CN116615448A - 免疫相容性细胞、组织、器官以及用于在最大程度地减少附带基因组破坏的情况下进行针对沉默、人源化和个性化的移植的方法 - Google Patents

免疫相容性细胞、组织、器官以及用于在最大程度地减少附带基因组破坏的情况下进行针对沉默、人源化和个性化的移植的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116615448A
CN116615448A CN202180072530.5A CN202180072530A CN116615448A CN 116615448 A CN116615448 A CN 116615448A CN 202180072530 A CN202180072530 A CN 202180072530A CN 116615448 A CN116615448 A CN 116615448A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sla
human
wild
reprogrammed
pig
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180072530.5A
Other languages
English (en)
Inventor
P·W·霍尔泽
J·阿德金斯
R·L·蒙罗伊
E·J·常
K·罗杰斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alexis Biology
Pharmasum Therapeutics AS
Original Assignee
Alexis Biology
Pharmasum Therapeutics AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alexis Biology, Pharmasum Therapeutics AS filed Critical Alexis Biology
Publication of CN116615448A publication Critical patent/CN116615448A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8778—Swine embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

一种用于产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库的生物系统，其中所述生物系统具有生物和代谢活性，即是活的，所述生物系统包括用于移植到人接受者中的非人动物供体中的基因重新编程的蛋白质、细胞、组织和/或器官，其中所述非人动物供体是用于从所述基因重新编程的猪供体分离的细胞、组织和/或器官的异种移植的基因重新编程的猪供体。

Description

免疫相容性细胞、组织、器官以及用于在最大程度地减少附带 基因组破坏的情况下进行针对沉默、人源化和个性化的移植 的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月24日提交的U.S.63/069,569的优先权权益。
背景技术
在过去的从2014年到2019年的5年中，每年有平均约6,400名在等待器官移植的名单上但未接受器官移植的候选者死亡。大约有同样数量的候选者由于病得太重，以致于无法接受必须通过手术进行的移植，因此无法接受长期移植等待。尽管可用供体和接受者未满足的需求之间的分歧率已有些许改善，但是这种差异一直持续到今天并且仍然很大；供应仍然严重不足。当然，有需要的患者正在等待来自人供体的器官，这将代表将器官从一个物种移植到另一个物种(同种异体移植)。
同种异体移植存在许多重要的多方面问题，涉及安全性、后勤、伦理、法律、体制和文化复杂性。从安全性的角度来看，来自人供体的同种异体组织具有重大的感染疾病风险。例如，在移植领域中有一些人报告：“[人]巨细胞病毒(CMV)是影响器官移植接受者的最重要的单一感染因子，其中这些患者中的至少三分之二在移植之后具有CMV感染。”Denner,J.,Reduction of the survival time of pig xenotransplants by porcinecytomegalovirus.Virology Journal,2018,15(1):171；Rubin,R.H.,Impact ofcytomegalovirus infection on organ transplant recipients.Reviews ofInfectious Diseases,1990,12增刊7:S754-766。
有关组织移植的法规包括供体筛选和不定因子测试的标准，以及管理组织移植物处理和分配的严格法规。同种异体移植期间已经发生病毒传播。外源性逆转录病毒(人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)、人T细胞白血病病毒2型(HTLV-2)和人免疫缺陷病毒(HIV))已在器官和细胞移植过程中由于具有病毒(诸如人巨细胞病毒以及甚至狂犬病)而通过人组织传播。由于围绕器官生存能力和验尸筛选的技术和时间限制，绝对测试受到阻碍，并且这种风险无法消除。
接受者和供体之间的免疫学差异阻止移植物存活延长的时间段，而没有造成他们自身的一系列并发症和额外风险的免疫抑制方案。当患者从(非自身)供体(活着的或死去的)接受器官时，接受者的免疫系统会将移植物识别为异物。这种识别将导致他们的免疫系统动员并“排斥”器官，除非使用抑制免疫系统的自然过程的附随药物。对同种异体皮肤移植物的反应是一种涉及先天性和适应性免疫系统两者的参与的有效免疫反应。Abbas AK,Lichtman AHH,Pillai S(2017)Cellular and Molecular Immunology.
关于免疫抑制剂的使用，免疫抑制药物会延长所移植的移植物在急性和慢性排斥模式中的存活。然而，它们使得患者容易受到甚至最常规的病原体的感染，并且需要终生持续使用，但会使患者暴露于更高的感染风险，甚至是癌症。免疫抑制剂可以减弱自然免疫过程；不幸的是，这些药物通常是器官移植后的终生需求并且会增加接受者对其他常规病原体的易感性。尽管这些药物允许移植接受者耐受外来器官的存在，但它们也增加了与免疫系统受损相关的感染疾病和症状的风险，因为“人同种异体移植物可能会传播大量的生物体。”Fishman,JA等人,Transmission ofInfection With Human Allografts:EssentialConsiderations in Donor Screening.Clinical Infectious Diseases,2012,55(5):720-727。
尽管有此类缺点，器官移植无疑是大多数患有晚期器官衰竭的患者的首选疗法，这在很大程度上是由于缺乏可行的替代方法。然而，器官移植作为一种成功的挽救生命的治疗干预的出现、以及可用于移植的器官的匮乏不幸地使医学专业人员处于必须决定谁存活和谁死去的思想上令人困惑的位置。最终，替代和辅助治疗选择将最大程度地减少同种异体移植材料的严重缺点，同时提供使它们如此有效的相同作用机制，将对全世界的患者带来巨大的益处。
通常对器官和其他移植组织的迫切需要，包括用于在定位和利用更永久的器官或其他组织的同时进行临时治疗，导致对利用来自非人来源(包括其他动物)的器官、细胞和组织进行临时和/或永久异种移植进行了调查。
异种移植(诸如将非人动物供体器官移植到人接受者中)有可能减少可用于移植的器官短缺，从而潜在地帮助全世界成千上万的人。鉴于猪的大小和生理学与人相容，猪供体一直被认为是用于人异种移植中潜在的非人器官、组织和/或细胞来源。然而，使用标准的、未经修饰的猪组织异种移植到人或其他灵长类动物中会伴随着移植组织的排斥反应。
野生型猪供体器官在移植到人体中后将会引起人免疫系统的排斥，其中天然人抗体靶向在猪供体细胞上的表位，导致所移植的器官、细胞或组织的排斥和衰竭。排斥可以是细胞排斥(淋巴细胞介导的)或体液(抗体介导的)排斥(包括但不限于超急性排斥、急性排斥、慢性排斥)，可能涉及生存限制性血小板减少性凝血病和急性体液异种移植反应(AHXR)。关于猪供体到人的异种移植的其他障碍包括疾病或寄生虫的跨物种传播的风险。
其他人已经进行了许多尝试来修改猪供体以用作异种移植制品的来源，然而迄今为止此类尝试还没有产生成功的猪供体模型。此类商业、学术和其他团体专注于干预、基因改变、通过嵌合状态诱导耐受性的努力、包含转基因、同时使用旨在减少接受者的自然免疫反应的外源性免疫抑制药物以及其他方法。这些团体已经试图创造一种“一刀切”的源动物，旨在为所有接受者创造一种标准化的源动物。
具体而言，某些团体专注于产生不含PERV的转基因猪供体并且利用转基因骨髓进行治疗(参见，例如，eGenesis,Inc.PCT/US2018/028539)；利用干细胞支架来产生转基因猪供体(参见，例如，United Therapeutics/Revivicor[US20190111180A1])；混合嵌合体并且利用转基因骨髓进行治疗以耐受患者T细胞(参见，例如Columbia University[US20180070564A1])。这些旨在解决被人免疫系统识别后的不相容问题的“下游”方法并没有成功地产生出生产适合于长期用于异种移植中的制品或在上述转基因和其他改变中存活下来的猪供体。
与上述方法不同的是，本发明通过以下方式来实现“患者特异性”(或临床相关的“群体特异性”)解决方案，修饰猪供体细胞的基因组以逃避人免疫系统的检测，然后当患者的T细胞和抗体被引发以破坏外源物质时，避免随之而来的免疫级联反应。在一个方面，这种“上游”方法通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合来实现，该取代或修饰的设计最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，这使得供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生致耐受性，而不牺牲动物的免疫功能。因此，本发明解决了将异种移植科学转化为临床现实的长期但未满足的需求。
在一个方面，这种“上游”方法通过精确的定点诱变基因取代或修饰的特定组合来实现，该取代或修饰的设计最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，这使得供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生致耐受性，而不牺牲动物的免疫功能。因此，本发明解决了将异种移植科学转化为临床现实的长期但未满足的需求。
发明内容
在一个方面，本公开包括一种从基因工程改造的非人动物供体产生生物系统的方法，以产生基因工程改造的非人动物供体、细胞、制品、载体、试剂盒、抗体、蛋白质、疫苗、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、神经元细胞和/或遗传物质。本公开包括产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库。
在第一方面，本公开包括使野生型非人动物供体中的特定蛋白质、表位或分子沉默、敲除、失活或使它们的表达最小化，以产生基因工程改造的非人动物供体，所述供体在移植到人时产生致耐受性的生物制品。在第二方面，本公开包括使野生型非人动物供体中编码特定蛋白质、表位或分子的基因人源化，以产生基因工程改造的非人动物供体，所述供体在移植到人时产生致耐受性的生物制品。在第三方面，本公开包括使野生型非人动物供体中编码特定蛋白质、表位或分子的基因个性化，以产生基因工程改造的非人动物供体，所述供体在移植到人时产生致耐受性的生物制品。在某些方面，将第一方面、第二方面和第三方面组合以产生基因工程改造的非人动物供体，所述供体在移植到人时产生致耐受性的生物制品。在一些方面，所述方面中的一个、两个或全部三个涉及所述非人动物供体的基因组的最小附带基因组破坏。在一些方面，最小附带基因组破坏涉及替换野生型非人动物供体的基因组的基因内的特定长度(本文称为“框”或“盒”)的核苷酸序列的方法。在一些方面，替换框或盒涉及使用标准化长度的核苷酸序列。
在第一方面的一个方面，将所述非人动物供体的所述基因组基因工程改造为不呈递一个或多个表面聚糖表位，所述表位选自半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)、Neu5Gc和Sia-α2,3-[GalNAc-β1,4]Gal-β1,4-GlcNAc Sda。在第一方面的另一个方面，使编码SLA-1和SLA-2的MHC I类序列在所述野生型非人动物供体的基因组中沉默、敲除或失活。在第一方面的另一个方面，使编码SLA-DR的MHC II类序列在所述野生型非人动物供体的基因组中沉默、敲除或失活。在第一方面的另一个方面，使编码SLA-DRβ1的MHC II类序列在所述野生型非人动物供体的基因组中沉默、敲除或失活。在第一方面的另一个方面，使β2微球蛋白(B2M)的两个拷贝中的一个在所述野生型非人动物供体的基因组中沉默、敲除或失活。在一些方面，将终止密码子插入所述野生型非人动物供体的基因组中。
在第二方面的一个方面，将所述非人动物供体的所述基因组基因工程改造以使PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI、MIC区域中的一个或多个以及未根据第一方面沉默的所述非人动物供体的内源性B2M的另一个拷贝人源化。
在第三方面的一个方面，将所述非人动物供体的所述基因组基因工程改造以使SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQA和/或SLA-DQ-B区域中的一个或多个个性化。
在本文所述的任何或所有方面，将编码α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的基因破坏，使得基因重新编程的猪供体缺乏由那些基因编码的表面聚糖表位的功能性表达。
在其他方面，本公开包括一种制备基因重新编程的猪供体的方法，所述供体包含如下核基因组：其缺乏选自半乳糖-α-1,3-半乳糖、Neu5Gc和/或Sda的表面聚糖表位的功能性表达，并且被基因重新编程为表达人捕获参考序列的人源化表型和人接受者的基因组的个性化表型，所述方法包括：
a.获得猪胚胎成纤维细胞、猪受精卵、猪间充质干细胞(MSC)或猪生殖系细胞；
b.对a)中的所述细胞进行基因改变以缺乏功能性α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)；
c.使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR或任何多重、精确基因编辑技术)对以下区域处的核苷酸进行定点诱变取代来对b)中的所述细胞进行基因重新编程：i)用来自所述人接受者的基因组的HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-3的核苷酸进行定点诱变取代；以及ii)分别用来自所述人接受者的基因组的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-6、SLA-7和SLA-8的核苷酸进行定点诱变取代；以及iii)用来自所述人接受者的基因组的HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-DQ的核苷酸进行定点诱变取代，
其中未对所述野生型猪供体的基因组的内源外显子和/或内含子区域进行重新编程，并且
其中所述重新编程的基因组包括A-D：
A)其中所述重新编程的猪供体核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2-的直系同源外显子的核苷酸对在所述野生型猪供体的两个β2-中的第一个的区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪供体核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白(B2M)直系同源的人源化β2微球蛋白(B2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪供体核基因组已经被重新编程，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏所述野生型猪供体的两种内源性β2-多肽中的第二种的功能性表达；
D)其中所述重新编程的猪供体核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2的直系同源外显子的核苷酸对在所述野生型猪供体的PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代，
其中所述重新编程不引入任何移码或框破坏，
d.从c)中基因重新编程的细胞生成胚胎；以及
e.将胚胎移植到代孕猪中并且使移植的胚胎在所述代孕猪中生长。
在另一个方面，本公开包括生产用于异种移植的猪供体组织或器官的方法，其中所述猪供体组织或器官的细胞被基因重新编程成特征在于接受者特异性表面表型，所述方法包括：
a.从预期的人移植接受者获得含有DNA的生物样品；
b.对生物样品进行全基因组测序以获得人捕获参考序列；
c.在基因座(i)-(v)处比较所述人捕获参考序列与猪供体的野生型基因组：
(i)编码SLA-3的外显子区域；
(ii)编码SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域；
(iii)编码SLA-DQ的外显子区域；
(iv)一个或多个编码β2微球蛋白(B2M)的外显子；
(v)SLA-MIC-2基因、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI的外显子区域，
d.创建合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是针对所述基因座(i)-(v)中的一个或多个根据人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，长度为3、4、5、6、7、8、9或10至270、280、290、300、310、320、330、340或350个碱基对或者在3和350个碱基对之间的范围内的任何范围或整数，其中所述合成核苷酸序列在主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类的多态性和高免疫原性基因区域的直系同源基因座(vi)-(x)处与所述人捕获参考序列直系同源，(vi)-(x)分别对应于猪供体基因座(i)-(vi)：
e.用所述合成核苷酸序列替换(i)-(v)中的核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计；以及
f.从具有所述合成核苷酸序列的基因重新编程的猪供体获得用于异种移植的所述猪供体组织或器官，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计。
在另一个方面，本公开包括筛选在包含本公开的核基因组的基因重新编程的猪供体中的脱靶编辑或基因组改变的方法，所述方法包括：
a.在对猪供体核基因组进行基因重新编程之前，对含有来自所述猪供体的DNA的生物样品进行全基因组测序，从而获得第一全基因组序列；
b.在对所述猪供体核基因组重新编程之后，进行全基因组测序以获得第二全基因组序列；
c.比对所述第一全基因组序列和所述第二全基因组序列以获得序列比对；
d.分析所述序列比对以鉴定在脱靶位点处与所述猪供体的基因组的任何错配。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MHC Ia类的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的SLA-3的区域处被用来自人捕获参考序列的HLA-C的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述SLA-3与来自所述人捕获参考序列的所述HLA-C之间不保守的氨基酸。在一些方面，所述野生型猪供体的SLA-1和SLA-2各自包含se对。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MHC Ib类的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的SLA-6、SLA-7和SLA-8的区域处被分别用来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的密码子进行重新编程，所述密码子分别编码在所述SLA-6、SLA-7和SLA-8与来自所述人捕获参考序列的所述HLA-E、HLA-F和HLA-G之间不保守的氨基酸。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MHC II类的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的SLA-DQ的区域处被分别用来自人捕获参考序列的HLA-DQ的密码子进行重新编程，所述密码子分别编码在来自所述人捕获参考序列的所述SLA-DQ与所述HLA-DQ之间不保守的氨基酸，并且其中所述野生型猪供体的SLA-DR包含终止密码子(TAA、TAG或TGA)，或者这些中的1、2和/或3个的依次组合，并且在一些情况下，可以被取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体β2微球蛋白(B2M)的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)的区域处被用来自人捕获参考序列的β2微球蛋白(B2M)的密码子的进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)与来自所述人捕获参考序列的所述β2微球蛋白(B2M)之间不保守的氨基酸，其中基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计的所述合成核苷酸序列包含至少一个终止密码子(TAA、TAG或TGA)，或者这些中的1、2和/或3个的依次组合，并且在一些情况下，可以被取代外显子区域中所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对，使得基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计的所述合成核苷酸序列缺乏所述野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)的功能性表达。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MIC-2的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在所述野生型猪供体的MIC-2的区域处被用来自人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述MIC-2与来自所述人捕获参考序列的所述MIC-A或所述MIC-B之间不保守的氨基酸。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体CTLA-4的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的CTLA-4的区域处被用来自人捕获参考序列的CTLA-4的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的CTLA-4与来自所述人捕获参考序列的所述CTLA-4之间不保守的氨基酸。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体PD-L1的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的PD-L1的区域处被用来自人捕获参考序列的PD-L1的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的PD-L1与来自所述人捕获参考序列的所述PD-L1之间不保守的氨基酸。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体EPCR的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的EPCR的区域处被用来自人捕获参考序列的EPCR的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的EPCR与来自所述人捕获参考序列的所述EPCR之间不保守的氨基酸。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体TBM的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的TBM的区域处被用来自人捕获参考序列的TBM的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的TBM与来自所述人捕获参考序列的所述TBM之间不保守的氨基酸。
在另一个方面，本公开包括一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列是基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体TFPI的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的TFPI的区域处被用来自人捕获参考序列的TFPI的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的TFPI与来自所述人捕获参考序列的所述TFPI之间不保守的氨基酸。
与上述方法不同的是，本发明通过以下方式来实现“患者特异性”解决方案：首先修饰猪供体细胞的基因组以逃避人免疫系统的检测，然后当患者的T细胞和抗体被引发以破坏外源物质时，避免随之而来的免疫级联反应。在第一方面的一个方面，这种“上游”方法通过以下方式来实现：对涉及不同破坏组合的猪供体基因组进行最小修饰(诸如敲除α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)，使得所述猪供体细胞不在其细胞表面上表达这些酶)，调节某些基因(例如，CTLA-4和PD-1)的表达，以及用基于接受者人捕获序列的合成工程改造部分来替换所述猪供体基因组的特定部分(例如，在某些SLA序列中，调节猪供体的例如MHC-I和MHC-II的表达)。因此，本发明解决了将异种移植科学转化为临床现实的长期但未满足的需求。
通过选择性地改变供体的细胞外抗原以增加接受移植的可能性，此类修饰导致减少由“非自我”的识别引起的致病性、免疫差异和相关的有害免疫过程的程度。
在某些方面，本公开集中于(断言)不需要在移植手术后移植接受者普遍和有害地使用外源性免疫抑制药物(或延长的免疫抑制方案)以延长挽救生命的移植物的低免疫原性和/或致耐受性细胞、组织和器官的产生。这种方法与现有和以前的教条方法相反；代替接受在供体与接受者之间存在先天和固定的差异，并因此专注于将干预、基因改变和/或伴随的外源性免疫抑制药物用作减少/消除/消极改变接受者自然产生的免疫反应的方法，转移(如果不是逆转)基础科学教条其他领域的焦点。
在某些其他方面，本公开提供了最小程度破坏的基因工程改造的非转基因猪供体。例如，在本发明中，包含天然碱基对的出现在猪供体SLA上的某些不同序列被去除并替换成包含相同数量的碱基对但基于接受者的人捕获序列被重新编程的合成序列。此外，在本发明中，出现在所述供体即猪供体SLA上的某些独特的序列基于氨基酸的单独空间和物理化学性质而被保留，这些独特的序列包含的天然碱基对可以是用所述接受者的人捕获序列进行重新编程的靶标。这种最小的改变将天然猪供体基因组的其他方面保持在适当的位置，并且不会干扰例如所述猪供体基因组中天然存在的内源外显子和/或内含子和其他密码子以及所述SLA的3D构象和相互作用。
在某些其他方面，本发明提供了根据本文所提供的过程和方法在指定病原体环境中产生的具有此类和其他修饰的猪供体。
在某些其他方面，来源于此类猪供体的用于异种移植的制品是有活力的活细胞，并且能够与移植接受者形成有机结合，包括但不限于诱导移植接受者中的血管形成和/或胶原产生。
在某些其他方面，以保持此类制品的生存能力和活细胞特征的方式保存(包括但不限于通过冷冻保存)来源于此类源动物的制品。
在某些其他方面，此类制品用于同源用途，即用执行与供体相同的一种或多种基本功能的对应器官、细胞和/或组织修复、重建、替换或补充接受者的器官、细胞和/或组织(例如，将猪供体皮肤用作人皮肤的移植体，将猪供体肾用作人肾的移植体，将猪供体肝用作人肝的移植体，将猪供体神经用作人神经的移植体，等等)。
在某些其他方面，本发明认为在需要使用或不需要使用抑制或干扰正常免疫功能的免疫抑制剂药物或疗法的情况下进行此类制品在异种移植中的利用。
附图说明
并入本文并构成本公开的一部分的附图帮助说明本发明的各个方面，并且与本说明书一起进一步用于描述本发明以使相关领域的技术人员能够制造和使用本文所公开的方面。在附图中，相同的附图标记指示相同或功能上类似的元件。
图1示出了人滋养层和滋养层细胞的图像。
图2示意性地示出了结合MHC I类和肽的T细胞受体(TCR)。
图3示意性地示出了细胞表面上的HLA I类。
图4示意性地示出了细胞毒性T细胞(CD8+)-靶细胞相互作用。
图5示意性地示出了细胞毒性T细胞(CD4+)-靶细胞相互作用。
图6示意性地示出了HLA基因的共显性表达和HLA基因在人6号染色体上的位置。
图7是列出用于人MHC I类和II类同种型的血清抗原、蛋白质和等位基因的数目的表。
图8示意性地示出了细胞表面上的HLA I类和II类。
图9显示了MHC I类蛋白(A)和II类蛋白(B)的结构。形成肽结合区(PBR)的距质膜最远的两个球状结构域用蓝色阴影表示。包括β2微球蛋白(B2M)的两个Ig样结构域以灰色阴影显示。
图10显示了HLA基因组基因座图。
图11示意性地示出了人MHC I类和II类同种型。
图12显示了HLA I类基因的示意性分子组织。外显子用矩形表示，内源外显子和/或内含子用线表示。
图13显示了HLA II类基因的示意性分子组织。外显子用矩形表示，内源外显子和/或内含子用线表示。
图14显示了用于“人源化”细胞外猪细胞表达的复合遗传改变设计
图15显示了人和猪供体主要组织相容性复合物(MHC)I类区域的比较基因组组织。人白细胞抗原(HLA)I类图改编自参考文献[17]，并且猪供体白细胞抗原(SLA)I类图仅基于一种完全测序的单倍型(Hp-1.1，H01)[4]。注意，此处并未显示所有基因并且比例是近似的。所表达的SLA I类基因的数量和位置可能在单倍型之间改变。
图16显示了人和猪供体主要组织相容性复合物(MHC)II类区域的比较基因组组织。人白细胞抗原(HLA)II类图改编自参考文献[17]，并且猪供体白细胞抗原(SLA)II类图仅基于一种完全测序的单倍型(H01)[4]。注意，此处并未显示所有基因并且比例是近似的。所表达的HLA-DRB基因和假基因的数量和位置可以因单倍型而异。
图17显示了SLA复合物的物理图谱。黑色框：含有MHC相关序列的基因座。白色框：没有MHC相关序列的基因座。从染色体的长臂到短臂，区域的顺序为II类(II)、III类(III)和I类(I)。
图18显示了SLA基因的示意性分子组织。外显子用灰色椭圆形表示，内源外显子和/或内含子用线表示。基因长度近似于Hp-1.1基因组序列的长度。
图19显示了肽序列的并排基因组分析。
图20显示了SLA-DQA的位置和长度α1(外显子2)和SLA-DQB的β1(外显子2)。
图21显示了详述SLA-DQA和SLA-DQB的内源外显子和/或内含子的核苷酸序列的电子表格。
图22显示了野猪(sus scrofa/wild boar)的SLA-DQβ1结构域。
图23示出了HLA等位基因的命名法。每个HLA等位基因名称都具有与由冒号分隔的至多四组数字对应的唯一编号。等位基因名称的长度取决于等位基因的序列及其最接近的亲缘的序列。所有等位基因收到至少一个四位数字的名称，其与前两组数字对应，只有在必要时才分配更长的名称。在第一个冒号之前的数字描述类型，其通常对应于由同种异型携带的血清抗原。下一组数字用于列出亚型，数字按DNA序列被确定的顺序分配。其编号在两组数字中不同的等位基因必须在改变所编码蛋白质的氨基酸序列的一个或多个核苷酸取代上有所不同。通过使用第三组数字来区分仅在编码序列内的同义核苷酸取代(也称为沉默或非编码取代)不同的等位基因。通过使用第四组数字来区分仅在内源外显子和/或内含子中或者在内源外显子和/或内含子侧翼的5'或3'非翻译区中的序列多态性不同的等位基因。
图24显示了HLA-DQA中外显子的长度
图25A显示了在接受者特异性HLA-DQA与从数据库获取的HLA-DQA之间的核苷酸序列文库，图25B显示了鉴定在HLA与SLA(DQ-A，外显子2)之间的完全差异的核苷酸序列文库，图25C显示了三名患者的DQA的人捕获参考序列，图25D显示了三名患者的DQB的人捕获参考序列，图25E显示了三名患者的DR-A的人捕获参考序列，图25F显示了三名患者的DQR-B1的人捕获参考序列。
图26A显示了三名患者的人捕获参考序列(DQA)的实例。图26B显示了三名患者的人捕获参考序列(DQB)的实例。图26C显示了三名患者的人捕获参考序列(DR-A)的实例。图26D显示了三名患者的人捕获参考序列(DRB)的实例。如本文所公开，DR-A和/或DRB被沉默。
图27显示了野生型人β2微球蛋白(B2M)以及人B2M基因和猪供体B2M基因的示意性分子组织。
图28显示了人B2M的外显子2与猪供体B2M的外显子2的氨基酸序列的比较。
图29显示了猪肺泡巨噬细胞(PAM)的表型分析。将细胞在单独的培养基(对照)中培养，或用100ng/mL IFN-γ激活72小时或用加载的30μg/mL KLH激活24小时。对细胞进行SLA-DQ染色，并且使用抗小鼠APC缀合的多克隆IgG二抗检测标志物。数据表示为计数(y轴)与荧光强度的对数刻度(x轴)的直方图。激活细胞的SLA-DQ的阳性和阴性细胞百分比显示在直方图上。
图30显示了BrdU(5-溴-2'-脱氧尿苷)ELISA的SI值。在孵育7天之后，三种人CD4+T细胞(A)和PBMC(B)对未经处理的和IFN-y激活的PAM细胞(15K)的增殖反应。
图31显示了根据本公开的人源化猪细胞的示意性描绘
图32显示了其中用增加数量的来自四倍敲除猪10261或野生型猪的辐照(30Gy)猪的PBMC来刺激1×105纯化的人CD8+T细胞(A)或人PBMC(B)的图。在5d+16h小时之后通过3H-胸苷掺入来测量增殖。数据代表在单次实验中用来自一名人献血者的细胞获得的一式三份培养物的平均cpm±SEM。使用来自第二名血液供体的应答细胞和来自四倍敲除猪10262的刺激者细胞观察到类似的应答模式。在用四倍敲除猪的PBMC刺激之后，人CD8+T细胞的增殖减少。(Fischer等人,2019)
图33显示了根据本公开的人源化猪细胞的示意性描绘。
图34显示了使用WT 128-11和Gal T-KO B-174PBMC在3个不同的日子运行的人血浆供体的增殖的图
图35显示了与未转染的13 271细胞的裂解相比两名供体(上图：KH；下图：MS)对用HLA-E/A2(左列)和HLA-E/B7(右列)转染的13 271细胞的NK细胞毒性。结果被描绘为特异性裂解的百分比，并且是在四种不同的E:T比率下获得的。数据代表三次独立的实验。空心三角形代表HLA-E转染的13 271细胞，实心菱形代表未转染的13 271细胞。(Forte等人,2005)
图36A和36B显示了每个血浆浓度(稀释)的细胞毒性％图，并且将结果在Prism中绘图。根据细胞毒性曲线，确定了50％杀伤(IC50)的所需稀释度。
图37示出了根据本发明的源动物设施和对应的无指定病原体的设施、动物和畜群。
图38示出了根据本发明的体外肝过滤器和回路。
图39示出了根据本发明的组合皮肤制品。
图40A描绘了POD-15。H&E，H&E高倍图像描绘了具有表面和滤泡上皮坏死的组织生存能力。图40B描绘了展示具有良好总体生存能力的残留自体移植物(星号)的POD-22H&E高倍图像。观察到没有表面上皮坏死和一些表面坏死，以及广泛的纤维化和渗入自体移植物中(箭头)。
图41描绘了在非人灵长类动物接受者中用作治疗全层厚度伤口缺损的临时伤口闭合的猪分层厚度皮肤移植物的纵向进展。左图：POD-0，伤口部位2处的异种移植制品。右图：POD-30，伤口部位2处的相同异种移植制品。
图42显示了以下的POD-30组织学图像：顶部、中心：H&E，伤口部位的低倍图像描绘了完整的上皮覆盖。虚线圈住的是残留的异种移植制品。
图43A绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgMELISA(μg/mL)。图43B绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgG ELISA(μg/mL)。
图44A绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的可溶性CD40L的全身浓度。图44B绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的TGF-α的全身浓度。图44C绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的IL-12/23(p40)的全身浓度。
图45示出了制备根据本发明的皮肤制品的方法。
图46显示了用于储存异种移植制品的冷冻小瓶。
图47显示了异种移植制品的运输过程。
图48显示了用于在低于环境温度的温度(包括但不限于-150摄氏度和其他温度)下储存异种移植制品的辅助封闭或容器系统。
图49A描绘了在POD-12下从左到右分别在伤口部位1、2、3和4处的猪分层厚度(split-thickness)皮肤移植物。图49B描绘了在POD-12(左)和POD-14(右)下在伤口部位4处的猪分层厚度皮肤移植物。
图50A绘制了在新鲜与冷冻保存(7年)的猪组织样品中的MTT还原测定，显示出无统计学差异。图50B绘制了在热失活与冷冻保存(7年)的猪组织样品中的MTT还原测定，显示出所产生的甲臜的量具有统计学显著差异。
图51A-G显示了用于治疗人患者的严重且广泛的部分厚度和全层厚度烧伤的本公开的异种移植制品的图像。
图52A显示了用核苷酸序列TAGTGATAA对SLA-DRA中的核苷酸进行的示例性重新编程，该重新编程使SLA-DRA不表达。图52B显示了用核苷酸序列TAGTGATAA对CMAH、GGTA1和B4GALNT2中的每个中的核苷酸进行的示例性重新编程，该重新编程使CMAH、GGTA1和B4GALNT2中的每个不表达。
图53显示了相对于Xeno-001-00-1患者样品在多个时间点(之前、第7天、第16天和第30天)的中值荧光强度(MFI)的抗异种IgM(A)和IgG(B)抗体结合数据。显示了以1:2稀释度测试的血浆样品的数据。
图54显示了PAM细胞的表面表达。
图55A-55D显示了培养细胞的显微照片(聚集表明阳性反应性)。
图56显示了通过外显子1中的单碱基对取代进行的DR-B1的终止密码子敲除。
图57显示了在外显子2、α-1结构域内通过CRISPR进行的DQ-A1的大(264bp)片段缺失。
图58A-58B显示了BrdU ELISA的ABS450值。图58A显示了在三种不同的PAM细胞浓度下丝裂霉素C处理的PAM“X”、PAM和含有10μg/mL LPS的PAM的增殖。图58B显示了三名人PBMC供体(#19、#29和#57)与三种不同浓度的丝裂霉素C处理的PAM细胞(10K、25K和50K)在七天孵育后的增殖。还显示了单向同种异体和自体对照。
图59A-59B显示了BrdU ELISA的SI值。图59A显示了在三种不同的PAM细胞浓度下丝裂霉素C处理的PAM“X”细胞的增殖。还显示了单向同种异体和自体对照。图59B显示了三名不同的供体PBMC的自体、同种异体和促有丝分裂增殖反应。
图60显示了丝裂霉素C处理的(X)和未经处理的PAM细胞的增殖的BrdU ELISA的ABS450值。
图61A-61B显示了在七天孵育后三种人CD4+T细胞(图61A)和PBMC(图61B)对未经处理的和IFN-γ激活的PAM细胞(15K)的增殖反应的BrdU ELISA的ABS450值。还显示了单向同种异体和自体对照。
图62A-62B显示了BrdU ELISA的刺激指数。显示了单向同种异体和自体对照与CD4+T细胞(图62A)和PBMC(图62B)。
图63A-63B显示了BrdU ELISA的刺激指数。在七天孵育后三种人CD4+T细胞(图63A)和PBMC(图63B)对未经处理的和IFN-γ激活的PAM细胞(15K)的增殖反应。
图64A-64B显示了以Xeno-001-00-1患者样品在多个时间点(之前、第7天、第16天和第30天)的相对中值荧光强度(MFI)显示的抗异种IgM(图64A)和IgG(图64B)抗体结合数据。显示了以1:2稀释度测试的血浆样品的数据。
图65A-65B显示了以Xeno-001-00-1患者样品在多个时间点(之前、第7天、第16天和第30天)的相对中值荧光强度(MFI)显示的抗异种IgM和IgG抗体结合数据。显示了以1:2(图65A)和1:10(图65B)稀释度测试的血浆样品的数据。
图66A-66B显示了以Xeno-001-00-1患者样品在多个时间点(之前、第7天、第16天和第30天)的相对中值荧光强度(MFI)显示的抗异种IgM和IgG抗体结合数据。显示了以1:2(图66A)和1:10(图66B)稀释度测试的血浆样品的对数标度数据。
图67A-67B显示了以Xeno-001-00-1患者样品在多个时间点(之前、第7天、第16天和第30天)的相对中值荧光强度(MFI)显示的抗异种IgM(图67A)和IgG(图67B)抗体结合数据。显示了以1:2、1:10、1:100和1:1000稀释度测试的血浆样品的数据。
图68显示了以Xeno-001-00-1患者样品在异种移植前(之前)和异种移植后(第7天、第16天和第30天)的相对中值荧光强度显示的抗异种IgM和IgG抗体结合数据。
图69显示了与AIM-V培养基中的培养物(SI＝5.25)相比，CTSTMT细胞扩增培养基中的异种培养物在BrdU掺入ELISA测定中显示出显著更高的刺激指数(SI＝86.92)。
图70显示了猪细胞的人源化:DR-B1敲除/敲入结果。
图71显示了SLA-DQB1的外显子2的264bp缺失
图72显示了使用流式细胞术针对WT PAM细胞、克隆M21和克隆B10和D10评估的SLA-DQ的表达。克隆M21是SLA-DQ敲除的起始克隆，不表达SLA-DR但表达SLA-DQ。克隆B-10和D10不表达SLA-DQ。在运行测定之前，将所有细胞均用IFNγ预处理48小时
图73A-73C显示了MLR中的人供体#57CD4+T细胞与WT PAM细胞。有反应的T细胞增殖并显示出CTV强度降低。在这种情况下，增殖率为13.25％。
图74显示了SLA-DQA的外显子2的264bp缺失
图75显示了凝胶色谱，图中展示了DQB1和DQA的缺失
图76显示了SLA-DRB-KO；SLA-DQA-KO；SLA-DQB-KO中的三联体终止密码子的示意图，其中CTTCAGAAA在外显子1中被更改为TAGTGATAA
图77显示了HLA-B2m供体与XT-PAM细胞之间的序列比对。
图78A显示了野生型PAM细胞上的SLA-I和pB2M的表达。图78B显示了克隆A1 PAM细胞上的SLA-I和pB2M的表达缺乏。
具体实施方式
尽管本公开的主题的方面可以以各种形式体现，但是以下描述仅旨在公开这些形式中的一些作为本公开所涵盖的主题的特定实例。因此，本公开的主题并非旨在限于所描述的形式和方面。
US2020/0108175A1(Holzer等人)的公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的，正同本文明确引用一样。
除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明领域内的普通技术人员对于该发明所属的通常理解的意义相同的意义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和示例仅是说明性的而不是旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均以全文引用的方式并入。本发明的其他特征和优势将根据以下详细描述和附图以及根据权利要求而显而易知。
“最好比对”或“最佳比对”意指如下文所述确定的同一性百分比最高的比对。两个核酸序列之间的序列比较传统上是通过在最佳比对之后比较这些序列来进行的，所述比较通过区段或通过“比较窗口”进行以鉴定和比较相似序列的局部区域。为了进行比较，可以手动地或通过使用比对软件对序列进行最佳比对，所述比对软件例如Smith和Waterman局部同源算法(1981)、Needleman和Wunsch局部同源算法(1970)、Pearson和Lipman相似性搜索方法(1988)和使用这些算法的计算机软件(威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA和TFASTA。在一些方面，最佳比对是使用BLAST程序与BLOSUM 62矩阵或具有类似功能性的软件获得的。在两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”是通过比较这两个最佳比对序列来确定的，待比较的核酸或氨基酸序列可能包括从参考序列的添加或缺失，以进行在这两个序列之间的最佳比对。通过确定在两个序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的位置数量，通过将该相同位置数量除以所比较位置的总数并将所获得的结果乘以100得到在这两个序列之间的同一性百分比来计算同一性百分比。
如本文所用，“保守”及其语法等价物包括保守氨基酸取代，包括氨基酸残基被具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代。保守氨基酸取代可以通过修饰核苷酸序列以引入将编码保守取代的核苷酸变化来实现。一般而言，保守氨基酸取代将不会显著改变蛋白质的感兴趣的功能特性，例如，MHC I呈递感兴趣的肽的能力。具有有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括脂族侧链，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族羟基侧链，诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链，诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳族侧链，诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，诸如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链，诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。本领域技术人员将会理解，除了编码本文所述的人或人源化MHC I多肽、MHC II多肽和/或β2微球蛋白(B2M)的核酸残基之外，由于遗传密码的简并性，其他核酸序列也可能编码本文公开的多肽。因此，除了在其基因组中包含编码具有保守氨基酸取代的MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白(B2M)多肽的核苷酸序列的基因工程改造的非人动物供体之外，还提供了其基因组包含由于遗传密码的简并性而与本文所述的不同的核苷酸序列的非人动物。
如本文所用，“保守的”及其语法等价物包括分别在多核苷酸序列或氨基酸序列上的核苷酸残基或氨基酸残基，它们是在被比较的两个或更多个相关序列的相同位置上未发生改变的那些核苷酸残基或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是在比序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的那些核苷酸或氨基酸。在本文中，如果两个或更多个序列彼此100％相同，则称它们为“完全保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同但小于100％相同，则称它们为“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少30％相同、至少40％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同但小于100％相同，则被它们为“保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约30％相同、约40％相同、约50％相同、约60％相同、约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同、或约99％相同，则称它们为“保守的”。
如本文所用“无指定病原体”及其语法等价物包括指代动物、动物畜群、从其衍生的动物制品和/或不含一种或多种指定病原体的动物设施。优选地，使用此类指定病原体的定义明确的例行测试，利用确保不存在和/或破坏此类指定病原体的适当标准操作程序(SOP)和畜群畜牧和兽医护理的实践(包括本文所公开和描述的例程、测试、程序、畜牧和兽医护理)来维持此类“无指定病原体”的动物、动物畜群、由其衍生的动物制品和/或动物设施。将进一步理解的是，如本文所用，术语“不含”和类似术语当与“无病原体”结合使用时，意在表示主题病原体不存在、不是活的、无活性或以其他方式无法通过主题病原体的标准或其他测试方法检测到。病原体还可以包括但不限于新出现的感染性疾病，它们是在人群中新出现的或已经存在的但发病率或地理范围正在迅速增加，或者是由美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)A、B或C类优先病原体中的一者导致的。
如本文所用，“改变(alter/altering/altered)”和语法等价物包括对基因的任何和/或所有修饰，包括但不限于缺失、插入、沉默、修饰、重新编程、破坏、突变、重排、增加表达、敲入、敲出、和/或任何或所有其他此类修饰或其任何组合。
如本文所用，“内源基因座”及其语法等价物包括在待转化到供体动物中的动物中发现的天然基因座。
如本文所用，“功能性”(例如，在提及功能性多肽时)及其语法等价物包括保留至少一种通常与天然蛋白质相关的生物活性的多肽。例如，在一些实施方案中，在内源性基因座处的替换(例如，内源性非人MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白(B2M)基因座处的替换)导致基因座不能表达功能性内源性多肽。同样，如本文所用的关于蛋白质的功能性细胞外结构域的术语“功能性”可以是指保留其功能性的细胞外结构域，例如，在MHC I的情况下，结合抗原的能力、结合T细胞共受体的能力等。在一些实施方案中，在内源性MHC基因座处的替换导致基因座不能表达内源性MHC的细胞外结构域(例如，功能性细胞外结构域)同时表达人MHC的细胞外结构域(例如，功能性细胞外结构域)。
如本文所用的“遗传或分子标记”及其语法等价物包括多态性基因座，即在特定基因座处的多态性核苷酸(所谓的单核苷酸多态性或SNP)或多态性DNA序列。标记是指在基因组中具有固定位置的可测量的遗传特征，其通常以孟德尔方式遗传并且其可以用于将感兴趣的性状绘图。因此，遗传标记可以是短DNA序列(诸如围绕单个碱基对变化的序列，即单核苷酸多态性或SNP)、或长DNA序列(诸如微卫星或简单序列重复(SSR))。标记的性质取决于所使用的分子分析，并且可以在DNA、RNA或蛋白质水平上进行检测。可以使用分子标记来进行遗传作图，所述分子标记诸如但不限于RFLP(限制性片段长度多态性；Botstein等人(1980),Am J Hum Genet.32:314-331；Tanksley等人(1989),Bio/Technology7:257-263)、RAPD[random amplified polymorphic DNA；Williams等人(1990),NAR 18:6531-6535]、AFLP[Amplified Fragment Length Polymorphism；Vos等人(1995)NAR 23:4407-4414]、SSR或微卫星[Tautz等人(1989),NAR 17:6463-6471]。适当的引物或探针由所使用的作图方法决定。
如本文所用，“改善”及其语法等价物包括本领域的技术人员认识的任何改善。例如，改善的移植可以意味着减少超急性排斥反应，这可以涵盖减少、减轻或消除不期望的作用或症状。在一些方面，实现了临床相关的改善。
如本文所用，“基因座(Locus)”(复数(loci))或“位点”以及它们的语法等价物包括染色体上例如在其中发现基因、遗传标记或QTL的一个或多个特定位置。
如本文所用的“最小程度破坏”及其语法等价物包括供体动物基因组的改变，包括去除和替换出现在供体动物基因组上的天然碱基对的某些不同序列并且将每个这样的序列替换成包含相同数量的碱基对的合成序列，其中对供体动物基因组中的碱基对的数量没有净变化，同时不会干扰供体动物天然基因组的其他方面，包括例如内源外显子和/或内含子和天然存在于供体动物基因组中的其他密码子。本公开包括促进精确的定点诱变基因取代或修饰，该取代或修饰的设计最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，这使得供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生耐受性，而不牺牲动物的免疫功能。这包括猪供体的SLA/MHC的核苷酸的定点诱变取代，其中所述重新编程引入了不会导致天然猪供体的SLA/MHC的特定外显子区域中的任何移码或框破坏的非转基因。例如，在猪供体作为供体动物的情况下，最小程度破坏的猪供体可以包括特异性改变，即使某些SLA外显子沉默、除去或失活以调节猪供体细胞的MHC II、Ia和/或Ib类的胞外表达或不表达；重新编程某些天然的、天然存在的猪供体细胞SLA外显子以调节猪供体细胞的MHC II类的细胞外表达或不表达；保留或以其他方式不除去存在于其他工程改造的序列之中或附近的猪供体内源外显子和/或内含子；增加猪供体CTLA4和PD-1的表达；以及使根据第一方面的α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)除去或失活。
如本文所用的“直系同源物”、“直系同源的”及其语法等同物包括来自一个物种的多核苷酸对应于另一个物种的多核苷酸，其具有与基因或蛋白质或QTL相同的功能，但(通常)在序列上从具有基因或数量性状基因座的物种发生分歧时的时间点开始分歧(即基因或数量性状基因座通过物种形成从共同祖先进化而来)。
如本文所用，“数量性状基因座(QTL)”及其语法等价物包括与是所讨论性状的基础的基因密切相关的DNA延伸段(诸如染色体臂、染色体区域、核苷酸序列、基因等)。“QTL定位”涉及使用遗传或分子标记(如AFLP、RAPD、RFLP、SNP、SSR等)、可见的多态性和同工酶创建基因组图谱，并且确定在基因组上的特定区域与感兴趣的性状的遗传的关联程度。由于标记不一定涉及基因，所以QTL定位结果涉及DNA延伸段与性状的关联程度，而不是直接指向负责该性状的基因。使用不同的统计方法来确定关联程度是否显著。如果标记和基因或基因座在遗传中的关联比将从独立分类预期的更大，即标记和基因座在分离群体中共同分离并且位于同一条染色体上，则称分子标记与基因或基因座“连锁”。“连锁”是指标记与基因座或基因(或两个基因座或两个标记彼此)的遗传距离。连锁越近，发生重组事件的可能性就越小，这将标记与基因或基因座分开。遗传距离(图谱距离)是根据重组频率计算的，并且以厘摩根(cM)表示[Kosambi(1944),Ann.Eugenet.12:172-175]。
如本文所用，“捕获序列”或“参考序列”及其语法等价物包括已从样品、动物(包括人)或群体中获得、测序或以其他方式获知的核酸或氨基酸序列。例如，来自人患者的捕获序列是“人患者捕获序列”。来自特定人群的捕获序列是“人群特异的人捕获序列”。来自人等位基因组的捕获序列是“等位基因组特异的人捕获序列”。
如本文所用，“人源化”及其语法等价物包括其中内源性非人基因或等位基因的全部或一部分被直系同源的人基因或等位基因的对应部分替换的实施方案。例如，在一些实施方案中，术语“人源化”是指将内源性非人MHC基因或其等位基因或片段的编码区(例如，外显子)完全替换成人MHC基因或其等位基因或片段的对应捕获序列，然而非人动物供体的内源性非编码区(诸如但不限于启动子、5'和/或3'非翻译区、增强子元件等)不被替换。
如本文所用，“个性化”或“个体化”及其语法等价物包括适合于个体人接受者或特定人接受者亚群的需要或特殊情况的来自非人动物供体的基因、等位基因、基因组、蛋白质组、细胞、细胞表面、组织或器官。
如本文所用，“重新编程”、“重新编程的”(包括提及“免疫基因组学重新编程”)及其语法等价物是指用基于单独参考序列的直系同源核苷酸替换或取代供体动物中的内源性核苷酸，其中这种重新编程不会引入移码突变。此外，重新编程不会导致供体动物基因组中核苷酸总数的净损失或净增加，或者导致供体动物基因组中核苷酸总数的净损失或净增加等于在单独参考序列中的核苷酸数的不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过6％、不超过7％、不超过8％、不超过9％、不超过10％、不超过12％、不超过15％或不超过20％。在“重新编程”的一个实例中，内源性非人核苷酸、密码子、基因或其片段被基于人捕获序列的对应合成核苷酸、密码子、基因或其片段替换，通过该替换在供体动物序列中的碱基对总数等于人捕获序列的碱基对总数。
如本文所用，“致耐受性”及其语法等价物包括在移植时通过接受者免疫系统的反应降低所耐受的器官、细胞、组织或其他生物制品的特征。
如本文所用，“转基因”及其语法等价物包括供体动物基因组，所述供体动物基因组已经被修饰以将来自不同物种的非天然基因在非直系同源、非内源的位置引入供体动物基因组中，使得同源的、内源形式的基因(如果有)的全部或部分得以保留。如本文所用，“转基因”、“转基因的”以及语法等价物不包括如本文所述和要求保护的重新编程的基因组、敲入/敲除、它们的定点诱变取代或系列或者其他修饰。举例来说，“转基因的”猪供体包括通过在猪供体基因组中的非直系同源、非内源位置插入人基因序列而不替换那些基因的内源形式来实现的、具有或表达hCD46(“人膜辅因子蛋白”或“MCP”)、hCD55(“人衰变加速因子”、“DAF”)、人β2微球蛋白(B2M)和/或其他人基因的那些猪供体。
