”是指在任选的协助表达和/或纯化的标签序列。另一优选例中,所述的标签序列包括6His标签。
术语“片段”为天然蛋白质的截短形式,并且其基本保留所述天然蛋白质的生物活性。
术语“多核苷酸”或“核酸”是指分离的核酸分子或构建体,例如,信使RNA(mRNA),病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如,可见于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。
关于“分离的”核酸分子或多核苷酸,意指已经从其天然环境中移出的核酸分子,DNA或RNA。例如,编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被认为是分离的。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,例如启动子,核糖体结合位点或转录终止子。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的,并且是指用于将与其可操作地相关联的特定基因引入靶细胞中并且指导所述特定基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。表达载体允许大量稳定的mRNA的转录。一旦表达载体进入靶细胞内,则通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。
在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包括编码本发明的多聚化结构单体的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”是指在其中引入了外源核酸的细胞,包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”,其包括初级转化细胞和从其衍生的后代,而不考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同,而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。宿主细胞是可用于产生本发明的多聚化结构单体的任何类型的细胞系统。
多聚化结构单体
本发明提供了一种新的多聚化结构单体。本发明的所述的多聚化结构单体可促使多聚体的形成。
在另一优选例中,所述的多聚化结构单体为结构如式I或式II所示的融合蛋白:
Z0-Z1-L1-Z2-L2-Z3 (I)
Z0-Z2-L1-Z1-L2-Z3 (II),
其中,
Z0为无、信号肽、或分泌肽;
Z1为目标蛋白元件;
L1为无或连接肽;
Z2为多聚化元件;
L2为无或连接肽;
Z3为无或纯化标签;
“-”为键;
其中,
所述的多聚化元件具有如下所示的任意一种氨基酸序列:
GRGGEEKIKELEKKVQELLEKITHLENEVARLKKLVG(SEQ ID NO.1);
GRGGEEKIKELEKKIQELLEKITHLENEIARLKKLIG(SEQ ID NO.2);
GRGGEEKIKEIEKEIQEILETITKIEKEIKRIKELIG(SEQ ID NO.3);或
GRGGEEKIKEIEKKIQEILEKITHIENEIARIKKLIG(SEQ ID NO.4)。
在另一优选例中,所述目标蛋白选自下组:SUMO蛋白、病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体或其片段。
如本文中所用,“三聚化结构单体”是指三聚化元件与病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体等或其片段融合形成的单链多肽。
本发明的多聚化结构单体包括三聚化元件,其中本发明的三聚化结构单体包含的三聚化元件与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少约80%、85%、90%、95%或100%同一的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少约80%、85%、90%、95%或100%同一的氨基酸序列。
在具体实施例中,本发明的三聚化结构单体中的目标蛋白为SUMO蛋白,其中,所述的三聚化结构单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
如本文中所用,“融合蛋白”是指本发明的第一方面所述的多聚化结构单体多聚化形成的多聚体或多聚体功能衍生物。优选地,所述多聚体为三聚体或二聚体,所述的三聚体包括同三聚体或异三聚体。
如本文所用,“融合蛋白”还包括具有上述活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):1-3个(通常为1-2个,更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内,较佳地为2个以内,更佳地为1个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外,所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的说明,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比,有至多7个,较佳地至多2个,更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外,还可以对本发明融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
核酸以及包含其的宿主细胞
本领域技术人员可以将编码本发明所述多聚化结构单体的DNA分子克隆到载体中,进而转化宿主细胞。因此,本发明还提供了一种重组DNA载体,其含有编码本发明所述多聚化结构单体的DNA分子。
优选地,所述重组DNA载体是一种表达载体,本领域技术人员将所述多聚化结构单体的DNA分子克隆到表达载体中,转化宿主细胞,通过诱导表达获得多聚体。本发明的表达载体含有编码多聚化结构单体的DNA序列,转染哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中,所述表达载体进一步含有启动子和编码分泌信号肽的DNA序列,以及至少一种用于筛选的抗药基因。
本发明提供了一种编码本文中所述的任何多聚化结构单体的经分离核酸,其包含载体(例如表达载体)以便表达该多聚化结构单体。
在另一方面中,本发明提供了一种包含前述核酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在其他实施方案中,该宿主细胞为原核细胞(例如大肠杆菌细胞)。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明还提供了一种产生前述多聚化结构单体中的任一者的方法,该方法包括培养可产生该多聚化结构单体的宿主细胞及由该宿主细胞或培养基回收该多聚化结构单体。
多聚化结构单体的用途