免疫基因组重新编程
如本文所公开，提供了针对若干种人I类和/或II类MHC分子的致耐受性非人动物供体细胞、组织和器官。
人免疫反应系统是一种抵御入侵的生物体的高度复杂且有效的防御系统。T细胞是参与细胞反应的主要效应细胞。正如抗体已被开发为治疗药物一样，赋予它们特异性的在T细胞表面上的受体(TCR)作为开发治疗药物的平台具有独特的优势。虽然抗体仅限于识别在血液和细胞外空间中的病原体或在细胞表面上的蛋白质靶标，但TCR识别在细胞表面上的MHC分子所展示的抗原(包括源自细胞内蛋白质的抗原)。取决于识别所展示的抗原并变得被激活的T细胞的亚型，TCR和具有TCR的T细胞参与控制各种免疫反应。例如，辅助T细胞通过诱导B细胞分化为抗体分泌细胞来参与体液免疫反应的调节。此外，激活的辅助T细胞通过细胞毒性T细胞启动细胞介导的免疫反应。因此，TCR特异性地识别抗体通常看不到的靶标，并且也触发携带它们的T细胞以启动各种免疫反应。
应当理解，T细胞借助于在其细胞表面上表达的TCR识别在细胞表面上呈递的抗原。TCR是二硫键连接的异源二聚体，大部分由α和β链糖蛋白组成。T细胞使用重组机制在其受体分子中产生多样性，类似于产生在B细胞中运作的抗体多样性的那些机制(Janeway和Travers,Immunobiology 1997)。与免疫球蛋白基因类似，TCR基因由在T细胞发育期间重新排列的区段构成。TCR多肽由可变区、恒定区、跨膜区和胞质区组成。虽然跨膜区锚定蛋白质，并且细胞内区域在受体被占据时参与信号传导，但是可变区负责抗原的特异性识别并且恒定区支持可变区结合表面。TCRα链仅包含由可变(V)和连接(J)区段编码的可变区，而β链包含另外的多样性(D)区段。
主要组织相容性复合物I类(MHCI)和II类(MHCII)分子在抗原呈递细胞表面上展示肽，用于随后的T细胞识别。参见图2。在人群体中，经典MHCI和II基因产物之间的等位基因变异是差异肽结合、胸腺库偏倚和同种异体移植物排斥的基础。MHC分子是对适应性免疫过程至关重要的细胞表面糖蛋白，发挥在抗原呈递细胞(APC)的表面上捕获和展示肽的功能。MHC I类(MHCI)分子在大多数细胞上表达，结合大小范围为8至10个氨基酸残基的内源性衍生的肽，并且被CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别。参见图3和图4。在另一方面，MHCII类(MHCII)仅存在于专门的APC上，结合大小从8至26个残基变化的外源性地衍生的肽，并被CD4+辅助T细胞识别。参见图5。这些差异表明，MHCI和MHCII分子接合T细胞介导的免疫反应的两个不同的臂，前者靶向侵入性病原体诸如通过CD8+CTL破坏的病毒，而后者诱导基于细胞因子的炎症介质来刺激CD4+辅助T细胞活性，包括B细胞激活、成熟和抗体产生。在一些方面，本公开的生物制品未被CD8+T细胞识别，不结合抗HLA抗体，并且对NK介导的裂解具有抗性。
人白细胞抗原(HLA)系统或复合物是编码人体中的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。这些细胞表面蛋白负责调节人体中的免疫系统。HLA基因复合物位于染色体6p21内的3Mbp延伸段上。参见图6。HLA基因高度多态，这意味着它们具有许多不同的等位基因，从而允许它们微调适应性免疫系统。参见图7。由某些基因编码的蛋白质也被称为抗原，这是由于其作为器官移植中的因子的历史发现。不同的类别具有不同的功能。参见图8和图9。
所述HLA区段被分成三个区域(从着丝粒到端粒)：II类、III类和I类。参见图10。经典的I类和II类HLA基因分别包含在I类和II类区域中，然而III类基因座带有编码参与免疫系统但与MHC分子在结构上不相关的蛋白质的基因。经典的HLA I类分子分为三种类型，即HLA-A、HLA-B和HLA-C。这些成熟的HLA I类分子中只有α链由各自的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因编码在I类HLA基因座内。参见图11。相比之下，β2微球蛋白(B2M)链由定位于染色体15上的基因编码。经典的HLA II类分子也具有三种类型(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)，每个分子的α和β链均由一对相邻的基因座编码。除了这些经典的HLA I类和HLA II类基因之外，人MHC基因座还包括许多HLA假基因以及编码非经典MHCI和MHCII分子的基因。HLA假基因表明基因复制是HLA进化的主要驱动力，然而非经典的MHCI和MHCII分子通常在免疫系统内发挥有限的功能，这与抗原呈递至αβTCR的功能截然不同。
HLA基因的范围包括高多态性、多态性、寡态性和单态性，多态性末端的上的基因有数百种同种异型。每个人细胞表达六个MHC I类等位基因(来自每个亲本的一个HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因)和六至八个MHC II类等位基因(来自每个亲本的一个HLA-DP和HLA-DQ、以及一个或两个HLA-DR、以及这些的组合)。不相同的双胞胎的任何两个个体将表达不同的MHC分子。
全部都属于HLA 1类组的与MHC I类(A、B和C)对应的HLA从细胞内部呈递肽。例如，如果细胞受到病毒感染，则HLA系统将病毒的片段带到细胞表面，以便免疫系统可以破坏细胞。这些肽是在蛋白酶体中分解的消化蛋白质产生。通常，这些特定的肽是小的聚合物，长度为约9个氨基酸。由MHC I类呈递的外来抗原吸引了破坏细胞的杀伤性T细胞(也称为CD8阳性或细胞毒性T细胞)。由MHC I类呈递的外来抗原与破坏表达该抗原的细胞的CD8阳性细胞毒性T细胞相互作用。MHC I类蛋白与β2微球蛋白缔合，β2微球蛋白与HLA蛋白不同，由染色体15上的基因编码。
除了主要基因A、B和C之外，I类还包括次要基因E、G和F(也称为Ib类基因)。这些基因的多态性低于HLA A、B和C，但作为免疫反应的调节剂发挥着重要作用。Ib类分子作为涉及移植排斥的细胞亚群表达的免疫调节细胞表面受体的配体。HLA E可以抑制CD8+T细胞和自然杀伤(NK)淋巴细胞二者的细胞毒性功能。HLA G和HLA F可以通过与NK细胞的Ig样受体结合来促进移植物耐受性。HLA G和HLA F的更高表达使细胞表面上的相应肽的水平升高，从而促进移植物耐受性，而不产生免疫抑制。1
与MHC II类(DP、DM、DO、DQ和DR)对应的HLA将抗原从细胞外部呈递给T淋巴细胞。这些特定的抗原刺激T辅助细胞(也称为CD4阳性T细胞)的增殖，其进而刺激产生抗体的B细胞产生针对该特定抗原的抗体。自身抗原被调节性T细胞抑制。已知受影响的基因编码控制MHC II类基因转录的4种不同的调节因子。这些反式作用因子为II类反式激活因子以及调节因子X(RFX)的3个亚基：含有锚定蛋白重复序列的RFX(RFXANK)、RFX家族的第五个成员(RFX5)和RFX相关蛋白(RFXAP)。每个之一的突变定义了4种不同的互补基团，分别称为A、B、C和D。
与MHC III类对应的HLA编码补体系统的组分。HLA具有其他作用。它们在疾病防御中很重要。它们是器官移植排斥的主要原因。它们可能预防癌症，或者未能预防(如果由于感染而被下调)癌症。HLA的突变可能与自身免疫性疾病有关(实例：I型糖尿病、腹部疾病)。HLA也可能与人们对其他人的气味感知有关，并且可能参与伴侣选择，因为至少一项研究发现在隔离的社区中配偶之间的HLA相似性低于预期比率。
除了编码抗原呈递蛋白的基因外，位于HLA复合物上的还有大量的其他基因，其中许多参与免疫功能。人群体中HLA的多样性是疾病防御的一个方面，并且因此，两个不相关个体在所有基因座上具有相同HLA分子的机会极低。HLA基因在历史上已被鉴定为能够在HLA相似个体之间成功移植器官的能力的结果。
I类MHC分子在所有有核细胞(包括肿瘤细胞)上表达。它们在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞等细胞上特异性地表达，并且起到将表面上的肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)展示给CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。CTL专门用于杀死任何带有由其自身的膜结合TCR识别的MHC I结合肽的细胞。当细胞展示从通常不存在的(例如，病毒、肿瘤或其他非自身来源的)细胞蛋白来源的肽时，此类肽被CTL识别，CTL变得被激活并杀死展示所述肽的细胞。
在猪中，MHC被称为猪白细胞抗原(SLA)。在猪(Sus scrofa)基因组中，SLA在图谱上位于7号染色体，它在该染色体处被着丝粒分开。它由三个区域组成：在图谱上位于7p1.1的I类和III类区域以及在图谱上位于7q1.1的II类区域。SLA复合物的大小在2.4和2.7Mb之间，具体取决于单倍型，并编码大约150个基因座，具有至少120个功能性基因。鉴于猪的大小和生理学与人相容，长期以来猪一直被认为是用于人异种移植中潜在的非人器官、组织和/或细胞来源。猪SLA可以包括但不限于由SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-4、SLA-5、SLA-6、SLA-8、SLA-9、SLA-11和SLA-12基因座编码的抗原。猪II类SLA包括由SLA-DQ和SLA-DR基因座编码的抗原。
在器官、组织和干细胞移植中，成功移植的一个挑战是找到组织类型尽可能相似的宿主和供体。因此，在器官、组织和干细胞移植中，成功的关键是找到组织类型尽可能相似的宿主和供体。组织学相容性或组织相容性是具有相同或足够相似的MHC等位基因以使得接受者的MHC不会触发免疫系统对供体的组织的排斥的性质。
在移植中，MHC分子它们自身充当抗原，引起接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。因此，从供体中消除特定MHC分子的表达将有助于减少在人接受者中对移植的猪细胞、组织和/或器官的免疫排斥。然而，MHC分子的完全消除也可以由于先天免疫反应而导致排斥。人MHC I类和II类也被称为人白细胞抗原(HLA)。为了使供体动物存活和茁壮成长，有必要保留为供体动物提供最低限度能力的免疫系统的某些MHC分子(例如SLA)。依赖于MHC基因缺失的现有技术策略对供体动物造成很大的风险，例如严重的组合免疫缺陷(SCID)。不对猪基因组重新编程的现有技术策略对人接受者造成很大的排斥风险，或者需要大量且无休止使用免疫抑制剂。
因为人群中的MHC变异非常高，所以很难或不可能获得表达的MHC分子与接受者充分相同以安全有效地移植器官和组织的用于异种移植的细胞、组织或器官。此外，人和猪之间非MHC分子的多样性和氨基酸变异是野生型猪细胞的免疫排斥的原因。异种移植物的免疫反应性可以随着供体群体中MHC的自然变异而变化。在另一个方面，人MHC的自然变异也会调节免疫反应的强度。
如图12所示，MHC I类蛋白包含细胞外结构域(其包括三个结构域：α1、α2和α3)、跨膜结构域和胞质尾。α1和α2结构域形成肽结合裂缝，而α3与β2微球蛋白(B2M)相互作用。I类分子由两条链组成：一条多态的α链(有时称为重链)和一条通常不是多态的、称为β2微球蛋白(B2M)的较小链(也称为轻链)。这两条链在细胞表面上形成非共价异源二聚体。α链包含三个结构域(α1、α2和α3)。如图12所示，α链基因的外显子1编码前导序列，外显子2和3编码α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜结构域，并且外显子6和7编码胞质尾。α链形成一个肽结合裂缝，包括α1和α2结构域(其类似于Ig样结构域)，随后是类似于β2微球蛋白(B2M)的α3结构域。
β2微球蛋白(B2M)是非糖基化的12kDa蛋白质；其功能之一是稳定MHC I类α链。与α链不同，β2微球蛋白(B2M)不跨越膜。人β2微球蛋白(B2M)基因座位于15号染色体上，由4个外显子和3个内含子区域组成。循环形式的β2微球蛋白(B2M)存在于血清、尿液和其他体液中；非共价MHC I相关的β2微球蛋白(B2M)可以在生理条件下与循环的β2微球蛋白(B2M)交换。
如图13所示，MHC II类蛋白包含细胞外结构域(其包括三个结构域：α1、α2、β1、和β1)、跨膜结构域和胞质尾。α1和β1结构域形成肽结合裂缝，而α1和β1与跨膜结构域相互作用。
除了上述抗原之外，I类抗原还包括其他抗原，称为非经典I类抗原，特别是抗原HLA-E、HLA-F和HLA-G；后者尤其由正常人胎盘的绒毛外滋养层表达，除了HLA-C外。
一般地参考图1，Peter Medawar博士深刻地说：“人怀孕的成功，其中胎儿在母体子宫内舒适地居住9个月，无视免疫学的规则。”换句话说，他观察到地球上最常见、最成功的移植是怀孕。
细胞表面标志物的滋养层表达被很好地表征，并且通过在猪细胞中在适当和必要的情况下复制这种表型来保留，可以获得关键和期望的细胞功能。根据文献，绒毛外滋养层细胞表达HLA Ia类分子(HLA-C)和所有HLA Ib类分子。与HLA-E和HLA-G在绒毛外滋养层细胞上高度表达相比，HLA-C和HLA-F表达较弱。参见例如，Djurisic等人“HLA Class IbMolecules and Immune Cells in Pregnancy and Preeclampsia,”Frontiers inImmunology,第5卷,论文652(2014)。除了MHC分子之外，PD-L1在正常妊娠的滋养层细胞中(尤其是在合胞体滋养层细胞中)被上调。HLA II类分子不存在于滋养层上，这可能有助于在母体淋巴细胞的存在下胚胎的存活和检测。参见例如，Veras等人,“PD-L1 Expressionin Human Placentas and gestational Trophoblastic Diseases,”Int.J.Gynecol.Pathol.36(2):146-153(2017)。
本发明提供了产生模拟人滋养层的细胞外构型的致耐受性异种移植猪供体细胞的方法。该方法包括但不限于去除或失活某些SLA外显子以调节猪供体细胞的MHC II类、Ia类和/或Ib类的细胞外表达或不表达；重新编程某些天然的、天然存在的猪供体细胞SLA外显子以调节猪供体细胞的MHC II类的细胞外表达或不表达；保留或以其他方式不除去存在于其他工程改造序列之中或附近的猪供体内源外显子和/或内含子；增加猪供体CTLA4和PD-1的表达；以及使根据第一方面的α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)除去或失活。引起猪供体基因组的这种表达增加和其他工程改造方面、产生模拟人滋养层的细胞外构型的致耐受性异种移植猪供体细胞的这种去除、重新编程和修饰描述如下。
以前和现在对这种未满足的临床需求的尝试正是遵循了“一刀切”的经典医学教条。我们将此称为“下游”方法，其必须与按顺序解决所有自然免疫过程相抗衡。代替采用这种受限的观点，本发明采用“患者特定”的解决方案来显著改善临床结果度量。后者是我们的方法，我们称为“上游”方法，即代表使未完成的科学工作以协调的转化医学工作结束的一种方法。我们方法的中心定理与现有和以前的教条方法相反。“下游”方法接受供体与接受者之间固有的和不可改变的差异，并专注于将干预、基因改变和/或伴随的外源性免疫抑制药物用作减少/消除/消极改变接受者自然产生的免疫反应的方法。相比之下，我们有意地选择逆转基础科学教条的其他领域的重点。代替接受在供体和接受者之间的免疫学不相容，特别是(但不限于)一种或多种主要组织相容性复合物的那些不匹配，我们在来源处改变这些催化抗原，从而消除了所有作为在供体和接受者之间的细胞、组织和器官排斥的成因效应因子的沉淀机制。这种方法适用于异种移植领域之外，包括但不限于遗传学、产科学、感染性疾病、肿瘤学、农业、畜牧业、食品工业和其他领域。
本公开在创建用于异种移植的非转基因基因重新编程的猪供体中体现了上述修饰，其中所述猪供体的MHC表面特征模拟接受者滋养层的MHC表面特征，其中来自异种移植的免疫反应显著降低。人绒毛外滋养层细胞表达HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G，但不表达HLA-A、HLA-B、HLA-DQ和HLA-DR。因此，当前的实施方案将人滋养层的独特MHC表面特征与定点诱变取代组合，以最小化或去除与异种移植相关的免疫反应，同时最小化对天然猪供体的SLA/MHC基因的脱靶效应。
人免疫反应系统是一种抵御入侵的生物体的高度复杂且有效的防御系统。T细胞是参与细胞反应的主要效应细胞。正如抗体已被开发为治疗药物一样，赋予它们特异性的在T细胞表面上的受体T细胞受体(TCR)作为开发治疗药物的平台具有独特的优势。虽然抗体仅限于识别在血液和细胞外空间中的病原体或在细胞表面上的蛋白质靶标，但TCR识别在细胞表面上的MHC分子所展示的抗原(包括源自细胞内蛋白质的抗原)。取决于识别所展示的抗原并变得被激活的T细胞的亚型，TCR和具有TCR的T细胞参与控制各种免疫反应。例如，辅助T细胞通过诱导B细胞分化为抗体分泌细胞来参与体液免疫反应的调节。此外，激活的辅助T细胞通过细胞毒性T细胞启动细胞介导的免疫反应。因此，TCR特异性地识别抗体通常看不到的靶标，并且也触发携带它们的T细胞以启动各种免疫反应。
如图2所示，T细胞借助于在其细胞表面上表达的TCR识别在细胞表面上呈递的抗原。TCR是二硫键连接的异源二聚体，大部分由α和β链糖蛋白组成。T细胞使用重组机制在其受体分子中产生多样性，类似于产生在B细胞中运作的抗体多样性的那些机制(Janeway和Travers,Immunobiology 1997)。与免疫球蛋白基因类似，TCR基因由在T细胞发育期间重新排列的区段构成。TCR多肽由可变区、恒定区、跨膜区和胞质区组成。虽然跨膜区锚定蛋白质，并且细胞内区域在受体被占据时参与信号传导，但是可变区负责抗原的特异性识别并且恒定区支持可变区结合表面。TCRα链仅包含由可变(V)和连接(J)区段编码的可变区，而β链包含另外的多样性(D)区段。
在自身主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下，TCR识别在抗原呈递细胞表面上呈递的肽抗原。由TCR识别的两种不同类型的MHC分子参与抗原呈递，即I类MHC和II类MHC分子。成熟的T细胞亚群由它们表达的共同受体分子定义。这些共同受体与TCR共同作用于MHC抗原复合物的识别和T细胞的激活。成熟的辅助T细胞在MHC II类分子的背景下识别抗原，并且通过具有共同受体CD4来区分。细胞毒性T细胞在MHC I类决定簇的背景下识别抗原，并且通过具有CD8共同受体来区分。
在人中，MHC分子被称为HLA(人白细胞抗原的首字母缩写)，并且由位于染色体6p21.3-上的HLA区域编码。8,9所述HLA区段被分成三个区域(从着丝粒到端粒)：II类、III类和I类。参见图10。经典的I类和II类HLA基因分别包含在I类和II类区域中，然而III类基因座带有编码参与免疫系统但与MHC分子在结构上不相关的蛋白质的基因。经典的HLA I类分子分为三种类型，即HLA-A、HLA-B和HLA-C。这些成熟的HLA I类分子中只有α链由各自的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因编码在I类HLA基因座内。参见图11。相比之下，由β2微球蛋白(B2M)基因编码的B2M链位于15号染色体上。经典的HLA II类分子也具有三种类型(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)，每个分子的α和β链均由一对相邻的基因座编码。除了这些经典的HLA I类和HLA II类基因之外，人MHC基因座还包括许多HLA假基因以及编码非经典MHCI和MHCII分子的基因。HLA假基因表明基因复制是HLA进化的主要驱动力，然而非经典的MHCI和MHCII分子通常在免疫系统内发挥有限的功能，这与抗原呈递至αβTCR的功能截然不同。
人白细胞抗原(HLA)基因在人群体中显示出难以置信的序列多样性。例如，仅HLA-B基因就有>4,000个已知的等位基因。据信，HLA基因中的遗传多样性(其中不同等位基因具有呈递不同抗原的不同效率)是进化赋予针对人所暴露的各种不同病原体的更好的群体水平抗性的结果。这种遗传多样性在异种移植期间也呈现出问题，其中接受者的免疫反应是决定植入结果和移植后存活的最重要因素。
在人中，经典的I类基因，称为HLA-A、HLA-B和HLA-C，由在细胞表面上形成非共价异源二聚体的两条链组成。如图12所示，α链包含三个结构域(α1、α2和α3)。α链基因的外显子1编码前导序列，外显子2和3编码α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜结构域，并且外显子6和7编码胞质尾。α链形成肽结合裂缝，该裂缝涉及α1和α2结构域(其类似于Ig样结构域)，随后是α3结构域。
β2微球蛋白(B2M)是非糖基化的12kDa蛋白质；其功能之一是稳定MHC I类α链。与α链不同，β2微球蛋白(B2M)不跨越膜。β2微球蛋白(B2M)基因座位于15号染色体上，由4个外显子和3个内含子区域组成。β2微球蛋白(B2M)结合的蛋白复合物在各种免疫系统途径中发挥关键作用，所述各种免疫系统途径包括新生儿Fc受体(FcRn)、分化簇1(CD1)蛋白、非经典的主要组织相容性复合物(MHC)和熟知的MHC I类分子。
I类MHC分子在所有有核细胞(包括肿瘤细胞)上表达。它们在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞等细胞上特异性地表达，并且起到将表面上的肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)展示给CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。CTL专门用于杀死任何带有由其自身的膜结合TCR识别的MHC I结合肽的细胞。当细胞展示从通常不存在的(例如，病毒、肿瘤或其他非自身来源的)细胞蛋白来源的肽时，此类肽被CTL识别，CTL变得被激活并杀死展示所述肽的细胞。
MHC基因座在基因组中表现出最高的多态性。所有I类和II类MHC基因都可以呈递肽片段，但每个基因表达具有不同的结合特征的蛋白质，反映了多态性和等位基因变体。任何给定的个体都具有可以在免疫反应的过程中在细胞表面上呈递给B和T细胞的一系列独特的肽片段。
除了上述抗原之外，I类抗原还包括其他抗原，称为非经典I类抗原，特别是抗原HLA-E、HLA-F和HLA-G；后者尤其由正常人胎盘的绒毛外滋养层表达，除了HLA-C外。
MHC II类蛋白包含细胞外结构域(其包括三个结构域：α1、α2、β1、和β1)、跨膜结构域和胞质尾，如图13所示。α2和β2结构域形成肽结合裂缝，而α1和β1与跨膜结构域相互作用。
关于MHC-I蛋白，本公开要么失活，要么在必要时保留“寻找和替换”具有HLA类似物的直系同源SLA蛋白的功能，这将导致最少的免疫识别。根据第一方面，此类基因修饰在本文中可称为“选择性沉默”(及其语法变体)。在一些方面，沉默编码并负责表达SLA-1的基因去除了高度有问题的和多态性的HLA-A类似物。类似地，与SLA-2相关的基因的失活或完全去除将减少由错配的HLA-B蛋白所施加的负担。在细胞表面界面，这将向人接受者的T细胞中显露为HLA-A和HLA-B阴性细胞。对于最后一个经典的MHC I类蛋白HLA-C，使用参考HLA-C序列对编码SLA-3的基因进行定点诱变将模拟利用这种差异的同种异体移植。鉴于与HLA-A和HLA-B相比，HLA-C具有“较少多态性”的性质，这将通过用基于在自然界中天然流行的HLA-C亚类的参考替换序列来替换SLA-3，并且还调用允许将提供众多已知和那些未知的MHC-I依赖性过程的功能和不中断的最低但必需的表达水平的机制得到进一步改善。
关于MHC-I蛋白，本公开要么失活，要么在必要时保留“寻找和替换”具有HLA类似物的直系同源SLA蛋白的功能，这将导致最少的免疫识别。在一些方面，沉默编码并负责表达SLA-1的基因去除了高度有问题的和多态性的HLA-A类似物。类似地，与SLA-2相关的基因的失活或完全去除将减少由错配的HLA-B蛋白所施加的负担。在细胞表面界面，这将向人接受者的T细胞中显露为HLA-A和HLA-B阴性细胞。对于最后一个经典的MHC I类蛋白HLA-C，使用参考HLA-C序列对编码SLA-3的基因进行定点诱变将模拟利用这种差异的同种异体移植。鉴于与HLA-A和HLA-B相比，HLA-C具有“较少多态性”的性质，这将通过用基于在自然界中天然流行的HLA-C亚类的参考替换序列来替换SLA-3，并且还调用允许将提供众多已知和那些未知的MHC-I依赖性过程的功能和不中断的最低但必需的表达水平的机制得到进一步改善。
此外，非经典的MHC蛋白(包括在I-b类别中的那些，其包括HLA-E、F和G)的表达对于胎儿的存活和滋养层的协同存在两者都至关重要。幸运的是，这些的多态性显著低于“经典的”MHC-Ia多样性。在没有这些表达的情况下，细胞裂解的增强上调是NK细胞识别的直接结果并且观察到激活。以与对MHC-Ia组分所描述的相同方式，具有HLA类似物的直系同源SLA蛋白要么被失活，要么在必要时“寻找和替换”。图14显示了包括在本公开中的特定改变。
HLA-G可以是一种有效的免疫抑制性和致耐受性分子。HLA-G在人胎儿中的表达可以使得人胎儿逃避母体免疫反应。迄今为止，尚未报告对同种异体HLA-G的刺激功能或反应。HLA-G可以是非经典的HLA I类分子。其可以在其遗传多样性、表达、结构和功能方面与经典的MHC I类分子不同。HLA-G可能以低等位基因多态性为特征。HLA-G的表达可能限于滋养层细胞、成人胸腺髓质和干细胞。HLA-G基因(HLA-6.0基因)的序列已由GERAGHTY等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,9145-9149)进行描述：它包含4,396个碱基对并且表现出与HLA-A、HLA-B和HLA-C基因同源的内源外显子和/或内含子组织。更准确地说，此基因包含8个外显子和一个未翻译的3'UT末端，分别具有以下对应关系：外显子1：信号序列，外显子2：α1结构域，外显子3：α2结构域，外显子4：α3结构域，外显子5：跨膜区，外显子6：胞质结构域I，外显子7：胞质结构域II，外显子8：胞质结构域III，以及3'非翻译区(GERAGHTY等人，上文所提及，ELLIS等人,J.Immunol.,1990,144,731-735)。然而，HLA-G基因与其他I类基因的不同之处在于其框内翻译终止密码子位于外显子6的第二个密码子；因此，由该基因HLA-6.0编码的蛋白质的胞质区比HLA-A、HLA-B和HLA-C蛋白的胞质区短得多。
自然杀伤(NK)细胞介导的免疫(包括细胞毒性和细胞因子分泌)在对许多自体和同种异体细胞的生物抗性中起主要作用。靶细胞识别的常见机制似乎是在细胞表面上的自身MHC I类肽复合物的缺乏或修饰，这可能导致病毒感染细胞、肿瘤细胞和主要组织相容性MHC不相容的移植细胞的清除。最近已经发现并克隆了KIR'，其是在NK细胞上表达的Ig超家族的成员。KIR'对多态性MHC I类分子具有特异性，并且在配体结合时产生负信号，这导致在大多数系统中保护靶细胞免受NK细胞介导的细胞毒性。为了防止NK细胞自身免疫性(即正常自体细胞的裂解)，据信个体的每个给定NK细胞表达识别自体HLA-A、B、C或G等位基因中的至少一种的至少一种KIR。
根据本公开，在猪供体至人异种移植的上下文中，每个人接受者将具有该个体独特的主要组织相容性复合物(MHC)(I类、II类和/或III类)，并且极不可能匹配猪供体的MHC。因此，当将猪供体移植物引入接受者时，猪供体MHC分子它们本身充当抗原，引起来自接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。
根据本公开的这一方面(即，将SLA/MHC重新编程以特异性地表达所选择的人MHC等位基因)，当应用于用于异种移植目的猪供体细胞、组织和器官时与来自缺乏这种重新编程的野生型猪供体或以其他方式基因工程改造的猪供体(例如转基因猪供体或具有非特定或不同基因修饰的猪供体)的细胞、组织和器官相比将减少排斥。
结合先前的修饰，插入或激活如母体胎儿共生所见将产生保护性的局部免疫反应的另外的细胞外配体将是最小化可能由于次要抗原差异而保留的有害的细胞介导的免疫功能的另外步骤。因此，用人对应物MICA将SLA-MIC2的猪配体进行直系同源重新编程。人主要组织相容性复合物I类链相关基因A(MICA)是在内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞、上皮细胞和许多肿瘤上表达的一种细胞表面糖蛋白。其位于人6号染色体的短臂上，并且由7个外显子组成，其中5个外显子编码MICA分子的跨膜区。在正常状态下的MICA蛋白在上皮组织中的表达水平低，但响应于各种细胞应激的刺激而上调。MICA被归类为非经典的MHC I类基因，并且充当由在NK细胞和CD8+T细胞的表面上表达的激活受体NKG2D识别的配体(atlasgeneticsoncology.org/Genes/MICAID41364ch6p21.html)。
此外，PD-L1、CTLA-4等的猪配体被过表达和/或以其他方式用人对应物进行直系同源重新编程。PD-L1是一种跨膜蛋白，在抑制妊娠、同种异体移植物和自身免疫性疾病中的适应性免疫系统方面具有重要作用。它由人的CD274基因编码并且位于9号染色体。PD-L1与PD-1(一种在激活的T-细胞、B-细胞和骨髓细胞上发现的受体)结合，以调节激活或抑制。特别地，PD-L1与T细胞上的受体PD-1的结合抑制了IL-2产生和T细胞增殖的激活。CTLA4是一种也充当下调免疫反应的免疫检查点的蛋白质受体。其由CTLA4基因编码，并且位于人的2号染色体上。它在调节性T细胞上组成型表达，但在活化的T细胞中上调。CTLA-4和PD-L1的基因表达增加，例如，基于它们的重新编程性启动子。在基因型与CTLA-4或PD-L1表达之间存在关系。例如，在CTLA4启动子的-318位置处携带胸腺嘧啶(T(-318))且外显子1的位置49处的腺嘌呤是纯合的个体显示出细胞刺激后细胞表面CTLA-4和非刺激细胞中的CTLA-4mRNA二者的表达显著增加，载于Ligers A等人CTLA-4gene expression is influencedby promoter and exon 1polymorphisms,Genes Immun.2001年5月；2(3):145-52，该文献以引用的方式整体并入本文用于所有目的。使用PD-L1启动子重新编程可以实现类似的上调以过表达PD-L1。
此外，用人对应物对内皮蛋白质C受体(EPCR)、血栓调节蛋白(TBM)、组织因子途径抑制剂(TFPI)等的抗凝血剂猪配体进行直系同源重新编程，如图14所示。内皮蛋白质C受体是由位于人20号染色体的PROCR基因编码的内皮细胞特异性跨膜糖蛋白。其增强了蛋白质C(一种抗凝血剂丝氨酸蛋白酶)的激活，并且在激活的蛋白质C介导的细胞保护信号传导中具有关键作用。血栓调节蛋白是存在于内皮细胞表面上的一种完整的膜糖蛋白。其由位于人20号染色体的THBD基因编码。除了在抗凝血剂途径中凝血酶诱导的蛋白质C激活中充当辅因子之外，其还在调节C3b失活方面发挥作用。组织因子途径抑制剂(TFPI)是一种通过抑制因子Xa充当天然抗凝血剂的糖蛋白。其由位于人2号染色体的TFPI基因编码，并且蛋白质结构由三个串联的Kunitz结构域组成。在人中，存在两种主要的TFPI亚型，TFPIα和TFPIβ。TFPIα由三个抑制结构域(K1、K2和K3)和一个带正电荷的C末端组成，而TFPIβ由两个抑制结构域(K1和K2)和C末端组成。虽然已知K1和K2结构域分别结合和抑制因子VII和因子Xa，但K3的抑制功能未知。在某些方面，本公开集中于(断言)不需要在移植手术后移植接受者普遍和有害地使用外源性免疫抑制药物(或延长的免疫抑制方案)以延长挽救生命的器官的低免疫原性和/或致耐受性细胞、组织和器官的产生。
图14中提供的表格显示了展示各种编辑的总和以产生模拟人滋养层的细胞外构型的致耐受性异种移植猪供体细胞的的概念设计。如图14所展示，SLA-1(一种与HLA-A直系同源的猪供体基因)，被沉默以模拟滋养层，因为HLA-A不在滋养层上表达。如图14中进一步展示，SLA-8(一种与HLA-G直系同源的猪供体基因)通过替换为“人捕获”参考序列而被人源化，因为HLA-G在滋养层中表达并且鉴于其与NK细胞的相互作用而在母体胎儿耐受性方面具有关键作用。
因此，应当理解，可以将具有一系列生物学特性，包括但不限于基因组修饰和/或其他基因工程改造的特性的多种源动物用于降低由异种移植引起的在人体内的免疫原性和/或免疫排斥(例如，急性排斥、超急性排斥和慢性排斥)。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免血栓性微血管病。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免肾小球病。将进一步理解的是，本文列出的源动物的列表不是限制性的，并且本发明涵盖具有单独或组合用于降低免疫原性和/或免疫排斥的一种或多种修饰(基因的或其他方式)的任何其他类型的源动物。
为了重新编程在猪供体白细胞抗原(SLA)与人白细胞抗原(HLA)之间的MHC差异，本公开包括在这两个物种之间使用高度保守的MHC-基因座，例如，在功能上对应的众多基因。MHC Ia类、HLA-A、HLA-B和HLA-C在猪供体中有一个类似的伴侣(分别为SLA 1、2和3)。在根据本公开的免疫基因组学重新编程期间，在MHC II类中还有许多待利用的匹配。
如图15所示，MHC基因分为三类；I类、II类和III类，所有这些类别都编码在人6号染色体上。MHC基因是猪供体和人基因组中最具多态性的基因之一，MHC多态性被认为在提供进化优点方面很重要；序列的变化可以导致肽结合的差异，从而使病原体更好地呈递给细胞毒性T细胞。
已知的人HLA/MHC或单个接受者的测序的HLA/MHC序列可以用作模板来用精确的取代重新编程猪供体白细胞抗原(SLA)/MHC序列以与已知的人HLA/MHC序列或人接受者的HLA/MHC序列匹配，例如具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同源性。在鉴定待使用的已知人接受者HLA/MHC序列或对人接受者进行基因测序以获得HLA/MHC序列后，3可以根据所需的HLA/MHC序列对猪供体细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。例如，向本公开的猪供体施用几种靶向引导RNA(gRNA)序列，以用人接受者的模板HLA/MHC序列对猪供体细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。
如本文所用，术语“MHC I复合物”等包括在MHC Iα链多肽与β2微球蛋白(B2M)多肽之间的复合物。如本文所用，术语“MHC I多肽”等包括单独的MHC Iα链多肽。通常，术语“人MHC”和“HLA”可以互换使用。
出于修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC的目的，已对人和猪供体组织相容性复合物的比较基因组组织进行作图，如图16和图17所示。例如，这种SLA到HLA作图可以在以下文献中找到：Lunney,J.,“Molecular genetics of the porcine donor majorhistocompatibility complex,the SLA complex,”Developmental and ComparativeImmunology 33:362-374(2009)(“Lunney”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。此外，通过将HLA的基因座和各种HLA基因的示意性分子组织(如图12和图13所示)与SLA的基因座和各种SLA基因的示意性分子组织(如图17和图18所示)进行比较，很容易看出外显子在细胞外和跨膜结构域中的位置和数量在HLA MHC和SLA MHC之间是共同的。因此，鉴于本公开并使用Lunney等人的作图作为参考工具，本领域普通技术人员有效且高效地对猪供体细胞进行基因重新编程。
猪供体的SLA/MHC基因在产生替换模板时用作参考模板。在实施本公开时，可以通过在线档案或数据库诸如Ensembl(http://vega.archive.ensembl.org/index.html)获得猪供体的SLA/MHC基因。如图19、图20、图21和图22所示，绘制了SLA-DQA和SLA-DQB基因的准确位置、各自基因(内源外显子和/或内含子)的长度、以及SLA-DQA和SLA-DQB的准确核苷酸序列。在本公开的替代性方面，可以对猪供体的SLA/MHC基因进行测序。在本公开的替代性方面，可以对猪供体的全基因组进行测序。在一个方面，可以用作参考模板的所测序的猪供体SLA/MHC基因包括但不限于SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、SLA-DQ和β2微球蛋白(B2M)。在另一个方面，可以用作基础模板的所测序的猪供体SLA/MHC基因包括但不限于SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQA、SLA-DQB和β2微球蛋白(B2M)的外显子区域。在一些方面，重新编程的SLA区域的其他SLA和内源外显子和/或内含子区域未被破坏，从而产生提供在移植到人体中时具有致耐受性的细胞、组织和器官的最小破坏的重新编程的猪供体基因组。
根据本发明的一个方面，向猪供体提供了被生物工程改造以表达一组特定的已知人HLA分子的基因组。例如从IPD-IMGT/HLA数据库(可获自ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)和internationalImMunoGeneTicsinformationsystem(可获自imgt.org)中可以获得此类HLA序列。此类基因的命名法在图23中展示出。例如，HLA-A1、B8，DR17是白种人中最常见的HLA单倍型，频率为5％。因此，可以使用已知的MHC/HLA序列信息结合本文提供的公开内容来执行所公开的方法。HLA序列可通过在线档案或数据库诸如Ensembl(vega.archive.ensembl.org/index.html)获得。如图24所示，可以获得HLA-DQA基因的准确位置、相应基因(外显子和内源外显子和/或内含子)的长度以及HLA-DQA的准确核苷酸序列。
在一些方面，鉴定出接受者的人白细胞抗原(HLA)基因和MHC(I类、II类和/或III类)并对其进行作图。将理解的是，能以本领域已知的任何方式来确定人接受者的HLA/MHC序列。例如，HLA/MHC基因通常用靶向测序方法(长读测序或长插入短读测序)进行分型。常规上，已经以2位数分辨率(例如，A*01)确定了HLA类型，其近似于血清抗原分组。最近，已经将序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)方法用于以4位数分辨率(例如，A*01:01)进行HLA分型，这可以区分氨基酸差异。当前，与其他常规方法相比，用于HLA分型的靶向DNA测序是最流行的HLA分型方法。由于基于序列的方法直接确定编码区域和非编码区域，因此其可以实现分别以6位数分辨率(例如A*01:01:01)和8位数分辨率(例如A*01:01:01:01)进行HLA分型。从临床角度来看，以最高分辨率进行HLA分型期望将现有HLA等位基因与新等位基因或无效等位基因区分开。此类测序技术描述于例如Elsner HA,Blasczyk R:(2004)Immunogeneticsof HLA null alleles:implications for blood stem cell transplantation.Tissueantigens.64(6):687-695；Erlich RL等人(2011)Next generation sequencing for HLAtyping of Class I loci.BMC genomics.12:42-10.1186/1471-2164-12-42；Szolek A等人(2014)OptiType:Precision HLA typing from next-generation sequencingdata.Bioinformatics30:3310–3316；Nariai N等人(2015)HLA-VBSeq:Accurate HLAtyping at full resolution from whole-genome sequencing data.BMC Genomics 16:S7；Dilthey AT等人(2016)High-accuracy HLA type inference from whole-genomesequencing data using population reference graphs.PLoS Comput Biol 12:e1005151；Xie C.等人(2017)Fast and accurate HLA typing from short-read next-generation sequence data with xHLA 114(30)8059-8064中，将所述文献中的每一篇以全文引用的方式并入本文。
异种移植物上的MHC I类表达的完全破坏已经显示出对动物的生存力产生不利影响。在一项研究中，通过靶向猪β2微球蛋白(B2M)基因的外显子2，SLA I类在猪细胞上的表达被消除。所产仔猪的基因组测序显示出在导致移码、过早终止密码子(TAA、TAG或TGA)或者这些中的1、2和/或3个的依次组合的β2微球蛋白(B2M)基因座处具有修饰，并且在一些情况下，可以取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对，并最终进行功能性敲除。然而，该研究的仔猪由于意外的疾病过程没有存活超过4周，表明这种破坏性的基因修饰可能对动物的生存能力具有负面影响。Sake,H.J.等人Possibledetrimental effects of Beta-2-Microglobulin(B2M)knockout inpigs.Xenotransplantation.2019；26:e12525。
在一个方面，为猪供体的SLA/MHC核苷酸的定点诱变取代产生了替换模板，其中所述重新编程引入了不会导致天然猪供体SLA/MHC的特定外显子区域中的任何移码或框破坏的非转基因的最低要求的改变。替换模板的核苷酸序列通过以下方式来鉴定：a)从移植接受者获得含有DNA的生物样品，b)对移植接受者样品中的MHC I类和II类基因进行测序，c)在不同基因座将接受者的核苷酸序列与猪供体的核苷酸序列进行比较，以及d)为所述基因座中的一个或多个产生替换模板，其中如下文进一步所述。
图25A和图25B中的电子表格分别显示了三名个体接受者的DQA和DQB的外显子的人捕获参考序列。如上文所提及，已知的人HLA/MHC或单个接受者的经测序的HLA/MHC序列可用作模板，所述模板通过精确取代猪供体白细胞抗原(SLA)/MHC序列来重新编程至匹配。如图25C所示，可以在核苷酸序列文库中比较通过在线数据库获取的已知人HLA-DQA和个体接受者的测序的HLA-DQA。图26D显示了通过在线数据库获取的猪供体SLA-DQA的外显子2区域与已知和测序的接受者HLA-DQA的比较。SLA-DQA和HLA-DQA的外显子2区域均包含249个核苷酸。如图25D所示，可以观察到在SLA-DQA和HLA-DQA的外显子2区域之间比对的249个核苷酸中有11％完全不同。因此，本公开公开了鉴定在人和猪供体MHC复合物的特定外显子处的非保守核苷酸序列的方法。此外，通过使用已知或测序的人捕获参考模板，可以进行定点诱变，其中在SLA基因的特定外显子区域与已知或接受者的HLA基因的特定外显子区域之间的特定非保守核苷酸序列被替换而不会导致任何移码。SLA-DQA和SLA-DQB基因的定点诱变如图26A和图26B所示，其中将接受者特异性HLA-DQA和HLA-DQB的外显子2区域的核苷酸序列用于产生人捕获替代序列。因此，使用对MHC基因的外显子区域特异的合成替换模板，导致不会引起天然猪供体的SLA/MHC基因发生任何移码或框破坏的非转基因的最小程度破坏的基因组。
导致移码的破坏性基因修饰可以对动物的生存能力具有负面影响。因此，本发明公开了在不引起MHC基因移码的情况下抑制MHC蛋白的表达的方法。图25E和图25F中的电子表格分别显示了三名个体接受者的DR-A和DRB的外显子的人捕获参考序列。如图26C和图26D所示，通过将前导外显子1的初始三个核苷酸序列替换为终止密码子，可以抑制DR分子的表达而不导致移码。具体而言，对于HLA-DRA和DRB，外显子1的初始三个序列ATG被替换成终止密码子TAA。因此，通过使用合成替换模板，本发明提供了抑制所需MHC分子的表达的方法，其中基因组的非转基因的最小改变不会导致天然猪供体SLA/MHC基因的任何移码或框破坏。
此外，包含每种MHC-I蛋白的异源二聚体结构的β2微球蛋白(B2M)是物种特异性的。基于猪基因组组装SSC10.2，在猪1号染色体中鉴定出编码整个B2M蛋白的约45.5kb的区段重复，其中所述B2M基因的功能性重复被鉴定为在猪的两个拷贝之间具有完全相同的编码序列。对十种哺乳动物物种中的B2M重复的系统发育分析证实了鲸偶蹄目动物(如牛、绵羊、山羊、猪和鲸鱼)中存在B2M重复，但在非鲸偶蹄目动物(如小鼠、猫、狗、马和人)中不存在B2M重复。发现在重复块的边缘的长散布核元件(LINE)的密度(39％至66％)比猪基因组的平均值(20.12％)高2至3倍，表明其在重复事件中的作用。猪中的B2M mRNA表达水平分别比人和小鼠高12.71和7.57倍(2-ΔΔCt值)。在仅鲸偶蹄目动物的基因组中鉴定出部分剩余的重复B2M序列表明该事件是谱系特异性的。B2M复制可以通过增加MHC I类轻链蛋白B2M的可用性以与猪中由相对大量的MHC I类重链基因编码的蛋白质复合来有益于猪的免疫系统。如图27所示，可以观察到相对于MHC I类分子的B2M分子。进一步如上文所述并如图27所示，猪供体具有重复的B2M基因，而人只有一个。因此，在本公开的一个实施方案中，猪供体B2M基因的第一拷贝通过定点诱变被重新编程，如先前所公开的。如图28所示，将猪供体B2M的外显子2的氨基酸序列与人的氨基酸序列进行比较，其中鉴定出非保守区域。此外，猪供体B2M基因的第二拷贝的表达通过使用终止密码子(TAA、TAG或TGA)或者这些中的1、2和/或3个的依次组合来抑制，并且在一些情况下，可以取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对，如上文所公开。因此，在本公开的一个实施方案中包括基因修饰，其中猪供体B2M基因的第一拷贝通过定点诱变被重新编程并且第二重复的B2M基因不表达，其中所述重新编程不导致B2M基因移码。
试验猪细胞系的选择和表征
原代巨噬细胞和其他抗原呈递细胞(APC)可用于研究免疫反应，然而原代细胞的长期使用受到细胞寿命短的限制。此外，原代细胞在细胞衰老之前只能进行一次基因工程改造和评价。在猪模型中，研究人员已经频繁地使用猪主动脉内皮细胞(PAEC)进行这些类型的研究。具有巨噬细胞或代表性APC的所需特征(MHC I类和II类分子和CD80/86的表达)的永生化细胞系将是对基因组进行多重修饰并使用相同遗传背景解决对免疫反应性的影响的理想选择。产生活的永生化猪细胞系的能力仅限于与异种移植中的免疫反应研究无关的成纤维细胞和上皮细胞系。
永生化猪肺泡巨噬细胞(PAM)系是从猪的长白猪(Landrace)品系[Weingartl2002]中开发的，并且可通过[3D4/21,ATCC CRL-2843TM]商购获得。另一种这种细胞系是3D4/2(/>CRL-2845TM)。细胞系显示出一定百分比的非特异性酯酶和吞噬作用，这取决于培养基的条件。细胞可以在无血清条件下以贴壁依赖性或以集落形式生长。检测到骨髓/单核细胞标志物(例如CD14)。永生化细胞系的理想特征是MHC I类和II类。显示MHC I类在所有细胞上广泛表达，然而，3D4/21细胞的MHC II类(DR和DQ)表达最初报告为低水平(18％和4％)。PAEC已经显示出被活化，并且DR表达可以随着暴露于IFN-γ而上调。使3D4/21细胞暴露于IFN-γ，在暴露于IFN-γ24小时后，II类表达使DR从29.68％增加至42.27％，DQ从2.28％增加至57.36％。此外，CD80/86在细胞表面上表达，这些糖蛋白对于T细胞激活和增殖的第二信号是必不可少的。PAM细胞(34D/21)具有猪APC的所需特征，其中可以使用永生化细胞系记录在与MHC相关的基因中的遗传变化并且可以使用流式细胞术评估所产生的表型变化以解决所关注的糖蛋白的表达或缺乏表达和细胞免疫反应(混合淋巴细胞反应(MLR))。
为了测试细胞免疫反应，建立了一种单向MLR，其中一组细胞被鉴定为刺激细胞，这些细胞是供体细胞或未经修饰或经修饰的PAM细胞，并且另一组细胞是应答细胞，这些是来自接受者的细胞(这些可能来自享有相似的MHC分子表达的接受者)，是经修饰的PAM细胞。刺激者细胞用药剂处理以防止细胞增殖，并且这可以是辐射或与丝裂霉素C一起孵育，丝裂霉素C共价交联DNA，从而抑制DNA合成和细胞增殖。因此，刺激细胞在培养物中不增殖，然而应答细胞响应于MHC I类和II类的相互作用而增殖，并且正是这种增殖在MLR中被测量。制备含有刺激细胞和应答细胞两者的细胞培养物并将其孵育5-7天，并且测量增殖/激活。增殖可以通过在5或7天结束时在增殖时掺入DNA中的放射性胸苷[3HTdr]或BrdU[胸苷的类似物]的量来测量。
MLR的组合。应答细胞可以是PBMC、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其他T细胞亚群。PBMC代表在接受者中存在的所有免疫细胞，并且测量的反应反映了应答者对刺激细胞[未经修饰或经修饰的PAM细胞]产生免疫反应的能力。测量的增殖由分别与MHC II类和I类相互作用的CD4+和CD8+T细胞两者组成。仅使用针对未经修饰或经修饰的PAM细胞的CD4+T细胞是为了测量对MHC II类糖蛋白DR和DQ的反应。为了观察对DQ的特异性反应，在培养物中不存在人抗原呈递细胞(APC)，使得细胞反应不是由APC呈递的猪抗原的结果。同时，应答CD8+T细胞被用于评估对MHC I类糖蛋白SLA1和2的免疫反应。这种类型的分析消除了PBMC中存在的应答APC对免疫反应的贡献。比较数据将证明这些各自的糖蛋白对遗传定义的应答者的免疫反应的贡献，并且反映了对PAM细胞进行的基因修饰。
基因工程改造的PAM细胞的流式细胞术、表型分析。分析基因工程改造的细胞(例如，来自基因工程改造的动物的细胞或离体制备的细胞)的细胞表型，以测量由被修饰的基因编码的糖蛋白表达的变化。将细胞与带有荧光标记的抗体一起孵育，所述荧光标记结合所关注的糖蛋白，并且使用流式细胞术分析标记的细胞。对未经修饰的PAM细胞进行了分析，以鉴定MHC I类、II类(DR和DQ)和CD80/86的表达。经修饰的PAM细胞中的变化将参考此数据库。流式细胞术还将用于表征由SLA 3、6、7和8的基因编码的糖蛋白的表达，因为PAM细胞中的基因被与HLA C、E、F和G相关的接受者特异性序列修饰。
此外，这种类型的分析还用于确保由被敲除的基因编码的糖蛋白不被表达。此技术还可以用于从具有混合表型的细胞池中分选出基因工程改造的细胞。
可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定以确定抗HLA抗体是否识别来自本公开的生物制品的细胞。可以使用通过添加含有先前表征的抗HLA抗体(或对照血清)的特定人血清制备的测定板。将经IFN-γ处理的供体细胞重悬并添加至测定板中，与补体来源(例如兔血清)一起孵育。在室温下孵育至少1小时之后，添加吖啶橙/溴化乙锭溶液。通过以下方式确定细胞毒性百分比：对在荧光显微镜下可视化的死细胞和活细胞计数，减去在不存在抗HLA抗体的情况下获得的自发裂解值，并用量表评分。
NK细胞反应性，调节以降低细胞毒性。通过NK细胞(单独或组合)激活、识别和消除靶细胞的潜在机制诱导其裂解颗粒(穿孔素、颗粒酶和溶细胞素)内容物的释放。例如，NK细胞通过抑制性NK细胞受体识别在靶细胞上自身主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的缺乏，从而导致直接的NK细胞毒性。异种移植就是这种情况。NK细胞受HLA C调节，HLA C被抑制性NK细胞抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、KIR2DL2/2DL3、KIR2DL1和KIR3DL1识别。NK细胞抑制受体免疫球蛋白样转录物2(ILT2)与MHC I类和CD94-NKG2A识别的HLA-E相互作用。HLA F和G在滋养层细胞上具有相似的作用。可以在体外测量接受者NK细胞对未经修饰的PAM细胞的细胞溶解活性，其中将人NK细胞添加到未经修饰的PAM细胞的贴壁单层中并培养4小时。细胞裂解通过放射性Cr51的释放或通过流式细胞术测量的发色团来测量。可以使用这种细胞毒性测定来评估具有经修饰的SLA 3、6、7或8以分别反映HLA C、HLA E、HLAG或HLA F的PAM细胞。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
进行了一项研究，通过流式细胞术鉴定了IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激对从(3D4/21细胞，目录号CRL-2843TM)购买的猪肺泡巨噬细胞(PAM)表型的影响。
PAM细胞在RPMI-1640/10％ FBS中解冻，并在三个不同的培养板中培养两天。在第3天，对于巨噬细胞激活，将培养基更换为含有100ng/mL IFN-γ(板1)和100ng/mL IFN-γ加10ng/mL LPS(板2)的RPMI-1640/20％FBS培养基。在RPMI-1640/20％ FBS中的未经处理的细胞用作对照(板3)。孵育24小时后，使用TrypLE处理将贴壁细胞从板上分离。将细胞重悬于FACS缓冲液(1X PBS pH＝7.4、2mM EDTA、0.5％ BSA)中。通过台盼蓝排除法确定细胞计数和生存能力。在4℃下，将总共1x 105个细胞用小鼠抗猪SLA I类、SLA II类DR、SLA II类DQ抗体染色30分钟，并用APC偶联的CD152(CTLA-4)-mulg融合蛋白(结合至猪CD80/CD86)染色45分钟。使用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并将抗体染色的细胞重悬于100μL含有抗小鼠APC偶联的多克隆IgG二抗的FACS缓冲液中。随后在4℃下孵育30分钟。使用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。将所有细胞重悬于200μL FACS缓冲液中。在Novacyte流式细胞术中获取样品，并使用NovoExpress分析数据。
分析程序基于NovoExpress流式细胞术分析软件。任何等效的软件都可以用于数据分析。取决于所使用的软件，分析演示可能略有不同。门控可能命名不同，并且％值可能略有不同。
如图29所示，未经处理的PAM细胞分别导致99.98％、29.68％和2.28％的SLA I类、SLA II类DR和DQ分子表达。这些细胞为4.81％CD80/86+。在IFN-γ的存在下培养细胞24小时增加了所有SLA分子表达(99.99％ SLA I类+伴有中值荧光强度增加、42.27％ DR+、57.36％ DQ+)和CD80/86水平(47.38％)。与仅用IFN-γ处理的细胞相比，含IFN-γ的细胞与LPS导致相似水平的SLA分子和CD80/86表达。
将PAM细胞用猪IFN-γ处理24小时，并用一级mAb和荧光素缀合的二抗和对共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)具有高亲和力的APC缀合的CD152染色。在用IFN-γ处理后，与未刺激的PAM细胞相比，这些细胞显示出增加的SLA和CD80/86共刺激分子表达。虽然未刺激的细胞为99.98％ SLA I类+、29.68％ DR+2.28DQ+和4.81％ CD80/86+，但IFN-γ刺激的细胞为99.99％ SLA I类+、42.27％ DR+、57.36％ DQ+、47.38％CD80/86+。与仅用IFN-γ处理的细胞相比，含有IFN-γ细胞与LPS导致相似水平的SLA分子和CD80/86表达。
在基础条件下，巨噬细胞表达低水平的SLA II类和CD80/86共刺激分子。IFN-γ和IFN-γ-LPS处理24小时诱导SLA II类和CD80/86共刺激分子以及SLA I类分子的表达。延长孵育将可能进一步增加这些分子的表达。
此外，还进行了一项研究，以评价人PBMC(外周血单核细胞)、CD8+和CD4+阳性T细胞在与猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞共培养时的免疫增殖反应性。将人供体PBMC或它们的CD4+T细胞与未经处理的、IFN-y激活的和负载KLH的PAM细胞共培养7天。如图30A和图30B所示，分别使用从供体#11、#50和#57分离的细胞作为阳性和阴性对照进行单向同种异体和自体MLR实验。对丝裂霉素C(X)处理的和未经处理的PAM细胞以及每种人供体细胞进行背景对照。使用溴脱氧尿苷(BrdU)ELISA测定来确定增殖反应。在第6天，BrdU添加完成。在第7天收集培养基用于细胞因子(IFN-y和IL-2)分析并确定增殖反应。在共培养的第7天，在OlympusCK40显微镜下以200X放大倍数观察细胞。
如图31所示，在IFN-γ的存在下培养PAM细胞72小时使SLA II类DQ分子表达从2.55％增加到95.82％。负载KLH的PAM细胞导致与未经处理的细胞相似水平的SLA II类DQ分子表达。所有同种异体对照均具有超过基线值的阳性增殖反应，并且丝裂霉素C处理的PBMC和PAM细胞与基线值相比具有降低的增殖反应。如图32A和图32B所示，人PBMC和CD4+增殖反应导致同种异体反应高于PAM细胞的异种反应。三种不同的人CD4+T细胞的增殖反应显示出类似的异种反应，其中PAM细胞SI(刺激指数)值介于15和18.08之间。在来自PBMC供体#57的异种培养物中增殖反应最高(SI w/PAM，PAM-IFN-γ，KLH＝3.12、2.75和3.79)。
试验猪细胞的基因重新编程
可以利用已知的基因组编辑技术进行基因修饰，所述基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑以及成簇的规则间隔回文重复序列Cas9(CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9)。这些可编程核酸酶能够实现DNA双链断裂(DSB)的靶向产生，这促进了细胞修复机制的上调，从而导致非同源末端连接(NHEJ)或同源指导的修复(HDR)的易错过程，后者用于整合外源供体DNA模板。CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9也可用于对遗传物质进行精确修饰。例如，能以在以下文献中所描述的方式进行经由CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9的基因修饰：Kelton,W.等人,“ReprogrammingMHC specificity by CRISPR or any current or future multiplex,precision geneediting technology-Cas9-assisted cassette exchange,”Nature,ScientificReports,7:45775(2017)(“Kelton”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，本公开包括使用CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9重新编程以介导整个等位基因(例如MHC、HLA、SLA等)的快速且无痕的交换。
根据本公开，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9用于介导猪供体细胞中特定天然基因座上整个MHC等位基因的快速且无痕的交换。使用具有两种gRNA的Cas9多重靶向来引入MHC等位基因侧翼的单链断裂或双链断裂，从而使得能够用模板HLA/MHC序列(以单链或双链DNA模板提供)替换。
在一些方面，供体动物的MHC的多态性蛋白质基序的表达可以通过本领域已知的敲除方法来进一步修饰。例如，敲除一个或多个基因可以包括从非人动物供体的基因组中使一个或多个基因缺失。敲除还可以包括从非人动物供体中除去基因序列的全部或一部分。还预期，敲除可以包括用一个或多个核苷酸来替换非人动物供体的基因组中的基因的全部或一部分。敲除一个或多个基因还可以包括取代一个或多个基因中的序列，从而破坏一个或多个基因的表达。敲除一个或多个基因还可以包括替换一个或多个基因中的序列，从而破坏一个或多个基因的表达，而不会在天然猪供体的SLA/MHC基因中发生移码或框破坏。例如，替换序列可以引入终止密码子(TAA、TAG或TGA)或者这些中的1、2和/或3个的依次组合(“三联体”终止密码子)，并且在一些情况下可以取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对，这导致导致无功能的转录物或蛋白质。例如，如果在一个或多个基因内引入终止密码子，则所产生的转录物和/或蛋白质可能被沉默并使得失去功能。
在另一个方面，本发明引入终止密码子(TAA、TAG或TGA)或者这些中的1、2和/或3个的依次组合，并且在一些情况下可以在野生型猪供体的SLA-1、SLA-2和/或SLA-DR区域，取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对，以避免接受者产生细胞介导的免疫反应，包括制备缺乏表位的功能性表达的细胞。例如，本发明利用终止密码子TAA，但可以通过引入终止密码子(TAA、TAG或TGA)或者这些中的1、2和/或3个的依次组合来实现，并且在一些情况下可以取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对。
在一个方面，如上文所述，本发明利用在野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)第一和/或第二相同的重复基因的区域处插入或产生(通过核苷酸置换)终止密码子，以降低猪的β2微球蛋白(B2M)mRNA表达水平。应当理解，β2微球蛋白(B2M)是主要的免疫原，特别是非Gal异种抗原。
在一个方面，对接受者的HLA/MHC基因进行测序，并根据接受者的HLA/MHC基因制备模板HLA/MHC序列。在另一个方面，来自世界卫生组织(WHO)数据库的已知人HLA/MHC基因型可以用于本公开的猪供体的基因重新编程。
例如，使用聚合酶链式反应制备CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9质粒，并将接受者的HLA/MHC序列作为模板克隆到质粒中。CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术在猪供体细胞中的SLA/MHC基因座处的切割位点，以及靶向切割位点的gRNA序列得以识别，并且被克隆到一个或多个CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9质粒。然后将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9质粒施用于猪供体细胞，并在猪供体细胞的MHC基因座处进行CRIPSR/Cas9切割。
猪供体细胞中的SLA/MHC基因座被与已知的人HLA/MHC序列或接受者的测序HLA/MHC基因匹配的一个或多个模板HLA/MHC序列精确替换。在执行SLA/MHC重新编程步骤之后对猪供体细胞进行测序，以便确定是否已成功重新编程猪供体细胞中的SLA/MHC序列。来自HLA/MHC序列重新编程的猪供体的一种或多种细胞、组织和/或器官被移植到人接受者中。
修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC使得与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同或几乎相同的在新猪供体细胞中的特定MHC分子表达。在一个方面，本公开涉及对仅限于猪供体基因组的特定SLA区域的特定部分进行修饰以在猪供体中保持有效的免疫特性，同时当生物制品被移植到人接受者中时是致耐受性的，使得可以减少或避免免疫抑制剂的使用。与本公开的方面形成对比，现有技术的异种移植研究需要使用免疫抑制剂来抵抗排斥。
在一个方面，猪供体基因组被重新编程以破坏、沉默、引起对应于HLA-A、HLA-B、DR和猪供体B2M的两个拷贝中的一个的猪供体基因的非功能性表达(第一方面)，并且通过取代HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DQ-A和HLA-DQ-B来进行重新编程(第三方面)。此外，根据第二方面，猪供体基因组被重新编程以使猪供体B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC2的另一个拷贝被人源化。
在某些方面，降低在重新编程的猪供体基因组中的HLA-C表达。通过对猪供体细胞进行重新编程以使其对人的免疫系统不可见，这种重新编程由此可以最小化甚至消除免疫反应，所述免疫反应基于猪供体细胞原本表达的猪供体MHC分子原本发生。
制备并测试猪供体细胞中的各种细胞标志物组合，以制备人患者身体所接受的生物学上重新编程的猪供体细胞用于各种用途。对于这些测试，使用可从(3D4/21)获得的猪主动脉内皮细胞、成纤维细胞和/或转化的猪巨噬细胞细胞系。
仅敲除和敲除加敲入细胞集合是通过设计和合成靶基因的引导RNA产生的。每个引导RNA由两种组分组成：CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)。这些组分可以连接形成称为单引导RNA(sgRNA)的连续分子，或退火形成两片式引导RNA，以包括反式激活crispr RNA(tracrRNA)。
可以将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术组分(gRNA和Cas9)以DNA、RNA或核糖核蛋白(RNP)复合物形式递送至细胞中。DNA形式涉及将gRNA和Cas9序列克隆到质粒中，然后将所述质粒引入细胞中。如果需要永久表达gRNA和/或Cas9，则可以使用慢病毒将DNA插入宿主细胞的基因组中。可以酶促地(通过体外转录)或合成地产生引导RNA。合成的RNA通常比IVT衍生的RNA更纯，并且可以进行化学修饰以抵抗降解。Cas9也可以作为RNA递送。核糖核蛋白(RNP)形式由gRNA和Cas9蛋白组成。将RNP预先复合在一起，并且然后引入细胞中。这种形式易于使用，并且已被证明在许多细胞类型中都非常有效。
在设计并产生引导RNA之后，通过几种可能的转染方法之一将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术组分引入细胞中，所述可能的转染方法诸如脂质转染、电穿孔、核转染或显微注射。在将引导RNA和Cas9引入细胞培养物中之后，它们在一些细胞内的靶位点处产生DSB。然后，NHEJ途径修复断裂，从而可能在该过程中插入或缺失核苷酸(插入缺失)。由于NHEJ可能不同地修复每条染色体上的靶位点，因此每个细胞可能具有不同的插入缺失集、或插入缺失和未编辑序列的组合。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。
还将进一步理解的是，对本文提供的源动物基因组的破坏和修饰可以通过几种方法来进行，所述方法包括但不限于通过使用成簇的规律间隔短回文重复序列(“CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术”)，其可以用于产生具有专门定制的基因组的动物。参见，例如，Niu等人,“Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigsusing CRISPR or any current or future multiplex,precision gene editingtechnology-Cas-9,”Science 357:1303-1307(2017年9月22日)。这样的基因组修饰可以包括但不限于本文所公开的任何基因修饰、和/或设计成减少源自此类源动物的制品的生物负荷和免疫原性以使免疫排斥最小化的任何其他定制基因组修饰。
CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术相关蛋白(Cas)，最初被称为微生物适应性免疫系统，最近已适用于哺乳动物基因编辑。CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas系统是基于细菌和古细菌中的适应性免疫机制，以通过DNA或RNA干扰防御外来遗传元件的入侵。通过哺乳动物密码子优化，CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas已适应于精确的DNA/RNA靶向，并且在哺乳动物细胞和胚胎中非常高效。最常用和最集中表征的CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/用于基因组编辑的Cas系统是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术系统；该系统使用Cas9核酸酶和短引导RNA(gRNA)的组合来靶向用于切割的特定DNA序列。与直接位于PAM序列(例如NGG)5'的靶DNA互补的20个核苷酸的gRNA将Cas9指导至靶DNA并介导双链DNA的切割以形成DSB。因此，CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9可以在任何N20-NGG位点实现基因靶向。
因此，本发明还涵盖基因工程改造的非人动物供体，该供体的基因组包含编码人或人源化MHC I多肽、MHC II多肽和/或β2微球蛋白(B2M)多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含本文所述的氨基酸序列的保守氨基酸取代。
本领域技术人员将会理解，除了编码本文所述的人或人源化MHC I多肽、MHC II多肽和/或β2微球蛋白(B2M)的核酸残基之外，由于遗传密码的简并性，其他核酸也可能编码本发明的多肽。因此，除了在其基因组中包含编码具有保守氨基酸取代的MHC I、MHC II多肽和/或β2微球蛋白(B2M)多肽的核苷酸序列的基因工程改造的非人动物供体之外，还提供了其基因组包含由于遗传密码的简并性而与本文所述的不同的核苷酸序列的非人动物供体。
在另外的或替代的方法中，本公开包括重新编程或利用MHC-I(B类)分子的抑制和共刺激作用。具体而言，本公开包括“查找和替换”供体动物基因组中对应于HLA基因部分的部分的过程，例如，在可能的情况下过表达HLA-G，保留和过表达对应于HLA-E的部分，以及/或者“查找和替换”对应于HLA-F的部分。如本文所用，术语“查找和替换”包括同源/类似/直系同源保守遗传区域的鉴定以及通过基因编辑技术用相应的人组分替换一个或多个区段。
另一个方面包括查找和替换在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G中表达的β2微球蛋白(B2M)多肽。同源/类似/直系同源保守细胞因子介导补体抑制或其他免疫调节细胞标记或表面蛋白，可增强供体-接受者细胞界面的总体免疫致耐受性。
在另外或替代性的方法中，本发明利用免疫基因组学重新编程来减少或消除MHC-I(A类)组分，以避免接受者激发天然细胞介导的免疫反应。在另一个方面，供体动物(例如，猪供体)基因组中对应于HLA-A和HLA-B外显子区域的外显子区域在供体动物上被破坏、沉默或者非功能性表达。在另一个方面，供体动物(例如，猪供体)基因组中对应于HLA-A和HLA-B外显子区域的外显子区域在供体动物的基因组中被破坏、沉默或者非功能性表达，并且供体动物(例如，猪供体)基因组中对应于HLA-C外显子区域的外显子区域可以被调节，例如，减少。在一个方面，本公开包括与没有这种免疫基因组学重新编程的情况下如何表达相比，沉默、敲除或引起源动物的直系同源的HLA-C的最低表达。
此外，包含每种MHC-I蛋白的异源二聚体结构的β2微球蛋白(B2M)是物种特异性的。因此，在本公开的一个实施方案中，其被重新编程。与其对应物相比，编码这种流行的构建块蛋白质的遗传指令并不位于MHC基因位点中。因此，在本公开的一个实施方案中，除了如本文所述的对相应靶标特异的那些之外，还包括基因修饰。
图33是根据本公开的人源化猪细胞的示意性描绘。如其中所示，本公开涉及重新编程编码特定多肽或糖蛋白的外显子、重新编程和上调特定多肽或糖蛋白、以及重新编程基因组以具有特定多肽或糖蛋白的非功能性表达，所有这些都在本文中有详细描述。
在一些方面，猪细胞系中的基因修饰插入图33中所列的表格中所列的修饰。在一些方面，除了图33中列出的基因修饰之外，三种主要的猪供体细胞表面聚糖(半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)、Neu5Gc和/或Sda)不被表达，以便减少超急性排斥现象和抗体介导的免疫途径的有害激活，即补体级联的激活。通过这一步骤，可以大致实现与非MHC细胞标志物相关的同种异体“类似”细胞的创建。
分析和分选基因工程改造的细胞，例如来自基因工程改造的动物的细胞或离体制备的细胞。在一些情况下，可以通过流式细胞术(例如荧光激活的细胞分选)分析和分选基因工程改造的细胞。例如，可以使用基于识别由基因编码的多肽的标记(例如荧光标记)的流式细胞术从其他细胞中检测到和纯化表达所关注基因的基因工程改造的细胞。所关注的基因可以是小到几百cDNA碱基对、或大到约几十万碱基对的包含外显子-内源外显子和/或内含子编码序列和获得空间和时间控制的表达所必需的调控序列的基因座。优选地，重组DNA区段的大小在25kb与大于500kb之间。在任何情况下，重组DNA区段都可能小于25kb和大于500kb。
还应当理解，使猪供体细胞、组织和器官表达已知的人MHC基因型或具体如本文所述的接受者的MHC，同时消除猪供体细胞中的α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2(例如，“单敲除”、“双重敲除”或“三重敲除”))代表如下猪供体，所述猪供体与缺乏本公开的特异性SLA/MHC重新编程的三重敲除猪供体相比，细胞将具有减少的免疫排斥反应。本公开提供了一种新型程序，所述新型程序重新编程猪供体基因组，以防止α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)在猪供体细胞中的表达。具体而言，对野生型猪供体基因组进行重新编程，以用核苷酸序列TAGTGATAA替换编码α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的基因中的每个中的ATG起始密码子后的前九个核苷酸。因此，具有根据本公开的重新编程的基因组的猪供体细胞不表达α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)。具有这种新型基因修饰的猪供体被称为“三重敲除”猪供体。本公开还包括用核苷酸序列TAGTGATAA对本文公开的其他基因进行重新编程以使那些基因不表达。通过使用核苷酸序列TAGTGATAA，可以实现安全稳定的不表达效果，以避免可以导致不需要的蛋白质或其突变体的意外表达的基因的偶然再活化。
通过混合淋巴细胞反应(MLR)研究来评估经修饰的猪供体细胞的免疫反应。通过CD8+T细胞的免疫反应来测量MHC Ia多肽的修饰或不表达对免疫反应的影响。通过NK细胞的免疫反应来测量MHC Ib多肽的修饰对免疫反应的影响。MHC II多肽的修饰或不表达对免疫反应的影响通过CD4+T细胞的免疫反应来测量。在本文中的MLR研究不仅测量了定点诱变取代的功效，而且还评价和确定了单独修饰(单独地和作为整体)的影响，因为测量是随着另外的定点诱变取代进行迭代地进行的。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定以确定抗HLA抗体是否识别来自本公开的生物制品的细胞。可以使用通过添加含有先前表征的抗HLA抗体(或对照血清)的特定人血清制备的测定板。将经IFN-γ处理的供体细胞重悬并添加至测定板中，与补体来源(例如兔血清)一起孵育。在室温下孵育至少1小时之后，添加吖啶橙/溴化乙锭溶液。通过以下方式确定细胞毒性百分比：对在荧光显微镜下可视化的死细胞和活细胞计数，减去在不存在抗HLA抗体的情况下获得的自发裂解值，并用量表评分。
当敲除或以其他方式沉默表面糖聚糖时，获得了不表达糖部分的细胞系，因此在人血清中不存在天然的预先形成的抗体的结合。这是使用流式细胞术和人血清以及标记的山羊抗人IgG或IgM抗体；或者针对糖的特异性抗体来检测的。结果是没有抗体与最终细胞系的结合。阳性对照是没有基因修饰的原始细胞系(WT)。此外，分子分析证明了那些基因的变化。
在使用CRISPR技术或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术敲除或以其他方式沉默SLA I类分子的表达时，所得的细胞系缺乏上述糖部分以及SLA I类表达。通过流式细胞术和分子基因进行分析以证明没有表面表达和在基因水平上进行的变化。使用与人PBMC和受辐照的细胞系的混合淋巴细胞反应(MLR)评估细胞反应性。与WT细胞系相比，存在T细胞增殖(主要是CD8+T细胞)的减少。
针对SLA II类分子、DR和DQ表达的反应性也被最小化或消除(没有猪DP)。在分子水平、细胞表面表达以及与人PBMC的体外反应性上进行分析。存在针对所得细胞系的反应性的显著向下调节。
为了测试细胞反应性，将所有细胞与猪IFN-γ一起孵育72小时，然后将人CD4+T细胞添加到猪细胞系中并培养7天。读数是激活/增值的形式，这取决于可用的资源。
为了观察对DQ的特异性反应，在培养物中不存在人抗原呈递细胞(APC)，使得细胞反应不是由APC呈递的猪抗原的结果。
将理解的是，在猪供体至人异种移植的上下文中，每个人接受者将具有该个体独特的主要组织相容性复合物(MHC)(I类、II类和/或III类)，并且极不可能匹配猪供体的MHC。因此，将理解的是，当将猪供体移植物引入接受者时，猪供体MHC分子它们本身充当非Gal异种抗原，引起来自接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。
人白细胞抗原(HLA)基因在人群体中显示出难以置信的序列多样性。例如，仅HLA-B基因就有>4,000个已知的等位基因。据信，HLA基因中的遗传多样性(其中不同等位基因具有呈递不同抗原的不同效率)是进化赋予针对人所暴露的各种不同病原体的更好的群体水平抗性的结果。这种遗传多样性在异种移植期间也呈现出问题，其中接受者的免疫反应是决定植入结果和移植后存活的最重要因素。
根据本发明的一个方面，向猪供体提供了被生物工程改造以表达一组特定的已知人HLA分子的基因组。例如在IPD-IMGT/HLA数据库(可获自ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)和international ImMunoGeneTics information(可获自imgt.org)中可获得此类HLA序列。例如，HLA-A1、B8，DR17是白种人中最常见的HLA单倍型，频率为5％。因此，可以使用已知的MHC/HLA序列信息结合本文提供的公开内容来执行所公开的方法。
在一些方面，鉴定出接受者的人白细胞抗原(HLA)基因和MHC(I类、II类和/或III类)并对其进行作图。将理解的是，能以本领域已知的任何方式来确定人接受者的HLA/MHC序列。例如，HLA/MHC基因通常用靶向测序方法(长读测序或长插入短读测序)进行分型。常规上，已经以2位数分辨率(例如，A*01)确定了HLA类型，其近似于血清抗原分组。最近，已经将序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)方法用于以4位数分辨率(例如，A*01:01)进行HLA分型，这可以区分氨基酸差异。当前，与其他常规方法相比，用于HLA分型的靶向DNA测序是最流行的HLA分型方法。由于基于序列的方法直接确定编码区域和非编码区域，因此其可以实现分别以6位数分辨率(例如A*01:01:01)和8位数分辨率(例如A*01:01:01:01)进行HLA分型。从临床角度来看，以最高分辨率进行HLA分型期望将现有HLA等位基因与新等位基因或无效等位基因区分开。此类测序技术描述于例如Elsner HA,Blasczyk R:(2004)Immunogeneticsof HLA null alleles:implications for blood stem cell transplantation.Tissueantigens.64(6):687-695；Erlich RL等人(2011)Next-generation sequencing for HLAtyping of Class I loci.BMC genomics.12:42-10.1186/1471-2164-12-42；Szolek A等人(2014)OptiType:Precision HLA typing from next-generation sequencingdata.Bioinformatics30:3310–3316；Nariai N等人(2015)HLA-VBSeq:Accurate HLAtyping at full resolution from whole-genome sequencing data.BMC Genomics 16:S7；Dilthey AT等人(2016)High-accuracy HLA type inference from whole-genomesequencing data using population reference graphs.PLoS Comput Biol 12:e1005151；Xie C.等人(2017)Fast and accurate HLA typing from short-read next-generation sequence data with xHLA 114(30)8059-8064中，将所述文献中的每一篇以全文引用的方式并入本文。
已知的人HLA/MHC或单个接受者的测序的HLA/MHC序列可以用作模板来修饰猪供体白细胞抗原(SLA)/MHC序列以与已知的人HLA/MHC序列或人接受者的HLA/MHC序列匹配序列同源性。在鉴定待使用的已知人接受者HLA/MHC序列或对人接受者进行基因测序以获得HLA/MHC序列后，可以根据所需的HLA/MHC序列对猪供体细胞中的SLA/MHC序列进行生物学重新编程。例如，向本公开的猪供体施用几种靶向引导RNA(gRNA)序列，以用人接受者的模板HLA/MHC序列对猪供体细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。
将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9用于介导猪供体细胞中特定天然基因座上整个MHC等位基因的快速且无痕的交换。使用具有两种gRNA的Cas9多重靶向来引入MHC等位基因侧翼的单链断裂或双链断裂，从而使得能够用模板HLA/MHC序列(以单链或双链DNA模板提供)替换。在某些方面，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射入猪供体卵母细胞、卵子、合子或胚细胞中，然后转移到代孕母体内。
在某些方面，本公开包括无SLA和表达HLA的生物学重新编程猪供体的胚胎发生和活产。在某些方面，本公开包括使无SLA和表达HLA的生物学重新编程的猪供体进行繁殖，以产生无SLA和表达HLA的后代。在某些方面，通过猪受精卵的胞质内显微注射，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射入猪供体受精卵中。在某些方面，在CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9基因工程改造的猪供体的选择性繁殖之前，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射到猪供体中。在某些方面，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射到猪供体中，然后从猪供体收获细胞、组织、受精卵和/或器官。在某些方面，CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分包括用于受控基因编辑的所有必需组分，所述受控基因编辑包括利用控制性gRNA分子的自灭活，如美国专利号9,834,791(Zhang)所述，所述专利以全文引用的方式并入本文。
可以利用已知的基因组编辑技术进行基因修饰，所述基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑以及成簇的规则间隔回文重复序列Cas9(CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9)。这些可编程核酸酶能够实现DNA双链断裂(DSB)的靶向产生，这促进了细胞修复机制的上调，从而导致非同源末端连接(NHEJ)或同源指导的修复(HDR)的易错过程，后者可以用于整合外源供体DNA模板。CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9也可用于除去细胞中的病毒感染。例如，能以在以下文献中所描述的方式进行经由CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9的基因修饰：Kelton,W.等人,“Reprogramming MHC specificity by CRISPR or any current or future multiplex,precision gene editing technology-Cas9-assisted cassette exchange,”Nature,Scientific Reports,7:45775(2017)(“Kelton”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，本公开包括使用CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9重新编程以介导整个等位基因(例如MHC、HLA、SLA等)的快速且无痕的交换。
在一个方面，对接受者的HLA/MHC基因进行测序，并根据接受者的HLA/MHC基因制备模板HLA/MHC序列。在另一个方面，来自WHO数据库的已知人HLA/MHC基因型可以用于本公开的猪供体的基因重新编程。例如，使用聚合酶链式反应制备CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9质粒，并将接受者的HLA/MHC序列作为模板克隆到质粒中。CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术在猪供体细胞中的SLA/MHC基因座处的切割位点，以及靶向切割位点的gRNA序列得以识别，并且被克隆到一个或多个CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9质粒。然后将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术-Cas9质粒施用于猪供体细胞，并在猪供体细胞的MHC基因座处进行CRIPSR/Cas9切割。
猪供体细胞中的SLA/MHC基因座被与已知的人HLA/MHC序列或接受者的测序HLA/MHC基因匹配的一个或多个模板HLA/MHC序列替换。在执行SLA/MHC重新编程步骤之后对猪供体细胞进行测序，以便确定是否已成功重新编程猪供体细胞中的HLA/MHC序列。来自HLA/MHC序列重新编程的猪供体的一种或多种细胞、组织和/或器官被移植到人接受者中。
在某些方面，在将HLA/MHC序列重新编程的猪供体用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源之前，使它们繁殖至少一代或至少两代。在某些方面，CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分也可以用于灭活负责PERV活性的基因，例如pol基因，从而同时从猪供体中完全消除PERV。
出于修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC的目的，已对人和猪供体组织相容性复合物的比较基因组组织进行作图。例如，这种SLA到HLA作图可以在以下文献中找到：Lunney,J.,“Molecular genetics of the porcine conor major histocompatibilitycomplex,the SLA complex,”Developmental and Comparative Immunology 33:362-374(2009)(“Lunney”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，鉴于本公开并使用Lunney等人的作图作为参考工具，本领域普通技术人员有效且高效地对猪供体细胞进行基因重新编程。
修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC使得与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同或几乎相同的来自猪供体细胞的特定MHC分子表达。在一个方面，本公开涉及对仅限于猪供体基因组的特定SLA区域的特定部分进行修饰以在猪供体中保持有效的免疫特性，同时当生物制品被移植到人接受者中时是低免疫原性的，使得可以减少或避免免疫抑制剂的使用。与本公开的方面形成对比，现有技术的异种移植研究需要使用免疫抑制剂来抵抗排斥。在一个方面，猪供体基因组被重新编程以敲除对应于HLA-A、HLA-B、HLA-C和DR的猪供体基因，并且敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪供体基因组被重新编程以敲除对应于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR的猪供体基因，并且敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪供体基因组被重新编程以敲除对应于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR的猪供体基因，并且敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。在一个方面，猪供体基因组被重新编程以敲除SLA-11；SLA-6,7,8；SLA-MIC2；和SLA-DQA；SLA-DQB；SLA-DQB2，并且以及敲入HLA-C；HLA-E；HLA-G；和HLA-DQ。在某些方面，在重新编程的猪供体基因组中降低HLA-C表达。在某些方面，本公开包括敲除编码MHC II类DQ或DR的基因。在某些方面，本公开包括敲除MHC II类DQ或DR，并且用人DQ或DR基因序列替换。通过对猪供体细胞进行重新编程以使其对人的免疫系统不可见，这种重新编程由此可以最小化甚至消除基于猪供体细胞原本表达的猪供体MHC分子原本发生的免疫反应。
在一个方面，保守氨基酸取代，包括用具有有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代氨基酸残基，被用于促进精确的定点诱变基因取代或修饰，该定点诱变取代或修饰的设计最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，这使得供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生耐受性，而不牺牲动物的免疫功能。20种氨基酸的化学性质在本领域中是熟知的。例如，具有有相似化学性质的侧链的氨基酸组包括脂族侧链，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族羟基侧链，诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链，诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳族侧链，诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，诸如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链，诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。
在一个方面，对供体SLA/MHC进行修饰以匹配接受者HLA/MHC，从而使来自猪供体细胞的特定MHC分子的表达实际上与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同仅限于保守氨基酸取代，其中错配序列仅在它们在相同保守氨基酸取代组内时才被修饰。在另一个方面，对供体SLA/MHC进行修饰以匹配接受者HLA/MHC，从而使来自猪供体细胞的特定MHC分子的表达实际上与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同仅限于保守氨基酸取代，其中当SLA蛋白的3D结构随着人氨基酸的取代而发生显著变化时，猪氨基酸会被保留下来。这可能是人氨基酸侧链R是极性的，而猪氨基酸是非极性的。然后，评估错配序列在肽结合区域中或肽结合区域附近的残基中是否被认为是关键的，或者在与SLA-DQA相互作用的结构构象中的作用。肽结合区域中的氨基酸对于TCR相互作用至关重要，并且是人氨基酸，但对于分子结构完整性至关重要的猪氨基酸将被保留。然后，将氨基酸残基共有具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的错配序列修饰为接受者的序列，以实现混合个性化模板，其中该模板可用于修饰供体动物的SLA-DQA。例如，如图58所示，首先鉴定出供体的SLA-DQB的外显子2与接受者的HLA-DQB之间的错配序列。然后，评估错配序列在肽结合区域中或肽结合区域附近的残基中是否被认为是关键的，或者在与SLA-DQB相互作用的结构构象中的作用。肽结合区域中的氨基酸对于TCR相互作用至关重要，并且是人氨基酸，但对于分子结构完整性至关重要的猪氨基酸将被保留。然后，将氨基酸残基共有具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的错配序列修饰为接受者的序列，以实现混合个性化模板，其中该模板可用于修饰供体动物的SLA-DQB。上文所述的保守氨基酸取代允许供体动物的细胞、组织和器官在通过施加精确的定点诱变基因取代或修饰移植到人体时具有致耐受性，该定点诱变取代或修饰的设计最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，而不牺牲动物的免疫功能。
因此，根据这一方面(即，将SLA/MHC重新编程以特异性地表达所选择的人MHC等位基因)理解，当应用于用于异种移植目的猪供体细胞、组织和器官时与来自缺乏这种重新编程的野生型猪供体或以其他方式基因工程改造的猪供体(例如转基因猪供体或具有非特定或不同基因修饰的猪供体)的细胞、组织和器官相比将减少排斥。
还应当理解，使猪供体细胞、组织和器官表达已知的人MHC基因型或具体如本文所述的接受者的MHC，同时消除猪供体细胞中的α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2(例如，“单敲除”、“双重敲除”或“三重敲除”))提供猪供体，所述猪供体与缺乏本公开的特异性SLA/MHC重新编程的三重敲除猪供体相比，其细胞将具有减少的免疫排斥。此外，通过对编码α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的基因进行新的基因重新编程，根据本公开(三重基因敲除猪供体)，免疫原性可以进一步降低并且对排斥的耐受性可以进一步增加。
重新编程的试验猪细胞的表征
可以分析和分选基因工程改造的细胞，例如来自基因工程改造的动物的细胞或离体制备的细胞。在一些情况下，可以通过流式细胞术(例如荧光激活的细胞分选)分析和分选基因工程改造的细胞。例如，可以使用基于识别由基因编码的多肽的标记(例如荧光标记)的流式细胞术从其他细胞中检测到和纯化表达所关注基因的基因工程改造的细胞。在此应用中，SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DR和SLA-DQ在未经修饰的PAM细胞上的表面表达是使用针对在那些糖蛋白上的表位的标记过的抗体建立的。在特定基因敲除(例如SLA-1、SLA-2和SLA-DR)的情况下，通过流式细胞术的分析用于证明即使在细胞与干扰素γ一起孵育之后也缺乏这些糖蛋白的表达。SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和SLA-DQ的基因将被修饰，使得在细胞表面上表达的糖蛋白将分别反映HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和HLA-DQ糖蛋白。因此，对HLA表位特异的一组不同的抗体将用于检测由经修饰的基因编码的糖蛋白的表达，并且针对SLA相关糖蛋白的抗体将不与经修饰的PAM细胞的细胞表面结合。
当敲除表面糖聚糖表位时，获得了不表达糖部分的细胞系，因此在人血清中不存在天然的预先形成的抗体的结合。这是使用流式细胞术和人血清以及标记的山羊抗人IgG或IgM抗体；或者针对糖的特异性抗体；或标记的糖特异性异凝集素来检测的。结果是没有抗体(同工凝集素)与最终细胞系的结合。阳性对照是没有基因修饰的原始细胞系(WT)。此外，分子分析证明了那些基因的变化。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育长达72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
通过混合淋巴细胞反应(MLR)研究来评估经修饰的猪供体细胞的免疫反应。应答细胞可以是PBMC、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其他T细胞亚群。PBMC代表在接受者中存在的所有免疫细胞，并且测量的反应反映了应答者对刺激细胞产生免疫反应的能力(例如，未经修饰的PAM细胞和经修饰的PAM细胞的比较)。可替代地，可以使用PAEC或成纤维细胞。测量的增殖由分别与MHC II类和I类相互作用的CD4+和CD8+T细胞两者组成。仅使用针对未经修饰或经修饰的PAM细胞的CD4+T细胞测量对MHC II类糖蛋白DR和DQ的反应。例如，在PAM细胞中SLA DR被敲除的MLR中，CD4+T细胞增殖反应将降低；或者当SLA-DQ基因通过使用来自“接受者”[应答者]的序列进行修饰时，增殖反应将降低，因为在这种情况下，应答者将DQ糖蛋白识别为自身，然而在DR敲除中，DR不存在并且因此不能产生信号。
应答CD8+T细胞被用于评估对MHC I类糖蛋白、SLA-1和SLA-2的免疫应答。用增加数量的来自四倍敲除猪10261或野生型猪的辐照(30Gy)猪的PBMC来刺激1×105个纯化的人CD8+T细胞(A)或人PBMC(B)。在5d+16h小时之后通过3H-胸苷掺入来测量增殖。数据代表在单次实验中用来自一名人献血者的细胞获得的一式三份培养物的平均cpm±SEM。使用来自第二名血液供体的应答细胞和来自四倍敲除猪10262的刺激者细胞观察到类似的应答模式。在用四倍敲除猪的PBMC刺激之后，人CD8+T细胞的增殖减少。(Fischer等人,Viablepigs after simultaneous inactivation of porcine MHC Class I and threexenoreactive antigen genes GGTA1,CMAH and B4GALNT2,Xenotransplantation,2019)。不表达SLA-1和SLA-2的经修饰的敲除PAM细胞将不产生CD8+T细胞反应。这与使用PBMC作为应答者的反应形成对比。参见图34。
可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定以确定抗HLA抗体是否识别来自本公开的生物制品的细胞。可以使用通过添加含有先前表征的抗HLA抗体(或对照血浆)的特定人血浆制备的测定板。血浆在含钙和镁的HBSS培养基中以1:50至1:36450开始连续稀释，与经修饰或未经修饰的PAM细胞一起在4℃下孵育30分钟，随后与新鲜重构的幼兔补体一起在37℃下孵育1小时。然后将细胞用荧光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙锭(PI)染色15分钟，并通过流式细胞术进行分析。为每个测定运行适当的补偿对照。在ACEA NovoCyte流式细胞仪上采集和分析细胞。也可以用干扰素γ处理PAM细胞，以增加MHC分子的表面表达。
在以下条件下确定细胞群：
a.死细胞：PI+、FDA-
b.受损细胞：PI+、FDA+
c.活细胞：PI-、FDA+
进行适当的计算以确定每个血浆浓度(稀释)的细胞毒性％，并且将结果在Prism中绘图。根据细胞毒性曲线，确定了50％杀伤(IC50)的所需稀释度。这在图36A和图36B中使用针对WT或GalT-KO猪PBMC的人血浆进行了说明，其中针对缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)的细胞鉴定出降低的细胞毒性。
NK对未经修饰和经修饰的PAM细胞的细胞毒性，其中SLA 3、SLA 6、SLA 7和SLA 8的基因被修饰使得在细胞表面上表达的糖蛋白将分别反映HLA C、HLA E、HLA F和HLA G糖蛋白。在无血清AIM-V培养基中在4小时51Cr释放测定中测试了新鲜分离的和IL-2激活的人NK细胞的细胞毒性活性。标记的未经修饰和经修饰的PAM细胞以一式三份进行培养，以从40:1至5:1四种E:T比率连续稀释NK细胞2倍。在孵育4小时后。在37℃处，停止测定，在伽马计数器上分析51Cr释放，并计算特定裂解的百分比。与未经修饰的PAM细胞相比，来自特定的遗传匹配“接受者”的NK细胞将对经修饰的PAM细胞具有降低的杀伤。图34中说明了由在针对NK细胞的转染的PAEC细胞中的HLA E提供的保护。
猪淋巴母细胞样细胞上的HLA E表达抑制了异种人NK细胞毒性。2名供体(KH和MS)对分别用HLA E/A2或HLA E/B7转染的13271-E/A2或13271-E/B7(实心菱形)或未转染的13271细胞(空心三角形)的NK细胞毒性。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
非人动物供体的产生
其他人已试图开发纯合的转基因猪，这是一个缓慢的过程，需要长达三年的时间，使用传统方法在胎儿成纤维细胞中进行同源重组，随后进行体细胞核移植(SCNT)，并且然后培育杂合转基因动物以产生纯合转基因猪。开发那些用于异种移植的转基因猪的尝试由于缺乏多能干细胞而受到阻碍，而是依赖于胎儿成纤维细胞作为进行基因工程改造的细胞。例如，第一批缺乏半乳糖的任何功能性表达的活猪的生产最早报告于2000年。与此类先前的尝试相反，本公开提供了用于制备如本文所公开的非转基因重新编程猪供体的更快且根本不同的程序。在一些方面，使用基因编辑对猪胚胎成纤维细胞进行重新编程，例如通过使用CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas来进行精确重新编程，并将基因工程改造的猪胚胎成纤维细胞的细胞核转移至猪去核卵母细胞以产生胚胎；以及d)将胚胎转移到代孕猪中并且使移植的胚胎在代孕猪中生长成基因工程改造的猪。
在确认研究结果后，繁殖基因重新编程的猪，以便繁殖几个猪群体，每个群体都具有从上述测定中确定的所需人细胞修饰中的一种。研究猪在完全生长后的细胞活性，以确定所述猪是否表达所需的性状以避免异种移植后对猪细胞和组织的排斥。此后，繁殖具有超过一种所需人细胞修饰的进一步基因重新编程的猪，以获得表达在异种移植后将不被人患者身体排斥的细胞和组织的猪。
来自猪的多能间充质干细胞(MSC)的潜力提供了超越使用来自胚胎成纤维细胞的原代细胞的机会。MSC分化成各种细胞亚群的能力(这与原代体细胞在它们衰老之前可以经历的有限数量的细胞分裂形成对比)可能意味着MSC在核移植之前将耐受适应几个基因的定向变化所需的多重选择步骤，尤其是对于基因敲除和敲入。MSC相对于体细胞的另一个优势是，据预测克隆效率应该与分化状态和相关的表观遗传状态呈负相关。本公开中提供的PAM细胞是转化的细胞系，但基因工程改造模式可以移植到猪MSC中。然后，将特定基因工程改造的MSC品系用于体细胞核移植(SCNT)，将基因工程改造的猪胚胎成纤维细胞的细胞核转移到猪去核卵母细胞中以产生胚胎；以及将胚胎转移到代孕猪中并且使移植的胚胎在代孕猪中生长成基因工程改造的猪。这样做的优势在于所移植的细胞核含有特定的基因组，因此仔猪无需经过培育即可获得纯合的子代。仔猪的基因型和表型与MSC相同。
基因修饰的MSC的特定群体可以作为特定细胞系冷冻保存，并且根据需要用于该遗传背景所需的猪的开发。培养解冻的MSC，并且将细胞核移植到去核卵母细胞中以产生用于植入代孕猪中的囊胚/胚胎。这创建了一个活的基因工程改造的MSC库用于产生患者特定组织、器官或细胞移植所需的猪。
重申一下，针对这种未满足的临床需求的前一种/先前的方法恰好遵循了“一刀切”的经典医学教条。代替遵照这种局限性的方法，我们务实地展示了利用当前技术进步和基本原理来实现显著改善临床结果指标的“患者特异性”解决方案的能力。前者，我们称为“下游”方法-其必须与按顺序解决所有自然免疫过程相抗衡。后者是我们的方法，我们乐观地称为“上游”方法-代表使未完成的科学工作以协调的转化医学工作结束的一种方法。
在另一个方面，本文公开了一种制备本申请中所描述的基因工程改造的动物的方法，所述方法包括：a)获得MHC I特异性增强体的组分、MHC I-结合肽的转运蛋白和/或C3中的一种或多种的表达降低的细胞；b)从所述细胞产生胚胎；并且c)使所述胚胎生长成基因工程改造的动物。在一些情况下，所述细胞是受精卵。
在某些方面，在将HLA/MHC序列重新编程的猪供体用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源之前，使它们繁殖至少一代或至少两代。在某些方面，CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分也可以用于灭活负责PERV活性的基因，例如pol基因，从而同时从猪供体中完全消除PERV。
在某些方面，本公开包括无SLA和表达HLA的生物学重新编程猪供体的胚胎发生和活产。在某些方面，本公开包括使无SLA和表达HLA的生物学重新编程的猪供体进行繁殖，以产生无SLA和表达HLA的后代。在某些方面，通过猪受精卵的胞质内显微注射，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射入猪供体受精卵中。在某些方面，在CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9基因工程改造的猪供体的选择性繁殖之前，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射到猪供体中。在某些方面，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射到猪供体中，然后从猪供体收获细胞、组织、受精卵和/或器官。在某些方面，CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分包括用于受控基因编辑的所有必需组分，所述受控基因编辑包括利用控制性gRNA分子的自灭活，如美国专利号9,834,791(Zhang)所述，所述专利以全文引用的方式并入本文。在某些方面，本公开包括使用SCNT来产生猪。在某些方面，本公开包括通过将工程改造的核酸酶直接显微注射到胚胎中来产生猪。
在确认研究结果后，繁殖基因重新编程的猪，以便繁殖几个猪群体，每个群体都具有从上述测定中确定的所需人细胞修饰中的一种。研究猪在完全生长后的细胞活性，以确定所述猪是否表达所需的性状以避免异种移植后对猪细胞和组织的排斥。此后，繁殖具有超过一种所需人细胞修饰的进一步基因重新编程的猪，以获得表达在异种移植后将不被人患者身体排斥的细胞和组织的猪。
可以在与医疗制品相关的各种文档中描述任何上述方案或其类似变体。此文档可以包括但不限于方案、统计分析计划、研究人员手册、临床指南、药物指南、风险评估和调解程序、处方信息以及可能与药物制品相关的其他文档。特别预期的是，这样的文档可以与细胞、组织、试剂、装置和/或遗传物质一起作为试剂盒物理包装，这可能是有益的或者由监管机构提出。
在另一个方面，本文公开了一种制备本申请中所描述的基因工程改造的动物的方法，所述方法包括：a)获得MHC I特异性增强体的组分、MHC I-结合肽的转运蛋白和/或C3中的一种或多种的表达降低的细胞；b)从所述细胞产生胚胎；并且c)使所述胚胎生长成基因工程改造的动物。在一些情况下，所述细胞是受精卵。
从这些猪的每一头上采集的肌肉和皮肤组织样品被解剖并培养以长出成纤维细胞。然后将所述细胞收获并用于体细胞核移植(SCNT)以产生克隆。在第30天收获了多个胎儿(最多8个)。胎儿被分别解剖并平板接种在150mm培养皿上以长出胎儿成纤维细胞。在整个培养过程中，胎儿细胞系保持分离，并在每个管或培养容器上标记上胎儿编号。当汇合时，将细胞收获并以约100万个细胞/mL冷冻在含有10％ DMSO的FBS中进行液氮低温储存。
从不同的实例添加：在某些方面，将CRISPR或任何目前或未来的多重、精确基因编辑技术/Cas9组分注射入猪供体卵母细胞、卵子、合子或胚细胞中，然后转移到代孕母体内。
因此，基于其与成年猪供体相比的特征，可以将早产猪供体胎儿和新生仔猪供体用作根据本发明的组织、细胞和器官的来源。
指定的病原体可以包括任何数量的病原体，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫和/或朊病毒(和/或与可传播的海绵状脑病(TSE)相关的其他病原体)。指定的病原体可以包括但不限于任何和全部人畜共患病毒和来自以下科的病毒：腺病毒科(adenoviridae)、指环病毒科(anelloviridae)、星状病毒科(astroviridae)、杯状病毒科(calicivirdae)、圆环病毒科(circoviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、细小RNA病毒科(picornaviridae)和呼肠孤病毒科(reoviridae)。
指定的病原体还可以包括但不限于腺病毒、虫媒病毒、动脉炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、杯状病毒、心病毒、圆环病毒2、圆环病毒1、冠状病毒、脑心肌炎病毒、附红细胞体、猪嗜血杆菌、疱疹病毒和疱疹相关病毒、虹膜病毒、嵴病毒、钩端螺菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、支原体、正粘病毒、papovirus、副流感病毒3、副粘病毒、细小病毒、pasavirus-1、瘟病毒、细小双节RNA病毒(PBV)、微小核糖核酸病毒、猪圆环病毒样(po-circo-like)病毒、猪星状病毒、猪博卡病毒、猪博卡病毒2、猪博卡病毒4、猪肠病毒9、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪脊髓灰质炎病毒、猪嗜淋巴细胞疱疹病毒(PLHV)、猪粪便相关环状病毒(PoSCV)、posavirus-1、天花病毒、狂犬病相关病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、立克次体、萨佩罗病毒(sapelovirus)、札幌病毒、猪葡萄球菌(staphylococcus hyicus)、中间葡萄球菌(staphylococcus intermedius)、葡萄球菌表皮(staphylococcus epidermidis)、凝固酶阴性葡萄球菌、猪痘病毒、猪供体流感、捷申病病毒(teschen)、环曲病毒、猪细环病毒2(TTSuV-2)、可传播的胃肠炎病毒、水疱性口炎病毒、和/或任何和/或全部其他病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫和/或朊病毒(和/或与TSE相关的其他病原体)。在一些方面，特别是在猪供体群中，因为未在猪供体的自然条件下报告TSE，因此未进行TSE的测试。在其他方面，作为本公开的方法的一部分，进行了对TSE的测试。
有可以在动物畜群中测试的大量病原体，并且没有法规指南或标准，也没有该领域中关于应在供体动物中测试哪些特定组的病原体以及哪些特定组的病原体应从供体动物群体中除去以确保安全且有效的异种移植的了解。换句话说，在本公开之前，没有待测试和排除的有限数量的已鉴定的、可预测的病原体。
重要的是，本公开提供了由本发明人鉴定出对于进行安全且有效的异种移植而排除在外至关重要的特定组的病原体，如下表1中所示。
表1
在某些方面，本公开的制品来源于具有低于本公开中讨论的多种或全部病原体的检测水平的抗体滴度水平的动物。在某些方面，测试了移植有本公开的制品的受试者，并发现其具有低于本公开中讨论的多种或全部病原体的检测水平的抗体滴度水平。
在一些方面，本公开包括一种测试由不超过18-35种，例如35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18种病原体组成的特定病原体组的方法，特定病原体组包括表1中鉴定的病原体中的每种。在一些方面，本公开包括产生、维持和使用不含18-35种，例如35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18种病原体的供体动物，特定病原体组包括表1中鉴定的病原体中的每种。
来源于它们的生物制品
如本文所述，用于异种移植的生物制品来源于根据本发明生产和维持的源动物。此类生物制品包括但不限于肝、肾、皮肤、肺、心脏、胰腺、肠、神经和其他器官、细胞和/或组织。
举例来说，可以通过本领域已知的再生细胞疗法方法(例如，通过利用生物支架)利用此类细胞产生用于异种移植的一系列器官和/或组织，包括但不限于：皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、脑、脑、软骨、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫、子宫和阴道、蜂窝组织、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、软骨质、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、主动脉组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织。
本公开提供了异种移植制品的连续制造方法，所述异种移植制品在进行冷冻保存的异种移植组织中具有降低的免疫原性、降低的抗原性、增加的生存能力、增加的线粒体活性、特别需要的病原体特征以及出乎意料的长保质期。连续制造方法在避免超急性排斥、延迟异种移植物排斥、急性细胞排斥、慢性排斥、疾病的跨物种传播、寄生物的跨物种传播、细菌的跨物种传播、真菌的跨物种传播、以及病毒的跨物种传播方面令人惊讶且出乎意料地有效。连续制造方法在产生其中供体动物正常生存而没有可检测的病理变化的封闭畜群方面令人惊讶且出乎意料地有效。
生物制品还可以包括但不限于本文公开的那些(例如，在具体的实例中)，以及从源动物中收获的任何和所有其他组织、器官和/或纯化的或基本上纯的细胞和细胞系。在一些方面，用于如本文所述的异种移植的组织包括但不限于蜂窝组织(areolar)、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、软骨质、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、主动脉组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(Epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织。在一些方面，用于如本文所述的异种移植的器官包括但不限于皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、软骨、角质层、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫和阴道。