本发明的多聚化结构单体包括三聚化结构单体或二聚化结构单体。其中,本发明的多聚化元件可用于与其它生物学功能分子融合形成多聚体。在某些实施方案中,所述的多聚化元件可与病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体等或其片段融合形成多聚化结构单体,用于疫苗组合物、体外诊断试剂或药物组合物中。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物,它含有本发明的融合蛋白,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的融合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内。
本发明的主要优点包括
(1)本发明首次发现一种多聚化元件,可以与其它生物学功能分子融合,形成多聚体,例如三聚体或二聚体。
(2)本发明的多聚化结构单体表达简单,容易纯化和回收。
(3)本发明的多聚化结构单体具有分子量小、多聚化效率高和稳定性高。
下面结合具体实施例,进一步陈述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1.多聚体的制备
1.1小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)多聚体的设计
α螺旋coiled-coil结构可作为多聚化元件,选取IgD铰链区α螺旋片段进行工程化设计。通过融合小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)进行筛选可形成多聚体的多聚化元件,例如三聚化元件或二聚化元件。
有助于促进目标蛋白元件三聚化的三聚体元件的序列如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示;有助于促进目标蛋白元件二聚化的二聚体元件的序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。
1.2构建融合表达载体:
编码小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)(序列如SEQ ID NO.13所示),C端融合S(GGGGS)2连接肽,不同的多聚化元件,SGGGGS连接肽和6×His标签的基因,克隆到原核表达载体中,验证序列。分别命名为多聚化结构单体TH-D、TH-E、TH-F、DH、DH-A和DH-B,相关序列如下所示:
SUMO的序列(SEQ ID NO.13):
MGGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG
多聚化结构单体TH-D、TH-E、TH-F、DH、DH-A和DH-B中的多聚化元件的序列分别为:
DH中的多聚化元件
GRGGEEKIKELEKKVQELLEKITHLENEVARLKKLVG(SEQ ID NO.1)
DH-A中的多聚化元件
GRGGEEKIKELEKKIQELLEKITHLENEIARLKKLIG(SEQ ID NO.2)
TH-E中的多聚化元件
GRGGEEKIKELEKEVQELLETITKLEKEVKRLKELVG(SEQ ID NO.5)
TH-F中的多聚化元件
GRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTKEEKKKEKEKEEQG(SEQ ID NO.6)
DH-B中的多聚化元件
GRGGEEKIKEIEKEIQEILETITKIEKEIKRIKELIG(SEQ ID NO.3)
TH-D中的多聚化元件
GRGGEEKIKEIEKKIQEILEKITHIENEIARIKKLIG(SEQ ID NO.4)
其中,连接有SUMO蛋白、多聚化元件、连接肽和6×His标签的多聚化结构单体TH-D、TH-E、TH-F、DH、DH-A和DH-B的序列如下所示:
DH的氨基酸序列(SEQ ID NO.7):
MGGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSGGGGSGGGGSGRGGEEKIKELEKKVQELLEKITHLENEVARLK KLVGSGGGGSHHHHHH
DH-A的氨基酸序列(SEQ ID NO.8):
MGGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSGGGGSGGGGSGRGGEEKIKELEKKIQELLEKITHLENEIARLK KLIGSGGGGSHHHHHH
TH-E的氨基酸序列(SEQ ID NO.9):
MGGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSGGGGSGGGGSGRGGEEKIKEIEKEIQEILETITKIEKEIKRIK ELIGSGGGGSHHHHHH
TH-F的氨基酸序列(SEQ ID NO.10):
MGGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSGGGGSGGGGSGRGGEEKIKEIEKKIQEILEKITHIENEIARIK KLIGSGGGGSHHHHHH
DH-B的氨基酸序列(SEQ ID NO.11):
MGGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSGGGGSGGGGSGRGGEEKIKELEKEVQELLETITKLEKEVKRLK ELVGSGGGGSHHHHHH
TH-D的氨基酸序列(SEQ ID NO.12):
MGGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSGGGGSGGGGSGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTKEEKKKEKEK EEQGSGGGGSHHHHHH
1.3表达和纯化融合蛋白:
将表达质粒转化到大肠杆菌BL21细胞中,终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在298K下LB培养基中表达18小时。通过在4500g离心20分钟收集细胞并重悬在超声缓冲液中,该缓冲液由50mM HEPES pH 7.6、500mMNaCl,7mM巯基乙醇和0.1%TritonX-100组成。将细胞在冰上超声处理20分钟,并通过在10℃下以40000g离心30分钟除去细胞碎片。
将上清液加载到预先用超声缓冲液平衡过的Ni Sepharose 6 Fast Flow色谱柱(GE Healthcare)上。用超声缓冲液洗涤后,用纯化缓冲液(20mM HEPES pH 7.6、200mMNaCl)中的0-0.5M咪唑梯度洗脱吸附的蛋白(M为mol/L,mM为mmol/L)。
1.4多聚体的检测
将含有多聚化结构单体的洗脱组分(此时TH-E、TH-F结构单体形成了三聚体,DH、DH-A结构单体形成了二聚体)进一步使用纯化缓冲液(同上)预先平衡的尺寸排阻色谱Superdex 200 10/300GL色谱柱(GE Healthcare),按照色谱柱说明书提供“不同分子量标准样品-洗脱峰时间”的对照图,确定对应于各洗脱峰的分子量,进而评估其寡聚状态,并分离对应于小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)三聚体或二聚体的单分散组分(图1)。