在一些方面，用于如本文所述的异种移植的纯化的或基本上纯的细胞和细胞系包括但不限于血细胞、血液前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、堆积细胞、内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、粒膜细胞、造血细胞、朗格汉斯细胞胰岛、角质形成细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、黑素细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cell)、神经细胞、其他肌肉细胞、胰腺α-1细胞、胰腺α-2细胞、胰腺β细胞、胰腺胰岛素分泌细胞、脂细胞、上皮细胞、主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、星形细胞、嗜碱性粒细胞、骨细胞、骨前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、肝细胞、角质形成细胞、库普弗(Kupffer)细胞、肝星状细胞、淋巴细胞、微血管内皮细胞、单核细胞、神经元干细胞、神经元、嗜中性白细胞、胰岛细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、血小板、原始干细胞、雪旺细胞、平滑肌细胞、甲状腺细胞、肿瘤细胞、脐静脉内皮细胞、肾上腺细胞、抗原呈递细胞、B细胞、膀胱细胞、宫颈细胞、视锥细胞、卵细胞、上皮细胞、生殖细胞、毛细胞、心脏细胞、肾细胞、Leydig细胞、叶黄素细胞、巨噬细胞、记忆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、起搏器细胞、肾小管周细胞、垂体细胞、浆细胞、前列腺细胞、红细胞、视网膜细胞、杆状细胞、支持细胞(Sertoli cell)、体细胞、精细胞、脾细胞、T细胞、睾丸细胞、子宫细胞、阴道上皮细胞、白细胞、纤毛细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、子宫内膜细胞、成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、卵泡细胞、杯状细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、粘液细胞、未角质化的上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞、鳞状上皮细胞。在一个具体实施方案中，提供了来自猪的缺乏功能性α-1,3-GT表达的胰细胞，包括但不限于朗格汉斯岛细胞、胰岛素分泌细胞、α-2细胞、β细胞、α-1细胞。不能存活的衍生物可以包括通过酶促或化学处理除去活细胞的组织，这些组织衍生物可以在用于移植之前通过交联或其他化学处理进一步处理。在一些实施方案中，衍生物包括来源于多种组织的细胞外基质，包括皮肤组织、泌尿组织、膀胱组织或器官粘膜下组织。此外，还提供了除去了活组织(以包括心脏瓣膜)的肌腱、关节和骨骼以及作为医疗设备的其他不能存活的组织。
根据一些实施方案，可以以多种方式将细胞按顺序施用于宿主中。优选的施用方式是肠胃外、腹膜内、静脉内、皮内、硬膜外、脊柱内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内、肌肉内、鼻内、皮下、眶内、囊内、局部、透皮贴剂、通过直肠、阴道或尿道施用，包括通过栓剂、经皮、喷鼻剂、手术植入物、内部手术涂料、输注泵或通过导管。在一个实施方案中，剂和载体以缓释制剂施用，所述缓释制剂诸如直接组织注射或推注、植入物、微粒、微球、纳米颗粒或纳米球。
可以通过输注所公开的细胞来治疗的病症包括但不限于由正常血细胞产生和成熟的功能障碍失效导致的疾病(即，再生障碍性贫血和低增殖性干细胞病症)；造血器官的赘生性、恶性疾病(例如，白血病和淋巴瘤)；非造血来源的广谱恶性实体瘤；自身免疫疾病；和遗传疾病。此类病症包括但不限于由正常血细胞产生的失效或功能障碍导致的疾病和成熟过度增殖性干细胞病症，包括再生障碍性贫血、全血细胞减少症、粒细胞缺乏症、血小板减少症、红细胞再生障碍、布-戴二氏(Blackfan-Diamond)综合征，它们是由于药物、辐射或感染导致的、特发性的；造血系统恶性肿瘤，包括急性淋巴母细胞性(淋巴细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性恶性骨髓硬化症、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、原因不明的骨髓化生、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；恶性实体瘤患者的免疫抑制，包括恶性黑素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、睾丸癌、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤；自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮；遗传(先天性)疾病，包括家族性再生障碍性贫血、范康尼(Fanconi)综合征、二氢叶酸还原酶缺乏症、甲酰氨基转移酶缺乏症、莱施-尼汉(Lesch-Nyhan)综合征、先天性红细胞生成异常性综合征I-IV、施-戴二氏(Chwachmann-Diamond)综合征、二氢叶酸还原酶缺乏症、甲酰氨基转移酶缺乏症、莱施-尼汉(Lesch-Nyhan)综合征、先天性球形红细胞增多症、先天性椭圆形红细胞增多症、先天性口形红细胞增多症、先天性无Rh抗原病、阵发性睡眠性血红蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)变体1、2、3、丙酮酸激酶缺乏症、先天性促红细胞生成素敏感、缺乏症、镰状细胞病和性状、地中海贫血α、β、γ、高铁血红蛋白血症、先天性免疫疾病、严重联合免疫缺陷病(SCID)、裸淋巴细胞综合征、离子载体反应性联合免疫缺陷、联合免疫缺陷伴上盖异常、核苷磷酸化酶缺乏症、粒细胞肌动蛋白缺乏症、婴儿粒细胞缺乏症、戈谢(Gaucher)病、腺苷脱氨酶缺乏症、科斯特曼(Kostmann)综合征、网状细胞发育不全、先天性白细胞功能障碍综合征；以及其他病症，诸如骨质疏松症、骨髓硬化症、获得性溶血性贫血、获得性免疫缺陷、导致原发性或继发性免疫缺陷的感染性疾病、细菌感染(例如，布鲁氏菌病、李斯特菌病、结核病、麻风病)、寄生虫感染(例如，疟疾、利什曼病)、真菌感染、因衰老导致的涉及淋巴样细胞组比例失调和免疫功能受损的疾病、吞噬细胞疾病、科斯特曼(Kostmann)粒细胞缺乏症、慢性肉芽肿病、契-东(Chediak-Higachi)综合征、中性粒细胞肌动蛋白缺乏症、中性粒细胞膜GP-180缺乏症、代谢贮积病、粘多糖贮积症、粘脂贮积症、涉及免疫机制的杂病、威斯科特-奥尔德里奇(Wiskott-Aldrich)综合征、α1-抗胰蛋白酶缺乏症等。疾病或病理可以包括神经退行性疾病、肝退行性疾病、肾退行性疾病、脊髓损伤、头部创伤或手术、导致组织、器官或腺体退化的病毒性感染等等。此类神经退行性疾病包括但不限于艾滋病痴呆综合症；脱髓鞘性疾病，诸如多发性硬化和急性转移酶脊髓炎；锥体外和小脑疾病，诸如皮质脊髓系统的病变；基底神经节疾病或小脑疾病；多动性运动障碍，诸如亨廷顿(Huntington)舞蹈症和老年性舞蹈病；药物诱导的运动障碍，诸如由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的那些运动障碍；少动性运动障碍，诸如帕金森(Parkinson)病；进行性核上性麻痹；小脑结构性病变；脊髓小脑退化，诸如脊髓性共济失调、弗里德赖希(Friedreich)共济失调、小脑皮质退化、多系统退化(门切尔(Mencel)病、代-托二氏(Dejerine Thomas)综合征、夏伊-德雷格(Shi-Drager)综合征和马查多-约瑟夫(Machado-Joseph)病)、系统性疾病诸如雷夫叙姆(Rufsum)病、无β脂蛋白血症、共济失调、毛细血管扩张症；以及线粒体多系统疾病；脱髓鞘性核心疾病，诸如多发性硬化、急性横贯性脊髓炎；以及运动单位障碍，诸如神经源性肌萎缩(前角细胞退化，诸如肌萎缩性侧索硬化、婴儿脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)；阿尔茨海默(Alzheimer)病；中年唐氏(Down)综合征；弥漫性路易体病；路易体型老年性痴呆；帕金森病、韦尼克-科尔萨科夫(Wernicke-Korsakoff)综合征；慢性酒精中毒；克罗伊茨费尔特-雅各布(Creutzfeldt-Jakob)病；亚急性硬化性全脑炎哈勒沃登-施帕茨(hallerrorden-Spatz)病；以及拳击员痴呆。
如美国临时专利申请号16/830213；2020年2月12日提交的美国临时专利申请号62/975611；2020年1月22日提交的美国临时专利申请号62/964397；2019年5月15日提交的美国临时专利申请号62/848272；2019年3月25日提交的美国临时专利申请号62/823455和2019年10月4日提交的美国非临时专利申请号16/593785(该非临时专利申请要求2018年10月5日提交的美国临时申请号62/742,188的优先权权益)；2018年11月7日提交的美国临时专利申请号62/756925；2018年11月7日提交的美国临时专利申请US 62/756955；2018年11月7日提交的US 62/756977；2018年11月7日提交的US 62/756993；2019年1月14日提交的US62/792282；2019年1月22日提交的US 62/795527；2019年3月25日提交的US 62/823455；和2019年5月15日提交的US 62/848272所更全面地描述(这些专利申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的)，供体动物细胞可以被重新编程为使得供体动物中的全部免疫功能得以保留，但是细胞表面表达蛋白和聚糖被重新编程为使得人接受者的免疫系统不将它们识别为异物。因此，只有动物基因组的离散和小部分可能需要重新编程，以便动物保留功能性免疫系统，但动物的重新编程的细胞不表达细胞表面表达蛋白和聚糖，这些蛋白和聚糖会引起人接受者的免疫系统的攻击。
就从猪供体收获生物制品而言，非人动物供体是用于从非转基因基因重新编程的猪供体分离的细胞、组织和/或器官的异种移植的非转基因基因重新编程的猪供体，非转基因基因重新编程的猪供体包含如下基因组，所述核基因组已被重新编程以将野生型猪供体的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获序列的已知人主要组织相容性复合物序列的直系同源外显子区域的核苷酸，其中所述重新编程不引入任何移码或框破坏。在以下公开内容和权利要求中提供了进一步的具体方面、细节和实例，并且那些方面、细节和实例的任何和所有组合构成本公开的方面。
在其他方面，本文描述和公开的异种移植制品是有活力的活细胞(例如，有活力、生物活性的)制品；不同于由无法完成血管形成过程的最终灭菌的无活力细胞构成的合成或其他基于组织的制品。此外，在一些方面，本公开的制品没有被戊二醛或放射治疗灭活或“固定”。
在另外其他方面，本文描述和公开的异种移植制品是通过促进精确的定点诱变取代或修饰产生的，所述取代或修饰的设计最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏(例如，不对相关的细胞、器官或组织进行物理改变)，使得此类制品基本上处于其天然状态。本公开包括定点诱变取代或修饰，所述定点诱变取代或修饰的设计最大程度地减少或避免对重新编程的基因表达的蛋白质的翻译后修饰的变化。
在某些方面，本文所描述和公开的异种移植制品从非人动物供体(例如非转基因的基因重新编程的猪供体)获得，包括从非转基因的基因重新编程的猪供体中分离的细胞、组织和/或器官，所述非转基因的基因重新编程的猪供体包含如下基因组，所述核基因组已被重新编程以将野生型猪供体的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获序列的已知人主要组织相容性复合物序列的直系同源外显子区域的核苷酸，并且其中所述基因重新编程的猪供体的细胞不呈现一个或多个表面聚糖表位，其中所述重新编程不引入任何移码或框破坏。例如，编码α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的基因被破坏，使得由所述基因编码的表面聚糖表位不被表达。在以下公开内容和权利要求中提供了进一步的具体方面、细节和实例，并且那些方面、细节和实例的任何和所有组合构成本公开的方面。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品能够与人接受者进行器质性结合，包括但不限于与血管形成、胶原生长(例如就皮肤而言)和/或来自移植接受者的其他相互作用(诱导移植物附着、器质性结合或接受者的其他临时或永久性接受)相容。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品用于异种移植中，而无需使用或至少减少使用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法来实现期望的治疗效果。
在其他方面，本文所描述和公开的一些异种移植制品(例如皮肤)通过冷冻保存来储存、新鲜储存(无冷冻)或通过其他方法储存以保存与本发明一致的此类制品。存储涉及使用保持细胞和组织生存能力的条件和过程。
在一些方面，存储可能涉及在无菌等渗溶液(例如，有或没有抗生素的无菌盐水)的任何组合中将器官、组织或细胞储存在冰上，储存在冷冻保存液体中，冷冻保存在-40℃左右或-80℃左右的温度下，以及本领域已知的其他方法。这样的存储可以发生在主要收容系统和次要收容系统中。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品用于同源用途，即，用执行与供体相同的一种或多种基本功能的对应器官、细胞和/或组织修复、重建、替换或补充接受者的器官、细胞和/或组织(例如，将猪供体肾用作人肾的移植体，将猪供体肝用作人肝的移植体，将猪供体皮肤用作人皮肤的移植体，将猪供体神经用作人神经的移植体，等等)。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品具有低的生物负荷，使可能用于增加异种移植后制品的生物负荷和人体对制品的免疫排斥的病原体、抗体、遗传标记和其他特性最小化。这可能包括通过PRR TLR检测PAMP并排斥主题异种移植制品的先天免疫系统。
将理解的是，本文所公开和描述的方面可以以任何数量的组合来应用以产生包含由本发明所涵盖的方面的一个或多个特征和/或方面的一系列或不同方面。
将理解的是，根据本发明，存在源自DPF封闭群体的制品有许多治疗应用。例如，此类制品可以用于治疗器官、细胞或组织的急性和/或慢性疾病、病症或对器官、细胞或组织的损伤，以及可以利用本文公开的制品的任何和所有其他疾病。此类治疗和/或疗法可以包括利用此类制品修复、重构、替换或补充(在一些方面是临时的，并且在其他方面是永久的)人接受者的对应器官、细胞和/或组织，所述器官、细胞和/或组织与供体执行一种或多种相同的基本功能。
具体的治疗应用包括但不限于肺移植、肝移植、肾移植、胰腺移植、心脏移植、神经移植和其他完全或部分移植。关于皮肤，治疗应用还包括但不限于治疗烧伤、糖尿病性溃疡、静脉溃疡、慢性皮肤病症和其他皮肤不适、损伤和/或病症(包括但不限于严重和广泛、深度的局部和全层损伤、不适和/或病症)(参见例如本文的实施例1)；用于全身表面积大于或等于30％的深层真皮或全层烧伤的成人和儿童患者，任选地与分层自体移植物组合使用，或者单独用于由于伤口/烧伤的严重度和程度可能无法选择分层自体移植物的患者；用根据本发明衍生的肝制品来治疗肝衰竭、伤口、不适、损伤和/或病症；治疗外周神经损伤和其他神经疾病、损伤和/或病症；以及使用从DPF封闭菌落收获的材料的细胞和其他疗法，包括美国专利7,795,493(“Phelps”)中公开的治疗用途，包括针对某些疾病的细胞疗法和/或输注(如第30栏第1行至第31栏第9行中所公开)以及某些病症或病理的治疗(如第31栏第10至第42行中所公开)，这些公开内容以引用的方式并入本文。
应当理解，本文对疗法的具体叙述决不限制本文公开和描述的制品的治疗应用类型，所述治疗应用类型涵盖以下器官、组织和/或细胞的急性和/或慢性疾病、病症、损伤：皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、脑、脑、软骨、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫、子宫、阴道、蜂窝组织、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、软骨质、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、主动脉组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织；血细胞、血液前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、堆积细胞、内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、粒膜细胞、造血细胞、朗格汉斯细胞胰岛、角质形成细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、黑素细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cell)、神经细胞、其他肌肉细胞、胰腺α-1细胞、胰腺α-2细胞、胰腺β细胞、胰腺胰岛素分泌细胞、脂细胞、上皮细胞、主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、星形细胞、嗜碱性粒细胞、骨细胞、骨前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、肝细胞、角质形成细胞、库普弗(Kupffer)细胞、肝星状细胞、淋巴细胞、微血管内皮细胞、单核细胞、神经元干细胞、神经元、嗜中性白细胞、胰岛细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、血小板、原始干细胞、雪旺细胞、平滑肌细胞、甲状腺细胞、肿瘤细胞、脐静脉内皮细胞、肾上腺细胞、抗原呈递细胞、B细胞、膀胱细胞、宫颈细胞、视锥细胞、卵细胞、上皮细胞、生殖细胞、毛细胞、心脏细胞、肾细胞、Leydig细胞、叶黄素细胞、巨噬细胞、记忆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、起搏器细胞、肾小管周细胞、垂体细胞、浆细胞、前列腺细胞、红细胞、视网膜细胞、杆状细胞、支持细胞(Sertoli cell)、体细胞、精细胞、脾细胞、T细胞、睾丸细胞、子宫细胞、阴道上皮细胞、白细胞、纤毛细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、子宫内膜细胞、成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、卵泡细胞、杯状细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、粘液细胞、未角质化的上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和鳞状上皮细胞。此列表绝不意味着限制治疗急性和/或慢性疾病、病症、损伤、器官或组织衰竭、以及可以利用本文公开的制品的任何和所有其他疾病的治疗用途的阵列。
关于烧伤的治疗，包括但不限于例如II度烧伤和III度烧伤，在一些方面，根据本发明衍生的皮肤制品用于治疗具有严重且广泛的深度部分厚度和/或全层厚度烧伤伤口的人患者。此类制品包含在使用前不会离体扩增并且在预期的治疗持续时间内不会从应用部位迁移的最终分化的细胞类型。因此，致瘤性的潜力可忽略不计。
此类制品粘附在伤口床上，并在-烧伤后立即提供屏障功能。此类制品具有非最终灭菌的有活力的细胞，允许移植物组织在接受者中的血管形成。在一些方面，表皮保持完全完整，并且真皮组分得以保持，而没有改变各种细胞和组织的结构形态或组织。该生理机制支持移植物材料的延长生存，并提供至少一种临时的屏障功能，与同种异体移植物相比具有相等或更佳的显著的临床影响。在一些方面，如果存在或发展出感染的临床体征，例如疼痛、水肿、红斑、发热、流水、臭味或不明原因的发烧，则直到感染的临床体征在预定的时间段内(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、1周、2周、3周或4周)减轻或消除或者如果受试者的感染测试呈阴性都不应用本公开的制品。在一些方面，清洁伤口，确认其血管形成良好且无渗出。如果还使用了真皮替代物(诸如尸体同种异体移植物)，则在应用制品之前从被移植的同种异体移植物中去除表皮层，而不去除植入的真皮。表皮层可以根据设施的标准操作程序用皮刀或其他器械去除。
通常在临床实践中使用的移植物由用于实现临时的浅表伤口覆盖的脱细胞和/或重构的均质真皮薄片组成。此类常规移植物不保留原始组织结构，也不保留有代谢活性的原本天然存在的细胞，并且因此不会变成血管化的；未进行毛细管向内生长或血管间的连接。相比之下，本文所述的皮肤制品从根本上不同于此类移植物，因为本公开的制品包括与患者原始皮肤执行相同功能的活细胞，即所述制品充当器官移植体。皮肤执行与体内平衡、温度调节、液体交换和感染预防有关的另外的关键作用。没有足够量的皮肤可能会损害执行这些功能的能力，从而导致由于感染和体液损失引起的高死亡率和发病率的发生。皮肤移植体已被可靠地使用，具有防止具有严重创伤的患者出现这些结果的显著的临床益处；而不管移植物是临时的还是永久的。因此，与其他提议的移植体不同，将减少或不需要使用免疫抑制药物。实际上，在其损伤已经表现出一定水平的固有免疫功能的烧伤患者中，此类方案将是禁忌的。因此，本公开的异种移植制品(xenotransplantation product)不应与由形成为片状或网状的构建的均质野生型猪真皮组成的传统“异种移植物(xenotransplant)”制品(诸如EZ-DermTM或Medi-SkinTM)相混淆。此类猪异种移植物不形成血管，并且主要仅可用于浅表烧伤的临时覆盖。与之形成鲜明对比的是，本公开的异种移植制品含有与源组织相同构型和不变形态的有代谢活性的细胞。
在一些方面，本公开包括使用异种移植的供体皮肤作为预测来自同一动物供体的其他器官的排斥的测试。使用人供体皮肤进行此类预测性测试的技术此前已经在例如Moraes等人,Transplantation.1989；48(6):951-2；Starzl等人,Clinical andDevelopmental Immunology,第2013卷,文章ID 402980,1-9；Roberto等人,Shackman等人,Lancet.1975；2(7934):521-4中有所描述，这些文献的公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的。Moraes报告说，交叉匹配程序在预测早期肾移植排斥中非常准确。Shackman报告说，从活的人预期的肾供体中获取的皮肤移植物的命运与来自同一供体的肾移植的结果密切相关。根据本公开，在一个方面，本公开包括使用人患者中的异种移植皮肤样品以确定在人患者中是否存在排斥从同一动物供体异种移植的其他器官的风险的方法。
本文所述的皮肤移植方法可以用于治疗皮肤移植物可用于例如覆盖部分厚度和全层厚度伤口(包括但不限于烧伤，例如部分厚度或切除的全层厚度的烧伤伤口)；撕脱的皮肤(例如在四肢)；糖尿病伤口(例如不愈合的糖尿病足伤口、静脉淤滞性溃疡)的任何损伤。
在一些方面，本公开的异种移植制品具有满足法规要求的药代动力学和药效动力学特性。此类特性的表征需要一种关于药物吸收、分布、代谢和排泄的经典含义的独特方法。出于考虑药代动力学的目的，异种移植制品的“吸收”可以通过异种移植制品经历的血管形成过程来描述。例如，在手术后不久，皮肤异种移植制品可能以温暖、柔软和粉红色的形式呈现，然而野生型或传统的异种移植物则以未形成血管的“白色移植物”出现。在一些方面，如通过DNA PCR测试证明在移植位点之外的外周血中存在或不存在猪细胞所证实的，移植体的分布限于移植体的部位。
在其他方面，根据本发明生产的生物制品的细胞在异种移植后不会迁移到接受者中，包括迁移到接受者的循环中。这包括PERV或PERV感染的猪细胞不会迁移到接受者中。可以通过许多方式来确认此类细胞不会迁移到接受者中，所述许多方式包括通过DNA-PCR分析外周血单核细胞(PBMC)和来自移植部位的样品以及高度灌注的器官(例如肝、肺、肾和脾)的样品来确定并以其他方式证明在接受者中没有发生猪细胞(DNA)或猪逆转录病毒(RNA)组分迁移到在外周血中。
此外，异种移植制品的生物利用度和作用机理不受大小的影响。异种移植制品的分布限于施用的部位。例如，在皮肤移植体的情况下，最初由创伤或烧伤损伤产生的清创伤口床是施用部位。本公开包括测试以检测来自异种移植制品的细胞在施用部位之外的外周血、伤口床、脾和/或肾中的分布。在某些方面，这样的测试将证明来自异种移植制品的细胞在施用部位之外的外周血、伤口床、脾和/或肾中不存在。这样的测试可以包括DNA PCR测试在从其中获得制品的动物类型中存在的各种细胞标记，例如PERV、猪供体MHC和其他猪供体DNA序列。在某些方面，来自异种移植制品的细胞和核酸仍然限于施用部位。
异种移植制品的代谢，传统上定义为活的生物体通常通过专门的酶或酶促系统对药物的代谢分解，可以与上述在没有外源性免疫抑制药物的情况下发生的天然宿主排斥现象相吻合。通过与预期用于未来人使用的相同配制品和相同施用途径，此类异种移植制品在临床上可使用的时间里经历了与同种异体移植物比较物类似的延迟的免疫排斥过程。
以类似的方式，可以对异种移植制品的排泄建模，并通过由于抗体介导的血管损伤引起的移植体坏死缺血、最终引起组织死亡而导致的临床“坍陷”现象来凭经验进行监测。
与当前的护理标准相比，本公开的异种移植制品的已证明的功效以及安全性、可用性、贮存性、保质期和分布提供了显著的优势。
在一些方面，本公开的异种移植制品的“剂量”被表示为每单位移植面积的制品中有活力的细胞的百分比。因此，在一些方面，本公开的异种移植制品可以被认为类似于药物制品中的活性药物成分。
本公开的异种细胞、组织或器官的存活通过避免以下方面来增加：(a)免疫或炎性细胞至异种移植制品的浸润或此类细胞在其他相关区室(诸如血液和脑脊液)中的改变；(b)异种移植制品的纤维化包封，例如导致功能受损或异种移植制品损失；(c)异种移植制品坏死；(d)移植物抗宿主病(GVHD)；以及(e)旨在减少排斥反应或炎症反应的包封或屏障的体内功能和持久性。
使用FITC-IB4标记和流式细胞术，从仔猪获得血液样品并测试其表型、血细胞表面上α-半乳糖表达的缺乏。在这个发展阶段，所有后代都将在出生时进行基因分型。已经建立了PCR测定法，以通过使用从耳朵切迹或PBMC分离的DNA确定猪是否具有野生型α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)基因，或者对于Gal-T敲除(Gal-T-KO)是杂合的还是纯合的。按照Qiagen DNeasy试剂盒说明使用DNeasy试剂盒从PBMC(或皮肤组织)中分离基因组DNA。对基因组DNA和对照模板DNA、野生型Gal-T(+/+)杂合子Gal-T-KO(+/-)和纯合子Gal-T-KO(-/-)进行PCR。
将皮肤移植物的打孔活组织检查物与维持在75-cm2的烧瓶中的培养基(补充有10％胎牛血清和谷氨酰胺、青霉素和链霉素的达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco’smodified Eagle’s medium))中的亚汇合靶细胞、人293(肾上皮)和猪ST-IOWA细胞系共培养。使活组织检查物与靶细胞保持接触5天，其后除去培养基和剩余组织，并根据需要通过传代培养来维持靶细胞共培养物。通过培养上清液中逆转录酶(RT)活性的存在来确定靶细胞的PERV感染。将传播测定维持至少60天，然后才能视为阴性。
进行制品表征以测量安全性、身份、纯度和效力。安全性测试包括细菌和真菌的无菌性、支原体和病毒因子。本公开包括冷冻保存和存档以根据需要进一步测试所有最终的异种移植制品(即，器官的细胞或组织或活组织检查物)的样品，无论是新鲜的还是来自离体培养物。在一些情况下，例如，如果异种移植制品是整个的完整器官，则将相关的替代样品(例如，相邻组织或对侧器官)存档。
关于皮肤，猪皮肤的储存和冷冻保存还没有被充分表征，特别是在生存能力方面，因为大多数猪异种移植物是有意失活的，或者用戊二醛或放射处理“固定的”。这种信息对于支持使用活的猪皮移植物(或猪皮移植体)作为临时且临床上有利的选择是必要的。
在将异种移植制品从源动物中取出后立即进行移植的程序中，诸如整个器官的异种移植，异种移植制品的测试结果可能在其临床使用之前无法获得。在此类情况下，对源动物本身的测试可能是在程序之前可能进行的所有测试。可以根据本公开对从此类异种移植制品或适当的相关生物替代物(例如，相邻组织或对侧器官)中获取的样品进行测试。微生物检查方法可以包括下表2中阐述的方面：
表2
/>
本公开包括使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液或pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液来制备测试悬浮液；为了悬浮巴西曲霉孢子，可以将0.05％的聚山梨醇酯80添加到缓冲液中。本公开包括在2小时内，或者如果储存在2℃和8℃之间则在24小时内使用悬浮液。作为准备并且然后稀释巴西曲霉或枯草芽孢杆菌的营养细胞的新鲜悬浮液的替代，制备了稳定的孢子悬浮液，并且然后将适量的孢子悬浮液用于测试接种。可以将稳定的孢子悬浮液维持在2°至8°持续有效的时间段。为了验证测试条件，使用所选稀释剂代替测试制剂进行阴性对照。必须没有微生物的生长。如在制品测试中所述，当测试制品时也进行阴性对照。阴性对照失败需要进行调查。可以根据USP 61、USP 63、USP 71、USP 85EP第2.6.13节非无菌制品的微生物检查(Microbial Examination of Non-sterile Products)(测试特定微生物)来进行微生物检查，每篇所述文献均以全文引用的方式并入本文。
关于猪巨细胞病毒(PCMV)的测试，每季度对源动物进行PCMV筛选。然而，使然后持续饲养在封闭群体中的剖腹产来源的仔猪未感染有PCMV。在本文US2020/0108175A1所述的研究过程中进行了对PCMV的分析，并且使用以下PCR方法在打孔活组织检查中未检测到PCMV。这些结果与鼻拭子的PCR结果一致。将实时定量PCR用于PCMV测试。使用StratageneMx3005P通过实时PCR定量靶DNA序列。为每个基因靶标产生序列特异性引物和TaqMan探针。每个25uL PCR反应均包括靶DNA、800nM引物、200nM TaqMan探针、20nM Rox参考试剂和1xBrilliant III超快主混合物(Ultra Fast Master Mix)。PCR循环条件如下：在95℃下进行1次循环持续5分钟，然后在95℃下进行50个变性循环持续10秒，以及在60℃下进行退火延伸持续30秒，在每次延伸后收集数据。将克隆到Invitrogen TOPO质粒中的经凝胶提取的扩增子的系列稀释液用作定量标准。检测到的靶DNA的线性动态范围为10至106个拷贝。为了定量PCMV DNA，在TaqMan PCR中一式三份运行300ng异种移植物猪肾DNA。已显示对PCMVDNA聚合酶基因具有特异性的引物和探针与PLHV-1没有交叉反应性。剖腹产来源的猪供体作为源动物的使用，与所得封闭群体的动物畜牧业以及屏障隔离条件的维持相结合，归因于所述动物不含PCMV。关于皮肤，本发明人注意到，鉴于与同种异体移植物相当的性能，使用单敲除猪供体(与三重敲除或甚至进一步基因工程改造的猪供体相反)如US2020/0108175A1中所述获得的安全性和功效结果十分令人惊讶。此外，根据本公开(三重基因敲除猪供体)，通过对编码α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的基因进行新的基因重新编程，免疫原性可以进一步降低并且对排斥的耐受性可以进一步增加，以提高安全性和功效。
在一些方面，本公开包括具有如下基因的猪供体、细胞、组织或器官，该基因具有图52A和/或图52B中所示的序列。在一些方面，本公开包括一种对野生型猪供体基因进行重新编程，以用TAGTGATAA对猪供体基因的起始密码子后的前九个核苷酸进行重新编程的方法。在一些方面，重新编程的猪供体基因是SLA基因、CMAH、GGTA1、B4GALNT2。在一些方面，通过对编码β2微球蛋白(B2M)、SLA-1、SLA-2和SLA-DR进行重新编程来使重新编程的猪供体基因组缺乏β2微球蛋白(B2M)、SLA-1、SLA-2和SLA-DR中的一者或多者的功能性表达，所述重新编程通过用TAGTGATAA替换猪供体基因的起始密码子后的前九个核苷酸来进行。在一些方面，编码SLA-DR的重新编程的基因是编码SLA-DRA、SLA-DRB或它们的组合的基因。
在一些方面，用于测试异种移植制品的分析程序还可以包括：
a.USP<71>无菌性。酌情将样品转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。对于细菌抑制和真菌抑制，TSB样品掺有<100菌落形成单位(CFU)的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的24小时培养物、以及<100个的巴西曲霉孢子的接种物。FTM样品将掺有<100CFU的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和产孢梭菌的24小时培养物的接种物。如果未观察到生长，则发现所述制品具有细菌抑制和真菌抑制作用，并且未通过USP<71>无菌性测试。
b.需氧和厌氧细菌培养物。酌情将样品转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现微生物生长的迹象，则将判断所述制品符合如USP<71>所述的无菌性测试。
c.支原体测定USP<63>。将新鲜样品添加到100mL支原体Hayflick肉汤中，并在37℃下孵育至多21天。在2-4天、7-10天、14天和21天后对样品进行传代培养。然后将板在37℃下孵育至多14天，并检查支原体集落的存在。如果未检测到任何集落，则发现所述制品符合USP<63>并且不含支原体。
d.内毒素USP<85>。对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(LAL)测试的抑制/增强。将在37℃下每个样品用40mL WFI提取样品1小时。然后将样品在LAL动力学发色测试中进行测试，在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。将根据USP<85>进行测定。
e.细胞生存能力的MTT测定。使用针对[3-4,5二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)代谢的生化测定相对于对照组织样品测试了药物制品的代谢活性。将新鲜异种移植制品组织的阳性和阴性对照样品(阳性对照)或异种移植制品组织的热灭活圆盘(阴性对照)或异种移植制品的测试物品放入含有MTT溶液(在DMEM中为0.3mg/mL，0.5mL)的琥珀色微量离心管中。将圆盘用MTT甲臜处理，并在37℃和5％ CO 2空气的气氛下孵育180±15分钟。通过除去圆盘来终止反应，并且通过在环境温度下孵育≤24小时或在4℃下冷藏≤72小时来提取甲臜。在这段时间期间，样品要避光。提取完成后取等分试样，并测量550nm(参考波长为630nm)下的吸光度，并将其与标准曲线进行比较。
f.细胞外聚糖表位的IB4测定。将使用荧光激活流式细胞术确定细胞上不存在半乳糖-a-1,3-半乳糖(α-Gal)表位。用荧光色素标记的异凝集素-B4(FITC-I-B4)将全血中的白细胞染色，并与从野生型阳性对照和Gal-T-KO源动物获得的血液进行两次比较。首先，在出生时对所有源动物进行测试。其次，将从处死源动物时收集的全血进行相同的测试，并测试基因敲除的稳定性和半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)的阴性表型。异凝集素与野生型猪细胞上的表位结合，但在Gal-T-KO猪细胞上不发生结合。该测定用于确认半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)表位不存在于基因工程改造的源动物中。该基因的自发重新活化和半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)部分在处死后的重新表达是极不可能且不合理的预期；将它包括在内只会降低异种移植制品的功效，使异种移植制品类似于野生型猪组织并如前所述出现超敏排斥反应。
g.PERV病毒测定。PERV pol定量：使用Stratagene MX300P实时热循环仪(AgilentTechnologies)，在50个循环的PERV聚合酶定量TaqMan PCR中一式三份扩增10uL的RT反应的1:625稀释液。相似地处理10uL的“无RT酶”对照RT反应的1:25稀释液。PCR条件包括终浓度为800nM的PERV pol正向和反向引物以及终浓度为200nM的PERV pol探针。使用Brilliant III超快主混合物(600880Agilent Technologies)，并用ROX报告染料(600880Agilent Technologies)和0.04单位/μL UNG核酸酶(N8080096，LifeTechnologies)补充至20nM。循环条件包括：在50℃下10分钟进行1次循环，然后在95℃下10分钟进行一次循环以及在95℃下10秒进行50次循环，然后在60℃下30秒，在每个循环结束时收集数据。测量每纳克输入cDNA的PERV pol的绝对拷贝以及猪MHC-I和猪GAPDH核酸的绝对拷贝。测试如本文所述解冻的打孔活组织检查物和洗涤的异种移植制品中的PERV DNA和RNA的存在。
h.组织学和形态学。遵循所描述的制造过程对异种移植制品的样品进行取样以检查细胞形态和组织。在显微镜下通过可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织的正确细胞形态和组织、以及不存在异常细胞浸润群体。
i.释放测定取样方法。一旦产生了所有单位的最终异种移植制品批次，就独立随机地选择单位以用于所需接受标准的生产发布测定中。这些单位将被标记为向各个实验室承包商发布批次，并且将根据所需的cGMP条件进行各种分析测试。
同样，在验证人临床使用之前，所有最终异种移植制品必须符合选择材料用供体猪的验收标准，包括(i)查看医疗记录以了解特定谱系，(ii)查看医疗记录以了解通过流式细胞术进行的半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)的测试结果，(iii)查看医疗记录以了解完整疫苗接种史；(iv)查看医疗记录以了解在猪的整个生命周期中进行的监测测试；(v)源动物的外来因子筛选；(vi)查看医疗记录以了解在猪的整个生命周期中发生的感染；以及(vi)查看医疗记录以了解动物病史中记录的任何皮肤异常。
在生产过程结束时在发布供临床使用之前进行最终异种移植制品控制策略和分析测试。所需的分析测试的结果将通过异种移植制品药物制品分析证书(COA)记录下来，所述分析证书附有与每个批次的异种移植制品药物制品有关的主批次记录。
下表3是对异种移植制品材料进行的测定和一系列测试的结果的列表。
表3
在另一个方面，将理解的是，包括基于源动物开发的不定因子控制策略，包括物种、品系、地理起源、组织类型和建议的适应症。对不定因子进行分析测试，以包括细菌、真菌、支原体和病毒微生物，包括如下：
j.无细菌状态–进行细菌学筛选以确认药物制品不含人关注的潜在生物因子。进行需氧和厌氧筛选两者以确保无菌性。如本文所述将样品解冻，并酌情转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现微生物生长的迹象，则将判断所述制品符合无菌性测试。
k.无真菌学(真菌)状态–进行真菌学筛选以确认药物制品不含关注的潜在真菌因子。如本文所述将样品解冻。解冻后，将样品转移到大豆-酪蛋白消化物琼脂中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现真菌生长的迹象，则将根据USP<71>判断所述制品符合无菌性测试。
l.无支原体状态–进行支原体筛选以确认药物制品不含支原体。如本文所述将样品解冻，并且添加至100mL支原体肉汤中并在37℃下孵育至多21天。在2-4天、7-10天、14天和21天后对样品进行传代培养。然后将板在37℃下孵育至多14天，并检查支原体集落的存在。如果未检测到任何集落，则发现所述制品符合USP<63>并且不含支原体。
m.无内毒素状态–进行无内毒素状态以确认药物制品不含关注的内毒素和相关因子。对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(LAL)测试的抑制/增强。如本文所述将样品解冻，并在37℃下每个样品用40mL WFI提取1小时。然后将样品在LAL动力学发色测试中进行测试，在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。将根据USP<85>进行测定。
n.进行的病毒测定–进行病毒测定以确认源动物不含关注的潜在病毒因子，从而确认了内源性病毒(参见下文)。这包括针对特定潜伏性内源性病毒(包括PERV)的共培养和RT-PCR测试。还对动物源进行体内测定，以监测动物健康和无病毒感染，这是批次发布标准的关键方面。由于猪组织中PERV的本土性质，因此这使得有资格作为阳性结果而不排除使用这种组织。然而，已在批次发布中鉴定和表征所述病毒，以提供信息监测异种移植制品的接受者。
o.细胞生存能力测定–进行MTT测定以确认异种移植制品中细胞的生物活性状态。与阳性对照(新鲜、未冷冻保存的)和阴性对照(热变性的)相比，通过线粒体活性的替代标志物提供了生存能力的证据。细胞的活性对于异种移植制品是必需的，以提供预期的临床功能。这是批次发布标准所必需的，并且目前已确定组织生存能力应不低于新鲜组织对照比较物所展示的代谢活性的50％。
p.组织学和形态学–在显微镜下通过对表皮和真皮层的苏木精和曙红(H&E)切片染色的可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织和细胞浸润群体的正确细胞形态和组织。进行此操作以确认在异种移植制品中存在的细胞的适当生理外观和身份。异种移植制品由猪真皮和表皮组织层组成。这是批次发布标准所必需的。验证了表皮层中以下细胞层(从最表面到最深)的证据：
i.角质层
ii.颗粒层
iii.棘突层
iv.基底层
验证了真皮层中以下细胞结构的证据：
v.血管、脉管系统的证据
vi.神经
vii.各种腺体
viii.毛囊
ix.胶原
经基因工程改造的源动物在基因组中不含有任何外来的、引入的DNA；所采用的基因修饰仅是单个基因的敲除，所述单个基因负责编码引起细胞表面抗原普遍表达的酶。将理解的是，异种移植制品在一个或多个方面不结合转基因技术，诸如CD-46或CD-55转基因构建体。
进行无内毒素状态以确认药物制品不含关注的内毒素和相关因子。确保无内毒素状态的方案如下：对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(Limulus amoebocytelysate，LAL)测试的抑制/增强。将样品解冻、提取并在LAL动力学发色测试中进行测试，根据USP<85>在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。
进行MTT测定以确认制品中细胞的生物活性状态。与阳性对照(新鲜、未冷冻保存的)和阴性对照(热变性的)相比，通过线粒体活性的替代标志物提供了生存能力的证据。细胞活性是制品所必需的，以提供预期的临床功能和对于一个方面在50％至100％线粒体活性范围内的生存能力参数。
在显微镜下通过对表皮和真皮层的苏木精和曙红(H&E)切片染色的可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织和细胞浸润群体的正确细胞形态和组织。进行此操作以确认在制品中存在的细胞的适当生理外观和身份。
对于皮肤异种移植制品，验证了表皮层中以下细胞层(从最表层到最深)的证据：角质层；颗粒层；棘突层；基底层。验证了真皮层中以下细胞结构的证据：血管；神经；腺；毛囊；胶原蛋白。
可以将异种移植制品进一步处理以确保其仍然不含需氧和厌氧的细菌、真菌、病毒和支原体。在无菌条件下，在收获之后立即、在收获后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒内、在10秒至1分钟内、在1分钟至1小时内、在1小时至15小时内、或在15小时至24小时内，使用适用的无菌技术，在药物制品加工套房中的层流通风橱中，例如使用UV辐照或抗微生物剂/抗真菌剂中的一种或多种对异种移植制品进行灭菌。在一个方面，可以将制品放置于抗微生物剂/抗真菌剂浴(“抗病原体浴”)中。抗病原体浴可以包括：一种或多种抗细菌剂，例如氨苄青霉素、头孢他啶、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢菌素、青霉素、四环素、万古霉素等等；一种或多种抗真菌剂，例如两性霉素-B、唑类、咪唑类、三唑类、噻唑类、杀假丝菌素、哈霉素、游霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、烯丙胺、棘球白素等等；以及/或者一种或多种抗病毒剂。抗病原体浴可以包括载体或介质作为稀释剂，例如RPMI-1640培养基。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少2种抗细菌剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少2种抗细菌剂和至少一种抗真菌剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少四种药剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括不超过4、5、6、7、8、9或10种药剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括前述的任何组合。
在一个方面，关于皮肤，由根据本发明的源自猪供体的真皮组织组成的全层厚度皮肤移植物伤口敷料与所培养的表皮自体移植物结合或组合使用，以产生根据本公开的和可以在本公开的方法中使用的制品。在应用表皮自体移植物之前，需要对伤口床进行大量清创术以确保有足够的基底。为了确认伤口床已准备好进行表皮自体移植，应用本文所述的皮肤制品，例如源自本公开动物的生物皮肤制品以确认附着。一旦确认附着，就去除临时的伤口覆盖制品，并且在一些方面，用网状的自体移植物覆盖伤口床，并且将一种或多种培养的表皮自体移植物制品放置在顶部以封闭自体移植物网中的间隙。
在一些方面，伤口床可以包括或者可以是慢性伤口或急性伤口。慢性伤口包括但不限于静脉腿溃疡、压力性溃疡和糖尿病性足溃疡。急性伤口包括但不限于烧伤、创伤性损伤、截肢伤口、皮肤移植物供体部位、咬伤、冻疮伤口、皮肤擦伤和手术伤口。
在没有真皮的情况下，使用根据本发明生产的生物制品。从此类制品中去除表皮(例如，在使用VERSAJETTM Hydrosurgery系统在猪上收获真皮之前)，使得仅保留真皮。然后，将主题生物制品放置于患者的皮下组织上，作为本文所述的培养的表皮自体移植物过程的基质。
在一个方面，将根据本公开衍生的肝用于体外灌注作为人患者的临时过滤器，直到患者接受人移植体为止。在DPF隔离区域内的手术区域中，将源动物放置在一般麻醉剂(氯胺酮、甲苯噻嗪、安氟醚)下或通过俘虏式栓系实施安乐死。然后在无指定病原体条件下对源动物进行肝切除术。可以将源自源动物的肝制品包装起来并按照人供体肝的现行惯例运输到程序的地点。可以例如通过用动脉套管经皮将套管插入人患者的颈内静脉进行静脉回流、以及用动脉套管经皮将套管插入患者的股静脉进行静脉流出来执行利用肝过滤制品的程序。将这些套管连接到旁路回路，旁路回路装有其中并入的离心泵、热交换器、充氧器和辊式泵。将该回路用晶体预处理并运行一段时间(例如10-30分钟)，然后将根据本公开的动物的肝以稳定的流速(例如600-1000ml/min)掺入，维持在偶尔补充有温的溶液(例如30-40℃)的晶体浴中。
在一个方面，本公开包括来自优化的猪供体的免疫相容性多巴胺能神经元，所述神经元使多巴胺释放恢复并且重新支配人脑，从而治疗和逆转神经退行性疾病。
在一个方面，本公开包括用于治疗、抑制和逆转运动控制的进行性丧失的方法。PD是渐进退行性疾病，其特征在于震颤、运动迟缓、强直和姿势不稳。
在一个方面，本公开包括猪免疫相容性多巴胺能神经元，所述神经元被进一步修饰为对错误折叠的α-突触核蛋白聚集体的积聚具有耐受性，所述修饰通过沉默涉及α-突触核蛋白的产生、运输和处置的基因来进行。
在一个方面，本公开包括一种用于产生和保存免疫相容性多巴胺能神经元的方法、生物系统、细胞、经基因修饰的非人动物、细胞、制品、载体、试剂盒和/或遗传物质，当所述神经元移植到帕金森病患者中时具有致耐受性，并且对错误折叠的α-突触核蛋白聚集体的积聚具有耐受性。
在一个方面，本公开包括从临床级猪供体获得的间充质干细胞，所述间充质干细胞在体内进一步分化为mDA神经元或祖细胞。
在一个方面，本公开包括一种用于产生和保存免疫相容性多巴胺能神经元的方法、生物系统、细胞、经基因修饰的非人动物、细胞、制品、载体、试剂盒和/或遗传物质，当所述神经元移植到帕金森病患者中时具有致耐受性。
在一个方面，本公开包括一种用于产生和保存从临床级猪供体获得的免疫相容性间充质干细胞的方法、生物系统、细胞、经基因修饰的非人动物、细胞、制品、载体、试剂盒和/或遗传物质，所述间充质干细胞在体内进一步分化为mDA神经元或祖细胞。
在一个方面，本公开包括一种涉及手术的方法，所述方法包括将猪来源的细胞注射到脑单侧的纹状体中。在一些方面，手术可以分阶段进行。例如，可以在第一阶段首先将细胞施用于症状较重的脑侧，然后可以在第二阶段将细胞施用于症状较轻的脑侧。
根据本公开的冷冻保存和储存包括制备根据本公开的生物制品、放置于容器中、向容器中添加冷冻介质并密封。例如。将15％的二甲亚砜(DMSO)冷冻保护介质与胎儿猪血清(FPS)或供体血清(如果没有FPS)以1:1的比率组合，过滤(0.45微米)，并在使用前冷却至4℃。随后将容器以每分钟1℃的速率在控制速率的相冷冻机(phase freezer)中冷冻至-40℃，然后迅速冷却至-80℃的温度。DMSO在冷冻过程中会替换细胞内液体。以基于冷冻小瓶的最大内部体积(10ml)比异种移植制品的体积小约40-80％或50-70％的量使用冷冻保护介质(例如CryoStor)。为了解冻用于手术用途的冷冻保存的生物制品，将密封的小瓶放置于约37℃水浴中持续大约0.5至2分钟，此时打开容器并使用无菌技术将所述制品取出。随后，制品在温和搅拌下例如在盐水中经历三次1分钟连续洗涤，以稀释并系统地除去周围的残留DMSO并防止细胞生存能力丧失。然后可以通过外科手术使用制品。
将理解的是，可以使用材料、容器和过程进行处理、储存、运输和/或以其他方式处理异种移植制品，以确保保存无菌性并防止对其造成损害。在一些方面，可以使用无菌的非粘性材料来保护异种移植制品，例如，以支撑异种移植制品并防止所述制品粘附在表面上和/或防止异种移植制品在操作、存储或运输期间的自粘。异种移植制品的意外粘附可能破坏异种移植制品的完整性，并可能降低其治疗可行性。包含无菌非粘性材料提供了保护和/或物理支持，并防止粘附。在一些方面，无菌的非粘性材料没有生物或化学活性，并且不直接影响异种移植制品本身的代谢活性或功效。
描述性、非限制性条目列表
通过以下非限制性条目列表进一步描述本公开的各方面：
条目1.一种用于产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库的生物系统，其中所述生物系统具有生物活性和代谢活性，所述生物系统包括用于移植到人接受者中的非人动物供体中的基因重新编程的细胞、组织和器官，
其中所述非人动物供体是用于异种移植从基因重新编程的猪供体中分离的细胞、组织和/或器官的所述基因重新编程的猪供体，所述基因重新编程的猪供体包含如下基因组，所述基因组已被重新编程以将在野生型猪供体的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获参考序列的多个合成核苷酸，并且
其中所述基因重新编程的猪供体的细胞不呈递一个或多个表面聚糖表位，所述表面聚糖表位选自半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)、Neu5Gc和/或Sda，
并且其中编码α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的基因被破坏，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏由所述基因编码的表面聚糖表位的功能性表达，
其中所述重新编程的基因组包含在以下区域处的核苷酸的定点诱变取代：i)用来自所述人接受者的HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸来对所述野生型猪供体的SLA-3的核苷酸进行所述定点诱变取代；以及ii)分别用来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-6、SLA-7和SLA-8的核苷酸进行所述定点诱变取代；以及iii)用来自所述人接受者的HLA-DR和HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-DQ的核苷酸进行所述定点诱变取代，
其中所述野生型猪供体的基因组的内源外显子和/或内含子区域未被重新编程，并且
其中所述重新编程的基因组包括A-D：
A)其中所述重新编程的猪供体基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2-的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪供体的两个β2微球蛋白(B2M)中的第一个的区域处的核苷酸的定点诱变取代
B)
C)其中所述重新编程的猪供体基因组已经被重新编程，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏所述野生型猪供体的两种内源性β2微球蛋白(B2M)多肽中的第二种的功能性表达；
D)其中所述重新编程的猪供体基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪供体的PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代，
其中所述重新编程的猪供体基因组已经被重新编程，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏所述野生型猪供体的内源性β2微球蛋白(B2M)多肽的功能性表达；并且
其中所述重新编程不引入任何移码或框破坏。
条目2.如条目1所述的生物系统，其中所述基因重新编程的猪供体是非转基因的。
条目3.如条目1或条目2所述的生物系统，其中所述野生型猪供体的基因组的内源外显子和/或内含子区域未被重新编程。
条目4.如条目1-3中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述基因重新编程的猪供体不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪供体布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪供体肺炎支原体、猪供体生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、Microphyton属种、毛癣菌属种、猪供体流感、猪供体巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
条目5.如条目1-4中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述基因重新编程的猪供体根据减少生物负荷的程序来维持，所述程序包括将所述猪供体维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述病原体，并且其中所述猪供体被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物供体和动物安置设施接触。
条目6.如条目1-4中任一项所述的生物系统，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处以及在编码SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、CTLA-4、PD-L1、EPCR、TBM、TFPI和β2微球蛋白(B2M)的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)、SLA-1、SLA-2和SLA-DR的功能性表达。
条目7.如条目1-5中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述野生型猪供体基因组在CTLA-4启动子和PD-L1启动子中的一个或多个处包含重新编程的核苷酸，其中与野生型猪供体的CTLA-4和PD-L1的内源性表达相比，所述CTLA-4启动子和所述PD-L1启动子中的所述一个或多个被重新编程以增加重新编程的CTLA-4和重新编程的PD-L1中的一者或两者的表达。
条目8.如条目1-6中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述合成核苷酸的总数等于所替换核苷酸的总数，使得在用所述合成核苷酸重新编程所述野生型猪供体的基因组之后的核苷酸数量没有净损失或净增加。
条目9.如条目1-7中任一条目或组合所述的生物系统，其中用所述多个合成核苷酸的重新编程不包括编码在所述野生型猪供体MHC序列与所述人捕获参考序列之间保守的氨基酸的密码子区域中的核苷酸的替换。
条目10.如条目1-8中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪供体的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸的定点诱变取代。