如图1和表2显示,包含TH-E结构单体的融合蛋白和包含TH-F结构单体的融合蛋白为大量均一的小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)三聚体。包含DH结构单体的融合蛋白和包含DH-A结构单体的融合蛋白为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的二聚体。
表2.本发明中的多聚体分子量及其序列
名称 | 单体分子量 | 主峰近似分子量 | 多聚体形成情况 |
DH | 17.8kDa | 50.0kDa | 二聚体 |
DH-A | 17.8kDa | 46.0kDa | 二聚体 |
DH-B | 17.8kDa | 36.0kDa | 单体 |
TH-D | 18.0kDa | 39.0kDa | 单体 |
TH-E | 17.8kDa | 70.0kDa | 三聚体 |
TH-F | 17.8kDa | 67.0kDa | 三聚体 |
实施例2 Native-PAGE检测融合蛋白
将尺寸排阻色谱分离的小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)三聚体样品上样至Native-PAGE(6%-15%梯度)泳道中,在50mM Tris-HAc pH8.5泳动缓冲液150V电压下,泳动3.5h,然后考马斯亮蓝染色,最后用水加热脱色。
通过Native-PAGE检测纯化分离的小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的融合蛋白,评估融合蛋白(图2)。
由图2可知,在能够保持生物大分子生物活性的Native-PAGE电泳中,TH-D或DH-B(对照单体)比TH-E或TH-F三聚体具有更快的泳动速度,说明TH-E或TH-F具有更大的分子量,与实施例1中的尺寸排阻色谱的实验结果一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海近岸科技有限公司
<120> 一种多聚化结构单体及其用途
<130> P2021-2264
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Lys Lys Val Gln
1 5 10 15
Glu Leu Leu Glu Lys Ile Thr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu
20 25 30
Lys Lys Leu Val Gly
35
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Lys Lys Ile Gln
1 5 10 15
Glu Leu Leu Glu Lys Ile Thr His Leu Glu Asn Glu Ile Ala Arg Leu
20 25 30
Lys Lys Leu Ile Gly
35
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Ile Glu Lys Glu Ile Gln
1 5 10 15
Glu Ile Leu Glu Thr Ile Thr Lys Ile Glu Lys Glu Ile Lys Arg Ile
20 25 30
Lys Glu Leu Ile Gly
35
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Ile Glu Lys Lys Ile Gln
1 5 10 15
Glu Ile Leu Glu Lys Ile Thr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile
20 25 30
Lys Lys Leu Ile Gly
35
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Lys Glu Val Gln
1 5 10 15
Glu Leu Leu Glu Thr Ile Thr Lys Leu Glu Lys Glu Val Lys Arg Leu
20 25 30
Lys Glu Leu Val Gly
35
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln
1 5 10 15
Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Lys Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu
20 25 30
Lys Glu Glu Gln Gly
35
<210> 7
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
20 25 30
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
35 40 45
Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
50 55 60
Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Lys Lys Val
115 120 125
Gln Glu Leu Leu Glu Lys Ile Thr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg
130 135 140
Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 8
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
20 25 30
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
35 40 45
Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
50 55 60
Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Lys Lys Ile
115 120 125
Gln Glu Leu Leu Glu Lys Ile Thr His Leu Glu Asn Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Leu Lys Lys Leu Ile Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 9
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
20 25 30
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
35 40 45
Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
50 55 60
Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Ile Glu Lys Glu Ile
115 120 125
Gln Glu Ile Leu Glu Thr Ile Thr Lys Ile Glu Lys Glu Ile Lys Arg
130 135 140
Ile Lys Glu Leu Ile Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 10
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
20 25 30
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
35 40 45
Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
50 55 60
Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Ile Glu Lys Lys Ile
115 120 125
Gln Glu Ile Leu Glu Lys Ile Thr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Ile Lys Lys Leu Ile Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 11
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
20 25 30
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
35 40 45
Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
50 55 60
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100 105 110
Ser Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Lys Glu Val
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Gln Glu Leu Leu Glu Thr Ile Thr Lys Leu Glu Lys Glu Val Lys Arg
130 135 140
Leu Lys Glu Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 12
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
20 25 30
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
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Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
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Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His
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Arg Glu Gln Ile Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu
115 120 125
Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Lys Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
130 135 140
Glu Lys Glu Glu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
145 150 155 160
His His
<210> 13
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
20 25 30
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
35 40 45
Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
50 55 60
Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Gly Gly
100
Claims (10)
1.一种多聚化结构单体,其特征在于,所述的多聚化结构单体为结构如式I或式II所示的融合蛋白:
Z0-Z1-L1-Z2-L2-Z3 (I)
Z0-Z2-L1-Z1-L2-Z3 (II)
其中,
Z0为无、信号肽、或分泌肽;
Z1为目标蛋白元件;
L1为无或连接肽;
Z2为多聚化元件;
L2为无或连接肽;
Z3为无或纯化标签;
“-”为键;
其中,
所述的多聚化元件选自下组:
GRGGEEKIKELEKKVQELLEKITHLENEVARLKKLVG(SEQ ID NO.1);
GRGGEEKIKELEKKIQELLEKITHLENEIARLKKLIG(SEQ ID NO.2);
GRGGEEKIKEIEKEIQEILETITKIEKEIKRIKELIG(SEQ ID NO.3);
GRGGEEKIKEIEKKIQEILEKITHIENEIARIKKLIG(SEQ ID NO.4)。
2.如权利要求1所述的多聚化结构单体,其特征在于,所述Z1选自下组:SUMO蛋白、病毒刺突蛋白、抗体、肽类激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体或其片段。
3.如权利要求1所述的多聚化结构单体的用途,其特征在于,用于多聚化目标蛋白。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述多聚化包括二聚化或三聚化。
5.一种多聚化目标蛋白的方法,其特征在于,包括步骤:
(a)提供一如权利要求1所述的多聚化结构单体,其中所述的多聚化结构单体包含目标蛋白和多聚化元件;
(b)表达和纯化所述的多聚化结构单体,获得目标蛋白的多聚体。
6.一种目标蛋白的多聚体,其特征在于,所述目标蛋白的多聚体是通过如权利要求5所述的方法制备的。
7.一种分离的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码如权利要求1所述的多聚化结构单体。
8.一种载体,其特征在于,所述载体含有如权利要求7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有如权利要求8所述的载体,或染色体中整合有外源的如权利要求7所述的核酸分子。
10.一种制备目标蛋白的多聚体的方法,其特征在于,包括步骤:
(a)培养如权利要求9所述的宿主细胞,从而得到如权利要求6所述的目标蛋白的多聚体;
(b)纯化和回收步骤(a)中得到的多聚体。
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