条目11.如条目1-9中任一条目或组合所述的生物系统，其中在用于生产所述非人动物供体的种系细胞中进行定点诱变取代。
条目12.如条目1-10中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
条目13.如条目1-11中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-A捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-1的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目14.如条目1-12中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-B捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目14.如条目1-13中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-3的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目15.如条目1-14中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-E捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-6的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目16.如条目1-15中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-F捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-7的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目17.如条目1-16中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-8的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目18.如条目1-17中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含在所述野生型猪供体的MHC I类链相关基因2(MIC-2)的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目19.如条目1-18中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DR、SLA-DQ或它们的组合的功能性表达。
条目20.如条目1-19中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQA捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪供体的SLA-DQA的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目21.如条目1-20中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQB捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪供体的SLA-DQB的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目22.如条目1-21中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DRA和HLA-DRB的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-DRA和SLA-DRB的区域处的核苷酸的定点诱变取代，或其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DRA和SLA-DRB的功能性表达。
条目23.如条目1-22中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA和HLA-DQB的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-DQA和SLA-DQB的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目24.如条目1-23中任一条目或组合所述的生物系统，其中核苷酸的所述定点诱变取代位于在所述野生型猪供体的基因组与所述已知人序列之间不保守的密码子处。
条目25.如条目1-24中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人β2微球蛋白(B2M)的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目26.如条目1-25中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的猪供体基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白(B2M)糖蛋白的氨基酸序列直系同源的人源化β2微球蛋白(B2M)多肽序列。
条目27.如条目1-26中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组已被重新编程，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏所述野生型猪供体的内源性β2微球蛋白(B2M)多肽的功能性表达。
条目28.如条目1-27中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组已被重新编程，使得在所述猪供体的β2微球蛋白(B2M)基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人捕获参考序列的β2多肽的核苷酸序列。
条目29.如条目1-28中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和MIC-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目30.如条目1-29中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-DQ和MIC-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目31.如条目1-30中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ和MIC-2处的核苷酸的定点诱变取代。
条目32.如条目1-31中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DR、SLA-1和/或SLA-2的功能性表达。
条目33.如条目1-32中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组使用外显子区域的无痕交换来重新编程，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
条目34.如条目1-33中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程而不引入任何净插入、缺失、截短或其他将通过移码、无义突变、或错义突变而导致蛋白质表达的破坏的遗传改变。
条目35.如条目1-34中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组的内源外显子和/或内含子区域中的核苷酸未被破坏。
条目36.如条目1-35中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程以在重新编程的外显子区域为纯合的。
条目37.如条目1-36中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得多肽的细胞外的表型表面表达在人接受者中是致耐受的。
条目38.如条目1-37中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达通过重新编程CTLA-4启动子序列而被增加。
条目39.如条目1-38中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自人捕获参考序列CTLA-4的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型CTLA-4的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目40.如条目1-39中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的CTLA-4直系同源的人源化CTLA-4多肽序列。
条目41.如条目1-40中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得程序性死亡配体1(PD-L1)的表达通过重新编程PD-L1启动子序列而被增加。
条目42.如条目1-41中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自已知人PD-L1的直系同源外显子的核苷酸对野生型PD-L1的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目43.如条目1-42中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由人捕获参考基因组表达的PD-L1直系同源的人源化PD-L1多肽序列。
条目44.一种获自如条目1-43中任一条目或组合所述的生物系统的基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官。
条目45.如条目44所述的基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞是干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或分化的干细胞。
条目46.如条目45所述的基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述干细胞是造血干细胞。
条目47.如条目44所述的基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人组织是神经、软骨或皮肤。
条目48.如条目44所述的基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述基因重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人器官是实体器官。
条目49.一种制备基因重新编程的猪供体的方法，所述基因重新编程的猪供体包含如下核基因组，所述核基因组缺乏表面聚糖表位的功能性表达，并且被基因重新编程以表达人捕获参考序列的人源化表型，所述表面聚糖表位选自半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)、Neu5Gc和/或Sda，所述方法包括：
a.获得猪胚胎成纤维细胞、猪受精卵、猪间充质干细胞(MSC)或猪生殖系细胞；
b.对a)中的所述细胞进行基因改变以缺乏功能性α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)；
c.使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR或任何多重、精确基因编辑技术)/Cas对以下区域处的核苷酸进行定点诱变取代来对b)中的所述细胞进行基因重新编程：i)用来自所述人接受者的基因组的HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-3的核苷酸进行定点诱变取代；以及ii)分别用来自所述人接受者的基因组的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸对至少一个所述野生型猪供体的SLA-6、SLA-7和SLA-8的核苷酸进行定点诱变取代；以及iii)用来自所述人接受者的HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-DQ的核苷酸进行定点诱变取代，
其中所述野生型猪供体的基因组的内源外显子和/或内含子区域未被重新编程，并且
其中所述重新编程的基因组包含A-D中的至少一个：
A)其中所述重新编程的猪供体核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2微球蛋白(B2M)的直系同源外显子的核苷酸对在所述野生型猪供体的两个β2微球蛋白(B2M)中的第一个的区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪供体核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白(B2M)直系同源的人源化β2微球蛋白(B2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪供体核基因组已经被重新编程，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏所述野生型猪供体的两种内源性β2微球蛋白(B2M)多肽中的第二种的功能性表达；
D)其中所述重新编程的猪供体核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2的直系同源外显子的核苷酸对在所述野生型猪供体的PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代，
其中所述重新编程不引入任何移码或框破坏，
d.从c)中的所述基因重新编程的细胞产生胚胎；并且
e.将所述胚胎移植到代孕猪中并使所述移植的胚胎在所述代孕猪中生长。
条目50.如条目49所述的方法，其中步骤(a)还包括将野生型猪供体的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自所述人捕获参考序列的主要组织相容性复合物序列的直系同源外显子区域的核苷酸，其中所述替换不引入任何移码或框破坏。
条目51.如条目49-50中任一条目或组合所述的方法，其中所述替换包括用来自所述已知人主要组织相容性复合物序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪供体的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸进行定点诱变取代。
条目52.如条目49-51中任一条目或组合所述的方法，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
条目53.如条目49-52中任一条目或组合所述的方法，其中所述直系同源外显子区域位于所述野生型猪供体的主要组织相容性复合物的一种或多种多态性糖蛋白处。
条目54.如条目49-53中任一条目或组合所述的方法，其还包括：用所述胚胎使所述代孕猪受孕，孕育所述胚胎，并且通过剖腹产术从所述代孕猪中分娩出仔猪，
确认所述仔猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过测定抗体滴度确定的钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、Microphyton和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌(Brucellasuis)；并且
根据减少生物负荷的程序来维持所述仔猪，所述程序包括将所述仔猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述仔猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物供体和动物安置设施接触。
条目55.如条目49-54中任一条目或组合所述的方法，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处以及在编码SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、CTLA-4、PD-L1、EPCR、TBM、TFPI和β2微球蛋白(B2M)的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)、SLA-DR、SLA-1和SLA-2的功能性表达。
条目56.如条目49-55中任一条目或组合所述的方法，其中所述野生型猪供体基因组在CTLA-4启动子和PD-L1启动子中的一个或多个处包含重新编程的核苷酸，其中与野生型猪供体的CTLA-4和PD-L1的内源性表达相比，所述CTLA-4启动子和所述PD-L1启动子中的所述一个或多个被重新编程以增加重新编程的CTLA-4和重新编程的PD-L1中的一者或两者的表达。
条目57.如条目49-56中任一条目或组合所述的方法，其中所述合成核苷酸的总数等于所替换核苷酸的总数，使得在用所述合成核苷酸重新编程所述野生型猪供体的基因组之后的核苷酸数量没有净损失或净增加。
条目58.如条目49-57中任一条目或组合所述的方法，其中用所述多个合成核苷酸的重新编程不包括编码在所述野生型猪供体MHC序列与所述人捕获参考序列之间保守的氨基酸的密码子区域中的核苷酸的替换。
条目59.如条目49-58中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪供体的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸的定点诱变取代。
条目60.如条目49-59中任一条目或组合所述的方法，其中在用于生产所述非人动物供体的种系细胞中进行定点诱变取代。
条目61.如条目49-60中任一条目或组合所述的方法，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
条目62.如条目49-61中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-A捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-1的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目63.如条目49-62中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-B捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目64.如条目49-63中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-3的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目65.如条目49-64中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-E捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-6的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目66.如条目49-65中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-F捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-7的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目67.如条目49-66中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-8的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目68.如条目49-67中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含在所述野生型猪供体的MHC I类链相关基因2(MIC-2)的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目69.如条目49-68中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-1、SLA-2、SLA-DR或其组合的功能性表达。
条目70.如条目49-69中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQA捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪供体的SLA-DQA的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目71.如条目49-70中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQB捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪供体的SLA-DQB的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目72.如条目49-71中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DRA和HLA-DRB的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-DRA和SLA-DRB的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目73.如条目49-72中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA和HLA-DQB的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪供体的SLA-DQA和SLA-DQB的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目74.如条目49-73中任一条目或组合所述的方法，其中核苷酸的所述定点诱变取代位于所述野生型猪供体的核基因组与所述已知人序列之间不保守的密码子处。
条目75.如条目49-74中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人β2微球蛋白(B2M)的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目76.如条目49-75中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的猪供体核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白(B2M)糖蛋白的氨基酸序列直系同源的人源化β2微球蛋白(B2M)多肽序列；
条目77.如条目49-76中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组已被重新编程，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏所述野生型猪供体的内源性β2微球蛋白(B2M)多肽的功能性表达。
条目78.如条目49-77中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组已被重新编程，使得在所述猪供体的内源性β2微球蛋白(B2M)基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人捕获参考序列的β2微球蛋白(B2M)多肽的核苷酸序列。
条目79.如条目49-78中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和MIC-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目80.如条目49-79中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-DQ和MIC-2的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目81.如条目49-80中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含在SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ和MIC-2处的核苷酸的定点诱变取代。
条目82.如条目49-81中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DR、SLA-1和/或SLA-2的功能性表达。
条目83.如条目49-82中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组使用外显子区域的无痕交换来重新编程，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
条目84.如条目49-83中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程而不引入任何净插入、缺失、截短或其他将通过移码、无义突变、或错义突变而导致蛋白质表达的破坏的遗传改变。
条目85.如条目49-84中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组的内源外显子和/或内含子区域中的核苷酸未被破坏。
条目86.如条目49-85中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程以在重新编程的外显子区域为纯合的。
条目87.如条目49-86中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得多肽的细胞外的表现型表面表达在人接受者中是致耐受的。
条目88.如条目49-87中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达通过重新编程CTLA-4启动子序列而被增加。
条目89.如条目49-88中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自人捕获参考序列CTLA-4的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型CTLA-4的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目90.如条目49-89中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的CTLA-4直系同源的人源化CTLA-4多肽序列。
条目91.如条目49-90中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得程序性死亡配体1(PD-L1)的表达通过重新编程PD-L1启动子序列而被增加。
条目92.如条目49-91中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人PD-L1的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型PD-L1的区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目93.如条目49-92中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由人捕获参考基因组表达的PD-L1直系同源的人源化PD-L1多肽序列。
条目94.一种诱导在接受者人中对异种移植的细胞、组织或器官的至少部分免疫耐受的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白(B2M)的一种或多种的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)的功能性表达；并且将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目95.一种减少自然杀伤细胞介导的异种移植物的排斥的方法，所述方法包括：产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白(B2M)中的一者或多者的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)的功能性表达，并且其中所述野生型猪供体基因组包含在编码所述野生型猪供体的CTLA-4和PD-L1中的一者或多者的区域处的重新编程的核苷酸；并且将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目96.一种减少对异种移植物的细胞毒性T细胞淋巴细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白(B2M)中的一种或多种的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)的功能性表达，并且其中所述野生型猪供体基因组包含在编码所述野生型猪供体的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的区域处的重新编程的核苷酸；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目97.一种预防或减少在接受者人体内对异种移植的细胞、组织或器官的凝血和/或血栓性缺血的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白(B2M)中的一种或多种的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)的功能性表达，并且其中所述野生型猪供体基因组包含在编码所述野生型猪供体的内皮蛋白C受体(EPCR)、血栓调节蛋白(TBM)和组织因子途径抑制剂(TFPI)中的一种或多种的区域处的重新编程的核苷酸；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目98.一种减少对异种移植物的MHC Ia类介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-3和所述野生型猪供体的MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白(B2M)中的一种或多种的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)、SLA-1和SLA-2的功能性表达；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目99.一种减少对异种移植物的MHC Ib类介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-6、SLA-7和SLA-8以及所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC II类和β2微球蛋白(B2M)中的一种或多种的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)的功能性表达；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目100.一种减少对异种移植物的MHC II类介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种以及所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类和β2微球蛋白(B2M)中的一种或多种的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)的功能性表达；并且将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目101.一种抑制对异种移植物的凋亡细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白(B2M)中的一种或多种的区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪供体β2微球蛋白(B2M)的功能性表达，并且其中所述野生型猪供体基因组包含在编码所述野生型猪供体的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的区域处的重新编程的核苷酸；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目102.一种生产用于异种移植的猪供体组织或器官的方法，其中所述猪供体组织或器官的细胞被基因重新编程成特征在于接受者特异性表面表型，所述方法包括：
从预期的人移植接受者获得含有DNA的生物样品；
对生物样品进行全基因组测序以获得人捕获参考序列；
在基因座(i)-(v)处比较所述人捕获参考序列与猪供体的野生型基因组：
(i)编码SLA-3的外显子区域；
(ii)编码SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域；
(iii)编码SLA-DQ的外显子区域；
(iv)一个或多个编码β2微球蛋白(B2M)的外显子；
(v)SLA-MIC-2基因的外显子区域，以及编码PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI的基因，产生合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，长度为10至350个碱基对，针对所述基因座(i)-(v)中的一者或多者，其中所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，在分别对应于猪供体基因座(i)-(vi)的直系同源基因座(vi)-(x)处与所述人捕获参考序列具有至少95％同一性：
(vi)编码HLA-C的外显子区域；
(vii)编码HLA-E、HLA-F和HLA-G的外显子区域；
(viii)编码HLA-DQ的外显子区域；
(ix)一个或多个编码人β2微球蛋白(B2M)的外显子；
(x)编码来自所述人捕获参考序列的MIC-A、MIC-B、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI的外显子区域，用所述合成核苷酸来替换(i)-(v)中的核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计；以及从具有所述合成核苷酸序列的基因重新编程的猪供体获得用于异种移植的所述猪供体组织或器官，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计。
条目103.如条目102所述的方法，其还包括确认具有所述合成核苷酸序列的所述基因重新编程的猪供体不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过测定抗体滴度确定的钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、Microphyton和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌。
条目104.如条目102-103中任一条目或组合所述的方法，其还包括根据减少生物负荷的程序维持所述基因重新编程的猪供体，所述程序包括将所述基因重新编程的猪供体维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述基因重新编程的猪供体被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物供体和动物安置设施接触。
条目105.如条目102-104中任一条目或组合所述的方法，还包括从所述猪供体收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪供体实施安乐死并且从所述猪供体中无菌地取出所述生物制品。
条目106.如条目102-105中任一条目或组合所述的方法，其还包括在收获后使用不会如通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定所确定的将细胞生存能力降低至小于50％细胞生存能力的灭菌过程对所述生物制品进行处理，包括灭菌。
条目107.如条目102-106中任一条目或组合所述的方法，其还包括在保存细胞生存能力的存储条件下将所述生物制品储存在无菌容器中。
条目108.一种在所述基因重新编程的猪供体中筛选脱靶编辑或基因组改变的方法，所述基因重新编程的猪供体包含如条目1-49中任一条目或组合所述的核基因组，所述方法包括：对含有来自猪供体的DNA的生物样品进行全基因组测序，然后进行所述猪供体核基因组的基因重新编程，从而获得第一全基因组序列；在对所述猪供体核基因组重新编程之后，进行全基因组测序以获得第二全基因组序列；比对所述第一全基因组序列和所述第二全基因组序列以获得序列比对；分析所述序列比对以鉴定在脱靶位点处与所述猪供体的基因组的任何错配。
条目109.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MHC Ia类的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的SLA-3的区域处被用来自人捕获参考序列的HLA-C的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述SLA-3与来自所述人捕获参考序列的所述HLA-C之间不保守的氨基酸。
条目110.如条目109所述的基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计的合成核苷酸序列，其中所述野生型猪供体的SLA-1和SLA-2各自包含终止密码子(TAA、TAG或TGA)，或者这些中的1、2和/或3个的依次组合，并且在一些情况下，可以取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对。
条目111.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MHC Ib类的野生型猪供体内源外显子和/或内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的SLA-6、SLA-7和SLA-8的区域处被分别用来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的密码子进行重新编程，所述密码子分别编码在所述SLA-6、SLA-7和SLA-8与来自所述人捕获参考序列的所述HLA-E、HLA-F和HLA-G之间不保守的氨基酸。
条目112.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有如条目109和条目111两者或者条目110和条目111两者所述的合成核苷酸序列。
条目113.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MHC II类的野生型猪供体内源外显子和/或内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的SLA-DQ的区域处被分别用来自人捕获参考序列的HLA-DQ的密码子进行重新编程，所述密码子分别编码在来自所述人捕获参考序列的所述SLA-DQ与所述HLA-DQ之间不保守的氨基酸，并且其中所述野生型猪供体的SLA-DR包含终止密码子(TAA、TAG或TGA)，或者这些中的1、2和/或3个的依次组合，并且在一些情况下，可以取代所期望沉默(KO)的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对。
条目114.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有如条目109和条目113两者；条目110和条目113两者；或者条目112和条目113两者所述的根据所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计的合成核苷酸序列。
条目115.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体β2微球蛋白(B2M)的野生型猪供体内源外显子和/或内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)的区域处被用来自人捕获参考序列的β2微球蛋白(B2M)的密码子的进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的β2微球蛋白(B2M)与来自所述人捕获参考序列的所述β2微球蛋白(B2M)之间不保守的氨基酸，其中所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，包含在外显子区域中的至少一个终止密码子，使得所述合成核苷酸序列缺乏所述野生型猪供体的β2-多肽的功能性表达。
条目116.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体MIC-2的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在所述野生型猪供体的MIC-2的区域处被用来自人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述MIC-2与来自所述人捕获参考序列的所述MIC-A或所述MIC-B之间不保守的氨基酸。
条目117.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体CTLA-4的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的CTLA-4的区域处被用来自人捕获参考序列的CTLA-4的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的CTLA-4与来自所述人捕获参考序列的所述CTLA-4之间不保守的氨基酸。
条目118.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体PD-L1的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的PD-L1的区域处被用来自人捕获参考序列的PD-L1的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的PD-L1与来自所述人捕获参考序列的所述PD-L1之间不保守的氨基酸。
条目119.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体EPCR的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的EPCR的区域处被用来自人捕获参考序列的EPCR的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的EPCR与来自所述人捕获参考序列的所述EPCR之间不保守的氨基酸。
条目120.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体TBM的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的TBM的区域处被用来自人捕获参考序列的TBM的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的TBM与来自所述人捕获参考序列的所述TBM之间不保守的氨基酸。
条目121.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列基于所述人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，具有来自野生型猪供体TFPI的野生型猪供体内源外显子和/或内含子区域，并且在编码所述野生型猪供体的TFPI的区域处被用来自人捕获参考序列的TFPI的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪供体的TFPI与来自所述人捕获参考序列的所述TFPI之间不保守的氨基酸。
条目122.如任一条目所述的生物系统(动物)都可以具有O阴性血型。
条目123.如任一条目所述的制品的方法，其中蛋白质、细胞、组织和器官的获得以符合犹太教教规(Kosher)的方法进行。
在下面的实施例中进一步详细地描述了本发明，提供所述实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1
成功的人体临床异种移植
在用于治疗人患者的严重且广泛的部分厚度和全层厚度烧伤的本公开异种移植制品的人体评价中，获得了以下结果：
患者出现混合深度的火焰引起的烧伤，导致(解剖学)右侧上躯干有14％的全身表面积(TBSA)缺陷—具体而言，边界：从右侧腋窝(上边界)至第六根右侧肋骨(下边界)，如图51A所示。
外科医生用人已故供体(HDD)同种异体移植物和本公开的异种移植制品暂时地移植部分受累的伤口区域。伤口区域的其余区域用负压伤口疗法(NPWT)覆盖。患者在手术期间接受了大约150cm2的HDD同种异体移植物(啮合成1:1.5的比率和25cm2的本公开异种移植制品(啮合成1:1的比率)，这具体显示在图51B中。
两个临时伤口闭合敷料相邻放置，但不直接接触，并且在组织的周边用肘钉固定，覆盖上NPWT。
在第5天时对第一次伤口敷料更换的临床目视检查时，观察到HDD同种异体移植物和本公开的异种移植制品两者都完全粘附到下面的伤口床上并且无法区分开来，如图51C所示。
患者没有经历不良事件，也没有观察到或报告与异种移植制品相关的严重不良事件。
根据常规临床护理标准，在第一次伤口敷料更换时同时移除HDD同种异体移植物和本公开的异种移植制品。在机械移除后，下面的伤口床被同样地灌注(具有可见的点状出血)并且在其他方面看起来是等效的，如图51D所示。
与HDD同种异体移植物的伤口床相邻的本公开异种移植制品的伤口床的第5天特写图像显示在图51E中。
在移除后的第5天时，根据临床护理标准，整个受累的区域通过植入从患者获得的自身(自体)移植物(自体分层厚度皮肤移植物)接受了最终的伤口闭合，如图51F所示。
根据协议，获得了感染性疾病、免疫反应和长期评价的血液样品，以及手术前、围手术期和手术后的照片。
在第14天(从第一次手术开始)时，伤口敷料更换时的临床观察表明，在任何位置的伤口愈合率或质量都没有可辨别的差异，如图51G所示。
根据协议，获得了感染性疾病、免疫反应和长期评价的血液样品，以及手术前、围手术期和手术后的照片。
对基线血样(25mL)、第一次敷料更换(21mL)和两周血样(23mL)进行了通过定量RT-PCR检测PERV的测试。结果如下：
通过qPCR在从PBMC中分离的RNA或DNA和从血浆中分离的RNA中均未检测到PERV。在从PBMC中分离的RNA中没有发现如通过针对猪mtCOII基因的qPCR所确定的猪细胞的证据。
来源 Cq PERV pol Cq猪mtCOII PERV 猪细胞
DNA-PBMC <LOD <LOD 阴性 阴性
RNA-PBMC <LOD <LOD 阴性 阴性
RNA-血浆 <LOD <LOD 阴性 阴性
此外，还进行了一项研究以评估在丝裂霉素C处理的猪刺激细胞(GalT-KO猪B173)的存在下人淋巴细胞应答外周血单核细胞(PBMC)随时间的增殖反应。在移植猪皮肤移植物之前和之后，从在发起人研究XT-001中招募的患者获得PBMC样品。猪皮肤移植物从基因工程改造的GalT-KO猪获得。
患者PBMC样品事先通过Ficoll梯度离心制备并冷冻保存。来自皮肤供体猪(B173)的全血先前被运输到诊断实验室，并且PBMC通过Ficoll梯度离心分离并冷冻保存。在设置MLR的前一天，将样品在37℃下解冻、洗涤并在10％ FBS/RPMI中静置过夜。猪PBMC经丝裂霉素C处理(刺激物)并与等数量的测试人PBMC(应答者)混合。MLR与在第6天添加的BrdU一起孵育7天。在第7天，进行BrdU ELISA并测量增殖。
此外，还进行了一项研究以测量人血浆抗猪IgM和IgG与从GalT-KO猪获得的猪外周血单核细胞(PBMC)随时间结合的水平。在移植猪皮肤移植物之前和之后，从在发起人研究XT-001中招募的患者获得血浆样品。猪皮肤移植物从基因工程改造的GalT-KO猪获得。
在研究中，血浆样品在56℃的干热浴中进行了30分钟的去补体。将样品冷却并在FACS结合/洗涤介质中连续稀释。然后将稀释的血浆样品与KO猪PBMC一起孵育，随后与二抗(PE-山羊抗人IgG和FITC-山羊抗人IgM)一起孵育。适当的补偿、荧光减一(FMO)和空白限(LOB)对照在同一测定中运行。在ACEA NovoCyte流式细胞仪上采集和分析细胞。使用中值荧光强度(MFI)和如下获得的相对MFI评估抗猪IgM和IgG的结合：相对MFI＝实际MFI值/LOB(MFI仅在没有血浆的情况下使用二抗获得)。
在四个时间点(包括移植前和移植后(第7天、第16天、第30天))测量人血浆IgM和IgG结合。所有以1:2和1:10稀释的实际测试样品均显示MFI值高于LOB值。如图53所示，如相对中值荧光强度的增加所显示，在第16天和第30天获得了高于预先存在的水平的抗异种IgM和IgG水平的增加。通过7AAD确定的平均测定后细胞生存能力值为92.82％。将细胞仅针对活的细胞进行设门，以确定IgM和IgG与猪PBMC的结合。
在本实施例中，测量随时间推移的人血浆抗猪IgM和IgG与从GalT-KO猪获得的猪外周血单核细胞(PBMC)结合的水平。在移植猪皮肤移植物之前和之后，从在发起人研究XT-001中招募的患者获得血浆样品。猪皮肤移植物从基因工程改造的GalT-KO猪获得。
将血浆样品在56℃的干热浴中进行去补体30分钟。将样品冷却并在FACS结合/洗涤介质中连续稀释。然后将稀释的血浆样品与GalT-KO猪PBMC一起孵育，随后与二抗(PE-山羊抗人IgG和FITC-山羊抗人IgM)一起孵育。适当的补偿、荧光减一(FMO)和空白限(LOB)对照在同一测定中运行。在ACEA NovoCyteFlow流式细胞仪上采集和分析细胞。使用中值荧光强度(MFI)和如下获得的相对MFI评估抗猪IgM和IgG的结合：相对MFI＝实际MFI值/LOB(MFI仅在没有血浆的情况下使用二抗获得)。
在四个时间点(包括移植前和移植后(第7天、第16天、第30天))测量人血浆IgM和IgG结合。所有以1:2和1:10稀释的实际测试样品均显示MFI值高于LOB值。通过7AAD确定的平均测定后细胞生存能力值为92.82％。将细胞仅针对活的细胞进行设门，以确定IgM和IgG与猪PBMC的结合。
如相对中值荧光强度的增加所显示，在第16天和第30天获得了高于预先存在的水平的抗异种IgM和IgG水平的增加(图1、2、3、4和5)。
在第16天获得IgM增加6.8倍和IgG结合增加253.4倍。在第30天，IgM和IgG结合的倍数增加分别减少到4.6倍和179.9倍。
所有测试重复的重复平均值％CV<10。
将FSC-H和SSC-H密度图中的门(门E5-MAIN)在实际实验中设置为50,000个事件，每个孔中的事件>5,000。
另外五名患者随后接受了类似的成功治疗。
实施例2
MHC II类实验系列的沉默和个性化
本公开包括以下基因修饰实施方案：
/>
在本实施例中，研究了PAM细胞以类似MLR的形式与人PBMC供体一起刺激人PBMC增殖的能力。在第一个实验中，将静息的PBMC与1x104、2.5x104和5x104个细胞/孔丝裂霉素C处理的PAM细胞在96孔板中以2x105个细胞/孔的密度在200μL AIM-V培养基中共培养。结果显示PAM细胞在七天的培养中增殖，因此鉴定PBMC对PAM细胞的反应需要丝裂霉素C处理。丝裂霉素C是抗肿瘤抗生素，可通过与DNA交联并停止细胞复制来抑制DNA合成。虽然丝裂霉素C处理的细胞产生0.004-0.024的ABS450值，但未经处理的细胞产生1.117-1.158的ABS450值(图58A)。
PBMC#29+#57X和PBMC#57+#19X的七天共培养实验中的单向MLR响应分别为23.8和26.2，ABS450值分别为0.572和0.367。对于单向同种异体供体#29+57X和供体#57+供体#19X，IFN-γ和IL-2水平分别为708.01、121.22pg/mL和79.55、22.84pg/mL。
与阳性对照人同种异体MLR样反应相比，与人PBMC共培养的新鲜解冻的PAM细胞显示出显著较低的ABS450和SI值(图58B和图59A)。与供体#19和#29相比，供体#57PBMC显示出针对10K PAM细胞的最高增殖反应和IFN-γ水平(SIPAM10K+PBMC#57＝4.6和IFN-γ18.55pg/mL)，针对50K PAM细胞观察到最高的IL-2水平(IL-2＝8.68pg/mL)。人PBMC(PBMC#19+PHA、#29+PHA和#57+PHA)的促有丝分裂PHA对照呈阳性(SI＝15.8、29.0、33.4，ABS450＝0.799、0.705、0.457)
表：仅PBMC、促有丝分裂对照和共培养实验的SI、IFN-γ和IL-2水平
在三种不同的PAM细胞浓度下，含有10μg/mL LPS的丝裂霉素C处理的PAM“X”、PAM和PAM未产生任何IFN-γ和IL-2表达
表：在三种不同的PAM细胞浓度下，含有10μg/mL LPS的PAM“X”、PAM和PAM的IFN-γ和IL-2水平
与共培养实验前的两天培养的PAM细胞一致的是，未产生PBMC供体对PAM细胞的反应。虽然丝裂霉素C处理的PAM细胞产生的ABS450值为0.22-0.52，但是共培养实验也产生了类似的ABS450值(0.29-0.57)。
内容物 平均值 SD CV 刺激指数
10K PAM 2.88 0.13 4.46 N/A
10K PAMX 0.22 0.02 9.47 N/A
25K PAMX 0.41 0.03 7.79 N/A
50K PAMX 0.39 0 0.18 N/A
100K PAMX 0.52 0.04 6.84 N/A
IRB11 0.17 0.01 3.39 1
IRB11+10K PAMX 0.29 0.06 21.18 1.74
IRB11+25K PAMX 0.37 0 1.14 2.22
IRB11+50K PAMX 0.41 0 0.34 2.46
IRB11+100K PAMX 0.57 0.08 13.42 3.41
IRB 19 0.12 0 0.58 1
IRB 11/IRB 19 1.47 0.14 9.56 8.81
IRB 11/PHA 2.56 0.03 1.11 15.31
IRB 19/PHA 1.47 0.14 9.56 12.11
在本实施例中，评估了人PBMC(外周血单核细胞)和CD4+T细胞与猪肺泡巨噬细胞(PAM)共培养时的免疫增殖反应。本研究使用三种人PBMC供体(供体#11、#50、#57)。将人供体PBMC或它们的CD4+T细胞与未经处理的、IFN-γ激活的和负载KLH的PAM细胞共培养7天。使用分别从供体#11、#50和#57分离的细胞作为阳性和阴性对照进行单向同种异体和自体MLR实验。对丝裂霉素C(X)处理的和未经处理的PAM细胞以及每种人供体细胞进行背景对照。使用溴脱氧尿苷(BrdU)ELISA测定来确定增殖反应。在第6天，BrdU添加完成。在第7天收集培养基用于细胞因子(IFN-γ和IL-2)分析并确定增殖反应。
结果：
在IFN-γ的存在下培养PAM细胞72小时使SLA II类DQ分子表达从2.55％增加到95.82％。负载KLH的PAM细胞导致与未经处理的细胞相似水平的SLA II类DQ分子表达。
在MLR样共培养实验中，未经处理和经IFN-γ处理的PAM细胞在异种反应中均产生相似水平的ABS450值。此外，当供体#50与未经处理的和IFN-γ处理的PAM细胞共培养时，获得相似水平的IFN-γ和IL-2表达。虽然供体#11和供体#57在IFN-γ处理的细胞的情况下显示出相对较高的IL-2表达，但由于浓度水平低，很难得出有意义的结论。
所有同种异体对照均具有超过基线值的阳性增殖反应，并且丝裂霉素C处理的PBMC和PAM细胞与基线值相比具有降低的增殖反应。
人PBMC和CD4+T细胞反应导致同种异体反应高于在PAM细胞情况下的异种反应，但同种异体对照可能不是比较它们对异种反应的反应的合适对照。可以通过从相关人供体中分离或产生巨噬细胞来建立合适的对照。
在同种异体反应中，高IFN-γ和IL-2表达与高ABS-450值相关，如图60所示。然而，在异种反应中情况并非如此。所有具有人PBMC或CD4+T细胞的异种培养物均产生相似水平的ABS450值。然而，当PAM细胞与CD4#50(93.82pg/mL IFN-γ和146.44pg/mL IL-2)和PBMC#50(210.44pg/mL IFN-γ和72.58pg/mL IL-2)共培养时，观察到高IFN-γ和IL-2表达水平。事实上，与同种异体培养物相比，供体#50的异种培养物中的IL-2水平更高。
PAM细胞在不存在丝裂霉素-C的情况下增殖，产生最高ABS450值(15K PAM细胞)为3，不表达IFN-γ或IL-2，并且丝裂霉素C处理的细胞的ABS450值降低至0.029-0.06.
所有同种异体对照均具有超过基线值的阳性增殖反应，并且丝裂霉素C处理的PBMC和PAM细胞与基线值相比具有降低的增殖反应。所有自体增殖反应都接近预期的基线值并低于它们的同种异体反应(图61A-61B和62A-62B)。
未经处理的和经IFN-γ处理的PAM细胞在异种反应中均产生相似水平的ABS450值(图61A-61B)。此外，当供体#50与未经处理的和IFN-γ处理的PAM细胞共培养时，获得相似水平的IFN-γ和IL-2表达(表4)。虽然供体#11和供体#57在IFN-γ处理的细胞的情况下显示出相对较高的IL-2表达，但由于浓度水平低，很难得出有意义的结论。自身PBMC#50和PBMC#11或者仅PBMC#50或PBMC#11测试样品中的IFN-γ和IL-2表达接近或低于检出限(0.99pg/mL IFN-γ和1.72pg/mL IL-2)。
然而，这些细胞显示出针对BrdU掺入的高背景ABS 450水平(表4和图61B)。该结果可以表明在这些特定的PBMC细胞群中存在独立于T细胞活化的增殖细胞。
与阳性对照人同种异体MLR反应相比，异种共培养物显示出较低的ABS450和SI值(表4和图61A-61B)，但同种异体对照可能不是比较它们对异种反应的反应的合适对照。可以通过从相关人供体中分离或产生巨噬细胞来建立合适的对照。
在同种异体反应中，高IFN-γ和IL-2表达与高ABS-450值相关。
所有具有人PBMC或CD4+T细胞的异种培养物均产生低水平的ABS450值。
然而，当PAM细胞与CD4#50(93.82pg/mL IFN-γ和146.44pg/mL IL-2)和PBMC#50(210.44pg/mL IFN-γ和72.58pg/mL IL-2)共培养时，观察到高IFN-γ和IL-2表达水平。事实上，与同种异体培养物相比，供体#50的异种培养物中的IL-2水平更高。
较低的ABS 450值和相对较高的细胞因子分泌可能表明，在较早时间点发生的事件可能在异种反应中不发生，因为BrdU掺入传递了所发生情况的大致印象。
供体#57PBMC和CD4+T细胞与负载KLH、丝裂霉素处理的PAM细胞共培养，并且与未经处理的细胞相比时，显示出相似水平的ABS450值。
在共培养第7天使用流式细胞术7AAD染色分别测量到PBMC-PAM和CD4+-PAM共培养测试孔中的CD3+T细胞的活力为54％和64％。不含PAM细胞的PBMC细胞在第7天的活力为71％。
流式研究可以进一步支持这些数据。PAM细胞可以与CFSE标记的应答细胞共培养。CFSE共价标记细胞内分子。当CFSE标记的细胞分裂时，其子代具有一半的荧光强度，该荧光强度可以评估细胞分裂。此外，还可以分析应答细胞的T细胞活化标志物(CD69+、CD25+)，并研究耗尽的效应T细胞标志物。
在本实施例中，评估了人淋巴细胞(应答细胞)在丝裂霉素C处理的猪刺激淋巴细胞(非增殖性刺激细胞)存在下的增殖反应。通过将BrdU掺入增殖性淋巴细胞DNA来测量增殖反应，如通过ELISA程序所测量。所评估的组织从基因工程改造的GalT-KO猪获得。
猪淋巴细胞通过密度梯度分离法(Ficoll-Paque Plus)从外周全血中分离。将所分离的淋巴细胞分为两组；1)未经处理和2)丝裂霉素C处理。丝裂霉素C处理与DNA形成共价交联，从而防止增殖。未经处理的细胞能够增殖并充当应答细胞，而丝裂霉素C处理的细胞是非增殖性的，因此充当刺激细胞。由于非增殖性细胞不会主动掺入BrdU，因此使用抗BrdU特异性ELISA测定法可以对增殖性淋巴细胞与非增殖淋巴细胞进行差异测量。
用自身细胞(自体反应)、同一物种的其他个体的细胞(同种异体反应)、猪物种的细胞(存在和不存在α-Gal敲除基因-异种反应)或植物凝集素(促有丝分裂反应)评估患者淋巴细胞的增殖反应。作为测定法的对照指标，通过计算刺激指数δ将每个个体作为它们自己的对照，由此正数(促有丝分裂反应)对照减去负数(丝裂霉素C处理的细胞反应)得到正数。
使用等量的丝裂霉素C处理和未经处理的细胞来评估增殖反应。对于自体评估，将一组细胞用丝裂霉素C处理，并添加相同数量的来自同一个体动物的未经处理的细胞。该测定法中使用的同种异体刺激细胞来自无关的个体。猪刺激细胞来自同一头猪或遗传相关的猪异种移植供体。所有细胞均从外周血中分离，所述外周血被无菌收集到肝素钠中，并根据SOP A-031进行处理，或者从客户处接收冷冻保存的细胞。
读数：刺激指数的计算
刺激指数的计算方法是用测试吸光度(ABS450-570)值除以基线ABS450-570。
例如，如果平均测试ABS450-570＝1.321，基线平均ABS450-570＝0.124，则刺激指数(SI)为：1.321/0.124＝10.7。
下表显示了代表性模板图：
/>
刺激指数的计算方法是用测试吸光度(ABS450-570)值除以基线ABS450-570。
例如，如果平均测试ABS450-570＝1.321，基线平均ABS450-570＝0.124，则刺激指数(SI)为：1.321/0.124＝10.7。
验收标准如下：
如果QC测试样品产生的结果在以下范围内，则认为测定法是可接受的：
●阳性对照将等于或大于1.0
●阴性对照将等于或小于1.0
●同种异体对照SI将大于自体对照SI
●自体对照将等于或小于2.5
●异种对照将等于或大于2.0
该研究包括来自猪肺泡巨噬细胞(ATCC-263D421)的七种不同的WT来源修饰细胞系的八十五种单向、PBMC、CD8+和/或CD4+混合淋巴细胞反应(MLR)。
使用3名匿名、IRB批准的人受试者：
患者11(HLA-C、DQA、DQB等位基因字段)：等位基因：05:01、05:05、03:01
患者50(HLA-C、DQA、DQB等位基因字段)：等位基因：05:01、01:02、06:02
患者57(HLA-C、DQA、DQB等位基因字段)：等位基因：07:02、03:03、03:01
根据这些人患者的遗传信息，使用7种不同的基因工程改造的细胞系：
A-11DQA,B人源化
A-50DQA,B人源化
A-57DQA,B人源化
B-沉默DR
C-B2M人源化(患者11、50和57是同源的)
D-沉默SLA-A
E-沉默SLA-B
进行单向MLR(基线)测试：[接受者]:[供体]x
*所有测试一式三份进行总测试：36*
进行表型分析(FACS)。
总测试：21*
总测试：36*
组合总测试:49*
在本实施例中，通过流式细胞术评估了IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激对从(3D4/21细胞，目录号CRL-2843TM)购买的猪肺泡巨噬细胞(PAM)表型的影响。PAM细胞(3D4/21)的表面特征如图54所示。
将PAM细胞在RPMI-1640/10％ FBS中解冻，并在三个不同的培养板中培养两天。在第3天，对于巨噬细胞激活，将培养基更换为含有100ng/mL IFN-γ(板1)和100ng/mL IFN-γ加10ng/mL LPS(板2)的RPMI-1640/20％ FBS培养基。在RPMI-1640/20％ FBS中的未经处理的细胞用作对照(板3)。孵育24小时后，使用TrypLE处理将贴壁细胞从板上分离。将细胞重悬于FACS缓冲液(1X PBS pH＝7.4、2mM EDTA、0.5％BSA)中。通过台盼蓝排除法确定细胞计数和生存能力。在4℃下，将总共1x 105个细胞用小鼠抗猪SLA I类、SLA II类DR、SLA II类DQ抗体染色30分钟，并且用APC偶联的CD152(CTLA-4)-mulg融合蛋白(结合至猪CD80/CD86)染色45分钟。使用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并将抗体染色的细胞重悬于100μL含有抗小鼠APC偶联的多克隆IgG二抗的FACS缓冲液中。随后在4℃下孵育30分钟。使用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。将所有细胞重悬于200μL FACS缓冲液中。在Novacyte流式细胞术中获取样品，并使用NovoExpress分析数据。显示出聚集的培养细胞的显微照片显示于图55A-55B中。
未经处理的PAM细胞分别导致99.98％、29.68％和2.28％的SLA I类、SLA II类DR和DQ分子表达。这些细胞为4.81％ CD80/86+。在IFN-γ的存在下培养细胞24小时增加了所有SLA分子表达(99.99％ SLA I类+伴有中值荧光强度增加、42.27％ DR+、57.36％ DQ+)和CD80/86水平(47.38％)。与仅用IFN-γ处理的细胞相比，含IFN-γ的细胞与LPS导致相似水平的SLA分子和CD80/86表达。
将PAM细胞用猪IFN-γ处理24小时，并用一抗MAb和荧光素缀合的二抗和对共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)具有高亲和力的APC缀合的CD152染色。在用IFN-γ处理后，与未刺激的PAM细胞相比，这些细胞显示出增加的SLA和CD80/86共刺激分子表达。虽然未刺激的细胞为99.98％ SLA I类+、29.68％ DR+2.28DQ+和4.81％ CD80/86+，但IFN-γ刺激的细胞为99.99％ SLA I类+、42.27％ DR+、57.36％ DQ+、47.38％CD80/86+。与仅用IFN-γ处理的细胞相比，含有IFN-γ细胞与LPS导致相似水平的SLA分子和CD80/86表达。
在基础条件下，巨噬细胞表达低水平的SLA II类和CD80/86共刺激分子。IFN-γ和IFN-γ-LPS处理24小时诱导SLA II类和CD80/86共刺激分子以及SLA I类分子的表达。延长孵育将可能进一步增加这些分子的表达。
在本实施例中，在未经处理和IFN-γ处理的亲本猪巨噬细胞(PAM)存在的情况下，使用流式细胞术对供体#50CD4+T细胞的增殖和活化标志物表达进行评估。
在本研究中使用XenoDiagnostics,LLC通过其机构审查委员会(IRB)项目采购的一名人PBMC供体#50。在使用前，将冷冻保存的PBMC解冻并在培养箱中静置过夜。使用CD4+T细胞分离试剂盒(StemCell Technology)来分离CD4+T细胞(未接触/负向选择)。在该测定法中使用高度纯化的CD4+T细胞(98.58％)作为应答细胞。将CD4+T细胞使用CellTraceTM紫色(CTV)细胞增殖试剂盒来标记，并用抗CD3/CD28刺激来活化。这些刺激的细胞被用于荧光减一(FMO)对照，以确定阳性和阴性群体(5种颜色，CTV-405、CD4-PE、7AAD、CD69-APC、CD25-APC/Cy7)。将其余的CD4+CTV标记的T细胞(抗CD3/CD28刺激和未刺激的细胞二者)与未经处理的和IFN-γ处理的PAM或PAMX(丝裂霉素C处理)细胞共培养。在培养6天后，使用CD4-PE、7AAD(活力)、CD69-APC和CD25-APC/Cy7标志物对细胞进行染色。补偿对照被包括在内。其他对照包括(1)未标记的CD4+T细胞、(2)CTV标记的CD4+T细胞、(3)PAM细胞和(4)抗CD3/CD28刺激的CTV标记的CD4+T细胞。在Novocyte流式细胞仪上分析细胞。所有培养物均在CTSTMT细胞扩增培养基(CTS-OPT)中进行测试。在第6天，收集培养基，以用于细胞因子(IFN-γ和IL-2)的产生，并在配套研究(XD076-XLB366)中进行分析。
将活细胞通过用7AAD染色来区分，并通过用荧光抗体组染色来进行免疫表型分型，以区分CD4+T细胞与CD4-PAM细胞。该组还包括两种不同的T细胞活化标志物：CD69(早期)、CD25(晚期)。
未经刺激的CTV标记的CD4+T细胞或单独的PAM细胞未显示出任何增殖或者CD25和CD69表达。
使用CTV试剂，抗CD3/CD28刺激的细胞显示出8代。观察到直方图中的离散峰代表连续几代的活CD4+T细胞：99.82％和56.08％的CD4+T细胞分别为CD25+和CD69+。
使用CTV，在丝裂霉素C处理(PAMX)和IFNγ+丝裂霉素C处理的PAM细胞(PAMX-IFN-γ)的存在下，抗CD3/CD28刺激的CD4+T细胞显示出6代。这些共培养物中约99％的CD4+T细胞是CD25+和CD69+。
与丝裂霉素C处理的PAM细胞(PAMX)或IFN-γ处理的PAM细胞(PAMX-IFN-γ)共培养的CD4+T细胞分别显示出25.03％和32.46％的CD25表达以及5.82％和12.37％的CD69表达。
与PAM细胞或IFN-γ处理的PAM细胞共培养的CD4+T细胞分别显示出14.45％和51.30％的CD25表达以及2.92％和29.98％的CD69表达。CD69标志物不单独显示阳性和阴性群体。然而，CD69+染色细胞的荧光强度明显向右偏移(增加)。
将CD4+T细胞用平板结合的抗CD3、4μg/mL CD28(在溶液中)、PAM/PAMX细胞或IFN-γ处理的PAM/PAMX细胞进行刺激持续6天。将CD4+T细胞在培养前用5μM CTV来标记。通过用7AAD染色可将死CD4+T细胞与活细胞区分开来。将活细胞通过用荧光抗体组染色来进行免疫表型分型，以区分CD4+T细胞和CD4-PAM细胞。该组还包括两种不同的T细胞活化标志物：CD69(早期)、CD25(晚期)。使用补偿珠粒来运行补偿对照。运行FMO对照以区分阳性和阴性群体。使用NoVoExpress来进行数据分析。
使用CellTraceTM紫色试剂，抗CD3/CD28刺激的细胞显示出8代。该直方图中的离散峰代表连续几代的活CD4+细胞。99.82％和56.08％的CD4+T细胞分别为CD25+和CD69+。
表4：通过XD076-XLB366研究测试的CTSTM T细胞扩增培养基中的异种测试孔的IFN-γ和IL-2产生。含有高于可检测水平的细胞因子浓度的分析物以粗体显示。
数据表明，PAM细胞刺激T细胞增殖和活化标志物的表达。与未经处理的PAM细胞相比，IFN-γ处理的PAM细胞增强了增殖、CD25和CD69表达标志物。更高的增殖似乎与更高水平的CD25+和CD69+T细胞相关。
在本实施例中，目标是(1)测量猪肺泡巨噬细胞(PAM)和人供体#50CD4+T细胞共培养物中的IL-2和IFN-γ产生，(2)比较丝裂霉素c处理的和未经处理的PAM细胞对人供体#50CD4+T细胞的反应，以及(3)比较人CD4+T细胞在CTSTMT细胞扩增培养基和AIMV中与PAM细胞共培养时的免疫增殖反应。注意，在本研究中，PAM细胞未与IFN-γ一起预孵育。
本研究使用Xeno Diagnostics,LLC通过其机构审查委员会(IRB)项目采购的一名人PBMC供体#50。在使用前，将冷冻保存的PBMC解冻并在培养箱中静置过夜。使用CD4+T细胞分离试剂盒(StemCell Technology)来分离CD4+T细胞(未接触/负向选择)并用作应答细胞。使CD4+T细胞与WT PAM或丝裂霉素C处理的PAM细胞(PAMX)共培养。使细胞培养8天。在第2天、第4天和第7天从孔中收集培养物上清液，并储存在-80摄氏度处。对照孔含有CD4+T细胞和丝裂霉素C处理和未经处理的PAM细胞(作为阴性对照)。在XLB-364研究第4天从抗CD3和抗CD28刺激的细胞收集的上清液被用作阳性对照。所有培养物均在CTSTMT细胞扩增培养基中进行测试。还在仅第7天在AIM-V培养基中测试PAMX细胞的异种刺激能力，以比较第7天在CTSTMT细胞扩增培养基中测试的细胞。在第8天将上清液解冻，并使用MagPixTMMilliplex(LuminexTMtechnology)来分析IFN-γ和IL-2产生。此外，在第8天使用溴脱氧尿苷(BrdU)ELISA测定法来确定增殖反应。
在来自PAM和人供体#50CD4+T细胞共培养物的上清液中测量IL-2和IFN-γ产生。此外，我们通过BrdU ELISA测定法来研究PAM细胞刺激人CD4+T细胞增殖的能力。
抗CD3和抗CD28刺激的细胞在第4天显示出最高量的IL-2和IFN-γ表达。细胞因子水平低于所有基线细胞(CD4+T细胞、PAM和PAMX细胞)的检测水平。
第4天在异种培养物中收集的上清液显示出比第2天收集的培养物上清液更高的IL-2和IFN-γ表达。IL-2水平从163.48pg/mL(第4天)下降到第7天的8.37pg/mL的同时，IFN-γ水平从408.64pg/mL增加到1008pg/mL。
与第7天从PAMX-CD4+T细胞共培养物收集的上清液(8.37pg/mL，1008pg/mL)相比，从PAM-CD4+T细胞共培养物收集的培养上清液在第7天显示出更高水平的IL-2(173.98pg/mL)和IFN-γ(7406pg/mL)。
此前进行的XLB328研究在第7天在AIM-V培养基中的PAMX细胞与CD4+T细胞(供体#50)的培养物中产生146.44pg/mL IL-2和93.82pg/mL IFN-γ。目前的研究在相同的条件下产生134.31pg/mL IL-2和132.29pg/mL IFN-γ水平。
与AIM-V培养基中的培养物(SI＝5.25)相比，CTSTMT细胞扩增培养基中的异种培养物在BrdU掺入ELISA测定中显示出显著更高的刺激指数(SI＝86.92)，指示如图69所示的强阳性免疫原性反应。
总体而言，这些结果表明，细胞因子产生和增殖(BrdU掺入ELISA)二者均可用于研究PAM细胞刺激人CD4+T细胞的能力。
抗CD3和抗CD28刺激的细胞在第4天显示出最高量的IL-2和IFN-γ表达。在任何一天收集的上清液中，细胞因子表达均低于所有基线细胞(CD4+T细胞、PAM和PAMX细胞)的检测水平(表4、5和附录1)。第4天在异种培养物中收集的上清液显示出比第2天收集的培养物上清液更高的IL-2和IFN-γ表达(表4和附录1)。IL-2水平从163.48pg/mL(第4天)下降到第7天的8.37pg/mL的同时，IFN-γ水平从408.64pg/mL增加到第7天的1008pg/mL(表4和附录1)。
与第7天从PAMX-CD4+T细胞共培养物收集的上清液(8.37pg/mL IL-2，1008pg/mLIFN-γ)相比，从PAM-CD4+T细胞共培养物收集的培养上清液在第7天显示出更高水平的IL-2(173.98pg/mL)和IFN-γ(7406pg/mL)，如下表所示。
此前进行的XLB328研究在第7天在AIM-V培养基中的PAMX细胞与CD4+T细胞(供体#50)的培养物中产生146.44pg/mL IL-2和93.82pg/mL IFN-γ。目前的研究在相同的条件下产生134.31pg/mL IL-2和132.29pg/mL IFN-γ水平，如下表所示：
与AIM-V培养基中的培养物(SI＝5.25)相比，CTSTMT细胞扩增培养基中的异种培养物在BrdU掺入ELISA测定中显示出显著更高的刺激指数(SI＝86.92)，指示强阳性免疫原性反应。
刺激指数根据BrdU ELISA实验计算。显示了在CTS-OPT和AIM-V培养基中人CD4+T细胞(供体#50)对PAMX(mitC处理)的增殖反应。总之，研究XLB-366和XLB-364已经建立了用于表征WT PAM细胞在与人CD4+T细胞共培养时的免疫原性的最佳培养条件。
根据前述公开内容，发明人产生了在所述区域具有以下序列的猪供体细胞，以使细胞在本文所述的特定基因区域沉默、人源化和个性化。
在一个实施例中，使用单碱基对插入来敲除SLA-DRB1的基因，以在外显子1中产生终止密码子，如图70和图56所示。使用CRISPR技术并纳入引导RNA序列：GUGUCCCUGGCCAAAGCCAA；引导RNA切割位置：chr7:29,125,345；供体序列：GATGGTGGCTCTGACCGTGATGCTGGTGGTGCTGAGCCCTCCCTAG GCTTTGGCCAGGGACACCCCACGTAAGTACCTCTCTTGGG。
结果生成2个克隆ID：F3；修饰：DRB1-L26X(TTG>TAG)；描述：纯合子KI克隆，克隆ID：M21；修饰：DRB1-L26X(TTG>TAG)；描述：纯合子KI克隆。
将PAM细胞克隆F3和M21用p IFNγ处理48小时，并对细胞进行SLA-DR表达的表型分析。结果汇总于下表中，表中显示无SLA-DR的表面表达。
在本实施例中，使用大Fragdel在外显子2处敲除SLA-DQB1的基因，如图57所示。SLA DRB1敲除的克隆M21被用作起始细胞系：3D4/21DRB1-L26X克隆M21。CRISPR与以下序列一起使用：引导RNA序列1：GGCACGACCCUGCAGCGGCG；引导RNA1切割位置：chr7:29,186,966；引导RNA序列2：CUGGUACACGAAAUCCUCUG；引导RNA2切割位置：chr7:29,187,231。
在转染后产生两个克隆：基因型/ICE分析：B10：DQB1-缺失(-263)；D10：DQB1-缺失(-264)Synthego SO 4993085。图71显示了克隆D10的FragDel。图72中所示的SLA II类分子DR和DQ表达的流式细胞术分析显示，克隆B10和D10中不存在DR和DQ的表达，但起始克隆M21具有SLA-DQ的表达。
将所得的II类阴性克隆M21和D10在异种MLR中针对人供体CD4+T细胞进行激发，如图73A-73C所示。将克隆在IFNγ存在下培养48小时，然后与人T细胞一起培养。
在另一个实施例中，将来自供体11基因组的HLA-DQB的外显子2插入克隆B10中产生的FragDel中。CRISPR技术用于该插入。
细胞系：3D4/21DRB1-L26X DQB1-KO克隆B10(SO-4993085-1)；引导RNA序列：GCACUCACCUCGCCUCUGCG
分离出以下克隆
克隆编号：A11
修饰：SLA-DQB1-人患者11
描述：纯合子KI克隆
克隆编号：F3
修饰：SLA-DQB1-人患者11
描述：纯合子KI克隆
所得的克隆的细胞表型分析汇总于下表中
/>
克隆A11和F3上不存在已知DQ分子的细胞表面表达。此外，对细胞克隆F3进行质谱分析，以筛选保留在胞质溶胶中但不在细胞表面表达的DQB1蛋白的产生。XLB 485。如下表所示，该探索性分析表明，SLA-DQB/HLA-DQB蛋白存在于胞质溶胶中。
/>
在另一个实施例中，克隆即细胞系：3D4/21DRB1-L26X、DQB1-KO(来自4993085-1的克隆B10)被用于在基因:SLA-DQA的外显子2中产生大Fragdel。使用CRSPR技术，利用以下序列来进行该缺失：引导RNA序列1：UUAAGCCAUAGGAGGCAACA；引导RNA1切割位置：chr7:29,168,790；引导RNA序列2：UGAUGUGAACGGGUAAAGAA；引导RNA2切割位置：chr7:29,169,054；预期缺失大小：-264bp。所产生的具有264bp缺失的克隆如图74所示。使PCR产物在凝胶上运行并显示出缺失，如图75所示，其中泳道1：3D4/21野生型(预期大小＝698bp)；泳道2：3D4/21DRB1-L26X、DQB1-KO、DQA-KO克隆B1(预期大小＝434bp)；泳道3：3D4/21DRB1-L26X、DQB1-KO、DQA-KO克隆E4(预期大小＝434bp)。
在另一个实施例中，使用CRISPR技术在SLA-DRB-KO；SLA-DQA-KO；SLA-DQB-KO克隆中使用三联体终止密码子来敲除SLA DRA。CTTCAGAAA在外显子1中变为TAGTGATAA，如图76所示。染色体坐标：chr7:24825183-24825191。向导靶标：TCTTGAACCTTCAGAAATCA；PAM序列：TGG；转染后敲入分数38％。来源：https://ice.synthego.com/#/analyze/results/eq134fd2mp36zhk4/CE_695329-1005_8018554-1-g1-M3814_801-F1_E01
在另一个实施例中，PAM细胞中的两个猪B2M基因被关闭。猪B2M敲除需要敲除1号染色体上的2个几乎相同的基因。使用CRISPR，在两个基因的外显子2中产生大Fragdel，引导RNA切割位置：Chr1:141,534,750和chr1:126,839,891，引导RNA序列：CGAGAGUCACGUGCUUCACG。Synthego SO 5383318-1。这2个基因在同一染色体上相距20-23kbp。从该处理中产生96个克隆，随后对这些克隆进行评估。此外，将供体的B2M与PAM的进行比较，从而进行序列比对，如图77所示。将通过Synthego产生的96个PAM细胞克隆中的36个用猪IFNγ处理48小时，然后筛选SLA I类和pB2M的表达。目标是鉴定缺乏这两种分子的表达的克隆。克隆A1 PAM细胞上缺乏SLA-I和pB2M表达，如图78所示。此外，下表公开了SLA1和pB2M表达的汇总数据。
实施例3
猪细胞实验系列的人源化使用3名匿名、IRB批准的人受试者：
患者11(HLA-C、DQA、DQB等位基因字段)：等位基因：05:01、05:05、03:01
患者50(HLA-C、DQA、DQB等位基因字段)：等位基因：05:01、01:02、06:02
患者57(HLA-C、DQA、DQB等位基因字段)：等位基因：07:02、03:03、03:01
HLA-DQASLA-DQA个性化
样品编号：11、19、29
05:05:01
EX2
CTGACCACGTCGCCTCTTATGGTGTAAACTTGTACCAGTCTTACGGTCCCTCTGGCCAGTACACCCATGAATTTGATGGAGATGAGCAGTTCTACGTGGACCTGGGGAGGAAGGAGACTGTCTGGTGTTTGCCTGTTCTCAGACAATTTAGATTTGACCCGCAATTTGCACTGACAAACATCGCTGTCCTAAAACATAACTTGAACAGTCTGATTAAACGCTCCAACTCTACCGCTGCTACCAATG
样品编号：19、57
01:01:01
EX2
CTGACCACGTTGCCTCTTGTGGTGTAAACTTGTACCAGTTTTACGGTCCCTCTGGCCAGTACACCCATGAATTTGATGGAGATGAGGAGTTCTACGTGGACCTGGAGAGGAAGGAGACTGCCTGGCGGTGGCCTGAGTTCAGCAAATTTGGAGGTTTTGACCCGCAGGGTGCACTGAGAAACATGGCTGTGGCAAAACACAACTTGAACATCATGATTAAACGCTACAACTCTACCGCTGCTACCAATG
样品编号：57
03:03:01
EX2
CTGACCATGTTGCCTCTTACGGTGTAAACTTGTACCAGTCTTATGGTCCCTCTGGGCAGTACAGCCATGAATTTGATGGAGACGAGGAGTTCTATGTGGACCTGGAGAGGAAGGAGACTGTCTGGCAGTTGCCTCTGTTCCGCAGATTTAGAAGATTTGACCCGCAATTTGCACTGACAAACATCGCTGTGCTAAAACATAACTTGAACATCGTGATTAAACGCTCCAACTCTACCGCTGCTACCAATG
样品编号：50
01:02:01
EX2
CTGACCACGTTGCCTCTTGTGGTGTAAACTTGTACCAGTTTTACGGTCCCTCTGGCCAGTACACCCATGAATTTGATGGAGATGAGCAGTTCTACGTGGACCTGGAGAGGAAGGAGACTGCCTGGCGGTGGCCTGAGTTCAGCAAATTTGGAGGTTTTGACCCGCAGGGTGCACTGAGAAACATGGCTGTGGCAAAACACAACTTGAACATCATGATTAAACGCTACAACTCTACCGCTGCTACCAATG
HLA-DQB–SLA-DQB
样品编号：11、57
03:01:01
EX2
AGGATTTCGTGTACCAGTTTAAGGCCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCGCGTGCGTTATGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCACGCTTCGACAGCGACGTGGAGGTGTACCGGGCGGTGACGCCGCTGGGGCCGCCTGACGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGAGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACCAGTTGGAGCTCCGCACGACCTTGCAGCGGCGAG
样品编号：19、29
02:01:01
EX2
AGGATTTCGTGTACCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCGCGTGCGTCTTGTGAGCAGAAGCATCTATAACCGAGAAGAGATCGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACGCTGCTGGGGCTGCCTGCCGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAGAGGAAACGGGCGGCGGTGGACAGGGTGTGCAGACACAACTACCAGTTGGAGCTCCGCACGACCTTGCAGCGGCGAG
样品编号：19、57
05:01:01
EX2
AGGATTTCGTGTACCAGTTTAAGGGCCTGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCGCGTGCGGGGTGTGACCAGACACATCTATAACCGAGAGGAGTACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGTGTACCGGGCAGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGTTGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGGCCCGGGCGTCGGTGGACAGGGTGTGCAGACACAACTACGAGGTGGCGTACCGCGGGATCCTGCAGAGGAGAG
样品编号：50
06:02:01
EX2
AGGATTTCGTGTTCCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCGCGTGCGTCTTGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGTGTACCGCGCGGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACGAGGTGGCGTTCCGCGGGATCTTGCAGAGGAGAG
A-11DQA,B人源化
患者11DQA-α1
样品编号：11
等位基因：05:05:01
结构域：α1
------
图例：
区段A＝＝SLA：5'至3'，敲除的上游
区段B＝＝SLA：SLA敲除的精确框
区段C＝＝SLA：5'至3'，敲除的下游
区段D＝＝HLA：5'至3'，敲入的精确框
区段A)SLA：5'至3'，敲除的上游；239个碱基对
GAAGGCTGATTGCCAAGATAAGGAGGCTTTGCTTCAGGGCCTTTTAACTGTACTGGACAACTGCCAGCACTAAGGGGGGAAGGAAGCAGGTGATGGGGATTTTATCTAGAGACTGTGCCACAGATGAAGCCCTTGATATTTGAAAGTCAAGTTCTCTTGTCACTTTGTTTAATGAGGTTCTTTTCTCTCCCTTTGTTGTCCACCTTCATGCTGACCCCGACCTAGCCGACCATGTTGCC
区段B)SLA：SLA敲除的精确框；234个碱基对；78个氨基酸
TCCTATGGCTTAAATGTCTACCAGTCTTACGGTCCCAGCGGCTATTATACCCATGAATTTGATGGCGACGAGGAATTCTATGTGGACCTGGAGAAGAAGGAGACTGTCTGGCAGCTGCCTCTGTTTAGCAAATTTACAAGTTTTGACCCGCAGGGTGCACTGAGGAACATAGCTACGGCAAAACATAATTTGAACATCCTGATTAAACGTTCCAACAACACCGCGGCTGTCAAT
区段C)SLA：5'至3'，敲除的下游；251个碱基对
CGTATGTGTTCATCATTCTGCCTTTCTTTACCCGTTCACATCAGGCCCCTCTCCCTTCTTCCCTAGGGATAGAGACCCCTCACCCCTTTATAAAACTCTCTCCTTTCCAAGGAGCCTCCAGATTTTCCCATGGAGATTTGCTGGACCTTCATCCTCTCCCGTCTTACCCATCACGTATCTCCATATAATGCAAAGATCTCTTCTCCCATAACTCCCATATCACAATTTTTGAATCTTTCAAGGAGAGGTCC
区段D)HLA：5'至3'，敲入的精确框；231个碱基对；77个氨基酸
TCTTATGGTGTAAACTTGTACCAGTCTTACGGTCCCTCTGGCCAGTACACCCATGAATTTGATGGAGATGAGCAGTTCTACGTGGACCTGGGGAGGAAGGAGACTGTCTGGTGTTTGCCTGTTCTCAGACAATTTAGATTTGACCCGCAATTTGCACTGACAAACATCGCTGTCCTAAAACATAACTTGAACAGTCTGATTAAACGCTCCAACTCTACCGCTGCTACCAAT
**HLA 05:05:01具有天然存在的3个碱基对的插入缺失，在残基54处的TTT之间...AGACAATTT XXX AGATTTGAC
患者11DQB
样品编号：11
等位基因：03:01:01
结构域：β1
图例：
区段A＝＝SLA：5'至3'，敲除的上游
区段B＝＝SLA：SLA敲除的精确框
区段C＝＝SLA：5'至3'，敲除的下游
区段D＝＝HLA：5'至3'，敲入的精确框
区段A)SLA：5'至3'，敲除的上游；310个碱基对
ACACAGACGCCGTAGCATCAACCCTCCTTCCTCGACCGGGAACCCTCCTGCCTCAGGGACAGGCCTCCTCACACGAGGGCCATTCTGGAAGCCCTCAGAGAGGAGCCGCCTGGAGGATCCGGGGCTGGAGCGCGAGGCGCGGGGCCGGGCACGGCCGGGCACCCGGCTTGGGCGGCGGGTTTCAGGTGGGATGGGCCCAGCTGGCGGCGGCGGACGTCTCCCCGCCTGGCCGAGCGGTGGCGGCGTCGGGCTGGCGGGCGGAGGCCTGACTGACGCGGATCTCCCCGCAGAGGATTTCGTGTACCAGTTT
区段B)SLA：SLA敲除的精确框；240个碱基对；80个氨基酸
AAGTTCGAGTGCTACTTCTTCAACGGAACGCAGCGGGTGCGGGGCGTGGCCAGGTGGGTCTACAACCAGGAGGAGCACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACCCCGCTGGGGCGGCCGACCGCCGACTACTGGAACGGCCAGAAGGACGTCCTGGAGCAGAAGCGGGCCGAGGTGGACACGGTGTGCAAACACAACTACCAGATAGAGGAAGGCACGACCCTG
区段C)SLA：5'至3'，敲除的下游；260个碱基对
CAGCGGCGAGGTGAGTGCTTGCCCGCCGCCCGCGGAGACTCCGCGCGGAGAGAGGGGGGCGGCGCCTCCGGGGCGGGTCCCCAGGCTCGGGCAGGGGACGGCAAGGCCCGGCGCCCCGAGGAGCGCACAGCAGGCGAAAGACTTTAGCAGGCCCCCCGGGAACATTCCCTGCAGAGACAACCGGGCCTGCCCCTTGTGCCCCATCTCTCGTGGGCCAGTCCTGTGAGCTTCTTTCCACGAATTCTGCGCGTCCTCGGCCC
区段D)HLA：5'至3'，敲入的精确框；240个碱基对；80个氨基酸
AAGGCCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCGCGTGCGTTATGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCACGCTTCGACAGCGACGTGGAGGTGTACCGGGCGGTGACGCCGCTGGCGCCGCCTGACGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGAGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACCAGTTGGAGCTCCGCACGACCTTG
A-50DQA,B人源化
患者50DQA-α1
样品编号：50
等位基因：01:02:01
结构域：α1
图例：
区段A＝＝SLA：5'至3'，敲除的上游
区段B＝＝SLA：SLA敲除的精确框
区段C＝＝SLA：5'至3'，敲除的下游
区段D＝＝HLA：5'至3'，敲入的精确框
区段A)SLA：5'至3'，敲除的上游；239个碱基对
GAAGGCTGATTGCCAAGATAAGGAGGCTTTGCTTCAGGGCCTTTTAACTGTACTGGACAACTGCCAGCACTAAGGGGGGAAGGAAGCAGGTGATGGGGATTTTATCTAGAGACTGTGCCACAGATGAAGCCCTTGATATTTGAAAGTCAAGTTCTCTTGTCACTTTGTTTAATGAGGTTCTTTTCTCTCCCTTTGTTGTCCACCTTCATGCTGACCCCGACCTAGCCGACCATGTTGCC
区段B)SLA：SLA敲除的精确框；234个碱基对；78个氨基酸
TCCTATGGCTTAAATGTCTACCAGTCTTACGGTCCCAGCGGCTATTATACCCATGAATTTGATGGCGACGAGGAATTCTATGTGGACCTGGAGAAGAAGGAGACTGTCTGGCAGCTGCCTCTGTTTAGCAAATTTACAAGTTTTGACCCGCAGGGTGCACTGAGGAACATAGCTACGGCAAAACATAATTTGAACATCCTGATTAAACGTTCCAACAACACCGCGGCTGTCAAT
区段C)SLA：5'至3'，敲除的下游；251个碱基对
CGTATGTGTTCATCATTCTGCCTTTCTTTACCCGTTCACATCAGGCCCCTCTCCCTTCTTCCCTAGGGATAGAGACCCCTCACCCCTTTATAAAACTCTCTCCTTTCCAAGGAGCCTCCAGATTTTCCCATGGAGATTTGCTGGACCTTCATCCTCTCCCGTCTTACCCATCACGTATCTCCATATAATGCAAAGATCTCTTCTCCCATAACTCCCATATCACAATTTTTGAATCTTTCAAGGAGAGGTCC
区段D)HLA：5'至3'，敲入的精确框；234个碱基对；78个氨基酸
TCTTGTGGTGTAAACTTGTACCAGTTTTACGGTCCCTCTGGCCAGTACACCCATGAATTTGATGGAGATGAGCAGTTCTACGTGGACCTGGAGAGGAAGGAGACTGCCTGGCGGTGGCCTGAGTTCAGCAAATTTGGAGGTTTTGACCCGCAGGGTGCACTGAGAAACATGGCTGTGGCAAAACACAACTTGAACATCATGATTAAACGCTACAACTCTACCGCTGCTACCAAT
患者50DQB
样品编号：50
等位基因：06:02:01
结构域：β1
图例：
区段A＝＝SLA：5'至3'，敲除的上游
区段B＝＝SLA：SLA敲除的精确框
区段C＝＝SLA：5'至3'，敲除的下游
区段D＝＝HLA：5'至3'，敲入的精确框
区段A)SLA：5'至3'，敲除的上游；310个碱基对
ACACAGACGCCGTAGCATCAACCCTCCTTCCTCGACCGGGAACCCTCCTGCCTCAGGGACAGGCCTCCTCACACGAGGGCCATTCTGGAAGCCCTCAGAGAGGAGCCGCCTGGAGGATCCGGGGCTGGAGCGCGAGGCGCGGGGCCGGGCACGGCCGGGCACCCGGCTTGGGCGGCGGGTTTCAGGTGGGATGGGCCCAGCTGGCGGCGGCGGACGTCTCCCCGCCTGGCCGAGCGGTGGCGGCGTCGGGCTGGCGGGCGGAGGCCTGACTGACGCGGATCTCCCCGCAGAGGATTTCGTGTACCAGTTT
区段B)SLA：SLA敲除的精确框；240个碱基对；80个氨基酸
AAGTTCGAGTGCTACTTCTTCAACGGAACGCAGCGGGTGCGGGGCGTGGCCAGGTGGGTCTACAACCAGGAGGAGCACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACCCCGCTGGGGCGGCCGACCGCCGACTACTGGAACGGCCAGAAGGACGTCCTGGAGCAGAAGCGGGCCGAGGTGGACACGGTGTGCAAACACAACTACCAGATAGAGGAAGGCACGACCCTG
区段C)SLA：5'至3'，敲除的下游；260个碱基对
CAGCGGCGAGGTGAGTGCTTGCCCGCCGCCCGCGGAGACTCCGCGCGGAGAGAGGGGGGCGGCGCCTCCGGGGCGGGTCCCCAGGCTCGGGCAGGGGACGGCAAGGCCCGGCGCCCCGAGGAGCGCACAGCAGGCGAAAGACTTTAGCAGGCCCCCCGGGAACATTCCCTGCAGAGACAACCGGGCCTGCCCCTTGTGCCCCATCTCTCGTGGGCCAGTCCTGTGAGCTTCTTTCCACGAATTCTGCGCGTCCTCGGCCC
区段D)HLA：5'至3'，敲入的精确框；240个碱基对；80个氨基酸
AAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCGCGTGCGTCTTGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGTGTACCGCGCGGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACGAGGTGGCGTTCCGCGGGATCTTG
A-57DQA,B人源化
患者57 DQ-A α1
样品编号：57
等位基因：03:03:01
结构域：α1
图例：
区段A＝＝SLA：5'至3'，敲除的上游
区段B＝＝SLA：SLA敲除的精确框
区段C＝＝SLA：5'至3'，敲除的下游
区段D＝＝HLA：5'至3'，敲入的精确框
区段A)SLA：5'至3'，敲除的上游；239个碱基对
GAAGGCTGATTGCCAAGATAAGGAGGCTTTGCTTCAGGGCCTTTTAACTGTACTGGACAACTGCCAGCACTAAGGGGGGAAGGAAGCAGGTGATGGGGATTTTATCTAGAGACTGTGCCACAGATGAAGCCCTTGATATTTGAAAGTCAAGTTCTCTTGTCACTTTGTTTAATGAGGTTCTTTTCTCTCCCTTTGTTGTCCACCTTCATGCTGACCCCGACCTAGCCGACCATGTTGCC
区段B)SLA：SLA敲除的精确框；234个碱基对；78个氨基酸
TCCTATGGCTTAAATGTCTACCAGTCTTACGGTCCCAGCGGCTATTATACCCATGAATTTGATGGCGACGAGGAATTCTATGTGGACCTGGAGAAGAAGGAGACTGTCTGGCAGCTGCCTCTGTTTAGCAAATTTACAAGTTTTGACCCGCAGGGTGCACTGAGGAACATAGCTACGGCAAAACATAATTTGAACATCCTGATTAAACGTTCCAACAACACCGCGGCTGTCAAT
区段C)SLA：5'至3'，敲除的下游；251个碱基对
CGTATGTGTTCATCATTCTGCCTTTCTTTACCCGTTCACATCAGGCCCCTCTCCCTTCTTCCCTAGGGATAGAGACCCCTCACCCCTTTATAAAACTCTCTCCTTTCCAAGGAGCCTCCAGATTTTCCCATGGAGATTTGCTGGACCTTCATCCTCTCCCGTCTTACCCATCACGTATCTCCATATAATGCAAAGATCTCTTCTCCCATAACTCCCATATCACAATTTTTGAATCTTTCAAGGAGAGGTCC
区段D)HLA：5'至3'，敲入的精确框；234个碱基对；78个氨基酸
TCTTACGGTGTAAACTTGTACCAGTCTTATGGTCCCTCTGGGCAGTACAGCCATGAATTTGATGGAGACGAGGAGTTCTATGTGGACCTGGAGAGGAAGGAGACTGTCTGGCAGTTGCCTCTGTTCCGCAGATTTAGAAGATTTGACCCGCAATTTGCACTGACAAACATCGCTGTGCTAAAACATAACTTGAACATCGTGATTAAACGCTCCAACTCTACCGCTGCTACCAAT
患者57 DQB
样品编号：57
等位基因：05:01:01
结构域：β1
图例：
区段A＝＝SLA：5'至3'，敲除的上游
区段B＝＝SLA：SLA敲除的精确框
区段C＝＝SLA：5'至3'，敲除的下游
区段D＝＝HLA：5'至3'，敲入的精确框
区段A)SLA：5'至3'，敲除的上游；310个碱基对
ACACAGACGCCGTAGCATCAACCCTCCTTCCTCGACCGGGAACCCTCCTGCCTCAGGGACAGGCCTCCTCACACGAGGGCCATTCTGGAAGCCCTCAGAGAGGAGCCGCCTGGAGGATCCGGGGCTGGAGCGCGAGGCGCGGGGCCGGGCACGGCCGGGCACCCGGCTTGGGCGGCGGGTTTCAGGTGGGATGGGCCCAGCTGGCGGCGGCGGACGTCTCCCCGCCTGGCCGAGCGGTGGCGGCGTCGGGCTGGCGGGCGGAGGCCTGACTGACGCGGATCTCCCCGCAGAGGATTTCGTGTACCAGTTT
区段B)SLA：SLA敲除的精确框；240个碱基对；80个氨基酸
AAGTTCGAGTGCTACTTCTTCAACGGAACGCAGCGGGTGCGGGGCGTGGCCAGGTGGGTCTACAACCAGGAGGAGCACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACCCCGCTGGGGCGGCCGACCGCCGACTACTGGAACGGCCAGAAGGACGTCCTGGAGCAGAAGCGGGCCGAGGTGGACACGGTGTGCAAACACAACTACCAGATAGAGGAAGGCACGACCCTG
区段C)SLA：5'至3'，敲除的下游；260个碱基对
CAGCGGCGAGGTGAGTGCTTGCCCGCCGCCCGCGGAGACTCCGCGCGGAGAGAGGGGGGCGGCGCCTCCGGGGCGGGTCCCCAGGCTCGGGCAGGGGACGGCAAGGCCCGGCGCCCCGAGGAGCGCACAGCAGGCGAAAGACTTTAGCAGGCCCCCCGGGAACATTCCCTGCAGAGACAACCGGGCCTGCCCCTTGTGCCCCATCTCTCGTGGGCCAGTCCTGTGAGCTTCTTTCCACGAATTCTGCGCGTCCTCGGCCC
区段D)HLA：5'至3'，敲入的精确框；240个碱基对；80个氨基酸
AAGGGCCTGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCGCGTGCGGGGTGTGACCAGACACATCTATAACCGAGAGGAGTACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGTGTACCGGGCAGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGTTGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGGCCCGGGCGTCGGTGGACAGGGTGTGCAGACACAACTACGAGGTGGCGTACCGCGGGATCCTG
B-沉默DR
DRA 3XE敲除
编辑的5'上游200个碱基对(bps)：
CTGGACCCTTTGCAAGAGTCTTTCCTTTAGCAACAGATGTATCATCTCAAAGGATTTTTCTGATTGGCTGCAGCTCAACTGATTTTAAATTTTAATCAGTCAGACCCTGGGACACCCTGCATTCTCTTTGCTTGTATTGCTGTCCATCCTGACCCACCATAGCTCTACCGACCCTCATCGAGGCATCTAAGGAGAAAATG
-----------------------
编辑位点(9bps)：
TAGTGATAA
编辑的3'下游200bps：
GGGGTCCCAGTCCTGGGATTTGTCATCACCATCTTGAACCTTCAGAAATCATGGGCTATCGTAGGTAAGTTCTGAGAGAATCTAAGCGAGGGGTAGTAAGTTCTGAGAGCATCAGAGATGTGATGCTCTGGTGAACATTTGCAAGACAGTCCTTGGAGTGAAAGAGAAGTGTGATGGGTACTTATGTGGGTCTAAACCTA
在本实施例中，根据本公开在3D4/21细胞系中沉默DRB。
SLA-DRB野生型序列
EX1
ATGTTGCATCTGTGTTTCTCCAGAGGCTTTTGGATGGTGGCTCTGACCGTGATGCTGGTGGTGCTGAGCCCTCCCTTGGCTTTGGCCAGGGACACCCCAC
SLA-DRB KO序列
EX1
ATGTTGCATCTGTGTTTCTCCAGAGGCTTTTGGATGGTGGCTCTGACCGTGATGCTGGTGGTGCTGAGCCCTCCCTAGGCTTTGGCCAGGGACACCCCAC
参见图70中的猪细胞的人源化：DR-B KO/KI结果。
HLA-A-SLA-1
样品编号：11
03:01:01,19
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：11
32:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTTGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAGAGAGCCTGCGGATCGCGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：19、29、50
01:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAAGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATATGAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAGCGAACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACG
样品编号：57
11:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACG
样品编号：57
02:01:01
EX2
GCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
HLA-B–SLA-2
样品编号：11、50
44:02:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCCATGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGTGGGCTACGTGGACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCACGAGTCCGAGGAAGGAGCCGCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGATCTCCAAGACCAACACACAGACTTACCGAGAGAACCTGCGCACCGCGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：11
40:02:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCCACACCTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGTGGGCTACGTGGACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCACGAGTCCGAGGAAGGAGCCGCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGATCTCCAAGACCAACACACAGACTTACCGAGAGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：19、29
08:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCATGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGAACACACAGATCTTCAAGACCAACACACAGACTGACCGAGAGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：19
35:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCCATGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGGACGGAGCCCCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGAACACACAGATCTTCAAGACCAACACACAGACTTACCGAGAGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：29
57:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCCATGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGCGCCCCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAACATGAAGGCCTCCGCGCAGACTTACCGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：50
57:03:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCCATGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGCGCCCCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAACATGAAGGCCTCCGCGCAGACTTACCGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：57
15:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCCATGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGCGCCCCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGATCTCCAAGACCAACACACAGACTTACCGAGAGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：57
07:02:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGAACACACAGATCTACAAGGCCCAGGCACAGACTGACCGAGAGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
B2M-人源化
EX1
ATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCT TTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGC
EX2
GTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGG
EX3
ATCGAGACATGTAA
B2m克隆
HLA-C SLA-3个性化
样品编号：11
02:02:02
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCTGTGTCCCGGCCCAGCCGCGGAGAGCCCCACTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCAAGAGGGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCGCCAGGCACAGACTGACCGAGTGAACCTGCGGAAACTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：11、50
05:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCAGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCAAGAGGGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCGCCAGGCACAGACTGACCGAGTGAACCTGCGGAAACTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
样品编号：19、29、50
07:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAACTACAAGCGCCAGGCACAGGCTGACCGAGTGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACG
样品编号：19、57
04:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTCCACATCCGTGTCCTGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCAAGAGGGGAGCCGCGGGAGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCGCCAGGCACAGGCTGACCGAGTGAACCTGCGGAAACTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACG
样品编号：29
06:02:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGCCCCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCGCCAGGCACAGGCTGACCGAGTGAACCTGCGGAAACTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACG
样品编号：57
07:02:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCGCCAGGCACAGGCTGACCGAGTGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACG
HLA-E–SLA-6个性化
样品编号：11、19、29、50、57
01:01:01
EX2
GCTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCG
样品编号：19
01:06
EX2
GCTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCG
样品编号：50
01:03:05
EX2
GCTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCG
HLA-F–SLA-7个性化
样品编号：11、19、29、50、57
01:01:01
EX2
GCTCCCACTCCTTGAGGTATTTCAGCACCGCTGTGTCGCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTACATCGCCGTGGAGTACGTAGACGACACGCAATTCCTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGATTCCGAGGATGGAGCCGCGGGAGCCGTGGGTGGAGCAAGAGGGGCCGCAGTATTGGGAGTGGACCACAGGGTACGCCAAGGCCAACGCACAGACTGACCGAGTGGCCCTGAGGAACCTGCTCCGCCGCTACAACCAGAGCGAGGCTG
样品编号：11、19
01:03:01
EX2
GCTCCCACTCCTTGAGGTATTTCAGCACCGCTGTGTCGCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTACATCGCCGTGGAGTACGTAGACGACACGCAATTCCTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGATTCCGAGGATGGAGCCGCGGGAGCCGTGGGTGGAGCAAGAGGGGCCGCAGTATTGGGAGTGGACCACAGGGTACGCCAAGGCCAACGCACAGACTGACCGAGTGGCCCTGAGGAACCTGCTCCGCCGCTACAACCAGAGCGAGGCTG
样品编号：57
01:01:02
EX2
GCTCCCACTCCTTGAGGTATTTCAGCACCGCTGTGTCGCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTACATCGCCGTGGAGTACGTAGACGACACGCAATTCCTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGATTCCGAGGATGGAGCCGCGGGAGCCGTGGGTGGAGCAAGAGGGGCCGCAGTATTGGGAGTGGACCACAGGGTACGCCAAGGCCAACGCACAGACTGACCGAGTGGCCCTGAGGAACCTGCTCCGCCGCTACAACCAGAGCGAGGCTG
样品编号：50
01:03:01
EX2
GCTCCCACTCCTTGAGGTATTTCAGCACCGCTGTGTCGCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTACATCGCCGTGGAGTACGTAGACGACACGCAATTCCTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGATTCCGAGGATGGAGCCGCGGGAGCCGTGGGTGGAGCAAGAGGGGCCGCAGTATTGGGAGTGGACCACAGGGTACGCCAAGGCCAACGCACAGACTGACCGAGTGGCCCTGAGGAACCTGCTCCGCCGCTACAACCAGAGCGAGGCTG
HLA-G SLA-8个性化
样品编号：11、19
01:01:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCA
样品编号：11
01:03:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACTCGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCA
样品编号：19
01:01:19
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCAGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCA
样品编号：57
01:01:03
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCAGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCA
样品编号：57
01:01:06
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCA
样品编号：29、50
01:01:02
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCAGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCC
样品编号：29
01:06
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCAGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCA
样品编号：50
01:04:01
EX2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCAGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCA
实施例4
活的异种神经移植物展示出在非人灵长类动物中大间隙外周神经损伤的再生和功能恢复
据估计，每年有两百万美国人患有外周神经损伤(PNI)，导致需要近50,000台手术来修复PNI。四肢的严重创伤经常导致外周神经横断，这些损伤对患者的生活质量具有毁灭性的影响。即使在手术修复后这些神经的再生也是缓慢的，而且往往是不完整的。在受伤后接受神经修复的患者中，只有不到一半的患者可恢复足够的运动或感觉功能，而这种缺陷可以导致肢体完全瘫痪或顽固性神经性疼痛。
成功的外周神经再生涉及改善神经再生率和复合肌肉的神经重新支配，从而改善功能。现有的治疗选项包括使用从同一患者的供体部位获得的自体神经移植物或脱细胞化人尸体神经同种异体移植。这两种治疗选项都有严重的缺点，因此，对于大间隙(≥4cm)、节段性外周神经缺损，需要高质量的神经移植物。理想情况下，替代物应含有活的雪旺(Schwann)细胞和类似于人神经的富含基质的支架，以通过相同的基本作用机制而潜在地促进关键的轴突再生过程，所述作用机制使自体神经移植物成为目前护理标准。
猪神经与人运动神经和感觉神经共有很多生理特征，包括大小、长度、细胞外基质和构造。活的异种神经移植物包括活的雪旺细胞和富含基质的支架，并且提供了更大的临床可用性潜力，从而消除了与另外的手术获得程序相关的必要性和伴随疾病。已经证明，来源于基因工程改造的、无指定病原体(DPF)猪供体的皮肤异种移植物具有临床前功效，目前正在人体临床试验中进行评估。因此，我们假设，来源于GalT-KO猪供体的活的异种神经移植物可用于成功重建和治疗大间隙(≥4cm)、节段性PNI。
伦理
本研究的动物护理的手术程序、方案和指南由IACUC独立审查和监测，并且根据US-FDA 21CFR第58.351部和GFI 197、USDA动物福利法(9CFR第1、2和3部)、实验动物的护理和使用指南进行。
动物
本研究中使用的所有异种神经移植物均来源于一个基因工程改造的α-1,3-半乳糖基转移酶敲除(GalT-KO)、无指定病原体(DPF)的猪供体。将五只雄性和五只雌性幼年恒河猴(Macaca mulatta)作为异种移植神经制品的接受者。
手术程序
如上文所述，对猪供体实施安乐死并准备进行手术。为了在收获前分离坐骨神经，在骶骨和坐骨之间的中路做一个线性切口，并沿着股骨的后部向腹侧延伸，纵向解剖臀中肌、臀大肌、梨状肌和股二头肌，达到近端胫腓关节。使坐骨神经可视化，并通过神经起源远端与胫神经和腓总神经的分叉处近端的径向横断面收获。
在双侧重复该过程。将一个未经修改的坐骨神经节段储存在RPMI介质中并维持在4℃，直到48小时后手术使用。将另一个冷冻保存并在-80℃下储存一周。在移植前，将异种神经修剪至4cm以适应缺损大小。
在全部十名非人灵长类动物受试者中，通过双侧手术引入大间隙(≥4cm)、节段性外周神经缺损。使受试者在麻醉10下放置于侧卧位，肩部屈曲90°，完全内旋，中立外展。将皮下组织和深筋膜沿着近端手臂的后外侧边缘向肘前窝切开6-8cm的皮肤切口，暴露三头肌的长头和外侧头，它们会聚形成用于解剖定位的三头肌腱膜。肱三头肌的长头和外侧头之间的肌肉内平面在距离腱膜顶端的近端大约2.5cm处发育。在桡骨沟的肱骨上观察到桡神经和伴随血管。将手术平面向近端和远端延伸，以最大程度地减少意外损伤。将桡神经在深支起源的近端大约1cm处在远侧横切。移除4cm节段以产生缺损并保存以用于重新连接或后续分析。
在每个神经缝合部位用四至八根等距的8-0尼龙单丝缝合线将神经移植物近端和远端连接起来。然后使用表皮下可吸收缝合线逐层封闭切口。
该过程在十名受试者中的每个双侧进行；异种神经和自体神经均在同一手术程序中移植。异种移植物或自体移植物的肢体指定(右/左)是随机分配的，并且对观察者设盲以进行分析。将十名受试者随机、平均地分配到相隔一周的两个手术系列中。在第一系列中使用五个新鲜的异种移植物，在第二系列中使用五个预先冷冻保存的解冻活猪异种移植物。术后，所有受试者均接受他克莫司(tacrolimus)至少六个月14，谷水平低于30ng/mL。
功能评估
此前报道的桡神经损伤模型适用于评估异种和自体神经移植接受者的功能恢复。由于桡侧腕长伸肌和桡侧腕短伸肌的运动去神经支配，肘部近端的桡神经损伤导致腕部伸展功能丧失或“腕下垂”。每个月对每名受试者进行腕部伸展功能评估，包括在椅子和笼边观察受试者需要腕角伸展以获取物体期间的主动和被动腕角屈曲。所有功能评估均由两名独立观察员进行视频记录和分析，以准确测量最大腕部伸展角度。
这种测量的精度有限，但通过使用序数、分类值而不是连续的角度值来增强。通过对腕部从中立位置每伸展30°(与前臂成一条线，0°)分配1至3的数值，将角度数据转换为活动范围(ROM)分数。因此，ROM分数被分别定义为：角度<31°(分数1)、31°至60°(分数2)和61°至90°(分数3)。
电生理学
由独立专家(Natus UltraPro with Synergy Electrodiagnosticstic软件)在基线处和术后5个月、8.5个月和12个月对两个实验组的全部十名受试者进行桡骨运动和感觉分支的17以下参数的评估和分析：神经传导速度(NCV)、复合肌肉动作电位(CMAP)振幅、CMAP持续时间。
组织形态学分析
在尸检时，进行神经移植物的连续切除，包括神经缝合部位以外的近端和远端天然神经手术，并通过切片机纵向切至5μm厚度，并固定在10％ NBF中用于组织分析。将样品用苏木精和曙红、Luxol Fast蓝和NF200进行染色。
统计分析
除非另外说明，否则自体和异种神经移植部位之间的数据比较均表示为每组平均值±SD。使用司徒顿-纽曼-科伊尔斯(Student-Newman-Keuls)多重比较方法进行统计比较，以作为方差检验的单向分析。在Prism Graph Pad 9.1.0版软件(Prism,San Diego,CAUSA)中进行统计分析。小于0.05的P值被认为具有统计学显著性。
手术和临床结果
全部十名受试者均恢复，未发生与手术相关的不良事件。他克莫司水平维持在30ng/mL以下，然而谷水平在个体受试者之间差异很大(4.9至14.2ng/mL)。在术后6个月，对五名随机选择的受试者停用他克莫司方案，其余五名受试者维持他克莫司。到8个月时，接受他克莫司方案的受试者出现了与他克莫司毒性相关的进展性症状19，诸如膝关节活动受限、肌肉强直、僵硬、萎缩和体重显著减轻。因此，对这五名受试者实施安乐死8，其余五名受试者存活到研究结束。
功能恢复
在手术后，无论使用何种神经移植物类型，在大约三个月的时间里，全部十名受试者均观察到双侧腕部伸展功能完全丧失。从近端神经缝合部位到桡侧腕长伸肌和桡侧腕短伸肌的神经支配部位的距离测量值为16.0cm±0.56。轴突以1毫米/天的速率再生，21预期在POD-160可恢复功能。
到术后4个月，十个异种移植物中的六个和所有自体移植物开始展示出不同程度的功能恢复。到观察期结束(分别为8个月和12个月)时，自体神经移植物修复的全部十个肢体的功能恢复值均显示出等于基线值，而用异种神经移植物处理的七个肢体已恢复到术前水平。在三个无反应者中，两个异种神经是新鲜的，一个是冷冻保存的。
在17个成功病例中，受试者的平均恢复率似乎在两种神经类型之间相当，而用自体神经移植物治疗的肢体恢复幅度最大。
神经传导速度(NCV)
在12个月的观察期结束时，自体或异种重建肢体之间的运动或感觉传导速度在统计学或生理学上无显著差异。
在术后5个月的第一次评估中，全部十名受试者的运动和感觉传导速度(分别为-36％和-53％)均比术前值总体下降：运动(64.28m/s±2.32至41.16m/s±11.63)和感官(53.55m/s±2.63至25.00m/s±8.18)。
在术后8个月的第二次评估中，运动传导增加了48％和23％(自体神经为54.07m/s±6.29，异种神经为56.33m/s±5.82)，这表明快速传导纤维的部分髓鞘再生。
在术后12个月的第三次也是最后一次评估中，其余五名受试者在同种异体和异种组中显示出运动速度恢复到平均基线值的至少96％。在所有时间点所有动物均引出F波，这表明在包括近端脊髓节段和神经根在内的长神经元通路上存在运动传导。然而，感觉神经的速度在所有评估中均显著降低，并且任何一种移植物均从未展示出恢复。
复合肌肉动作电位(CMAP)振幅
全部二十个肢体的术前动作电位振幅为19.55mV±5.03。在术后5个月，观察到全部受试者的双肢几乎完全丧失。到第8个月时，自体神经移植物的振幅已经恢复到10.14mV±2.33，而用异种神经治疗的肢体仅恢复到6.94mV±3.62。到研究结束时，其余五名受试者的自体和异种移植物的振幅相当，然而均未能完全恢复到基线值。
复合肌肉动作电位(CMAP)持续时间
在三个时间点中的任一个中，异种移植物和自体移植物之间的CMAP持续时间在统计学或生理学上无显著差异。同种异体神经的基线CMAP持续时间为3.9ms±0.68，异种神经的基线CMAP持续时间为3.9ms±0.55。在术后5个月，两组复合肌肉动作电位的持续时间均延长(时间离散)，并且在术后8个月达到峰值(10.14mV±2.33，自体和6.94mV±3.62，异种)。对于术后12个月的其余五名受试者，持续时间部分恢复(-23％，自体和-41％，异种)，但仍比基线值延长。
组织形态学分析
在尸检时，在两种类型的神经移植物的近端和远端吻合部位均观察到不同程度的神经瘤。用H&E染色在这些部位进行显微镜检查，发现纤维组织增生伴有不同的炎症，通常包括缝合线周围的异物反应，以及与神经瘤形成一致的小直径神经分支的多向增殖。在吻合部位处的纤维蛋白沉积的原始缺损部位观察到轻度纤维化，其中嵌入神经纤维和神经原纤维通常纵向排列。
在8个月的终点，全部五名受试者的缺损部位的神经纤维的大小与两种神经移植物相当，范围为从100至300μm，而在围手术期测量时，自体神经半径超过300μm。在全部十名受试者的研究结束时，异种轴突直径[2.50μm±0.40]小于自体对照[3.40μm±0.55]，但均未完全恢复到围手术期天然桡神经的轴突直径[4.00μm±0.00]。
Luxol Fast蓝染色揭示，移植神经有不同程度的髓鞘形成。总体而言，对于两个组，神经移植区域近端的区域表现出轻微到轻度的脱髓鞘，而在远端区域则更严重。在尸检时，髓鞘形成的证据在自体移植物中更为突出，而脱髓鞘则在异种神经移植物治疗的部位更为严重。新鲜或冷冻保存的移植物之间无组织学上可辨别的差异。
鉴于异种皮肤移植物的生理特征与人运动和感觉神经的相似性，以及临床前和早期临床成功9，来源于GalT-KO猪供体的活的异种神经移植物似乎是自体神经的合理的高质量替代物，可成功重建和治疗大间隙(≥4cm)、节段性PNI。
在这项研究中，用两种神经类型在术后4个月均观察到功能恢复的开始，但异种移植物的恢复幅度小于自体对照。在七个成功的异种治疗肢体中，有六个展示出与自体神经移植物对照相当的恢复幅度和速率，而第七个呈现延迟恢复，在电生理学和组织学结果方面具有可比性。
未能恢复功能性腕部活动的三个无反应者中的两个具有明显的单侧肌肉萎缩，并且在尸检时，原位肉眼检查显示，与对侧臂的同源区域相比，该区域中没有活组织。经显微镜检查，未检测到神经纤维，无法确认移植物的连续性。目前尚不清楚这是技术故障还是神经肌肉接头已经完全退化到无法发生神经重新支配的程度。
虽然腕部伸展测量本质上受到主观性和无法实现单度精度的限制，但即使是分类排名，这些数据也表明异种移植物的功能恢复总体上不如自体对照稳健。
如此前所报道，亚治疗剂量的他克莫司也被施用于所有受试者以刺激神经再生，然而，五名受试者表现出的毒性限制了研究的潜在分析和统计能力。另一个限制是缺乏阐明方案的相对有益效果所必需的非他克莫司治疗的对照组。
运动传导速度的降低被认为是由于轴突破坏和神经失用症，而增加则表明快速传导纤维和髓鞘再生的恢复，这与相应的组织学观察结果一致。然而，神经传导的存在并不表示完整的功能性肌肉神经支配，不均匀传导可能指示局部区域脱髓鞘、未成熟髓鞘的髓鞘再生、纤维损失或结缔组织阻塞。
动作电位的幅度反映了运动神经元、神经肌肉接头的完整性以及对刺激作出反应的运动单位的强度和数量。振幅下降反映了轴突破坏、局灶性脱髓鞘、沃勒(Wallerian)变性和部分传导阻滞或运动单位损伤的组合，所有这些均可以表现为无力。振幅的恢复虽然不完整，但表明两个组之间的运动单位被重新支配并恢复快速传导的轴突。
CMAP持续时间(时间分散)的增加可能表明节段性或不均匀的脱髓鞘。在这些情况下，动作电位持续时间将更长，振幅更低，在每个时间点均观察到这两种迹象。
这些数据表明运动神经有恢复的趋势。相比之下，桡骨感觉神经传导则未显示出这种趋势。虽然在一些情况下，感觉动作电位被微弱地引出，这表示感觉重新支配可能来自侧支感觉神经，但在所有术后观察中，所有受试者可能均存在感觉缺陷。
总体而言，在涉及自体神经的重建的情况下观察到功能恢复、更大的神经纤维和更大程度的髓鞘再生方面通常更有利的结果，但电生理学和组织学评估未观察到统计学上显著或有意义的差异。可能的促成因素包括非人灵长类动物和猪神经之间的可变轴突直径和束数量，尤其是考虑到使用坐骨神经作为移植源来修复桡神经，以及可能导致观察到水肿、细胞浸润和三级淋巴结节，从而对总体轴突再生产生微妙影响的固有免疫差异。最后，观察到失效的新鲜异种移植物和冷冻保存异种移植物之间的比率为2:1，无统计学意义，并且没有组织学证据表明保存方法对临床结果有负面影响。
在这项研究中，使用基因工程改造的DPF猪供体异种神经移植物成功重建了外周神经缺损，没有不良事件或异种移植物对安全性的影响。这些数据表明，来源于基因工程改造的DPF猪供体的活的异种神经移植物的移植，可以是用于大间隙(≥4cm)、节段性外周神经损伤移植的活的供体神经的有前途的来源，和值得进一步评估的有希望的发现。
数据和结论的另外分析
在一项为期12个月的研究中，来源于基因工程改造的、无指定病原体的猪供体的活的、大口径、混合模式异种神经移植物的安全性和功效被评估为在非人灵长类动物中重建大间隙(≥4cm)外周神经破坏的潜在方法。每年有两百万美国人患有外周神经损伤(PNI)，导致需要近50,000台手术。成功的早期干预改善了神经再生和重新支配的速率，但现有的治疗存在严重缺点。迫切需要高质量的手术治疗。理想情况下，候选疗法应包含活的雪旺细胞和富含基质的支架。猪神经与人运动和感觉神经共有很多生理特征，并且提供了更大的临床可用性潜力。因此，我们假设，活的猪神经移植物可以是现有手术治疗的有效替代物。我们公布了研究的临床结果(例如功能恢复、电生理学)。在本文，我们特别评估了对异种移植的组织学和免疫反应。
将双侧4cm桡神经破坏，轴突和结缔组织的完全生理和解剖横断，通过手术引入十只恒河猴。对于每名受试者，一个肢体用自体神经移植物修复，而对侧肢体以盲法进行异种修复。在12个月的观察期内，对神经、脾、肝、肾、肺和心脏样品的各种宏观和微观组织形态学特征进行评估。通过qPCR反复评估受试者的抗GalT-KO猪IgG和IgM抗体以及猪细胞的存在。
在自体和异种治疗的肢体中均观察到此前报道的功能恢复。异种移植部位的炎症更严重，包括浸润性淋巴细胞、巨噬细胞和组织细胞群体，沿髓鞘外明显存在三级淋巴结节。抗GalT-KO猪IgG和IgM水平和趋势与我们此前的经验以及我们正在进行的临床试验一致。在任何组织样品中均未检测到微嵌合现象，也没有证据表明异种移植物有任何全身性影响。
这些长期体内数据表明，在用活的猪神经移植物进行重建后，安全性和耐受性是有前景的。关键发现包括受试者在12个月内缺乏全身性猪细胞迁移，并且完全消除了移植的猪组织。结合起来，这些数据对于神经异种移植疗法而言是令人鼓舞的，并且更广泛地支持异种移植的临床可行性。
在同一项为期12个月的研究中，采用标准化实验模型将来源于基因工程改造的、无指定病原体的猪供体的活的、大口径、混合模式异种神经移植物的安全性和功效评估为在非人灵长类动物中重建大间隙(≥4cm)外周神经破坏的潜在方法(NHP)。观察到此前报道的1功能恢复。自体或异种处理的肢体在运动或感觉神经的传导速度、复合肌肉动作电位(CMAP)振幅或CMAP持续时间方面无统计学上的显著差异。十名受试者中的任何一名都没有由异种移植物引起的全身性效应或不良事件的证据。鉴于在这项临床前研究中展示的异种神经移植物的前景，我们在本文中提供了对微生物安全性的分析，特别强调了猪内源性逆转录病毒(PERV)，以及活的猪神经移植物作为目前可用的在NHP中针对大间隙(≥4cm)外周神经损伤的手术治疗的安全替代物。
将PERV拷贝数和表达与微嵌合现象一起分析，以通过qPCR评估猪细胞的存在。分析的样品包括在治疗后8个月和12个月收获的异种(n＝5)和自体(n＝5)神经组织，以及在12个月研究的不同时间点获得的受试者(n＝10)的血清和PBMC，以及在尸检时获得的脾、肾、肝和肺切片。
基因工程改造的、无指定病原体的猪神经移植供体对弓形虫、钩端螺旋体、甲型流感、PCMV、PRV、PRCV和PRRSV呈阴性，这与我们的临床异种移植供体的微生物特征一致。在猪异种或NHP自体神经样品中未观察到PERV或微嵌合扩增。接受者PBMC、血清和组织的PERVRNA和/或DNA扩增检测呈阴性。在所分析的任何组织中均无循环猪细胞的证据。所有样品均符合分析质量标准。
这些长期体内数据表明，在用活的猪神经移植物进行重建后，微生物安全性是有前景的。在任何时间对任何受试者分析的任何组织或样品中，均无证据表明PERV的传播或感染。研究的一个局限性是使用恒河猴，此前已经发现恒河猴表现出低效的PERV感染性。有趣的是，在尸检时在从任何异种处理的肢体中获得的任何神经样品中均未检测到猪细胞。这与体内异种神经移植物的完全重塑的组织学证据一致。这些发现对于神经异种移植疗法的安全性和耐受性而言是令人鼓舞的，并且更广泛地支持异种移植的有前景的临床可行性。
虽然已经参考某些说明性方面(包括特征的各种组合和子组合)相当详细地描述和示出了本公开的主题，但是本领域技术人员将容易理解涵盖在本公开的范围内的其他方面及其变化和修改。此外，对这些方面、组合和子组合的描述并非旨在传达所要求保护的主题需要除了明确叙述于权利要求中的那些之外的特征或特征的组合。因此，本公开的范围旨在包括所附权利要求的精神和范围内的所有修改和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> Holzer, Paul
Rogers, Kaitlyn
Adkins, Jon
Chang, Elizabeth
Monroy, Rodney
<120> IMMUNOLOGICALLY COMPATIBLE CELLS, TISSUES, ORGANS, AND METHODS
FOR TRANSPLANTATION FOR SILENCING, HUMANIZATION, AND
PERSONALIZATION WITH MINIMIZED COLLATERAL GENOMIC DISRUPTIONS
<130> 4772-112
<150> US63069569
<151> 2020-08-24
<160> 211
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201, ENSSSCE00045087536
<400> 1
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087536 introns 2-3
<400> 2
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 3
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087540
<400> 3
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 4
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087536
<400> 4
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087536 introns 2-3
<400> 5
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 6
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087540
<400> 6
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 7
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087536
<400> 7
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087536 INTRONS 2-3
<400> 8
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 9
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087540
<400> 9
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 10
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087536
<400> 10
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 introns 2-3
<400> 11
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 12
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087540
<400> 12
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 13
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085054
<400> 13
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 introns 2-3
<400> 14
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 15
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085455
<400> 15
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagg 885
<210> 16
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085054
<400> 16
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 introns 2-3
<400> 17
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 18
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085973
<400> 18
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 19
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085054
<400> 19
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 introns 2-3
<400> 20
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 21
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085973
<400> 21
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 22
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085054
<400> 22
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 introns 2-3
<400> 23
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 24
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085973
<400> 24
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 5' Upstream sequence
<400> 25
cggggccggg cacggccggg cacccggctt gggcggcggg tttcaggtgg 50
<210> 26
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 ENSSSCE00045086917
<400> 26
atgggcccag ctggcggcgg cggacgtctc cccgcctggc cgagcggtgg cggcgtcggg 60
ctggcgggcg gaggcctgac tgacgcggat ctccccgcag aggatttcgt gtaccagttt 120
aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc ggctcttgac cagatacatc 180
tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg gggagtaccg ggcggtgacc 240
ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga aggacgtcct ggagcagacg 300
cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga tagaggaagg cacgaccctg 360
cagcggcgag 370
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 introns 1-2
<400> 27
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 28
<211> 1441
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 ENSSSCE00045087028
<400> 28
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagggtaag gagctctggg 900
gaaatgggga gacgggctgt ggttgggacc gtctgcaggg aggccttgtc tctagatgag 960
ctctttcctc ctgaccgtga aaggaaggag actgggatgg tggtgagaag aaacaaaata 1020
atctagggag acaatggagt ctgatttcac tgattgaaag gtagccccac tgcagaggtg 1080
acaggtggaa tttattctag ggcttttttc tagtgacaac tctattcatt tgggaggatt 1140
ttattttaga tcacttaagg ccttgtgggt agggagggaa tatatttcca gttaagttgc 1200
ttatctcatt tccctttggg gtgagtgaga cactgtgcca tgagacattt tgtgggacct 1260
cctgggcagg taatgtttct gctctgattc accaggggtt gtggggacag ggaaaggagg 1320
gaggaagggg tgaggtcagt gtacctgggc gcagtggtct cattcacagc ctatttactt 1380
ctgtgggatc cagagttagg ggagaagttt gctcagtttc tataggaagc tcctgaggtt 1440
g 1441
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 3' downstream
<400> 29
ttccccagaa ccaggccata actttggtgg cacctttctc tgaagctggg 50
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 5' upstream sequence
<400> 30
ccaaaacctg acctggcagc tgggctttgg gtgtctttag agttctttct 50
<210> 31
<211> 148
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087534
<400> 31
cagctccatc ctcatcattg ctctacaact ccgaagagca agagctgaga ccaccttgag 60
aagagcatgg tcccaggccg agttctgatg tggggggccc tcgccctgac caccgtgatg 120
agcgcctgtg gaggtgaaga cattgcgg 148
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 introns 1-2
<400> 32
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 33
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087536
<400> 33
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 introns 2-3
<400> 34
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 35
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087540
<400> 35
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 introns 3-4
<400> 36
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 37
<211> 175
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087547
<400> 37
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtggtctgc gccctgggat 60
tgatcgtggg ccttgtgggc atcgtggtgg gcactgtctt catcattcaa ggcctgcgct 120
caggtggtcc ctctagacac caagggtcct tgtgagtcac actccagaag ggaag 175
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 introns 4-5
<400> 38
gtaaggattc agatttgtca gaaccccagt cctgcctctt gtctttgcag 50
<210> 39
<211> 1115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087550
<400> 39
ggtcaaaagc aaagagctac ctatagagac ctgagggctc cctggacacc cagcacaagt 60
cctcttgatt tctccacggt gtcactctct ctttactcct attgtgaatg gcaatgtcca 120
ccctaaggaa gatgacagtg tcaacacaaa acctctgacc ccacttggca tcttgctctg 180
agcagacaca gactatgacc ttgagaagca gaatctggag actcccacac tccacagtgt 240
ccctggctga tgacctgcag tacaccctgg gatacaagct ctttctccaa aagaaagcct 300
agttctccaa tctaacctca tccaggagag tgaaggacct gccattggct cctcaggtcc 360
agtgtgtaga tgagggatca gggaagagag gatgcctgct cctagaggca cagcagtttc 420
ataacctcag agaaaagctc taagccactc gtgttaatga caaatccaag agtgtgagat 480
gaagaccact ttcagtagag tgactcttct aatgcctggg aagacagtgt catcccagat 540
cgacaggtca ttatgttcac agataagaga attccagctc agcagcgcca tcaggtgact 600
gtgcaggagg caatggctgg gatgggtgtg agtcagcccc ggagccaatg agggacccta 660
gagccaaagg gaactctgcc atttgtcttg tggggttcag aagaacaaac tgccccttat 720
ccactccaca ctcaggtggc actggaggct gggatgctcc atgtgacaga tgcagacatc 780
tccatgctgg aaagtcattt ccagcagcac aaagatctgg gaaatccagt ccctgttcct 840
tataaggggg gtgggcacaa tgccaaccat ctgcatccca tgtacaggat gatgtttctg 900
aaaggtgtgc atgttaccca gactgggccg gtagcatctt ccctaaaatg attaaaactg 960
tagtatacac tctggaaata tacaacagag acaaattaat acacacacac acagagagat 1020
aagctgtgag gtgatgagaa agaaagatat agaaaataga gatgaaaaga gaaacacagc 1080
aagataaaga gatgccgata aagagtgata aagat 1115
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-201 3' downstream sequence
<400> 40
gcaaatagtg aaaaattgat tttctttctc ctctgtagac ctttacgcag 50
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 5' upstream sequence
<400> 41
aactggcaac agaggtgtca tcatagggga agtttctgat tggccaaaac 50
<210> 42
<211> 191
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087621
<400> 42
ctgacctggc agctgggctt tgggtgtctt tagagttctt tctcagctcc atcctcatca 60
ttgctctaca actccgaaga gcaagagctg agaccacctt gagaagagca tggtcccagg 120
ccgagttctg atgtgggggg ccctcgccct gaccaccgtg atgagcgcct gtggaggtga 180
agacattgcg g 191
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 Intron 1-2
<400> 43
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 44
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087536
<400> 44
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 introns 2-3
<400> 45
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 46
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087540
<400> 46
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 introns 3-4
<400> 47
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 48
<211> 175
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087547
<400> 48
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtggtctgc gccctgggat 60
tgatcgtggg ccttgtgggc atcgtggtgg gcactgtctt catcattcaa ggcctgcgct 120
caggtggtcc ctctagacac caagggtcct tgtgagtcac actccagaag ggaag 175
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 introns 4-5
<400> 49
gtaaggattc agatttgtca gaacccgatc tcatgtctgt cctattgcag 50
<210> 50
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087625
<400> 50
gagcactgcc cgcctacaag agctgaagag tggatgtgct caacgaccta gaactatttt 60
ctggccaaat tcatcatata ccttctctct t 91
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 introns 5-6
<400> 51
cctacattct tcttctcacc tcttctttct ccacggtgtc actctctctt 50
<210> 52
<211> 879
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087664
<400> 52
tactcctatt gtgaatggca atgtccaccc taaggaagat gacagtgtca acacaaaacc 60
tctgacccca cttggcatct tgctctgagc agacacagac tatgaccttg agaagcagaa 120
tctggagact cccacactcc acagtgtccc tggctgatga cctgcagtac accctgggat 180
acaagctctt tctccaaaag aaagcctagt tctccaatct aacctcatcc aggagagtga 240
aggacctgcc attggctcct caggtccagt gtgtagatga gggatcaggg aagagaggat 300
gcctgctcct agaggcacag cagtttcata acctcagaga aaagctctaa gccactcgtg 360
ttaatgacaa atccaagagt gtgagatgaa gaccactttc agtagagtga ctcttctaat 420
gcctgggaag acagtgtcat cccagatcga caggtcatta tgttcacaga taagagaatt 480
ccagctcagc agcgccatca ggtgactgtg caggaggcaa tggctgggat gggtgtgagt 540
cagccccgga gccaatgagg gaccctagag ccaaagggaa ctctgccatt tgtcttgtgg 600
ggttcagaag aacaaactgc cccttatcca ctccacactc aggtggcact ggaggctggg 660
atgctccatg tgacagatgc agacatctcc atgctggaaa gtcatttcca gcagcacaaa 720
gatctgggaa atccagtccc tgttccttat aaggggggtg ggcacaatgc caaccatctg 780
catcccatgt acaggatgat gtttctgaaa ggtgtgcatg ttacccagac tgggccggta 840
gcatcttccc taaaatgatt aaaactgtag tatacactc 879
<210> 53
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-202 3' downstream sequence
<400> 53
tggaaatata caacagagac aaattaatac acacacacac agagagataa 50
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 5' upstream sequence
<400> 54
ctttgggtgt ctttagagtt ctttctcagc tccatcctca tcattgctct 50
<210> 55
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087772
<400> 55
acaactccga agagcaagag ctgagaccac cttgagaaga gcatggtccc aggccgagtt 60
ctgatgtggg gggccctcgc cctgaccacc gtgatgagcg cctgtggagg tgaagacatt 120
gcgg 124
<210> 56
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 introns 2-3
<400> 56
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 57
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087536
<400> 57
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 58
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 introns 2-3
<400> 58
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 59
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087540
<400> 59
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 introns 3-4
<400> 60
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 61
<211> 175
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLA-DQA-203 ENSSSCE00045087547
<400> 61
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtggtctgc gccctgggat 60
tgatcgtggg ccttgtgggc atcgtggtgg gcactgtctt catcattcaa ggcctgcgct 120
caggtggtcc ctctagacac caagggtcct tgtgagtcac actccagaag ggaag 175
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 introns 4-5
<400> 62
gtaaggattc agatttgtca gaaccttttt tttttgtttt cctttttcag 50
<210> 63
<211> 1324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087920
<400> 63
gacagctcct gcggcatatg gaagttccca ggctaggggg caaatctgag acgtagctgc 60
tagccattcc acagccatac cagatcagag cctcctacac cgcagctgac tgcaacgctg 120
gatccttaat ccacagagca aggccaggga tcaaacccgc atcctcatgg gtactagttg 180
ggttcatatc ctgctgagac acagtgggaa ctcctggaac taattcctta catggaagag 240
gactgtcaat tatttagcaa aatgaatgaa aaaagactca ctcctaaatg tgtcatttta 300
aaaatttcag ggagttccca ttgtggctca gcggcaatga atctgactag catccatgag 360
gatgcaggtt caatccctgg ccttgcccag tgggttaagg atccggtgtt gccgtgagtt 420
gtggtgtagg tcacagatgt ggctcagatc ccacattgct gtgtctgtgg ctatggcaca 480
ggctgacagc tgcagcttag ctccaattca acccccagtc tgggaacttt acatttctta 540
tgtgacaaag agaccagtcc aaaaagtgcc ttattaccat acagcacttt gattttactt 600
gccccaaaaa ctagtaagct agatcccatt ttctcccatt tcctataacc agtgaaggaa 660
gaagggggta ttatttgttt tgttttacta ttgatatttc agtaacgatg gaagagcttg 720
tgtaaccaag aagggctgct tactacccac tgtctatgta acagtcacaa agatgtgctc 780
agcctaaccc ccaaagagtt ctgaagcttc aagggctctt cagagttgac ccaagttatg 840
gtgggatcac aaactttaca cctctgcaat gagcagtcac tgcagctgaa ttcccttggg 900
aagtgcagta aaactggaac tgggattcaa ttccacagtc attcaaggga tctaggttat 960
gactcagggt tacaacactt catacaccat cattctcagc aatggcctcc aggcttgcag 1020
tagaaggaaa agacaaagca gacagagctt aaacttgctt ttaaattcca tcggctggta 1080
ccagtcacaa ctccaaccta acctggaggg gaagctggga gatactgggt gacattattg 1140
aaggtgagac caaatgttca tgacaagtgg gctgttctca gatacaccca tgtatttttc 1200
tccaaggtat atgactacta aaactttggg attttttgtt agcaaacttg tttatatgta 1260
tttttaatta aatgatcaat aaaggattat attacccaat gaaatctggg tacaaaaaaa 1320
aaaa 1324
<210> 64
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-203 3' downstream sequence
<400> 64
gttgttccta tgaaactgtc actggaagga aagaaaaaag actctttctc 50
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 5' upstream sequence
<400> 65
tagagaagca aaaagaaacg cagcaaaccc acatgtggag gccaggcaaa 50
<210> 66
<211> 535
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088042
<400> 66
ggggcttggg ggggtagtgc ctgccagagg ggggtcacct caggagtctt cccggaagct 60
gtaactcagg aaatatggtt ggacaaatta ttagtgttgg cctcatctta tccatgagag 120
ctcagaaatt cccgccccgc ttgtccgtgg caggcataca cacctccgag atgattctca 180
tttcatcccc tccctccttt cactgagagt cccctcagct ctagtctgag aggaggcagc 240
ctcagaaccg ggggatttcc caaccccttc caggcctctt caaacaaagt cttcaactgg 300
caacagaggt gtcatcatag gggaagtttc tgattggcca aaacctgacc tggcagctgg 360
gctttgggtg tctttagagt tctttctcag ctccatcctc atcattgctc tacaactccg 420
aagagcaaga gctgagacca ccttgagaag agcatggtcc caggccgagt tctgatgtgg 480
ggggccctcg ccctgaccac cgtgatgagc gcctgtggag gtgaagacat tgcgg 535
<210> 67
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 introns 1-2
<400> 67
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 68
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087536
<400> 68
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 introns 2-3
<400> 69
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 70
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087540
<400> 70
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 71
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 introns 3-4
<400> 71
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 72
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088055
<400> 72
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtg 44
<210> 73
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 introns 4-5
<400> 73
gtctgcgccc tgggattgat cgtgggtggg cactgtcttc atcattcaag 50
<210> 74
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088069
<400> 74
gcctgcgctc aggtggtccc tctagacacc aagggtcctt gtgagtcaca ctccagaagg 60
gaag 64
<210> 75
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 introns 5-6
<400> 75
gtaaggattc agatttgtca gaacccgatc tcatgtctgt cctattgcag 50
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088082
<400> 76
gagcactgcc cgcctacaag agctga 26
<210> 77
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQA-204 3' downstream sequence
<400> 77
agagtggatg tgctcaacga cctagaacta ttttctggcc aaattcatca 50
<210> 78
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 5' upstream sequence
<400> 78
ctacatgggc acttccacag gtttttattc tctgaagggg ggatacgaga 50
<210> 79
<211> 163
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045084941
<400> 79
accactgagt gggagctgtg ttgactacca ttacttcttc gtttgccctc aattatgtct 60
gggatggtgg ctctgcggct ccccagaggc ctttggacag cggccttgac ggtgatgctg 120
gtggtgctgg gtgctccagt ggctgagggc agagactctc cac 163
<210> 80
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 introns 1-2
<400> 80
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 81
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085054
<400> 81
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 82
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 introns 2-3
<400> 82
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 83
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085455
<400> 83
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagg 885
<210> 84
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 introns 3-4
<400> 84
gtaaggagct ctggggaaat ggggatgacc actctctctc tcttctacag 50
<210> 85
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085731
<400> 85
ggctcgtgcg ctgaatcctg aagatacttt ggggttggtt tttgctcttc ttaaatgcct 60
gtctgttctt gcctggaatt cccatacccc tgccagcttg ttcctctctg aggtcagatc 120
ctacagtgac tctgatgcag tcacgagggc gcttcctgtg atccccacct caaggctctg 180
gctgtgaagc ttcttcctga actgacccca gcgcctctgc ctgagtgcag ccagctgtgt 240
ctactcagac cacaagggat tttcctgttc ctattttccc tcaacagact gtgcaagaga 300
agcacattga aaccatttac ctggctgtag agtgcttttt ttaaaatcat aattaaacat 360
gattatgagt ta 372
<210> 86
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-201 3' downstream sequence
<400> 86
tctgtgcacc gacccttctt aaatgggcag aggtaagaaa caatggcaga 50
<210> 87
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 5' upstream sequence
<400> 87
catgggcact tccacaggtt tttattctct gaagggggga tacgagaacc 50
<210> 88
<211> 160
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085952
<400> 88
actgagtggg agctgtgttg actaccatta cttcttcgtt tgccctcaat tatgtctggg 60
atggtggctc tgcggctccc cagaggcctt tggacagcgg ccttgacggt gatgctggtg 120
gtgctgggtg ctccagtggc tgagggcaga gactctccac 160
<210> 89
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 introns 1-2
<400> 89
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 90
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085054
<400> 90
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 91
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 introns 2-3
<400> 91
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 92
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085973
<400> 92
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 93
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 introns 3-4
<400> 93
gtaaggggca gttggttttc tttccctgac atttgggctc tgctccccag 50
<210> 94
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA_DQB1-202 ENSSSCE00045086264
<400> 94
gggcacagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagcgg tgtcgggggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt cctcgggctg ggccttttca tccgtcacag gagtcagaag g 111
<210> 95
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 introns 4-5
<400> 95
gtaaggagct ctggggaaat ggggatgacc actctctctc tcttctacag 50
<210> 96
<211> 371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045086397
<400> 96
ggctcgtgcg ctgaatcctg aagatacttt ggggttggtt tttgctcttc ttaaatgcct 60
gtctgttctt gcctggaatt cccatacccc tgccagcttg ttcctctctg aggtcagatc 120
ctacagtgac tctgatgcag tcacgagggc gcttcctgtg atccccacct caaggctctg 180
gctgtgaagc ttcttcctga actgacccca gcgcctctgc ctgagtgcag ccagctgtgt 240
ctactcagac cacaagggat tttcctgttc ctattttccc tcaacagact gtgcaagaga 300
agcacattga aaccatttac ctggctgtag agtgcttttt ttaaaatcat aattaaacat 360
gattatgagt t 371
<210> 97
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-202 3' downstream sequence
<400> 97
atctgtgcac cgacccttct taaatgggca gaggtaagaa acaatggcag 50
<210> 98
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 5' upstream sequence
<400> 98
ctgagtggga gctgtgttga ctaccattac ttcttcgttt gccctcaatt 50
<210> 99
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045086523
<400> 99
atgtctggga tggtggctct gcggctcccc agaggccttt ggacagcggc cttgacggtg 60
atgctggtgg tgctgggtgc tccagtggct gagggcagag actctccac 109
<210> 100
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 introns 1-2
<400> 100
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 101
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085054
<400> 101
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 102
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 introns 2-3
<400> 102
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 103
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085973
<400> 103
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 104
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 introns 3-4
<400> 104
gtaaggggca gttggttttc tttccctgac atttgggctc tgctccccag 50
<210> 105
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045086652
<400> 105
gggcacagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagcgg tgtcgggggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt cctcgggctg ggccttttca tccgtcacag gagtcagaag ggtaagga 118
<210> 106
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 introns 4-5
<400> 106
gctctgggga aatggggaga cgggcggaag gagactggga tggtggtgag 50
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA_DQB1-203 ENSSSCE00045086845
<400> 107
aagaaacaaa ataatctag 19
<210> 108
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-203 3' downstream sequence
<400> 108
ggagacaatg gagtctgatt tcactgattg aaaggtagcc ccactgcaga 50
<210> 109
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 5' upstream sequence
<400> 109
ctgagtggga gctgtgttga ctaccattac ttcttcgttt gccctcaatt 50
<210> 110
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045086523
<400> 110
atgtctggga tggtggctct gcggctcccc agaggccttt ggacagcggc cttgacggtg 60
atgctggtgg tgctgggtgc tccagtggct gagggcagag actctccac 109
<210> 111
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 introns 1-2
<400> 111
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 112
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085054
<400> 112
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 113
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 introns 2-3
<400> 113
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 114
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085973
<400> 114
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 115
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 introns 3-4
<400> 115
gtaaggggca gttggttttc tttccctgac atttgggctc tgctccccag 50
<210> 116
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA_DQB1-204 ENSSSCE00045086652
<400> 116
gggcacagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagcgg tgtcgggggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt cctcgggctg ggccttttca tccgtcacag gagtcagaag ggtaagga 118
<210> 117
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 introns 4-5
<400> 117
gctctgggga aatggggaga cgggcggaga agtttgctca gtttctatag 50
<210> 118
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045086763
<400> 118
gaagctcctg aggttgttcc ccagaaccag gccataa 37
<210> 119
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA_DQB1-204 3' downstream sequence
<400> 119
ctttggtggc acctttctct gaagctggga ggaaagggtg aggtcagtgt 50
<210> 120
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 5' upstream sequence
<400> 120
cggggccggg cacggccggg cacccggctt gggcggcggg tttcaggtgg 50
<210> 121
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 ENSSSCE00045086917
<400> 121
atgggcccag ctggcggcgg cggacgtctc cccgcctggc cgagcggtgg cggcgtcggg 60
ctggcgggcg gaggcctgac tgacgcggat ctccccgcag aggatttcgt gtaccagttt 120
aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc ggctcttgac cagatacatc 180
tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg gggagtaccg ggcggtgacc 240
ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga aggacgtcct ggagcagacg 300
cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga tagaggaagg cacgaccctg 360
cagcggcgag 370
<210> 122
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 introns 1-2
<400> 122
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 123
<211> 1441
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA_DQB1-205 ENSSSCE00045087028
<400> 123
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagggtaag gagctctggg 900
gaaatgggga gacgggctgt ggttgggacc gtctgcaggg aggccttgtc tctagatgag 960
ctctttcctc ctgaccgtga aaggaaggag actgggatgg tggtgagaag aaacaaaata 1020
atctagggag acaatggagt ctgatttcac tgattgaaag gtagccccac tgcagaggtg 1080
acaggtggaa tttattctag ggcttttttc tagtgacaac tctattcatt tgggaggatt 1140
ttattttaga tcacttaagg ccttgtgggt agggagggaa tatatttcca gttaagttgc 1200
ttatctcatt tccctttggg gtgagtgaga cactgtgcca tgagacattt tgtgggacct 1260
cctgggcagg taatgtttct gctctgattc accaggggtt gtggggacag ggaaaggagg 1320
gaggaagggg tgaggtcagt gtacctgggc gcagtggtct cattcacagc ctatttactt 1380
ctgtgggatc cagagttagg ggagaagttt gctcagtttc tataggaagc tcctgaggtt 1440
g 1441
<210> 124
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-DQB1-205 3' downstream sequence
<400> 124
ttccccagaa ccaggccata actttggtgg cacctttctc tgaagctggg 50
<210> 125
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DRA sample 11 01:01:01 Ex 1
<400> 125
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 126
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 11 01:01:01 Ex 2
<400> 126
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 127
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 11 01:01:01 Ex 3
<400> 127
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catcgacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 128
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 11 01:01:01 Ex 4
<400> 128
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 129
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 19 01:01:02 Ex 1
<400> 129
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 130
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 19 01:01:02 Ex 2
<400> 130
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 131
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 19 01:01:02 Ex 3
<400> 131
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catagacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 132
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 19 01:01:02 Ex 4
<400> 132
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa tgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 133
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA1 Sample 11 05:05:01 Exon 2
<400> 133
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 134
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA1 Sample 19 01:01:01 Exon 2
<400> 134
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgaggagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 135
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA1 05:01:01 Exon 2
<400> 135
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 136
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sample 57 01:01:01 Exon 2
<400> 136
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgaggagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 137
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA1 03:03:01 Exon 2
<400> 137
ctgaccatgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttatggtccc tctgggcagt 60
acagccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggcagtt gcctctgttc cgcagattta gaagatttga cccgcaattt gcactgacaa 180
acatcgctgt gctaaaacat aacttgaaca tcgtgattaa acgctccaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 138
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA1 Sample 29 05:01:01 Exon 2
<400> 138
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 139
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA1 Sample 50 01:02:01 Exon 2
<400> 139
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 140
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA SLA-201 ENSSSCE00045087536
<400> 140
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 141
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA SLA-202 ENSSSCE00045087536 Exon 2
<400> 141
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 142
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA SLA-203 ENSSSCE00045087536 Exon 2
<400> 142
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 143
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DQA SLA-204 ENSSSCE00045087536 Exon 2
<400> 143
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 144
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01 Exon 1
<400> 144
atgatcctaa acaaagctct gatgctgggg acccttgccc tgaccaccgt gatgagcccc 60
tgtggaggtg aagacattgt gg 82
<210> 145
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01 Exon 2
<400> 145
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 146
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01 Exon 3
<400> 146
aggttcctga ggtcacagtg ttttccaagt ctcccgtgac actgggtcag cccaacatcc 60
tcatctgtct tgtggacaac atctttcctc ctgtggtcaa catcacatgg ctgagcaatg 120
ggcactcagt cacagaaggt gtttctgaga ccagcttcct ctccaagagt gatcattcct 180
tcttcaagat cagttacctc accctcctcc cttctgctga ggagagttat gactgcaagg 240
tggagcactg gggactggac aagcctcttc tgaaacactg gg 282
<210> 147
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01 Exon 4
<400> 147
agcctgagat tccagcccct atgtcagagc tcacagagac tgtggtctgc gccctggggt 60
tgtctgtggg cctcgtgggc attgtggtgg gcactgtctt catcatccga ggcctgcgtt 120
cagttggtgc ttccagacac caagggccct tgtga 155
<210> 148
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01 Exon 1
<400> 148
atgatcctaa acaaagctct gctgctgggg gccctcgctc tgaccaccgt gatgagcccc 60
tgtggaggtg aagacattgt gg 82
<210> 149
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01 Exon 2
<400> 149
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 150
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01 Exon 3
<400> 150
aggttcctga ggtcacagtg ttttccaagt ctcccgtgac actgggtcag cccaacaccc 60
tcatttgtct tgtggacaac atctttcctc ctgtggtcaa catcacatgg ctgagcaatg 120
ggcagtcagt cacagaaggt gtttctgaga ccagcttcct ctccaagagt gatcattcct 180
tcttcaagat cagttacctc accttcctcc cttctgctga tgagatttat gactgcaagg 240
tggagcactg gggcctggac cagcctcttc tgaaacactg gg 282
<210> 151
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01 Exon 4
<400> 151
agcctgagat tccagcccct atgtcagagc tcacagagac tgtggtctgt gccctggggt 60
tgtctgtggg cctcatgggc attgtggtgg gcactgtctt catcatccaa ggcctgcgtt 120
cagttggtgc ttccagacac caagggccat tgtga 155
<210> 152
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01 Exon 1
<400> 152
atgatcctaa acaaagctct gatgctgggg gccctcgccc tgaccaccgt gatgagccct 60
tgtggaggtg aagacattgt gg 82
<210> 153
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01 Exon 2
<400> 153
ctgaccatgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttatggtccc tctgggcagt 60
acagccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggcagtt gcctctgttc cgcagattta gaagatttga cccgcaattt gcactgacaa 180
acatcgctgt gctaaaacat aacttgaaca tcgtgattaa acgctccaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 154
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01 Exon 3
<400> 154
aggttcctga ggtcacagtg ttttccaagt ctcccgtgac actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtct tgtggacaac atctttcctc ctgtggtcaa catcacctgg ctgagcaatg 120
ggcactcagt cacagaaggt gtttctgaga ccagcttcct ctccaagagt gatcattcct 180
tcttcaagat cagttacctc accttcctcc cttctgatga tgagatttat gactgcaagg 240
tggagcactg gggcctggat gagcctcttc tgaaacactg gg 282
<210> 155
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01 Exon 4
<400> 155
agcctgagat tccaacacct atgtcagagc tcacagagac tgtggtctgc gccctggggt 60
tgtctgtggg cctcgtgggc attgtggtgg ggaccgtctt gatcatccga ggcctgcgtt 120
cagttggtgc ttccagacac caagggccct tgtga 155
<210> 156
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01 Exon 1
<400> 156
atgtcttgga aaaaggcttt gcggatcccc ggaggccttc gggcagcaac tgttaccttg 60
atgctggcga tgctgagcac cccagtggct gagggcagag actctcccg 109
<210> 157
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01 Exon 2
<400> 157
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 158
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:03:01 Exon 3
<400> 158
tggagcccac agtgaccatc tccccatcca ggacagaggc cctcaaccac cacaacctgc 60
tggtctgctc agtgacagat ttctatccag cccagatcaa agtccggtgg tttcggaatg 120
accaggagga gacaaccggc gttgtgtcca ccccccttat taggaacggt gactggacct 180
tccagatcct ggtgatgctg gaaatgactc cccagcatgg agacgtctac acctgccacg 240
tggagcaccc cagcctccag aaccccatca ccgtggagtg gc 282
<210> 159
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01 Exon 4
<400> 159
gggctcagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagtgg cattggaggc ttcgtgctgg 60
ggctcatctt cctcgggctg ggccttatta tccatcacag gagtcagaaa g 111
<210> 160
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01 Exon 1
<400> 160
atgtcttgga agaaggcttt gcggatcccc ggagaccttc gggtagcaac tgtcaccttg 60
atgctggcga tgctgagctc cctactggct gagggcagag actctcccg 109
<210> 161
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01 Exon 2
<400> 161
aggatttcgt gttccagttt aagggcatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gtcttgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggtgtaccg cgcggtgacg ccgcaggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggaggggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactacgagg 240
tggcgttccg cgggatcttg cagaggagag 270
<210> 162
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01 Exon 3
<400> 162
tggagcccac agtgaccatc tccccatcca ggacagaggc cctcaaccac cacaacctgc 60
tggtctgctc ggtgacagat ttctatccag gccagatcaa agtccggtgg tttcggaatg 120
atcaggagga gacagccggc gttgtgtcca ccccccttat taggaatggt gactggactt 180
tccagatcct ggtgatgctg gaaatgactc cccagcgtgg agatgtctac acctgccacg 240
tggagcaccc cagcctccag agccccatca ccgtggagtg gc 282
<210> 163
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01 Exon 4
<400> 163
gggctcagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagtgg cgttggaggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt ccttgggctg ggccttatca tccgtcaaag gagtcagaaa g 111
<210> 164
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01 Exon 1
<400> 164
atgtcttgga aaaaggcttt gcggatcccc ggaggccttc gggcagcaac tgttaccttg 60
atgctggcga tgctgagcac cccagtggct gagggcagag actctcccg 109
<210> 165
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01 Exon 2
<400> 165
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 166
<211> 164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01 Exon 3
<400> 166
tgaccaggag gagacaaccg gcgttgtgtc cacccccctt attaggaacg gtgactggac 60
cttccagatc ctggtgatgc tggaaatgac tccccagcat ggagacgtct acacctgcca 120
cgtggagcac cccagcctcc agaaccccat caccgtggag tggc 164
<210> 167
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01 Exon 4
<400> 167
gggctcagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagtgg cattggaggc ttcgtgctgg 60
ggctcatctt cctcgggctg ggccttatta tccatcacag gagtcagaaa g 111
<210> 168
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLAAlleles.Org 9.05% USA Exon 2 DQA1*01:01:01:01
<400> 168
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgaggagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 169
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLAAlleles.Org 14.17% USA Exon 2 DQA1*01:02:01:01
<400> 169
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 170
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLAAlleles.Org 13.14% USA Exon 2 DQA1*05:01:01:01
<400> 170
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 171
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLAAlleles.Org 11.08% USA Exon 2 DQA1*02:01:01:01
<400> 171
ctgaccacgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
tcacccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggaagtt gcctctgttc cacaaatttg gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtgct aaaacataac ttgaacatcc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 172
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 Exon 1
<400> 172
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 173
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 Exon 2
<400> 173
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 174
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 Exon 3
<400> 174
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catcgacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 175
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 Exon 4
<400> 175
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 176
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03 Exon 1
<400> 176
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 177
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03 Exon 2
<400> 177
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 178
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03 Exon 3
<400> 178
tacctccaga ggtaactgtg ctcacaaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catagacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 179
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03 Exon 4
<400> 179
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggattgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 180
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01 Exon 1
<400> 180
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 181
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01 Exon 2
<400> 181
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 182
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01 Exon 3
<400> 182
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catcgacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 183
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01 Exon 4
<400> 183
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 184
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01 Exon 1
<400> 184
atggtgtgtc tgaggctccc tggaggctcc tgcatggcag ttctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttggctggg gacaccagac 100
<210> 185
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11;01:01 Exon 2
<400> 185
cacgtttctt ggagtactct acgtctgagt gtcatttctt caatgggacg gagcgggtgc 60
ggttcctgga cagatacttc tataaccaag aggagtacgt gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggagttccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgatga ggagtactgg aacagccaga 180
aggacttcct ggaagacagg cgggccgcgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg 240
ttggtgagag cttcacagtg cagcggcgag 270
<210> 186
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01 Exon 3
<400> 186
tccatcctaa ggtgactgtg tatccttcaa agacccagcc cctgcagcac cacaacctcc 60
tggtctgttc tgtgagtggt ttctatccag gcagcattga agtcaggtgg ttccggaatg 120
gccaggaaga gaagactggg gtggtgtcca caggcctgat ccacaatgga gactggacct 180
tccagaccct ggtgatgctg gaaacagttc ctcggagtgg agaggtttac acctgccaag 240
tggagcaccc aagcgtgaca agccctctca cagtggaatg ga 282
<210> 187
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01 Exon 4
<400> 187
gagcacggtc tgaatctgca cagagcaaga tgctgagtgg agtcgggggc tttgtgctgg 60
gcctgctctt ccttggggcc gggctgttca tctacttcag gaatcagaaa g 111
<210> 188
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01 Exon 1
<400> 188
atggtgtgtc tgaagctccc tggaggctcc tgcatgacag cgctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttgtctggg gacacccgac 100
<210> 189
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01 Exon 2
<400> 189
cacgtttcct gtggcagcct aagagggagt gtcatttctt caatgggacg gagcgggtgc 60
ggttcctgga cagatacttc tataaccagg aggagtccgt gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggagttccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgacgc tgagtactgg aacagccaga 180
aggacatcct ggagcaggcg cgggccgcgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg 240
ttgtggagag cttcacagtg cagcggcgag 270
<210> 190
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01 Exon 3
<400> 190
tccaacctaa ggtgactgta tatccttcaa agacccagcc cctgcagcac cacaacctcc 60
tggtctgctc tgtgagtggt ttctatccag gcagcattga agtcaggtgg ttcctgaacg 120
gccaggaaga gaaggctggg atggtgtcca caggcctgat ccagaatgga gactggacct 180
tccagaccct ggtgatgctg gaaacagttc ctcgaagtgg agaggtttac acctgccaag 240
tggagcaccc aagcgtgaca agccctctca cagtggaatg ga 282
<210> 191
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01 Exon 4
<400> 191
gagcacggtc tgaatctgca cagagcaaga tgctgagtgg agtcgggggc tttgtgctgg 60
gcctgctctt ccttggggcc gggctgttca tctacttcag gaatcagaaa g 111
<210> 192
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01 Exon 1
<400> 192
atggtgtgtc tgaagttccc tggaggctcc tgcatggcag ctctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttggctggg gacacccgac 100
<210> 193
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01 Exon 2
<400> 193
cacgtttctt ggagcaggtt aaacatgagt gtcatttctt caacgggacg gagcgggtgc 60
ggttcctgga cagatacttc tatcaccaag aggagtacgt gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggacctcct ggagcagaag cgggccgcgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg 240
ttggtgagag cttcacagtg cagcggcgag 270
<210> 194
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01 Exon 3
<400> 194
tctatcctga ggtgactgtg tatcctgcaa agacccagcc cctgcagcac cacaacctcc 60
tggtctgctc tgtgaatggt ttctatccag gcagcattga agtcaggtgg ttccggaacg 120
gccaggaaga gaagactggg gtggtgtcca caggcctgat ccagaatgga gactggacct 180
tccagaccct ggtgatgctg gaaacagttc ctcggagtgg agaggtttac acctgccaag 240
tggagcaccc aagcctgacg agccctctca cagtggaatg ga 282
<210> 195
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01 Exon 4
<400> 195
gagcacggtc tgaatctgca cagagcaaga tgctgagtgg agtcgggggc ttcgtgctgg 60
gcctgctctt ccttggggcc gggctgttca tctacttcag gaatcagaaa g 111
<210> 196
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 11 05:05:01 Exon 2
<400> 196
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 197
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01 Exon 2
<400> 197
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 198
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01 Exon 2
<400> 198
ctgaccatgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttatggtccc tctgggcagt 60
acagccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggcagtt gcctctgttc cgcagattta gaagatttga cccgcaattt gcactgacaa 180
acatcgctgt gctaaaacat aacttgaaca tcgtgattaa acgctccaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 199
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01 Exon 2
<400> 199
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 200
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01 Exon 2
<400> 200
aggatttcgt gttccagttt aagggcatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gtcttgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggtgtaccg cgcggtgacg ccgcaggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggaggggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactacgagg 240
tggcgttccg cgggatcttg cagaggagag 270
<210> 201
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01 Exon 2
<400> 201
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 202
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 Exon 1
<400> 202
taagccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 203
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03 Exon 1
<400> 203
taagccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 204
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01 Exon 1
<400> 204
taagccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 205
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01 Exon 1
<400> 205
taagtgtgtc tgaagctccc tggaggctcc tgcatgacag cgctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttgtctggg gacacccgac 100
<210> 206
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01 Exon 1
<400> 206
taagtgtgtc tgaagctccc tggaggctcc tgcatgacag cgctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttgtctggg gacacccgac 100
<210> 207
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01 Exon 1
<400> 207
taagtgtgtc tgaagttccc tggaggctcc tgcatggcag ctctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttggctggg gacacccgac 100
<210> 208
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLA-B2M-208 ENSSSCE00000185155
<400> 208
Arg Pro Pro Lys Val Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Pro Asn Tyr Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Pro Gln
20 25 30
Ile Glu Ile Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Lys Met Asn Ala Glu Gln
35 40 45
Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Val His
50 55 60
Thr Glu Phe Thr Pro Asn Ala Val Asp Gln Tyr Ser Cys Arg Val Lys
65 70 75 80
His Val Thr Leu Asp Lys Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90
<210> 209
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon 2 B2M human ENSE00003751577
<400> 209
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp
20 25 30
Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu
35 40 45
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr
50 55 60
Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val
65 70 75 80
Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90
<210> 210
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-B2M-207 ENSE00003659794
<400> 210
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp
20 25 30
Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu
35 40 45
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr
50 55 60
Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val
65 70 75 80
Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90
<210> 211
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA B2M-214 ENSE00003659794
<400> 211
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp
20 25 30
Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu
35 40 45
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr
50 55 60
Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val
65 70 75 80
Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90

Claims (95)

1.一种用于产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库的生物系统，其中所述生物系统具有生物和代谢活性，即是活的，所述生物系统包括用于移植到人接受者中的非人动物供体中的基因重新编程的蛋白质、细胞、组织和/或器官，
其中所述非人动物供体是用于从基因重新编程的猪供体分离的细胞、组织和/或器官的异种移植的所述基因重新编程的猪供体，
所述基因重新编程的猪供体包含的基因组已经被重新编程为用多个合成核苷酸序列替换多个内源外显子和/或内含子区域中的多个野生型核苷酸，所述合成核苷酸序列是基于人捕获参考序列的免疫原性和/或物理化学性质而设计，长度为3至350个碱基对，
其中所述基因重新编程的猪供体的细胞不呈递选自半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)、Neu5Gc和/或Sda一个或多个表面聚糖表位，并且其中编码α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的基因被破坏，使得所述基因重新编程的猪供体缺乏由所述基因编码的表面聚糖表位的功能性表达，
其中所述猪供体的基因组通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合来进行重新编程，所述取代或修饰的设计最大程度地减少附带基因组破坏，并且核苷酸总数的净增加或净损失为5％或更少，并且避免了基因组组织破坏，是非转基因的，并且使得所述供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生致耐受性，而不牺牲动物的免疫功能，
其中所述重新编程的猪供体基因组包含所述野生型猪供体的主要组织相容性复合物的内源外显子和/或内含子区域，所述区域对应于SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DRA、SLA-DRB、SLA-DQA和/或SLA-DQB以及它们的任何组合的外显子区域，被破坏、沉默或者在(95％)的细胞外表面上非功能性表达，这通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合来实现；
其中所述重新编程的猪供体基因组包含所述野生型猪供体的B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和/或MIC-2以及它们的任何组合的内源外显子和/或内含子区域，所述区域通过重新编程来进行人源化，所述重新编程通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合用合成核苷酸来进行，所述合成核苷酸来自所述人捕获参考序列的已知人B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2的直系同源外显子，是根据所述人捕获参考序列而设计，并且所述取代或修饰最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，并且使得所述供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生致耐受性，而不牺牲所述B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和MIC-2蛋白的天然免疫功能；
其中所述重新编程的猪供体基因组包含所述野生型猪供体的主要组织相容性复合物的内源外显子和/或内含子区域，所述区域对应于SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DRA、SLA-DRB、SLA-DQA和/或SLA-DQB以及它们的任何组合的外显子区域，通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合用合成核苷酸来进行重新编程，所述合成核苷酸来自所述人捕获参考序列的已知人HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DQA和/或HLA-DQB的直系同源外显子，是根据所述人捕获参考序列设计的，并且所述取代或修饰最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，并且使得所述供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生致耐受性，而不牺牲所述SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DRA、SLA-DRB、SLA-DQA和/或SLA-DQB蛋白的天然免疫功能。
2.如权利要求1所述的生物系统，其中所述基因重新编程的猪供体不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、Microphyton属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
3.如权利要求1或权利要求2所述的生物系统，其中在用所述合成核苷酸对所述野生型猪供体的所述基因组进行重新编程之后，所述猪供体的基因组是重新编程的，其中核苷酸数量没有净损失或净增加。
4.如权利要求1-3中任一项所述的生物系统，其中在用于产生所述非人动物供体的种系细胞中进行定点诱变取代。
5.如权利要求1-4中任一项所述的生物系统，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的生物系统，其中使用所述外显子区域的无痕交换对所述基因组进行重新编程，而不引入任何净插入、缺失、截短或其他基因改变，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
7.如权利要求1-6中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含选自TAA、TAG和TGA的至少一个终止密码子，或者所述终止密码子中的两个或三个的依次组合。
8.如权利要求7所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含所述至少一个终止密码子或者所述终止密码子中的两个或三个的所述组合，所述终止密码子在待沉默的一个或多个基因的启动子下游超过70个碱基对，使得所述野生型猪供体基因缺乏所述一个或多个基因的功能性表达。
9.如权利要求1-8中任一项所述的生物系统，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处以及在编码SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、CTLA-4、PD-L1、EPCR、TBM、TFPI和β2微球蛋白的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-1、SLA-2和SLA-DR的功能性表达。
10.如权利要求1-9中任一项所述的生物系统，其中所述野生型猪基因组在CTLA-4启动子和PD-L1启动子中的一个或多个处包含重新编程的核苷酸，其中与所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1的内源性表达相比，所述CTLA-4启动子和所述PD-L1启动子中的所述一个或多个被重新编程以增加重新编程的CTLA-4和重新编程的PD-L1中的一者或两者的表达。
11.如权利要求1-10中任一项所述的生物系统，其中所述合成核苷酸的总数等于所替换核苷酸的总数，使得在用所述合成核苷酸重新编程所述野生型猪的基因组之后的核苷酸数量没有净损失或净增加。
12.如权利要求1-11中任一项所述的生物系统，其中用所述多个合成核苷酸的重新编程不包括编码在所述野生型猪MHC序列与所述人捕获参考序列之间保守的氨基酸的密码子区域中的核苷酸的替换。
13.如权利要求1-12中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸的定点诱变取代。
14.如权利要求1-13中任一项所述的生物系统，其中在用于产生所述非人动物的种系细胞中进行定点诱变取代。
15.如权利要求1-14中任一项所述的生物系统，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-A捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
17.如权利要求1-16中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-B捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
18.如权利要求1-17中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-3的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
19.如权利要求1-18中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-E捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-6的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
20.如权利要求1-19中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-F捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-7的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
21.如权利要求1-20中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-8的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
22.如权利要求1-21中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含在所述野生型猪的MHC I类链相关基因2(MIC-2)的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
23.如权利要求1-22中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-1、SLA-2、SLA-DR或其组合的功能性表达。
24.如权利要求1-23中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQA1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪SLA-DQA的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
25.如权利要求1-24中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQB1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪SLA-DQB的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
26.如权利要求1-25中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DRA1和HLA-DRB 1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DRA和SLA-DRB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代，或其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DRA和SLA-DRB1的功能性表达。
27.如权利要求1-26中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA1和HLA-DQB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DQA和SLA-DQB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
28.如权利要求1-27中任一项所述的生物系统，其中核苷酸的所述定点诱变取代位于在所述野生型猪的基因组与所述已知人序列之间不保守的密码子处。
29.如权利要求1-28中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基述因组包含用来自已知人B2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪的B2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
30.如权利要求1-29中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的猪基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列。
31.如权利要求1-30中任一项所述的生物系统，其中所述基因组已被重新编程，使得所述基因重新编程的猪缺乏所述野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达。
32.如权利要求1-31中任一项所述的生物系统，其中所述基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述基因组已被重新编程以包含编码所述人捕获参考序列的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和SLA-DQ的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
34.如权利要求1-33中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-DQ和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
35.如权利要求1-34中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ和B2M处的核苷酸的定点诱变取代。
36.如权利要求1-35中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DR、SLA-1和/或SLA-2的功能性表达。
37.如权利要求1-36中任一项所述的生物系统，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
38.如权利要求1-37中任一项所述的生物系统，其中所述基因组的内含子区域中的核苷酸没有被破坏。
39.如权利要求1-38中任一项所述的生物系统，其中所述基因组被重新编程以在重新编程的外显子区域为纯合的。
40.如权利要求1-39中任一项所述的生物系统，其中所述基因组被重新编程使得多肽的细胞外的表型表面表达在人接受者中是致耐受的。
41.如权利要求1-40中任一项所述的生物系统，其中所述基因组被重新编程使得细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达通过重新编程CTLA-4启动子序列而被增加。
42.如权利要求1-41中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自人捕获参考序列CTLA-4的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型CTLA-4的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
43.如权利要求1-42中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的CTLA-4具有至少95％同一性的人源化CTLA-4多肽序列。
44.如权利要求1-43中任一项所述的生物系统，其中所述基因组被重新编程使得程序性死亡配体1(PD-L1)的表达通过重新编程PD-L1启动子序列而被增加。
45.如权利要求1-44中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人PD-L1的直系同源外显子的核苷酸对野生型PD-L1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
46.如权利要求1-45中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的PD-L1具有至少95％同一性的人源化PD-L1多肽序列。
47.如权利要求1-46中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-3、SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域处的核苷酸的保守氨基酸取代。
48.如权利要求1-47中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA1和HLA-DQB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DQA和SLA-DQB1的外显子区域处的核苷酸的保守氨基酸取代。
49.一种从权利要求1-48中任一项所述的生物系统获得的基因重新编程的、具有生物和代谢活性的非人细胞、组织或器官，任选地其中所述生物系统具有O阴性血型，并且任选地其中蛋白质、细胞、组织和器官的获得以符合犹太教教规的方法进行。
50.如权利要求49所述的基因重新编程的、具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述基因重新编程的、具有生物活性和代谢活性的非人细胞是干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、多能干细胞、造血干细胞或分化的干细胞。
51.一种从权利要求1-48中任一项所述的生物系统获得的基因重新编程的非人功能性蛋白质。
52.一种从包含重新编程的基因组的基因重新编程的猪供体产生用于异种移植的猪供体蛋白质、细胞、组织或器官的方法，其中所述猪供体组织或器官的细胞被基因重新编程成特征在于接受者特异性表面表型，所述方法包括：
a)从预期的人移植接受者获得含有DNA的生物样品；
b)对所述生物样品进行全基因组测序以获得人捕获参考序列；
c)在基因座(i)-(v)处比较所述人捕获参考序列与猪供体的野生型基因组：
(i)编码SLA-3的外显子区域；
(ii)编码SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域；
(iii)编码SLA-DQ的外显子区域；
(iv)一个或多个编码β2微球蛋白(B2M)的外显子；
(v)SLA-MIC-2基因、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI的外显子区域；
d)针对所述基因座(i)-(v)中的一者或多者创建长度为3至350个碱基对的合成核苷酸序列，其中所述合成核苷酸序列在对应于猪供体基因座(i)-(vi)的基因座处与所述人捕获参考序列直系同源；
e)获得猪胚胎成纤维细胞、猪受精卵、猪间充质干细胞(MSC)或猪生殖系细胞；
f)对e)中的所述细胞进行基因重新编程以缺乏功能性α-1,3半乳糖基转移酶(GalT)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)；
g)使用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)或多重基因编辑对e)或f)中的所述细胞进行基因重新编程，以进行核苷酸的定点诱变取代，所述定点诱变取代通过用所述合成核苷酸序列替换(i)-(v)中的核苷酸序列来进行；
其中所述重新编程的猪供体基因组包含所述野生型猪供体的主要组织相容性复合物的内源外显子和/或内含子区域，所述区域对应于SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DRA、SLA-DRB、SLA-DQA和/或SLA-DQB以及它们的任何组合的外显子区域，被破坏、沉默或者在(95％)的细胞外表面上非功能性表达，这通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合来实现；
其中所述重新编程的猪供体基因组包含所述野生型猪供体的B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和/或MIC-2以及它们的任何组合的内源外显子和/或内含子区域，所述区域通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合用合成核苷酸来进行重新编程，所述合成核苷酸来自所述人捕获参考序列的已知人B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和/或MIC-2的直系同源外显子，根据所述人捕获参考序列而设计，并且所述取代或修饰最大程度地减少附带基因组破坏，并且具有5％或更少的核苷酸总数的净增加或净损失，并且避免了基因组组织破坏，并且使得所述供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生致耐受性，而不牺牲所述B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和/或MIC-2蛋白的天然免疫功能；
其中所述重新编程的猪供体基因组包含所述野生型猪供体的主要组织相容性复合物的内源外显子和/或内含子区域，所述区域对应于SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DRA、SLA-DRB、SLA-DQA和/或SLA-DQB以及它们的任何组合的外显子区域，通过精确的定点诱变取代或修饰的特定组合用合成核苷酸来进行重新编程，所述合成核苷酸来自所述人捕获参考序列的已知人HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DQA和/或HLA-DQB的直系同源外显子，是根据所述人捕获参考序列而设计，并且所述取代或修饰最大程度地减少附带基因组破坏，理想情况下不会导致核苷酸总数的净增加或损失，并且避免了基因组组织破坏，并且使得所述供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体内时产生致耐受性，而不牺牲所述SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DRA、SLA-DRB、SLA-DQA和/或SLA-DQB蛋白的天然免疫功能；
h)从g)中的所述基因重新编程的细胞产生胚胎；
i)将所述胚胎移植到代孕猪中，并且使所述移植的胚胎在所述代孕猪中生长，其中所述代孕猪产下所述基因重新编程的猪供体；以及
j)从所述基因重新编程的猪供体收获所述猪供体的蛋白质、细胞、组织或器官。
53.如权利要求52所述的方法，其还包括确认具有所述合成供体猪核苷酸序列的所述基因重新编程的猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过测定抗体滴度确定的钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、Micropython和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌。
54.如权利要求108-109中任一项所述的方法，其还包括根据减少生物负荷的程序维持所述基因重新编程的猪，所述程序包括将所述基因重新编程的猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述基因重新编程的猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
55.如权利要求102-104中任一项所述的方法，其还包括从所述猪中收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪实施安乐死并从所述猪中无菌地去除所述生物制品。
56.如权利要求102-105中任一项所述的方法，其还包括在收获后使用不会如通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定所确定的将细胞生存能力降低至小于50％细胞生存能力的灭菌过程对所述生物制品进行处理，包括灭菌。
57.如权利要求108-112中任一项所述的方法，其还包括在保存细胞生存能力的存储条件下将所述生物制品储存在无菌容器中。
58.一种减少对异种移植物的细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含使用所述人捕获参考序列在编码所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和/或MIC-2蛋白中的一者或多者，或者它们的任何组合的区域处的重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪直系同源物的功能性表达；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
59.一种预防或减少在接受者人中对异种移植物的凝血和/或血栓性缺血的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪供体基因组包含使用所述人捕获参考序列在编码所述野生型猪供体的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和B2M、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM、TFPI和/或MIC-2蛋白中的一者或多者，或者它们的任何组合的区域处的重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪直系同源物的功能性表达；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
60.一种诱导在接受者人中对异种移植的细胞、组织或器官的至少部分免疫耐受的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
61.一种减少对异种移植物的自然杀伤细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
62.一种减少对异种移植物的细胞毒性T细胞淋巴细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
63.一种减少对异种移植物的MHC Ia类介导的排斥的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-3和所述野生型猪的MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-1和SLA-2的功能性表达；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
64.一种减少对异种移植物的MHC Ib类介导的排斥的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-6、SLA-7和SLA-8以及所述野生型猪的MHC Ia类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
65.一种减少对异种移植物的MHC II类介导的排斥的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种以及所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
66.一种抑制对异种移植物的凋亡细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
a)产生或获得从权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
b)将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
67.如权利要求58-66中任一项所述的方法，其中在所述植入步骤之后，猪内源性逆转录病毒(PERV)A、B和/或C不传播到所述接受者人。
68.一种在包含权利要求1所述的基因组的所述基因重新编程的猪供体中筛选脱靶编辑或基因组改变的方法，所述方法包括：
a)对含有来自猪供体的DNA的生物样品进行全基因组测序，以获得第一全基因组序列；
b)对所述猪供体基因组进行基因重新编程，以获得所述重新编程的猪供体基因组；
c)在步骤b)之后，进行全基因组测序，以获得第二全基因组序列；
d)比对所述第一全基因组序列和所述第二全基因组序列以获得序列比对；
e)分析所述序列比对，以鉴定在脱靶位点处与所述猪供体的基因组的任何错配，其中所述脱靶位点是在步骤b)中未被选择用于基因重新编程的基因组位置。
69.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC Ia类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪SLA-3的外显子区域用来自所述人捕获参考序列的HLA-C的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述SLA-3与来自人捕获参考序列的HLA-C之间不保守的氨基酸。
70.如权利要求69所述的合成核苷酸序列，其中所述野生型猪的SLA-1和SLA-2各自包含终止密码子。
71.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC Ib类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域分别用来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的密码子进行重新编程，所述密码子分别编码在所述SLA-6、SLA-7和SLA-8与来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G之间不保守的氨基酸。
72.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有权利要求69和71两者或权利要求70和71两者所述的合成核苷酸序列。
73.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC II类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪SLA-DQ的外显子区域分别用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQ的密码子进行重新编程，所述密码子分别编码在来自所述人捕获参考序列的所述SLA-DQ与的HLA-DQ之间不保守的氨基酸，并且其中所述野生型猪的SLA-DR包含终止密码子。
74.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有权利要求70-73的任何组合所述的合成核苷酸序列。
75.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪β2微球蛋白的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域用来自人捕获参考序列的β2微球蛋白的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪的β2微球蛋白与来自所述人捕获参考序列的β2微球蛋白之间不保守的氨基酸，其中所述合成核苷酸序列包含在外显子区域中的至少一个终止密码子使得所述合成核苷酸序列缺乏所述野生型猪的β2微球蛋白多肽的功能性表达。
76.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MIC-2的野生型猪内含子区域并且在所述野生型猪MIC-2的外显子区域用来自人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述MIC-2与来自所述人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B之间不保守的氨基酸。
77.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪CTLA-4的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪CTLA-4的外显子区域用来自人捕获参考序列的CTLA-4的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪的CTLA-4与来自所述人捕获参考序列的CTLA-4之间不保守的氨基酸。
78.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪PD-L1的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪PD-L1的外显子区域用来自人捕获参考序列的PD-L1的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪的PD-L1与来自所述人捕获参考序列的PD-L1之间不保守的氨基酸。
79.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪EPCR的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的EPCR的外显子区域用来自人捕获参考序列的EPCR的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪的EPCR与来自所述人捕获参考序列的EPCR之间不保守的氨基酸。
80.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪TBM的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的TBM的外显子区域用来自人捕获参考序列的TBM的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪的TBM与来自所述人捕获参考序列的TBM之间不保守的氨基酸。
81.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪TFPI的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的TFPI的外显子区域用来自人捕获参考序列的TFPI的密码子进行重新编程，所述密码子编码在所述野生型猪的TFPI与来自所述人捕获参考序列的TFPI之间不保守的氨基酸。
82.如权利要求52-81中任一项所述的方法或合成核苷酸序列，其中所述重新编程的基因组包含用至少一个终止密码子替换野生型猪基因的起始密码子后的前九个核苷酸，使得所述野生型猪基因缺乏功能性表达，所述终止密码子选自TAA、TAG和TGA，或者所述终止密码子中的两个或三个的依次组合。
83.一种猪、细胞、组织或器官，其具有如图52A-B所示的序列。
84.一种猪、细胞、组织或器官，其具有如图52A和/或图22B所示重新编程的野生型猪基因。
85.一种对野生型猪基因进行重新编程以用至少一个终止密码子对所述猪基因的起始密码子后的前九个核苷酸进行重新编程的方法，所述终止密码子选自TAA、TAG和TGA，或者所述终止密码子中的两个或三个的依次组合。
86.如权利要求85所述的方法，其包括如图52A和/或图52B所示对所述野生型猪基因进行重新编程。
87.如本公开的任一项权利要求所述的方法或合成核苷酸序列，其中所述核苷酸的取代基于保守氨基酸取代。
88.如权利要求87所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有有相似化学性质的侧链R基团的氨基酸残基。
89.如权利要求88所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有脂族侧链的氨基酸残基。
90.如权利要求88所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有脂族羟基侧链的氨基酸残基。
91.如权利要求88所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有含酰胺侧链的氨基酸残基。
92.如权利要求88所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有芳族侧链的氨基酸残基。
93.如权利要求88所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有碱性侧链的氨基酸残基。
94.如权利要求88所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有酸性侧链的氨基酸残基。
95.如权利要求88所述的方法或合成核苷酸序列，其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代限于具有含硫侧链的氨基酸残基。
CN202180072530.5A 2020-08-24 2021-08-24 免疫相容性细胞、组织、器官以及用于在最大程度地减少附带基因组破坏的情况下进行针对沉默、人源化和个性化的移植的方法 Pending CN116615448A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063069569P 2020-08-24 2020-08-24
US63/069,569 2020-08-24
PCT/US2021/047424 WO2022046824A1 (en) 2020-08-24 2021-08-24 Immunologically compatible cells, tissues, organs, and methods for transplantation for silencing, humanization, and personalization with minimized collateral genomic disruptions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116615448A true CN116615448A (zh) 2023-08-18

Family

ID=77897721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180072530.5A Pending CN116615448A (zh) 2020-08-24 2021-08-24 免疫相容性细胞、组织、器官以及用于在最大程度地减少附带基因组破坏的情况下进行针对沉默、人源化和个性化的移植的方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20220053739A1 (zh)
EP (1) EP4199711A1 (zh)
JP (1) JP2023538663A (zh)
CN (1) CN116615448A (zh)
AU (1) AU2021333671A1 (zh)
CA (1) CA3189986A1 (zh)
WO (1) WO2022046824A1 (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2338111T3 (es) 2002-08-21 2010-05-04 Revivicor, Inc. Animales porcinos que carecen de cualquier expresion de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional.
DK3066201T3 (en) 2013-11-07 2018-06-06 Editas Medicine Inc CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES
WO2016154299A1 (en) 2015-03-24 2016-09-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genetic modification of pigs for xenotransplantation
US20190001180A1 (en) 2017-06-29 2019-01-03 Victory Grips Llc Rowing handle
AU2019356014A1 (en) 2018-10-05 2021-05-20 Alexis Bio, Inc. Xenotransplantation products and methods
CA3133638A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Xenotherapeutics, Inc. Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non- human) donor and methods and products relating to same

Also Published As

Publication number Publication date
CA3189986A1 (en) 2022-03-03
US20230323400A1 (en) 2023-10-12
AU2021333671A1 (en) 2023-05-04
WO2022046824A1 (en) 2022-03-03
AU2021333671A9 (en) 2023-07-13
JP2023538663A (ja) 2023-09-08
EP4199711A1 (en) 2023-06-28
US20220053739A1 (en) 2022-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
de Almeida et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives
US11424007B2 (en) Selection and monitoring methods for xenotransplantation
CN113784615A (zh) 用于从人源化的、定制的、无指定病原体的(非人)供体移植的个性化细胞、组织和器官以及与其相关的方法和制品
CN101218341A (zh) Nk细胞抑制作用用于促进定植的mhc-i阴性细胞持续存在的用途
CN113490412B (zh) 异种移植制品和方法
Pabón et al. Impact of human leukocyte antigen molecules E, F, and G on the outcome of transplantation
James et al. HY peptides modulate transplantation responses to skin allografts
US20230078894A1 (en) Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non-human) donor and methods and products relating to same
US20220053739A1 (en) Immunologically compatible cells, tissues, organs, and methods for transplantation for silencing, humanization, and personalization with minimized collateral genomic disruptions
CN103124492A (zh) 使用具有来源于体外培养和扩增的自我更新集落形成细胞的组分的有生命的和无生命的生物反应装置的组合物和方法
Lawrence Human iPS cells for clinical applications and cellular products
JPWO2015125941A1 (ja) 眼疾患治療剤、そのスクリーニング方法または網膜色素上皮細胞移植に伴う拒絶反応の予測方法
WO2022133155A1 (en) Humanization of beta2-microglobulin in porcine genome resulting in functional expression of human βeta2-microglobulin within donor cells, tissues, or organs
Weiss et al. The indirect alloresponse impairs the induction but not maintenance of tolerance to MHC class I-disparate allografts
Fabiosa Expression of ICAM-1, MHC-1 and B7 surface molecules in canine primary appendicular osteosarcoma
WO2022256401A1 (en) Xenogeneic nerve transplants and methods
Heeger What's new and what's hot in transplantation: basic science ATC 2003
Shanmugarajah TOLERANCE OF VASCULARISED COMPOSITE ALLOGRAFTS
Goulmy Session 15: Transplantation: fit for the 21st century

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination