CN113784615A - 用于从人源化的、定制的、无指定病原体的(非人)供体移植的个性化细胞、组织和器官以及与其相关的方法和制品 - Google Patents

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Abstract

一种用于产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库的生物系统，其中所述生物系统具有生物活性和代谢活性，所述生物系统具有用于移植到人接受者中的遗传重新编程的非人动物中的细胞、组织和器官，其中所述非人动物不呈现一个或多个表面聚糖表位，并且来自所述野生型猪的SLA的特定序列被替换成来自人接受者的HLA的基于人捕获参考序列的合成核苷酸。

Description

用于从人源化的、定制的、无指定病原体的(非人)供体移植的 个性化细胞、组织和器官以及与其相关的方法和制品
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月12日提交的美国临时专利申请第62/975611号、2020年1月22日提交的美国临时专利申请第62/964397号、2019年10月4日提交的PCT申请第PCT/US2019/054833号、2019年5月15日提交的美国临时专利申请第62/848272号、2019年3月25日提交的美国临时专利申请第62/823455号的优先权，所有这些专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文。
背景技术
根据器官共享联合网络(United Network for Organ Sharing，“UNOS”)的数据，每十分钟就有一个人被添加到国家移植等候列表中，并且每天有几乎20人死于等待移植。截至2020年3月，美国有约112,385个人需要进行挽救生命的器官移植，其中仅鉴定了约19,000名供体，并且2019年进行了约39,000例移植(来自器官共享联合网络(UNOS)的数据)。美国对特定器官的需求如下：
器官 有需要的候选人
肾 102,730名
肝 12,926名
胰腺 879名
肾/胰腺 1,820名
心脏 3,702名
肺 1,283名
心脏/肺 52名
肠 238名
总计 124,630名
在过去的5年中，从2014年到2019年，每年平均有约6,400名候选人在等候列表上且没有接受器官移植的情况下死亡。约有同样数量的人无法接受期待已久的移植手术，因为他们病得太重而不能接受用于必要手术的移植物。尽管可用供体和接受者未满足的需求之间的分歧率已有些许改善，但是这种差异一直持续到今天并且仍然很大；供应仍然严重不足。当然，有需要的患者正在等待来自人供体的器官，这将代表将器官从一个物种移植到另一个物种(同种异体移植)。
同种异体移植存在许多重要的多方面问题，涉及安全性、后勤、伦理、法律、体制和文化复杂性。从安全性的角度来看，来自人供体的同种异体组织具有重大的感染疾病风险。例如，在移植领域中有一些人报告：“[人]巨细胞病毒(CMV)是影响器官移植接受者的最重要的单一感染因子，其中这些患者中的至少三分之二在移植之后具有CMV感染。”Denner J(2018)Reduction of the survival time of pig xenotransplants by porcinecytomegalovirus.Virology Journal,15(1):171；Rubin RH(1990)Impact ofcytomegalovirus infection on organ transplant recipients.Reviews ofInfectious Diseases,12增刊7:S754-766。
有关组织移植的法规包括供体筛选和不定因子测试的标准，以及管理组织移植物处理和分配的严格法规。已经发生由于同种异体移植引起的病毒传播。外源性逆转录病毒(人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)、人T细胞白血病病毒2型(HTLV-2)和人免疫缺陷病毒(HIV))已在器官和细胞移植过程中由于具有病毒(诸如人巨细胞病毒以及甚至狂犬病)而通过人组织传播。由于围绕器官生存能力和验尸筛选的技术和时间限制，绝对测试受到阻碍，并且这种风险无法消除。
接受者和供体之间的免疫学差异阻止移植物存活延长的时间段，而没有造成他们自身的一系列并发症和额外风险的免疫抑制方案。当患者从(非自身)供体(活着的或死去的)接受器官时，接受者的免疫系统会将移植物识别为异物。这种识别将导致他们的免疫系统动员并“排斥”器官，除非使用抑制免疫系统的自然过程的附随药物。对同种异体皮肤移植物的反应是一种涉及先天性和适应性免疫系统两者的参与的有效免疫反应。Abbas AK,Lichtman AHH,Pillai S(2017)Cellular and Molecular Immunology。
关于免疫抑制剂的使用，免疫抑制药物会延长所移植的移植物在急性和慢性排斥模式中的存活。然而，它们使得患者容易受到甚至最常规的病原体的感染，并且需要终生持续使用，但会使患者暴露于更高的感染风险，甚至是癌症。免疫抑制剂可以减弱自然免疫过程；不幸的是，这些药物通常是器官移植后的终生需求并且会增加接受者对其他常规病原体的易感性。尽管这些药物允许移植接受者耐受外来器官的存在，但它们也增加了与免疫系统受损相关的感染疾病和症状的风险，因为“人同种异体移植物可能会传播大量的生物体。”Fishman JA,Greenwald MA,Grossi PA(2012)Transmission of Infection WithHuman Allografts:Essential Considerations in Donor Screening.ClinicalInfectious Diseases,55(5):720-727。
从逻辑上讲，在成功进行器官捐赠和移植程序之前，必须考虑许多因素。必须评估每个捐赠器官的血型和其他医学因素，但此外，每个器官类型都呈现也必须权衡的独特特征，诸如死后缺血、免疫相容性、患者位置和机构能力。
对于这些患者，以及不包括在这些统计数据中的也将从组织移植物诸如角膜或胰岛细胞中大大受益的数百万人，该领域中的一些人已经证实“同种异体移植将永远不会被证明是足够的来源。”Ekser B,Cooper DKC,Tector AJ(2015)The Need forXenotransplantation as a Source of Organs and Cells for ClinicalTransplantation.International journal of surgery(London,England),23(0 0):199-204。
尽管有此类缺点，器官移植无疑是大多数患有晚期器官衰竭的患者的首选疗法，这在很大程度上是由于缺乏可行的替代方法。然而，器官移植作为一种成功的挽救生命的治疗干预的出现、以及可用于移植的器官的匮乏不幸地使医学专业人员处于必须决定谁存活和谁死去的思想上令人困惑的位置。最终，替代和辅助治疗选择将最大程度地减少同种异体移植材料的严重缺点，同时提供使它们如此有效的相同作用机制，将对全世界的患者带来巨大的益处。
通常对器官和其他移植组织的迫切需要，包括用于在定位和利用更永久的器官或其他组织的同时进行临时治疗，导致对利用来自非人来源(包括其他动物)的器官、细胞和组织进行临时和/或永久异种移植进行了调查。
异种移植(诸如将非人动物器官移植到人接受者中)有可能减少可用于移植的器官短缺，从而潜在地帮助全世界成千上万的人。鉴于猪的大小和生理学与人相容，猪已经被认为是用于人异种移植中潜在的非人器官、组织和/或细胞来源。然而，使用标准的、未经修饰的猪组织异种移植到人或其他灵长类动物中会伴随着移植组织的排斥反应。
野生型猪器官在移植到人体中后将会引起人免疫系统的排斥，其中天然人抗体靶向在猪细胞上的表位，导致所移植的器官、细胞或组织的排斥和衰竭。排斥可以是细胞排斥(淋巴细胞介导的)或体液(抗体介导的)排斥(包括但不限于超急性排斥、急性排斥、慢性排斥)，可能涉及生存限制性血小板减少性凝血病和急性体液异种移植反应(AHXR)。关于猪到人的异种移植的其他障碍包括疾病或寄生虫的跨物种传播的风险。
超急性排斥的原因之一是猪细胞中α-1,3-半乳糖基转移酶(“α-1,3-GT”)的表达，这导致α-1,3-半乳糖表位的合成。除人、猿猴和旧世界猴以外，大多数哺乳动物在其细胞表面均携带含有半乳糖α-1,3-半乳糖的糖蛋白(参见例如，Galili等人,“Man,apes,and oldworld monkeys differ from other mammals in the expression ofα-galactosylepitopes on nucleated cells,”J.Biol.Chem.263:17755-17762(1988)。人、猿猴和旧世界猴均具有天然存在的抗αgal抗体，其被产生并与具有半乳糖(α-1,3半乳糖)的糖蛋白和糖脂结合(参见例如,Cooper等人,“Genetically engineered pigs,”Lancet 342:682-683(1993))。
因此，当在异种移植中使用天然类型的猪制品时，将调用人抗体来对抗外来的α-1,3-半乳糖表位，并且通常跟随而来的是超急性排斥。除α-1,3-GT以外，猪细胞还表达多种在人细胞中没有发现的基因。这些包括但不限于Neu5GC和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)。针对α-Gal、Neu5GC、β1,4-N和Sda样抗原的抗体在异种组织植入之前已存在于人血液中，并参与抗体介导的对植入组织的强烈和立即的排斥。
此外，猪细胞在内皮细胞上表达I类和II类SLA。SLA交叉反应性抗体有助于对植入猪组织的强烈和立即的排斥。SLA抗原也可能参与接受者的T细胞介导的免疫反应。猪SLA可以包括但不限于由SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-4、SLA-5、SLA-6、SLA-8、SLA-9、SLA-11和SLA-12基因座编码的抗原。猪II类SLA包括由SLA-DQ和SLA-DR基因座编码的抗原。
其他人已经进行了许多尝试来修改猪以用作异种移植制品的来源，然而迄今为止此类尝试还没有产生成功的猪模型。此类商业、学术和其他团体专注于干预、基因改变、通过嵌合状态诱导耐受性的努力、包含转基因、同时使用旨在减少接受者的自然免疫反应的外源性免疫抑制药物以及其他方法。这些团体已经试图创造一种“一刀切”的源动物，旨在为所有接受者创造一种标准化的源动物。
具体而言，某些团体专注于创造不含PERV的转基因猪并利用转基因骨髓进行治疗(参见例如，eGenesis,Inc.PCT/US2018/028539)；利用干细胞支架创造转基因猪(参见例如，United Therapeutics/Revivicor[US20190111180A1])；混合嵌合状态和利用转基因骨髓进行治疗以耐受患者T细胞(参见例如，哥伦比亚大学(Columbia University)[US20180070564A1])。这些“下游”方法—被人免疫系统识别后—并没有成功地产生出生产适合于长期用于异种移植中的制品或在上述转基因和其他改变中存活下来的猪。
与上文提及的方法对比，本发明通过修改供体猪细胞的基因组以首先逃避人免疫系统的检测，从而避免当患者的T细胞和抗体准备好破坏外来物质时跟随而来的免疫级联来实现“患者特异性”的解决方案。在一个方面，这种“上游”方法通过使得供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体中时致耐受性而不会牺牲动物免疫功能的最小基因改变的特定组合来实现。因此，本发明解决了将异种移植科学转化为临床现实的长期但未满足的需求。
在一个方面，这种“上游”方法通过使得供体动物的细胞、组织和器官在移植到人体中时致耐受性而不会牺牲动物免疫功能的最小基因改变的特定组合来实现。因此，本发明解决了将异种移植科学转化为临床现实的长期但未满足的需求。
发明内容
在一个方面，本公开包括用于产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库的生物系统，其中所述生物系统具有生物活性和代谢活性，所述生物系统包括用于移植到人接受者中的遗传重新编程的非人动物细胞、组织和器官。例如，所述非人动物是用于异种移植从遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官的遗传重新编程的猪，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组已被重新编程以将在野生型猪的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获参考序列的多个合成核苷酸。在一个方面，所述遗传重新编程的猪的细胞不呈现一个或多个选自α-Gal、Neu5Gc和SDa的表面聚糖表位。此外，编码α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的基因被改变，使得遗传重新编程的猪缺乏由那些基因编码的表面聚糖表位的功能性表达。在一些方面，重新编程的基因组包含以下定点诱变取代：i)野生型猪的SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自人捕获参考序列的HLA-A、HLA-B和HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；ii)野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及iii)野生型猪的SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自人捕获参考序列的HLA-DR和HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代。在一些方面，重新编程的基因组包含A-C中的至少一个：
A)其中所述重新编程的猪核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得在猪的内源性β2微球蛋白基因座处，核基因组已被重新编程以包含编码人接受者的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。此外，在一些方面，重新编程的猪核基因组已经被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达。此外，重新编程不会引入任何移码或框架破坏。
在其他方面，本公开包括制备遗传重新编程的猪的方法，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组缺乏选自α-Gal、Neu5Gc和SDa的表面聚糖表位的功能性表达并且被遗传重新编程以表达人捕获参考序列的人源化表型，所述方法包括：
a.获得猪胎儿成纤维细胞、猪受精卵、猪诱导多能干细胞(IPSC)或猪生殖系细胞；
b.对a)中的所述细胞进行遗传改变以缺乏功能性α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶；
c.使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas对以下的外显子区域中的核苷酸进行定点诱变取代来对b)中的所述细胞进行遗传重新编程：i)所述野生型猪的SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-A、HLA-B和HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及ii)所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及iii)所述野生型猪的SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-DR和HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代，
其中所述野生型猪的基因组的内含子区域没有被重新编程，并且
其中所述重新编程的基因组包含A-C中的至少一个：
A)其中所述重新编程的猪核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪核基因组已经被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达，其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人接受者的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，
其中所述重新编程不引入任何移码或框架破坏，
d.从c)中遗传重新编程的细胞产生胚胎；和
e.将胚胎移植到代孕猪中并且使移植的胚胎在所述代孕猪中生长。
在另一个方面，本公开包括生产用于异种移植的供体猪组织或器官的方法，其中所述供体猪组织或器官的细胞被遗传重新编程成特征在于接受者特异性表面表型，所述方法包括：
a.从预期的人移植接受者获得含有DNA的生物样品；
b.对生物样品进行全基因组测序以获得人捕获参考序列；
c.在基因座(i)-(v)处比较所述人捕获参考序列与所述供体猪的野生型基因组：
(i)编码SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域；
(ii)编码SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域；
(iii)编码SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域；
(iv)一个或多个编码β2微球蛋白(B2M)的外显子；
(v)SLA-MIC-2基因的外显子区域、以及编码PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI中的至少一种的基因，
d.为所述基因座(i)-(v)中的一个或多个创建长度为10至350个碱基对的合成供体猪核苷酸序列，其中所述合成供体猪核苷酸序列在分别与猪基因座(i)-(vi)对应的直系同源基因座(vi)-(x)处与人捕获参考序列具有至少95％同一性：
(vi)编码HLA-A、HLA-B和HLA-C中的至少一种的外显子区域；
(vii)编码HLA-E、HLA-F和HLA-G中的至少一种的外显子区域；
(viii)编码HLA-DR和HLA-DQ中的至少一种的外显子区域；
(ix)一个或多个编码人β2微球蛋白(hB2M)的外显子；
(x)编码来自人捕获参考序列的MIC-A、MIC-B、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI中的至少一种的外显子区域，
e.将(i)-(v)中的核苷酸序列替换成所述合成供体猪核苷酸序列；并且
f.从具有所述合成供体猪核苷酸序列的遗传重新编程的猪获得用于异种移植的猪组织或器官。
在另一个方面，本公开包括筛选在包含本公开的核基因组的遗传重新编程的猪中的脱靶编辑或基因组改变的方法，所述方法包括：
a.在对供体猪核基因组进行遗传重新编程之前，对含有来自所述供体猪的DNA的生物样品进行全基因组测序，从而获得第一全基因组序列；
b.在对所述供体猪核基因组重新编程之后，进行全基因组测序以获得第二全基因组序列；
c.比对所述第一全基因组序列和所述第二全基因组序列以获得序列比对；
d.分析所述序列比对以鉴定在脱靶位点处与所述猪的基因组的任何错配。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪MHC Ia类的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪SLA-3的外显子区域用编码在SLA-3与来自人捕获参考序列的HLA-C之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的HLA-C的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。在一些方面，野生型猪的SLA-1和SLA-2各自包含终止密码子。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪MHC Ib类的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域分别用编码在SLA-6、SLA-7和SLA-8分别与来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪MHC II类的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪SLA-DQ的外显子区域用编码在SLA-DQ与来自人捕获参考序列的HLA-DQ之间不保守的氨基酸的分别来自人捕获参考序列的HLA-DQ的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列，并且其中野生型猪的SLA-DR包含终止密码子。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪β2微球蛋白的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域用编码在野生型猪的β2微球蛋白与来自人捕获参考序列的β2微球蛋白之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的β2微球蛋白的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列，其中所述合成核苷酸序列包含在外显子区域中的至少一个终止密码子使得所述合成核苷酸序列缺乏野生型猪的β2微球蛋白多肽的功能性表达。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪MIC-2的野生型猪内含子区域并且在野生型猪MIC-2的外显子区域用编码在MIC-2与来自人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪CTLA-4的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪CTLA-4的外显子区域用编码在野生型猪的CTLA-4与来自人捕获参考序列的CTLA-4之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的CTLA-4的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪PD-L1的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪PD-L1的外显子区域用编码在野生型猪的PD-L1与来自人捕获参考序列的PD-L1之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的PD-L1的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪EPCR的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪EPCR的外显子区域用编码在野生型猪的EPCR与来自人捕获参考序列的EPCR之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的EPCR的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪TBM的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪TBM的外显子区域用编码在野生型猪的TBM与来自人捕获参考序列的TBM之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的TBM的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。
在另一个方面，本公开包括具有来自野生型猪TFPI的野生型猪内含子区域并且在编码野生型猪TFPI的外显子区域用编码在野生型猪的TFPI与来自人捕获参考序列的TFPI之间不保守的氨基酸的来自人捕获参考序列的TFPI的密码子进行重新编程的合成核苷酸序列。
与上文提及的方法形成对比，本发明通过修饰供体猪细胞的基因组以逃避人免疫系统的检测、从而首先避免当患者的T细胞和抗体准备好破坏外来物质时跟随而来的免疫级联来实现“患者特异性”的解决方案。在一个方面，这种“上游”方法通过对猪基因组进行最少的修饰来实现，所述最少的修饰涉及以下的不同组合：破坏(诸如敲除α1,3-半乳糖基转移酶(αGal)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和/或β1-4N-乙酰半乳糖氨基转移酶，使得供体猪细胞在其细胞表面上不表达此类基因)、调节某些基因(例如CTLA-4和PD-1)的表达、以及将猪基因组的特定部分替换成与基于接受者人捕获序列的合成工程改造部分(例如，在某些SLA序列中将调节猪的例如MHC-I和MHC-II的表达)。因此，本发明解决了将异种移植科学转化为临床现实的长期但未满足的需求。
通过选择性地改变供体的细胞外抗原以增加接受移植的可能性，此类修饰导致减少由“非自我”的识别引起的致病性、免疫差异和相关的有害免疫过程的程度。
在某些方面，本公开集中于(断言)不需要在移植手术后移植接受者普遍和有害地使用外源性免疫抑制药物(或延长的免疫抑制方案)以延长挽救生命的移植物的低免疫原性和/或致耐受性细胞、组织和器官的产生。这种方法与现有和先前的教条方法相反；代替接受在供体与接受者之间存在先天和固定的差异，并因此专注于将干预、基因改变和/或伴随的外源性免疫抑制药物用作减少/消除/消极改变接受者自然产生的免疫反应的方法，转移(如果不是逆转)基础科学教条其他领域的焦点。
在某些其他方面，本公开提供了最少改变的遗传修饰的非转基因猪。例如，在本发明中，包含天然碱基对的出现在供体猪SLA上的某些不同序列被去除并替换成包含相同数量的碱基对但基于接受者的人捕获序列重新编程的合成序列。这种最小的改变将天然猪基因组的其他方面保持在适当的位置，并且不会干扰例如猪基因组中天然存在的内含子和其他密码子。
在某些其他方面，本发明提供了根据本文所提供的过程和方法在指定病原体环境中产生的具有此类和其他修饰的猪。
在某些其他方面，来源于此类猪的用于异种移植的制品是最小程度操作的有活力的活细胞，并且能够与移植接受者形成有机结合，包括但不限于诱导移植接受者中的血管形成和/或胶原产生。
在某些其他方面，以保持此类制品的生存能力和活细胞特征的方式保存(包括但不限于通过冷冻保存)来源于此类源动物的制品。
在某些其他方面，此类制品用于同源用途，即用执行与供体相同的一种或多种基本功能的对应器官、细胞和/或组织修复、重建、替换或补充接受者的器官、细胞和/或组织(例如，将猪皮肤用作人皮肤的移植体，将猪肾用作人肾的移植体，将猪肝用作人肝的移植体，将猪神经用作人神经的移植体，等等)。
在某些其他方面，本发明认为在需要使用或不需要使用抑制或干扰正常免疫功能的免疫抑制剂药物或疗法的情况下进行此类制品在异种移植中的利用。
附图说明
并入本文并构成本公开的一部分的附图帮助说明本发明的各个方面，并且与本说明书一起进一步用于描述本发明以使相关领域的技术人员能够制造和使用本文所公开的方面。在附图中，相同的附图标记指示相同或功能上类似的元件。
图1示出了人滋养层和滋养层细胞的图像。
图2示意性地示出了结合MHC I类和肽的T细胞受体(TCR)。
图3示意性地示出了细胞表面上的HLA I类。
图4示意性地示出了细胞毒性T细胞(CD8+)-靶细胞相互作用。
图5示意性地示出了细胞毒性T细胞(CD4+)-靶细胞相互作用。
图6示意性地示出了HLA基因的共显性表达和HLA基因在人染色体6上的位置。
图7是列出人MHC I类和II类同种型的血清抗原、蛋白质和等位基因的数目的表。
图8示意性地示出了细胞表面上的HLA I类和II类。
图9显示了MHC I类蛋白(A)和II类蛋白(B)的结构。形成肽结合区(PBR)的距质膜最远的两个球状结构域用蓝色阴影表示。包括β2微球蛋白在内的两个Ig样结构域以灰色阴影显示。
图10显示了HLA基因组基因座图。
图11示意性地示出了人MHC I类和II类同种型。
图12显示了HLA I类基因的示意性分子组织。外显子用矩形表示，并且内含子用线表示。
图13显示了HLA II类基因的示意性分子组织。外显子用矩形表示，并且内含子用线表示。
图14显示了用于“人源化”细胞外猪细胞表达的复合遗传改变设计
图15显示了人和猪主要组织相容性复合物(MHC)I类区域的比较基因组组织。人白细胞抗原(HLA)I类图改编自参考文献[17]，并且猪白细胞抗原(SLA)I类图仅基于一种完全测序的单倍型(Hp-1.1，H01)[4]。注意，此处并未显示所有基因并且比例是近似的。所表达的SLA I类基因的数量和位置可能在单倍型之间变化。
图16显示了人和猪主要组织相容性复合物(MHC)II类区域的比较基因组组织。人白细胞抗原(HLA)II类图改编自参考文献[17]，并且猪白细胞抗原(SLA)II类图仅基于一种完全测序的单倍型(H01)[4]。注意，此处并未显示所有基因并且比例是近似的。*所表达的HLA-DRB基因和假基因的数量和位置可能在单倍型之间变化。
图17显示了SLA复合物的物理图谱。黑色框：含有MHC相关序列的基因座。白色框：没有MHC相关序列的基因座。从染色体的长臂到短臂，区域的顺序为II类(II)、III类(III)和I类(I)。
图18显示了SLA基因的示意性分子组织。外显子用灰色椭圆形表示，并且内含子用线表示。基因长度近似于Hp-1.1基因组序列的长度。
图19显示了肽序列的并排基因组分析。
图20显示了SLA-DQA的位置和长度α1(外显子2)和SLA-DQB1的β1(外显子2)。
图21显示了详述SLA-DQA和SLA-DQB1的外显子和内含子的核苷酸序列的电子表格。
图22显示了野猪(sus scrofa/wild boar)的SLA-DQβ1结构域。
图23示出了HLA等位基因的命名法。每个HLA等位基因名称都具有与由冒号分隔的至多四组数字对应的唯一编号。等位基因名称的长度取决于等位基因的序列及其最接近的亲缘的序列。所有等位基因收到至少一个四位数字的名称，其与前两组数字对应，只有在必要时才分配更长的名称。在第一个冒号之前的数字描述类型，其通常对应于由同种异型携带的血清抗原。下一组数字用于列出亚型，数字按DNA序列被确定的顺序分配。其编号在两组数字中不同的等位基因必须在改变所编码蛋白质的氨基酸序列的一个或多个核苷酸取代上有所不同。通过使用第三组数字来区分仅在编码序列内的同义核苷酸取代(也称为沉默或非编码取代)不同的等位基因。通过使用第四组数字来区分仅在内含子或在外显子和内含子侧翼的5'或3'非翻译区中的序列多态性不同的等位基因。
图24显示了HLA-DQA中外显子和内含子的长度
图25A显示了在接受者特异性HLA-DQA与从数据库获取的HLA-DQA之间的核苷酸序列文库，图25B显示了鉴定在HLA与SLA(DQ-A，外显子2)之间的完全差异的核苷酸序列文库，图25C显示了三名患者的DQ-A1的人捕获参考序列，图25D显示了三名患者的DQ-B1的人捕获参考序列，图25E显示了三名患者的DR-A的人捕获参考序列，图25F显示了三名患者的DQR-B1的人捕获参考序列。
图26A显示了三名患者的人捕获参考序列(DQ-A1)的实例。图26B显示了三名患者的人捕获参考序列(DQ-B1)的实例，图26C显示了三名患者的人捕获参考序列(DR-A)的实例，图26D显示了三名患者的人捕获参考序列(DR-B1)的实例。
图27显示了野生型人β2微球蛋白和人B2M基因和猪B2M基因的示意性分子组织。
图28显示了人B2M的外显子2与猪B2M的外显子2的氨基酸序列的比较
图29显示了猪肺泡巨噬细胞(PAM)的表型分析。将细胞在单独的培养基(对照)中培养，或用100ng/mL IFN-γ激活72小时或用加载的30μg/mL KLH激活24小时。对细胞进行SLA-DQ染色，并且使用抗小鼠APC缀合的多克隆IgG二抗检测标志物。数据表示为计数(y轴)与荧光强度的对数刻度(x轴)的直方图。激活细胞的SLA-DQ阳性和阴性细胞百分比显示在直方图上。
图30显示了BrdU ELISA的SI值。在孵育7天之后，三种人CD4+T细胞(A)和PBMC(B)对未经处理的和IFN-y激活的PAM细胞(15K)的增殖反应。
图31显示了根据本公开的人源化猪细胞的示意性描绘
图32显示了其中用增加数量的来自四倍敲除猪10261或野生型猪的经辐照(30Gy)猪的PBMC来刺激1×105个纯化的人CD8+T细胞(A)或人PBMC(B)的图。在5d+16h小时之后通过3H-胸苷掺入来测量增殖。数据代表在单次实验中用来自一名人献血者的细胞获得的一式三份培养物的平均cpm±SEM。使用来自第二名献血者的应答细胞和来自四倍敲除猪10262的刺激细胞观察到类似的应答模式。在用四倍敲除猪的PBMC刺激之后，人CD8+T细胞的增殖减少。(Fischer等人,2019)
图33显示了根据本公开的人源化猪细胞的示意性描绘。
图34显示了使用WT 128-11和Gal T-KO B-174PBMC在3个不同的日期运行的人血浆供体的增殖的图
图35显示了与未转染的13 271细胞的裂解相比两名供体(上图：KH；下图：MS)对用HLA-E/A2(左列)和HLA-E/B7(右列)转染的13 271细胞的NK细胞毒性。结果被描绘为特异性裂解的百分比，并且是在四种不同的E:T比率下获得的。数据代表三次独立的实验。空心三角形代表HLA-E转染的13 271细胞，实心菱形代表未转染的13 271细胞。(Forte等人,2005)
图36显示了每个血浆浓度(稀释)的细胞毒性％的图，并且将结果在Prism中绘图。根据细胞毒性曲线，确定了50％杀伤(IC50)的所需稀释度。
图37示出了根据本发明的源动物设施和对应的无指定病原体的设施、动物和畜群。
图38示出了根据本发明的体外肝过滤器和回路。
图39示出了根据本发明的组合皮肤制品。
图40A描绘了POD-15。H&E，H&E高倍图像描绘了具有表面和滤泡上皮坏死的组织生存能力。图40B描绘了展示具有良好总体生存能力的残留自体移植物(星号)的POD-22H&E高倍图像。观察到没有表面上皮坏死和一些表面坏死，以及广泛的纤维化和渗入自体移植物中(箭头)。
图41描绘了在非人灵长类动物接受者中用作治疗全层厚度伤口缺损的临时伤口闭合的猪分层厚度皮肤移植物的纵向进展。左：POD-0，在伤口部位2处的异种移植制品。右：POD-30，在伤口部位2处的相同异种移植制品。
图42显示了以下的POD-30组织学图像：顶部、中心：H&E，伤口部位的低倍图像描绘了完整的上皮覆盖。虚线圈住的是残留的异种移植制品。
图43A绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgMELISA(μg/mL)。图43B绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgG ELISA(μg/mL)。
图44A绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的可溶性CD40L的全身浓度。图44B绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的TGF-α的全身浓度。图44C绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的IL-12/23(p40)的全身浓度。
图45示出了制备根据本发明的皮肤制品的方法。
图46显示了用于储存异种移植制品的冷冻小瓶。
图47显示了异种移植制品的运输过程。
图48显示了用于在低于环境温度的温度(包括但不限于-150摄氏度和其他温度)下储存异种移植制品的辅助封闭或容器系统。
图49A描绘了在POD-12下从左到右分别在伤口部位1、2、3和4处的猪分层厚度(split-thickness)皮肤移植物。图49B描绘了在POD-12(左)和POD-14(右)下在伤口部位4处的猪分层厚度皮肤移植物。
图50A绘制了在新鲜与冷冻保存(7年)的猪组织样品中的MTT还原测定，显示出无统计学差异。图50B绘制了在热失活与冷冻保存(7年)的猪组织样品中的MTT还原测定，显示出所产生的甲臜的量具有统计学显著差异。
图51A-G显示了用于治疗人患者的严重且广泛的部分厚度和全层厚度烧伤的本公开的异种移植制品的图像。
图52显示了在丝裂霉素C处理的猪刺激细胞的存在下人淋巴细胞应答外周血单核细胞(PBMC)的增殖应答的图。
图53显示了相对于Xeno-001-00-1患者样品在多个时间点(之前、第7天、第16天和第30天)的中值荧光强度(MFI)的抗异种IgM(A)和IgG(B)抗体结合数据。显示了以1:2稀释度测试的血浆样品的数据。
具体实施方式
尽管本公开的主题的方面可以以各种形式体现，但是以下描述仅旨在公开这些形式中的一些作为本公开所涵盖的主题的特定实例。因此，本公开的主题并非旨在限于所描述的形式和方面。
除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明领域内的普通技术人员对于该发明所属的通常理解的意义相同的意义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和示例仅是说明性的而不是旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均以全文引用的方式并入。本发明的其它特征和优势将根据以下详细描述和附图以及根据权利要求而显而易知。
“最好比对”或“最佳比对”意指如下文所述确定的同一性百分比最高的比对。两个核酸序列之间的序列比较传统上是通过在最佳比对之后比较这些序列来进行的，所述比较通过区段或通过“比较窗口”进行以鉴定和比较相似序列的局部区域。为了进行比较，可以手动地或通过使用比对软件对序列进行最佳比对，所述比对软件例如Smith和Waterman局部同源算法(1981)、Neddleman和Wunsch局部同源算法(1970)、Pearson和Lipman相似性搜索方法(1988)和使用这些算法的计算机软件(威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA和TFASTA)。在一些方面，最佳比对是使用BLAST程序与BLOSUM 62矩阵或具有类似功能性的软件获得的。两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”是通过比较这两个最佳比对序列来确定的，待比较的核酸或氨基酸序列可能包括从参考序列的添加或缺失，以进行在这两个序列之间的最佳比对。通过确定在两个序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的位置数量，通过将该相同位置数量除以所比较位置的总数并将所获得的结果乘以100得到这两个序列之间的同一性百分比来计算同一性百分比。
如本文所用，“保守”及其语法等同物包括保守氨基酸取代，包括氨基酸残基被具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代。保守氨基酸取代可以通过修饰核苷酸序列以便引入将编码保守取代的核苷酸变化来实现。一般而言，保守氨基酸取代将不会显著改变蛋白质的感兴趣的功能特性，例如，MHC I呈递感兴趣的肽的能力。具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括脂肪族侧链，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族羟基侧链，诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺的侧链，诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链，诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，诸如天冬氨酸和谷氨酸；以及，含硫的侧链，诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。本领域技术人员将会理解，除了编码本文所述的人或人源化MHC I多肽和/或β2微球蛋白的核酸残基之外，由于遗传密码的简并性，其他核酸序列也可能编码本发明的多肽。因此，除了在其基因组中包含编码具有保守氨基酸取代的MHC I和/或β2微球蛋白多肽的核苷酸序列的经遗传修饰的非人动物之外，还提供了其基因组包含由于遗传密码的简并性而与本文所述的不同的核苷酸序列的非人动物。
如本文所用，“保守的”及其语法等同物包括分别在多核苷酸序列或氨基酸序列上的核苷酸或氨基酸残基，它们是在被比较的两个或更多个相关序列的相同位置上未发生改变的那些核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是在比序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的那些核苷酸或氨基酸。在本文中，如果两个或更多个序列彼此具有100％同一性，则称它们为“完全保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性但小于100％同一性，则称它们为“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少30％同一性、至少40％同一性、至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性但小于100％同一性，则被它们为“保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有约30％同一性、约40％同一性、约50％同一性、约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约98％同一性、或约99％同一性，则称它们为“保守的”。
如本文所用“无指定病原体”及其语法等同物包括指代动物、动物畜群、从其衍生的动物制品和/或不含一种或多种指定病原体的动物设施。优选地，使用此类指定病原体的定义明确的例行测试，利用确保不存在和/或破坏此类指定病原体的适当标准操作程序(SOP)和畜群畜牧和兽医护理的实践(包括本文所公开和描述的例程、测试、程序、畜牧和兽医护理)来维持此类“无指定病原体”的动物、动物畜群、来源于其的动物制品和/或动物设施。将进一步理解的是，如本文所用，术语“不含”和类似术语当与“无病原体”结合使用时，意在表示主题病原体不存在、不是活的、无活性或以其他方式无法通过主题病原体的标准或其他测试方法检测到。
如本文所用，“改变”(alter/altering/altered)和语法等同物包括对基因的任何和/或所有修饰，包括但不限于缺失、插入、沉默、修饰、重新编程、破坏、突变、重排、增加表达、敲入、敲除、和/或任何或所有其他此类修饰或其任何组合。
如本文所用，“内源基因座”及其语法等同物包括在待转化到供体动物中的动物中发现的天然基因座。
如本文所用，“功能性”(例如，在提及功能性多肽时)及其语法等同物包括保留至少一种通常与天然蛋白质相关的生物活性的多肽。例如，在本发明的一些实施方案中，在内源性基因座处的替换(例如，内源性非人MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白基因座处的替换)导致基因座不能表达功能性内源性多肽。同样，如本文所用的关于蛋白质的功能性细胞外结构域的术语“功能性”可以是指保留其功能性的细胞外结构域，例如，在MHC I的情况下，结合抗原的能力、结合T细胞共受体的能力等。在本发明的一些实施方案中，在内源性MHC基因座处的替换导致基因座不能表达内源性MHC的细胞外结构域(例如，功能性细胞外结构域)同时表达人MHC的细胞外结构域(例如，功能性细胞外结构域)。
如本文所用的“遗传或分子标记”及其语法等同物包括多态性基因座，即在特定基因座处的多态性核苷酸(所谓的单核苷酸多态性或SNP)或多态性DNA序列。标记是指在基因组中具有固定位置的可测量的遗传特征，其通常以孟德尔方式遗传并且其可以用于将感兴趣的性状绘图。因此，遗传标记可以是短DNA序列(诸如围绕单个碱基对变化的序列，即单核苷酸多态性或SNP)、或长DNA序列(诸如微卫星或简单序列重复(SSR))。标记的性质取决于所使用的分子分析，并且可以在DNA、RNA或蛋白质水平上进行检测。可以使用分子标记进行遗传作图，例如但不限于RFLP(限制性片段长度多态性；Botstein等人(1980),Am J HumGenet.32:314-331；Tanksley等人(1989),Bio/Technology 7:257-263)、RAPD[随机扩增多态性DNA；Williams等人(1990),NAR 18:6531-6535]、AFLP[扩增片段长度多态性；Vos等人(1995)NAR 23:4407-4414]、SSR或微卫星[Tautz等人(1989),NAR 17:6463-6471]。适当的引物或探针由所使用的作图方法决定。
如本文所用的“改善”及其语法等同物包括由本领域技术人员认可的任何改善。例如，改善移植可能意味着减轻超急性排斥反应，这可能涵盖不希望的作用或症状的减少、减轻或减弱。在一些方面，实现了临床相关的改善。
如本文所用，“基因座(Locus)”(复数(loci))或“位点”以及它们的语法等同物包括染色体上例如在其中发现基因、遗传标记或QTL的一个或多个特定位置。
如本文所用的“最小改变”及其语法等同物包括供体动物基因组的改变，包括去除和替换出现在供体动物基因组上的天然碱基对的某些不同序列并且将每个这样的序列替换成包含相同数量的碱基对的合成序列，其中对供体动物基因组中的碱基对的数量没有净变化，同时不会干扰供体动物天然基因组的其他方面，包括例如内含子和天然存在于供体动物基因组中的其他密码子。例如，在猪作为供体动物的情况下，最小改变的猪可以包括特定改变，所述特定改变去除或失活某些SLA外显子以调节供体猪细胞的MHC II类、Ia类和/或Ib类的细胞外表达或不表达；重新编程某些天然的、自然存在的猪细胞SLA外显子以调节猪细胞的MHC II类的细胞外表达或不表达；保留或以其他方式不去除存在于其他工程改造序列之中或附近的猪内含子；增加猪CTLA4和PD-1的表达；以及去除或失活α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶。
如本文所用，“最小程度地操作”及其语法等同物包括对源动物、从那些源动物来源的生物制品以及对相关细胞、器官或组织进行最小程度物理改变的其他生物制品进行处理使得此类动物和制品基本上处于它们的自然状态。
如本文所用的“直系同源物”、“直系同源的”及其语法等同物包括来自一个物种的多核苷酸对应于另一个物种的多核苷酸，其具有与基因或蛋白质或QTL相同的功能，但(通常)在序列上从具有基因或数量性状基因座的物种发生分歧时的时间点开始分歧(即基因或数量性状基因座通过物种形成从共同祖先进化而来)。
如本文所用，“数量性状基因座(QTL)”及其语法等同物包括与是所讨论性状的基础的基因密切相关的DNA延伸段(诸如染色体臂、染色体区域、核苷酸序列、基因等)。“QTL作图”涉及使用遗传或分子标记(如AFLP、RAPD、RFLP、SNP、SSR等)、可见的多态性和同工酶创建基因组图谱，并且确定在基因组上的特定区域与感兴趣的性状的遗传的关联程度。由于标记不一定涉及基因，所以QTL定位结果涉及DNA延伸段与性状的关联程度，而不是直接指向负责该性状的基因。使用不同的统计方法来确定关联程度是否显著。如果标记和基因或基因座在遗传中的关联比将从独立分类预期的更大，即标记和基因座在分离群体中共同分离并且位于同一条染色体上，则称分子标记与基因或基因座“连锁”。“连锁”是指标记与基因座或基因(或两个基因座或两个标记彼此)的遗传距离。连锁越近，发生重组事件的可能性就越小，这将标记与基因或基因座分开。遗传距离(图谱距离)是根据重组频率计算的，并且以厘摩根(cM)表示[Kosambi(1944),Ann.Eugenet.12:172-175]。
如本文所用，“捕获序列”或“参考序列”及其语法等同物包括已从样品、动物(包括人)或群体中获得、测序或以其他方式获知的核酸或氨基酸序列。例如，来自人患者的捕获序列是“人患者捕获序列”。来自特定人群的捕获序列是“人群特异的人捕获序列”。并且来自人等位基因组的捕获序列是“等位基因组特异的人捕获序列”。
如本文所用，“人源化”及其语法等同物包括其中内源性非人基因或等位基因的全部或一部分被直系同源的人基因或等位基因的对应部分替换的实施方案。例如，在一些实施方案中，术语“人源化”是指将内源性非人MHC基因或其等位基因或片段的编码区(例如，外显子)完全替换成人MHC基因或其等位基因或片段的对应捕获序列，然而非人动物的内源性非编码区(诸如但不限于启动子、5'和/或3'非翻译区、增强子元件等)不被替换。
如本文所用，“个性化”或“个体化”及其语法等同物包括适合于个体人接受者或特定人接受者亚群的需要或特殊情况的来自非人动物的基因、等位基因、基因组、蛋白质组、细胞、细胞表面、组织或器官。
如本文所用，“重新编程”、“重新编程的”(包括提及“免疫基因组学重新编程”)及其语法等同物是指用基于单独参考序列的直系同源核苷酸替换或取代供体动物中的内源性核苷酸，其中这种重新编程不会引入移码突变。此外，重新编程不会导致供体动物基因组中核苷酸总数的净损失或净增加，或者导致供体动物基因组中核苷酸总数的净损失或净增加等于在单独参考序列中的核苷酸数的不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过6％、不超过7％、不超过8％、不超过9％、不超过10％、不超过12％、不超过15％或不超过20％。在“重新编程”的一个实例中，内源性非人核苷酸、密码子、基因或其片段被基于人捕获序列的对应合成核苷酸、密码子、基因或其片段替换，通过该替换在供体动物序列中的碱基对总数等于人捕获序列的碱基对总数。
如本文所用，“致耐受性”及其语法等同物包括在移植时通过接受者免疫系统的反应降低所耐受的器官、细胞、组织或其他生物制品的特征。
如本文所用，“转基因”及其语法等同物包括供体动物基因组，所述供体动物基因组已经被修饰以将来自不同物种的非天然基因在非直系同源、非内源的位置引入供体动物基因组中，使得同源的、内源形式的基因(如果有)的全部或部分得以保留。如本文所用，“转基因”、“转基因的”以及语法等同物不包括如本文所述和要求保护的重新编程的基因组、敲除或其他修饰。举例来说，“转基因的”猪包括通过在猪基因组中的非直系同源、非内源位置插入人基因序列而不替换那些基因的内源形式来实现的、具有或表达hCD46(“人膜辅因子蛋白”或“MCP”)、hCD55(“人衰变加速因子”、“DAF”)、人B2M(β2微球蛋白)和/或其他人基因的那些猪。
免疫基因组学重新编程的猪
如本文所公开，提供了针对若干种人I类和/或II类MHC分子的致耐受性非人动物细胞、组织和器官。
人免疫反应系统是一种抵御入侵的生物体的高度复杂且有效的防御系统。T细胞是参与细胞反应的主要效应细胞。正如抗体已被开发为治疗药物一样，赋予T细胞特异性的在T细胞表面上的受体(TCR)作为开发治疗药物的平台具有独特的优势。虽然抗体仅限于识别在血液和细胞外空间中的病原体或在细胞表面上的蛋白质靶标，但TCR识别在细胞表面上由MHC分子所展示的抗原(包括源自细胞内蛋白质的抗原)。取决于识别所展示的抗原并变得被激活的T细胞的亚型，TCR和具有TCR的T细胞参与控制各种免疫反应。例如，辅助T细胞通过诱导B细胞分化为抗体分泌细胞来参与体液免疫反应的调节。此外，激活的辅助T细胞通过细胞毒性T细胞启动细胞介导的免疫反应。因此，TCR特异性地识别抗体通常看不到的靶标，并且也触发携带它们的T细胞以启动各种免疫反应。
应当理解，T细胞借助于在其细胞表面上表达的TCR识别在细胞表面上呈递的抗原。TCR是二硫键连接的异源二聚体，大部分由α和β链糖蛋白组成。T细胞使用重组机制在其受体分子中产生多样性，类似于产生在B细胞中发挥作用的抗体多样性的那些机制(Janeway和Travers,Immunobiology 1997)。与免疫球蛋白基因类似，TCR基因由在T细胞发育期间重新排列的区段构成。TCR多肽由可变区、恒定区、跨膜区和胞质区组成。虽然跨膜区锚定蛋白质，并且细胞内区域在受体被占据时参与信号传导，但是可变区负责抗原的特异性识别并且恒定区支持可变区结合表面。TCRα链仅包含由可变(V)和连接(J)区段编码的可变区，而β链包含另外的多样性(D)区段。
主要组织相容性复合物I类(MHCI)和II类(MHCII)分子在抗原呈递细胞表面上展示肽，用于随后的T细胞识别。参见图2。在人群体中，经典MHCI和II基因产物之间的等位基因变异是差异肽结合、胸腺库偏倚和同种异体移植物排斥的基础。MHC分子是对适应性免疫过程至关重要的细胞表面糖蛋白，发挥在抗原呈递细胞(APC)的表面上捕获和展示肽的功能。MHC I类(MHCI)分子在大多数细胞上表达，结合大小范围为8至10个氨基酸残基的内源性衍生的肽，并且被CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别。参见图3和图4。在另一方面，MHC II类(MHCII)仅存在于专职APC上，结合大小从9至22个残基变化的外源性来源的肽，并被CD4辅助T细胞识别。参见图5。这些差异表明，MHCI和MHCII分子接合T细胞介导的免疫反应的两个不同的分支，前者靶向侵入性病原体诸如通过CD8 CTL破坏的病毒，而后者诱导基于细胞因子的炎症介质来刺激CD4辅助T细胞活性，包括B细胞激活、成熟和抗体产生。在一些方面，本公开的生物制品未被CD8+T细胞识别，不结合抗HLA抗体，并且对NK介导的裂解具有抗性。
人白细胞抗原(HLA)系统或复合物是编码人体中的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。这些细胞表面蛋白负责调节人体中的免疫系统。HLA基因复合物位于染色体6p21内的3Mbp延伸段上。参见图6。HLA基因高度多态，这意味着它们具有许多不同的等位基因，从而允许它们微调适应性免疫系统。参见图7。由某些基因编码的蛋白质也被称为抗原，这是由于其作为器官移植中的因子的历史发现。不同的类别具有不同的功能。参见图8和图9。
所述HLA区段被分成三个区域(从着丝粒到端粒)：II类、III类和I类。参见图10。经典的I类和II类HLA基因分别包含在I类和II类区域中，而III类基因座带有编码参与免疫系统但与MHC分子在结构上不相关的蛋白质的基因。经典的HLA I类分子具有三种类型：HLA-A、HLA-B和HLA-C。这些成熟的HLA I类分子中只有α链由各自的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因在I类HLA基因座内编码。参见图11。相比之下，由β2m基因编码的β2微球蛋白β2m链位于染色体15上。经典的HLA II类分子也具有三种类型(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)，其中每个分子的α和β链均由一对相邻的基因座编码。除了这些经典的HLA I类和HLA II类基因之外，人MHC基因座还包括许多HLA假基因以及编码非经典MHCI和MHCII分子的基因。HLA假基因表明基因复制是HLA进化的主要驱动力，然而非经典的MHCI和MHCII分子通常在免疫系统内发挥有限的功能，这与抗原呈递至αβTCR的功能截然不同。
除了编码抗原呈递蛋白的基因外，位于HLA复合物上的还有大量的其他基因，其中许多参与免疫功能。人群体中HLA的多样性是疾病防御的一个方面，并且因此，两个不相关个体在所有基因座上具有相同HLA分子的机会极低。HLA基因在历史上已被鉴定为能够在HLA相似个体之间成功移植器官的能力的结果。
I类MHC分子在所有有核细胞(包括肿瘤细胞)上表达。它们在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞等细胞上特异性地表达，并且起到将表面上的肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)展示给CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。CTL专门用于杀死任何带有由其自身的膜结合TCR识别的MHC I结合肽的细胞。当细胞展示来源于通常不存在的细胞蛋白的肽(例如，病毒、肿瘤或其他非自身来源的)时，此类肽被CTL识别，CTL变得被激活并杀死展示所述肽的细胞。
如图12所示，MHC I类蛋白包含细胞外结构域(其包括三个结构域：α1、α2和α3)、跨膜结构域和胞质尾。α1和α2结构域形成肽结合裂缝，而α3与β2微球蛋白相互作用。I类分子由两条链组成：一条多态的α链(有时称为重链)和一条通常不是多态的、称为β2微球蛋白的较小链(也称为轻链)。这两条链在细胞表面上形成非共价异源二聚体。α链包含三个结构域(α1、α2和α3)。如图12所示，α链基因的外显子1编码前导序列，外显子2和3编码α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜结构域，并且外显子6和7编码胞质尾。α链形成一个肽结合裂缝，包括α1和α2结构域(其类似于Ig样结构域)，随后是类似于β2微球蛋白的α3结构域。
β2微球蛋白是一种非糖基化的12kDa蛋白质；其功能之一是稳定MHC I类α链。与α链不同，β2微球蛋白不跨越膜。人β2微球蛋白基因座位于15号染色体上，并且由4个外显子和3个内含子组成。β2微球蛋白的循环形式存在于血清、尿液和其他体液中；非共价MHC I缔合的β2微球蛋白可以在生理条件下与循环的β2微球蛋白进行交换。
如图13所示，MHC II类蛋白包含细胞外结构域(其包括三个结构域：α1、α2、β1、和β1)、跨膜结构域和胞质尾。α1和β1结构域形成肽结合裂缝，而α1和β1与跨膜结构域相互作用。
除了上述抗原之外，I类抗原还包括其他抗原，称为非经典I类抗原，特别是抗原HLA-E、HLA-F和HLA-G；后者尤其由正常人胎盘的绒毛外滋养层表达，除了HLA-C外。
细胞表型
一般地参考图1，Peter Medawar博士深刻地说：“人怀孕的成功，其中胎儿在母体子宫内舒适地居住9个月，无视免疫学的规则。”换句话说，他观察到地球上最常见、最成功的移植是怀孕。
细胞表面标志物的滋养层表达被很好地表征，并且通过在猪细胞中在适当和必要的情况下复制这种表型来保留，可以获得关键和期望的细胞功能。根据文献，绒毛外滋养层细胞表达HLA Ia类分子(HLA-C)和所有HLA Ib类分子。与HLA-E和HLA-G在绒毛外滋养层细胞上高度表达相比，HLA-C和HLA-F表达较弱。参见例如，Djurisic等人“HLA Class IbMolecules and Immune Cells in Pregnancy and Preeclampsia,”Frontiers inImmunology,第5卷,论文652(2014)。除了MHC分子之外，PD-L1在正常妊娠的滋养层细胞中(尤其是在合胞体滋养层细胞中)被上调。HLA II类分子不存在于滋养层上，这可能有助于在母体淋巴细胞的存在下胚胎的存活和检测。参见例如，Veras等人,“PD-L1 Expressionin Human Placentas and gestational Trophoblastic Diseases,”Int.J.Gynecol.Pathol.36(2):146-153(2017)。
本发明提供了产生模拟人滋养层的细胞外构型的致耐受性异种移植猪细胞的方法。该方法包括但不限于去除或失活某些SLA外显子以调节猪细胞的MHC II类、Ia类和/或Ib类的细胞外表达或不表达；重新编程某些自然的、天然存在的猪细胞SLA外显子以调节猪细胞的MHC II类的细胞外表达或不表达；保留或以其他方式不去除存在于其他工程改造序列之中或附近的猪内含子；增加猪CTLA4和PD-1的表达；并且去除或失活α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶。引起猪基因组的这种表达增加和其他工程改造方面、产生模拟人滋养层的细胞外构型的致耐受性异种移植猪细胞的这种去除、重新编程和修饰描述如下。
以前和现在对这种未满足的临床需求的尝试正是遵循了“一刀切”的经典医学教条。我们将此称为“下游”方法—其必须与按顺序解决所有自然免疫过程相抗衡。代替采用这种受限的观点，本发明采用“患者特定”的解决方案来显著改善临床结果度量。后者是我们的方法，我们称为“上游”方法—代表使未完成的科学工作以协调的转化医学工作结束的一种方法。我们方法的中心定理与现有和以前的教条方法相反。“下游”方法接受供体与接受者之间固有的和不可改变的差异，并专注于将干预、基因改变和/或伴随的外源性免疫抑制药物用作减少/消除/消极改变接受者自然产生的免疫反应的方法。相比之下，我们有意地选择逆转基础科学教条的其他领域的重点。代替接受在供体和接受者之间的免疫学不相容，特别是(但不限于)一种或多种主要组织相容性复合物的那些不匹配，我们在来源处改变这些催化抗原，从而消除了所有作为在供体和接受者之间的细胞、组织和器官排斥的成因效应因子的沉淀机制。这种方法适用于异种移植领域之外，包括但不限于遗传学、产科学、感染性疾病、肿瘤学、农业、畜牧业、食品工业和其他领域。
本公开在创建用于异种移植的非转基因遗传重新编程的猪中体现了上述修饰，其中所述猪的MHC表面特征模拟接受者滋养层的MHC表面特征，其中来自异种移植的免疫反应显著降低。人绒毛外滋养层细胞表达HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G，但不表达HLA-A、HLA-B、HLA-DQ和HLA-DR。因此，当前的实施方案将人滋养层的独特MHC表面特征与定点诱变取代组合，以最小化或去除与异种移植相关的免疫反应，同时最小化对天然供体猪的SLA/MHC基因的脱靶效应。
人免疫反应系统是一种抵御入侵的生物体的高度复杂且有效的防御系统。T细胞是参与细胞反应的主要效应细胞。正如抗体已被开发为治疗药物一样，赋予T细胞特异性的在T细胞表面上的受体(TCR)作为开发治疗药物的平台具有独特的优势。虽然抗体仅限于识别在血液和细胞外空间中的病原体或在细胞表面上的蛋白质靶标，但TCR识别在细胞表面上由MHC分子所展示的抗原(包括源自细胞内蛋白质的抗原)。取决于识别所展示的抗原并变得被激活的T细胞的亚型，TCR和具有TCR的T细胞参与控制各种免疫反应。例如，辅助T细胞通过诱导B细胞分化为抗体分泌细胞来参与体液免疫反应的调节。此外，激活的辅助T细胞通过细胞毒性T细胞启动细胞介导的免疫反应。因此，TCR特异性地识别抗体通常看不到的靶标，并且也触发携带它们的T细胞以启动各种免疫反应。
如图2所示，T细胞借助于在其细胞表面上表达的TCR识别在细胞表面上呈递的抗原。TCR是二硫键连接的异源二聚体，大部分由α和β链糖蛋白组成。T细胞使用重组机制在其受体分子中产生多样性，类似于产生在B细胞中发挥作用的抗体多样性的那些机制(Janeway和Travers,Immunobiology 1997)。与免疫球蛋白基因类似，TCR基因由在T细胞发育期间重新排列的区段构成。TCR多肽由可变区、恒定区、跨膜区和胞质区组成。虽然跨膜区锚定蛋白质，并且细胞内区域在受体被占据时参与信号传导，但是可变区负责抗原的特异性识别并且恒定区支持可变区结合表面。TCRα链仅包含由可变(V)和连接(J)区段编码的可变区，而β链包含另外的多样性(D)区段。
在自身主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下，TCR识别在抗原呈递细胞表面上呈递的肽抗原。由TCR识别的两种不同类型的MHC分子参与抗原呈递，即I类MHC和II类MHC分子。成熟的T细胞亚群由它们表达的共同受体分子定义。这些共同受体与TCR共同作用于MHC抗原复合物的识别和T细胞的激活。成熟的辅助T细胞在MHC II类分子的背景下识别抗原，并且通过具有共同受体CD4来区分。细胞毒性T细胞在MHC I类决定簇的背景下识别抗原，并且通过具有CD8共同受体来区分。
在人中，MHC分子被称为HLA(人白细胞抗原的首字母缩写)，并且由位于染色体6p21.3-上的HLA区域编码。8,9所述HLA区段被分成三个区域(从着丝粒到端粒)：II类、III类和I类。参见图10。经典的I类和II类HLA基因分别包含在I类和II类区域中，而III类基因座带有编码参与免疫系统但与MHC分子在结构上不相关的蛋白质的基因。经典的HLA I类分子具有三种类型：HLA-A、HLA-B和HLA-C。这些成熟的HLA I类分子中只有α链由各自的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因在I类HLA基因座内编码。参见图11。相比之下，由β2m基因编码的β2微球蛋白β2m链位于染色体15上。经典的HLA II类分子也具有三种类型(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)，其中每个分子的α和β链均由一对相邻的基因座编码。除了这些经典的HLA I类和HLA II类基因之外，人MHC基因座还包括许多HLA假基因以及编码非经典MHCI和MHCII分子的基因。HLA假基因表明基因复制是HLA进化的主要驱动力，然而非经典的MHCI和MHCII分子通常在免疫系统内发挥有限的功能，这与抗原呈递至αβTCR的功能截然不同。
人白细胞抗原(HLA)基因在人群体中显示出难以置信的序列多样性。例如，仅HLA-B基因就有>4,000个已知的等位基因。据信，HLA基因中的遗传多样性(其中不同等位基因具有呈递不同抗原的不同效率)是进化赋予针对人所暴露的各种不同病原体的更好的群体水平抗性的结果。这种遗传多样性在异种移植期间也呈现出问题，其中接受者的免疫反应是决定植入结果和移植后存活的最重要因素。
在人中，经典的I类基因(称为HLA-A、HLA-B和HLA-C)由两条链组成：一条多态的α链(有时称为重链)和一条通常不是多态的、称为β2微球蛋白的较小链(也称为轻链)。这两条链在细胞表面上形成非共价异源二聚体。如图12所示，α链包含三个结构域(α1、α2和α3)。α链基因的外显子1编码前导序列，外显子2和3编码α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜结构域，并且外显子6和7编码胞质尾。α链形成一个肽结合裂缝，包括α1和α2结构域(其类似于Ig样结构域)，随后是类似于β2微球蛋白的α3结构域。
β2微球蛋白是一种非糖基化的12kDa蛋白质；其功能之一是稳定MHC I类α链。与α链不同，β2微球蛋白不跨越膜。人β2微球蛋白基因座位于15号染色体上，并且由4个外显子和3个内含子组成。β2微球蛋白结合蛋白复合物在各种免疫系统途径中发挥关键作用，所述各种免疫系统途径包括新生儿Fc受体(FcRn)、分化簇1(CD1)蛋白、非经典的主要组织相容性复合物(MHC)和熟知的MHC I类分子。
I类MHC分子在所有有核细胞(包括肿瘤细胞)上表达。它们在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞等细胞上特异性地表达，并且起到将表面上的肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)展示给CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。CTL专门用于杀死任何带有由其自身的膜结合TCR识别的MHC I结合肽的细胞。当细胞展示来源于通常不存在的细胞蛋白的肽(例如，病毒、肿瘤或其他非自身来源的)时，此类肽被CTL识别，CTL变得被激活并杀死展示所述肽的细胞。
MHC基因座在基因组中表现出最高的多态性。所有I类和II类MHC基因都可以呈递肽片段，但每个基因表达具有不同的结合特征的蛋白质，反映了多态性和等位基因变体。任何给定的个体都具有可以在免疫反应的过程中在细胞表面上呈递给B和T细胞的一系列独特的肽片段。
除了上述抗原之外，I类抗原还包括其他抗原，称为非经典I类抗原，特别是抗原HLA-E、HLA-F和HLA-G；后者尤其由正常人胎盘的绒毛外滋养层表达，除了HLA-C外。
MHC II类蛋白包含细胞外结构域(其包括三个结构域：α1、α2、β1、和β1)、跨膜结构域和胞质尾，如图13所示。α2和β2结构域形成肽结合裂缝，而α1和β1与跨膜结构域相互作用。
关于MHC-I蛋白，本公开要么失活，要么在必要时保留“寻找和替换”具有HLA类似物的直系同源SLA蛋白的功能，这将导致最少的免疫识别。在一些方面，沉默编码并负责表达SLA-1的基因去除了高度有问题的和多态性的HLA-A类似物。类似地，与SLA-2相关的基因的失活或完全去除将减少由错配的HLA-B蛋白所施加的负担。在细胞表面界面，这将向人接受者的T细胞显露为HLA-A和HLA-B阴性细胞。对于最后一个经典的MHC I类蛋白HLA-C，使用参考HLA-C序列对编码SLA-3的基因进行定点诱变将模拟利用这种差异的同种异体移植。鉴于与HLA-A和HLA-B相比，HLA-C具有“较少多态性”的性质，这将通过用基于在自然界中天然流行的HLA-C亚类的参考替换序列来替换SLA-3，并且还调用允许将提供众多已知和那些未知的MHC-I依赖性过程的功能和不中断的最低但必需的表达水平的机制得到进一步改善。
关于MHC-I蛋白，本公开要么失活，要么在必要时保留“寻找和替换”具有HLA类似物的直系同源SLA蛋白的功能，这将导致最少的免疫识别。在一些方面，沉默编码并负责表达SLA-1的基因去除了高度有问题的和多态性的HLA-A类似物。类似地，与SLA-2相关的基因的失活或完全去除将减少由错配的HLA-B蛋白所施加的负担。在细胞表面界面，这将向人接受者的T细胞显露为HLA-A和HLA-B阴性细胞。对于最后一个经典的MHC I类蛋白HLA-C，使用参考HLA-C序列对编码SLA-3的基因进行定点诱变将模拟利用这种差异的同种异体移植。鉴于与HLA-A和HLA-B相比，HLA-C具有“较少多态性”的性质，这将通过用基于在自然界中天然流行的HLA-C亚类的参考替换序列来替换SLA-3，并且还调用允许将提供众多已知和那些未知的MHC-I依赖性过程的功能和不中断的最低但必需的表达水平的机制得到进一步改善。
此外，非经典的MHC蛋白(包括在I-b类别中的那些，其包括HLA-E、F和G)的表达对于胎儿的存活和滋养层的协同存在两者都至关重要。幸运的是，这些的多态性显著低于“经典的”MHC-Ia多样性。在没有这些表达的情况下，细胞裂解的增强上调是NK细胞识别的直接结果并且观察到激活。以与对MHC-Ia组分所描述的相同方式，具有HLA类似物的直系同源SLA蛋白要么被失活，要么在必要时“寻找和替换”。图14显示了包括在本公开中的特定改变。
HLA-G可以是一种有效的免疫抑制性和致耐受性分子。HLA-G在人胎儿中的表达可以使得人胎儿逃避母体免疫反应。迄今为止，尚未报告对同种异体HLA-G的刺激功能或反应。HLA-G可以是非经典的HLA I类分子。其可以在其遗传多样性、表达、结构和功能方面与经典的MHC I类分子不同。HLA-G可能以低等位基因多态性为特征。HLA-G的表达可能限于滋养层细胞、成人胸腺髓质和干细胞。GERAGHTY等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,9145-9149)已经描述HLA-G基因(HLA-6.0基因)的序列：其包含4,396个碱基对并且表现出与HLA-A、HLA-B和HLA-C基因同源的内含子/外显子组织。更准确地说，此基因包含8个外显子和一个未翻译的3'UT末端，分别具有以下对应关系：外显子1：信号序列，外显子2：α1结构域，外显子3：α2结构域，外显子4：α3结构域，外显子5：跨膜区，外显子6：胞质结构域I，外显子7：胞质结构域II，外显子8：胞质结构域III，以及3'非翻译区(GERAGHTY等人，上文所提及，ELLIS等人,J.Immunol.,1990,144,731-735)。然而，HLA-G基因与其他I类基因的不同之处在于，框内翻译终止密码子位于外显子6的第二个密码子；因此，由该基因HLA-6.0编码的蛋白质的胞质区比HLA-A、HLA-B和HLA-C蛋白的胞质区短得多。
自然杀伤(NK)细胞介导的免疫(包括细胞毒性和细胞因子分泌)在对许多自体和同种异体细胞的生物抗性中起主要作用。靶细胞识别的常见机制似乎是在细胞表面上的自身MHC I类肽复合物的缺乏或修饰，这可能导致病毒感染细胞、肿瘤细胞和主要组织相容性MHC不相容的移植细胞的清除。最近已经发现并克隆了KIR'，其是在NK细胞上表达的Ig超家族的成员。KIR'对多态性MHC I类分子具有特异性，并且在配体结合时产生负信号，这导致在大多数系统中保护靶细胞免受NK细胞介导的细胞毒性。为了防止NK细胞自身免疫性(即正常自体细胞的裂解)，据信个体的每个给定NK细胞表达识别自体HLA-A、B、C或G等位基因中的至少一种的至少一种KIR。
根据本公开，在猪至人异种移植的背景下，每个人接受者将具有该个体独特的主要组织相容性复合物(MHC)(I类、II类和/或III类)，并且将不匹配供体猪的MHC。因此，当将供体猪移植物引入接受者时，猪MHC分子它们本身充当抗原，引起来自接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。
因此，根据本公开的这一方面(即，将SLA/MHC重新编程以特异性地表达所选择的人MHC等位基因)，当应用于用于异种移植目的的猪细胞、组织和器官时与来自缺乏这种重新编程的野生型猪或以其他方式遗传修饰的猪(例如转基因猪或具有非特定或不同遗传修饰的猪)的细胞、组织和器官相比将减少排斥。
结合先前的修饰，插入或激活如母体胎儿共生所见将产生保护性的局部免疫反应的另外的细胞外配体将是最小化可能由于次要抗原差异而保留的有害的细胞介导的免疫功能的另外步骤。因此，用人对应物MICA将SLA-MIC2的猪配体进行直系同源重新编程。人主要组织相容性复合物I类链相关基因A(MICA)是在内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞、上皮细胞和许多肿瘤上表达的一种细胞表面糖蛋白。其位于人6号染色体的短臂上，并且由7个外显子组成，其中5个外显子编码MICA分子的跨膜区。在正常状态下的MICA蛋白在上皮组织中的表达水平低，但响应于各种细胞应激的刺激而上调。MICA被归类为非经典的MHC I类基因，并且充当由在NK细胞和CD8+T细胞的表面上表达的激活受体NKG2D识别的配体(atlasgeneticsoncology.org/Genes/MICAID41364ch6p21.html)。
此外，PD-L1、CTLA-4等的猪配体被过表达和/或以其他方式用人对应物进行直系同源重新编程。PD-L1是一种跨膜蛋白，其在抑制妊娠、同种异体移植物和自身免疫性疾病中的适应性免疫系统方面具有重要作用。其由人的CD274基因编码并且位于9号染色体。PD-L1与PD-1(一种在激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞上发现的受体)结合，以调节激活或抑制。特别地，PD-L1与T细胞上的受体PD-1的结合抑制了IL-2产生和T细胞增殖的激活。CTLA4是一种也充当下调免疫反应的免疫检查点的蛋白质受体。其由CTLA4基因编码，并且位于人的2号染色体上。其在调节性T细胞上组成型表达，但在激活的T细胞中被上调。CTLA-4和PD-L1的基因表达增加，例如，基于其重新编程的启动子。在基因型与CTLA-4或PD-L1表达之间存在关系。例如，在Ligers A等人CTLA-4 gene expression is influenced by promoterand exon 1polymorphisms,Genes Immun.2001May；2(3):145-52(出于所有目的以全文引用的方式并入本文)中，携带CTLA4启动子的位置-318处的胸腺嘧啶(T(-318))和对于在外显子1的位置49处的腺嘌呤为纯合的个体显示出在细胞刺激后细胞表面CTLA-4以及在非刺激细胞中的CTLA-4mRNA的表达都显著增加。使用PD-L1启动子重新编程可以实现类似的上调以过表达PD-L1。
此外，用人对应物对内皮蛋白质C受体(EPCR)、血栓调节蛋白(TBM)、组织因子途径抑制剂(TFPI)等的抗凝血剂猪配体进行直系同源重新编程，如图14所示。内皮蛋白质C受体是由位于人20号染色体的PROCR基因编码的内皮细胞特异性跨膜糖蛋白。其增强了蛋白质C(一种抗凝血剂丝氨酸蛋白酶)的激活，并且在激活的蛋白质C介导的细胞保护信号传导中具有关键作用。血栓调节蛋白是存在于内皮细胞表面上的一种完整的膜糖蛋白。其由位于人20号染色体的THBD基因编码。除了在抗凝血剂途径中凝血酶诱导的蛋白质C激活中充当辅因子之外，其还在调节C3b失活方面发挥作用。组织因子途径抑制剂(TFPI)是一种通过抑制因子Xa充当天然抗凝血剂的糖蛋白。其由位于人2号染色体的TFPI基因编码，并且蛋白质结构由三个串联的Kunitz结构域组成。在人中，存在两种主要的TFPi亚型，TFPIα和TFPIβ。TFPIα由三个抑制结构域(K1、K2和K3)和一个带正电荷的C端组成，而TFPIβ由两个抑制结构域(K1和K2)和C端组成。虽然已知K1和K2结构域分别结合和抑制因子VII和因子Xa，但K3的抑制功能未知。在某些方面，本公开集中于(断言)不需要在移植手术后移植接受者普遍和有害地使用外源性免疫抑制药物(或延长的免疫抑制方案)以延长挽救生命的器官的低免疫原性和/或致耐受性细胞、组织和器官的产生。
图14中提供的表格显示了展示各种编辑的总和以产生模拟人滋养层的细胞外构型的致耐受性异种移植猪细胞的概念设计。如图14所展示，SLA-1(一种与HLA-A直系同源的猪基因)，被沉默以模拟滋养层，因为HLA-A不在滋养层上表达。如图14中进一步展示，SLA-8(一种与HLA-G直系同源的猪基因)通过替换为“人捕获”参考序列而被人源化，因为HLA-G在滋养层中表达并且鉴于其与NK细胞的相互作用而在母体胎儿耐受性方面具有关键作用。
因此，应当理解，可以将具有一系列生物学特性(包括但不限于基因组修饰和/或其他基因工程改造特性)的多种源动物用于降低由异种移植引起的在人体内的免疫原性和/或免疫排斥(例如，急性排斥、超急性排斥和慢性排斥)。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免血栓性微血管病。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免肾小球病。将进一步理解的是，本文列出的源动物的列表不是限制性的，并且本发明涵盖具有单独或组合用于降低免疫原性和/或免疫排斥的一种或多种修饰(基因的或其他方式)的任何其他类型的源动物。
生物信息学序列分析比较在人基因组与猪基因组之间在各种免疫学关键基因座处的保守和非保守核苷酸的身份
为了重新编程在猪白细胞抗原(SLA)与人白细胞抗原(HLA)之间的MHC差异，本公开包括在这两个物种之间使用高度保守的MHC-基因座，例如，在功能上对应的众多基因。MHC Ia类、HLA-A、HLA-B和HLA-C在猪中有一个类似的伴侣(分别为SLA 1、2和3)。在根据本公开的免疫基因组学重新编程期间，在MHC II类中还有许多待利用的匹配。
如图15所示，MHC基因被分类为三类；I类、II类和III类，所有这些都被编码在人6号染色体上。MHC基因是猪和人基因组中最具多态性的基因之一，MHC多态性被推测在提供进化优势方面很重要；序列的变化可能导致肽结合的差异，这允许更好地将病原体呈递给细胞毒性T细胞。
已知的人HLA/MHC或单个接受者的测序的HLA/MHC序列可以用作模板来用精确的取代重新编程猪白细胞抗原(SLA)/MHC序列以与已知的人HLA/MHC序列或人接受者的HLA/MHC序列匹配，例如具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同源性。在鉴定待使用的已知人接受者HLA/MHC序列或对人接受者进行基因测序以获得HLA/MHC序列后，3可以根据所需的HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。例如，向本公开的猪施用几种靶向引导RNA(gRNA)序列，以用人接受者的模板HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。
如本文所用，术语“MHC I复合物”等包括在MHC Iα链多肽与β2微球蛋白多肽之间的复合物。如本文所用，术语“MHC I多肽”等包括单独的MHC Iα链多肽。通常，术语“人MHC”和“HLA”可以互换使用。
出于修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC的目的，已对人和猪组织相容性复合物的比较基因组组织进行作图，如图16和图17所示。例如，这种SLA到HLA作图可以在以下文献中找到：Lunney,J.,“Molecular genetics of the swine major histocompatibilitycomplex,the SLA complex,”Developmental and Comparative Immunology 33:362-374(2009)(“Lunney”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。此外，通过将HLA的基因座和各种HLA基因的示意性分子组织(如图12和图13所示)与SLA的基因座和各种SLA基因的示意性分子组织(如图17和图18所示)进行比较，很容易辨别外显子在细胞外和跨膜结构域中的位置和数量在HLA MHC和SLA MHC之间是共同的。因此，鉴于本公开并使用Lunney等人的作图作为参考工具，本领域普通技术人员有效且高效地对猪细胞进行遗传重新编程。
供体猪的SLA/MHC基因在产生替换模板时用作参考模板。在实施本公开时，可以通过在线档案或数据库诸如Ensembl(http://vega.archive.ensembl.org/index.html)获得猪的SLA/MHC基因。如图19、图20、图21和图22所示，绘制了SLA-DQA和SLA-DQB1基因的准确位置、各自基因(外显子和内含子)的长度、以及SLA-DQA和SLA-DQB1的准确核苷酸序列。在本公开的替代性方面，可以对供体猪的SLA/MHC基因进行测序。在本公开的替代性方面，可以对猪的全基因组进行测序。在一个方面，可以用作参考模板的所测序的供体猪SLA/MHC基因包括但不限于SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQa、SLA-DQb和β2微球蛋白。在另一个方面，可以用作基础模板的所测序的供体猪的SLA/MHC基因包括但不限于SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQa、SLA-DQb和β2微球蛋白的外显子区域。在一些方面，其他SLA未改变并且重新编程的SLA区域的内含子区域未改变，从而产生提供在移植到人体中时具有致耐受性的细胞、组织和器官的具有最小改变的重新编程的猪基因组。
根据本发明的一个方面，向供体猪提供了被生物工程改造以表达一组特定的已知人HLA分子的基因组。例如从IPD-IMGT/HLA数据库(可获自ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)和international ImMunoGeneTics information
Figure BDA0003331279010000381
(可获自imgt.org)中可以获得此类HLA序列。此类基因的命名法在图23中示出。例如，HLA-A1、B8，DR17是白种人中最常见的HLA单倍型，频率为5％。因此，可以使用已知的MHC/HLA序列信息结合本文提供的公开内容来执行所公开的方法。HLA序列可通过在线档案或数据库诸如Ensembl(vega.archive.ensembl.org/index.html)获得。如图24所示，可以获得HLA-DQA1基因的准确位置、相应基因(外显子和内含子)的长度、以及HLA-DQA1的准确核苷酸序列。
在一些方面，鉴定出接受者的人白细胞抗原(HLA)基因和MHC(I类、II类和/或III类)并对其进行作图。将理解的是，能以本领域已知的任何方式来确定人接受者的HLA/MHC序列。例如，HLA/MHC基因通常用靶向测序方法(长读段测序或长插入短读段测序)进行分型。常规上，已经以2位数分辨率(例如，A*01)确定了HLA类型，其近似于血清抗原分组。最近，已经将序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)方法用于以4位数分辨率(例如，A*01:01)进行HLA分型，这可以区分氨基酸差异。当前，与其他常规方法相比，用于HLA分型的靶向DNA测序是最流行的HLA分型方法。由于基于序列的方法直接确定编码区域和非编码区域，因此其可以实现分别以6位数分辨率(例如A*01:01:01)和8位数分辨率(例如A*01:01:01:01)进行HLA分型。从临床角度来看，以最高分辨率进行HLA分型期望将现有HLA等位基因与新等位基因或无效等位基因区分开。此类测序技术描述于例如Elsner HA,Blasczyk R:(2004)Immunogenetics of HLA null alleles:implications for blood stem celltransplantation.Tissue antigens.64(6):687-695；Erlich RL等人(2011)Next-generation sequencing for HLA typing of Class I loci.BMC genomics.12:42-10.1186/1471-2164-12-42；Szolek A等人(2014)OptiType:Precision HLA typing fromnext-generation sequencing data.Bioinformatics 30:3310–3316；Nariai N等人(2015)HLA-VBSeq:Accurate HLA typing at full resolution from whole-genomesequencing data.BMC Genomics 16:S7；Dilthey AT等人(2016)High-accuracy HLA typeinference from whole-genome sequencing data using population referencegraphs.PLoS Comput Biol 12:e1005151；Xie C.等人(2017)Fast and accurate HLAtyping from short-read next-generation sequence data with xHLA 114(30)8059-8064中，将所述文献中的每一篇以全文引用的方式并入本文。
MHC I类在异种移植物上的表达的完全破坏已表明对动物的生存能力具有不利影响。在一项研究中，通过靶向猪β2微球蛋白基因的外显子2废除了在猪细胞上的SLA I类表达。所产生的仔猪的基因组测序显示在B2M基因座处有修饰，导致移码、过早终止密码子和最终功能性敲除。然而，该研究的仔猪由于意外的疾病过程没有存活超过4周，表明这种破坏性的遗传修饰可能对动物的生存能力具有负面影响。Sake HJ,Frenszel A,Lucas-HahnA等人Possible detrimental effects of beta-2-microglobulin knockout inpigs.Xenotransplantation.2019；26:e12525。
在一个方面，为供体猪的SLA/MHC的核苷酸的定点诱变取代产生了替换模板，其中所述重新编程引入了不会导致天然供体猪SLA/MHC的特定外显子区域中的任何移码或框架破坏的非转基因的最低要求的改变。替换模板的核苷酸序列通过以下方式来鉴定：a)从移植接受者获得含有DNA的生物样品，b)对移植接受者样品中的MHC I类和II类基因进行测序，c)在不同基因座将接受者的核苷酸序列与供体猪的核苷酸序列进行比较，以及d)为所述基因座中的一个或多个产生替换模板，其中所述替换模板的所述核苷酸序列与移植接受者的核苷酸序列具有至少95％同一性，如下文进一步所述。
图25A和图25B中的电子表格分别显示了三名个体接受者的DQ-A1和DQ-B1的外显子的人捕获参考序列。如上文所提及，已知的人HLA/MHC或单个接受者的测序的HLA/MHC序列可以用作模板来用精确的取代重新编程猪白细胞抗原(SLA)/MHC序列以与已知的人HLA/MHC序列或人接受者的HLA/MHC序列匹配，例如具有90％、95％、98％、99％或100％的序列同源性。如图25C所示，可以在核苷酸序列文库中比较通过在线数据库获取的已知人HLA-DQA和个体接受者的测序的HLA-DQA。图26D显示了通过在线数据库获取的猪SLA-DQA的外显子2区域与已知和测序的接受者的HLA-DQA1的比较。SLA-DQA和HLA-DQA1的外显子2区域都包含249个核苷酸。如图25D所示，可以观察到在SLA-DQA1和HLA-DQA1的外显子2区域之间比对的249个核苷酸中有11％完全不同。因此，本公开公开了鉴定在人和猪MHC复合物的特定外显子处的非保守核苷酸序列的方法。此外，通过使用已知或测序的人捕获参考模板，可以进行定点诱变，其中在SLA基因的特定外显子区域与已知或接受者的HLA基因的特定外显子区域之间的特定非保守核苷酸序列被替换而不会导致任何移码。SLA-DQA1和SLA-DQB1基因的定点诱变在图26A和图26B中示出，其中将接受者特异性HLA-DQA1和HLA-DQB1的外显子2区域的核苷酸序列用于产生人捕获置换序列。因此，使用对MHC基因的外显子区域特异的合成替换模板，导致不会引起天然供体猪的SLA/MHC基因发生任何移码或框架破坏的非转基因的最小改变的基因组。
如上文所提及，导致移码的破坏性遗传修饰可能对动物的生存能力具有负面影响。因此，本发明公开了抑制MHC蛋白表达而不引起MHC基因移码的方法。图25E和图25F中的电子表格分别显示了三名个体接受者的DR-A和DR-B1的外显子的人捕获参考序列。如图26C和图26D所示，通过将前导外显子1的初始三个核苷酸序列替换为终止密码子，可以抑制DR分子的表达而不导致移码。具体而言，对于HLA-DRA和DRB1，外显子1的初始三个序列ATG被替换成终止密码子TAA。因此，通过使用合成置换模板，其中终止密码子位于外显子1的开头，本发明提供了抑制所需MHC分子的表达的方法，其中基因组的非转基因的最小改变不会导致天然供体猪的SLA/MHC基因的任何移码或框架破坏。
此外，包含每种MHC-I蛋白的异源二聚体结构的β2微球蛋白是物种特异性的。基于猪基因组组装SSC10.2，在猪1号染色体中鉴定出编码整个B2M蛋白的约45.5kb的区段重复，其中所述B2M基因的功能性重复被鉴定为在猪的两个拷贝之间具有完全相同的编码序列。对十种哺乳动物物种中的B2M重复的系统发育分析证实了鲸偶蹄目动物(cetartioldactyls)(如牛、绵羊、山羊、猪和鲸鱼)中存在B2M重复，但在非鲸偶蹄目动物(如小鼠、猫、狗、马和人)中不存在B2M重复。发现在重复块的边缘的长散布核元件(LINE)的密度(39％至66％)比猪基因组的平均值(20.12％)高2至3倍，表明其在重复事件中的作用。猪中的B2MmRNA表达水平分别比人和小鼠高12.71和7.57倍(2-ΔΔCt值)。在仅鲸偶蹄目动物的基因组中鉴定出部分剩余的重复B2M序列表明该事件是谱系特异性的。B2M复制可以通过增加MHC I类轻链蛋白B2M的可用性以与猪中由相对大量的MHC I类重链基因编码的蛋白质复合来有益于猪的免疫系统。如图27所示，可以观察到相对于MHC I类分子的B2M分子。进一步如上文所述并如图27所示，猪具有重复的B2M基因，而人只有一个。因此，在本公开的一个实施方案中，猪B2M基因的第一拷贝通过定点诱变被重新编程，如先前所公开的。如图28所示，将猪B2M的外显子2的氨基酸序列与人的氨基酸序列进行比较，其中鉴定出非保守区域。此外，如先前所公开，通过使用终止密码子抑制了猪B2M基因的第二拷贝的表达。因此，在本公开的一个实施方案中包括遗传修饰，其中猪B2M基因的第一拷贝通过定点诱变被重新编程并且第二重复的B2M基因不表达，其中所述重新编程不导致B2M基因移码。
通过遗传修饰进行人源化的中试猪细胞系的选择和表征
原代巨噬细胞和其他抗原呈递细胞(APC)可用于研究免疫反应，然而原代细胞的长期使用受到细胞寿命短的限制。此外，原代细胞在细胞衰老之前只能进行一次基因工程改造和评价。在猪模型中，研究人员已经频繁地使用猪主动脉内皮细胞(PAEC)进行这些类型的研究。具有巨噬细胞或代表性APC的所需特征(MHC I类和II类分子和CD80/86的表达)的永生化细胞系将是对基因组进行多重修饰并使用相同遗传背景解决对免疫反应性的影响的理想选择。产生活的永生化猪细胞系的能力仅限于与异种移植中的免疫反应研究无关的成纤维细胞和上皮细胞系。
永生化猪肺泡巨噬细胞(PAM)系是从猪的长白猪(Landrace)品系[Weingartl2002]中开发的，并且可通过ATCC[3D4/21,ATCC CRL-2843]商购获得。细胞系显示出一定百分比的非特异性酯酶和吞噬作用，这取决于培养基的条件。细胞可以在无血清条件下以贴壁依赖性或以集落形式生长。检测到骨髓/单核细胞标志物(例如CD14)。永生化细胞系的理想特征是MHC I类和II类。显示MHC I类在所有细胞上广泛表达，然而，3D4/21细胞的MHC II类(DR和DQ)表达最初报告为低水平(18％和4％)。PAEC已被证明被激活，并且DR表达可以在暴露于IFN-γ的情况下被上调。3D4/21细胞被暴露于IFN-γ，并且在暴露于IFN-γ的24小时之后，II类表达将DR从29.68％增加至42.27％并且将DQ从2.28％增加至57.36％。此外，CD80/86在细胞表面上表达，这些糖蛋白对于T细胞激活和增殖的第二信号是必不可少的。PAM细胞(34D/21)具有猪APC的所需特征，其中可以使用永生化细胞系记录在与MHC相关的基因中的遗传变化并且可以使用流式细胞术评估所产生的表型变化以解决所关注的糖蛋白的表达或缺乏表达和细胞免疫反应(混合淋巴细胞反应(MLR))。
为了测试细胞免疫反应，建立了一种单向MLR，其中一组细胞被鉴定为刺激细胞，这些细胞是供体细胞或未经修饰或经修饰的PAM细胞，并且另一组细胞是应答细胞，这些是来自接受者的细胞(这些可能来自享有相似的MHC分子表达的接受者)，是经修饰的PAM细胞。将刺激细胞用剂处理以防止细胞增殖，并且这可以是辐射或与丝裂霉素C一起孵育，丝裂霉素C共价交联DNA，从而抑制DNA合成和细胞增殖。因此，刺激细胞在培养物中不增殖，然而应答细胞响应于MHC I类和II类的相互作用而增殖，并且正是这种增殖在MLR中被测量。制备含有刺激细胞和应答细胞两者的细胞培养物并将其孵育5-7天，并且测量增殖/激活。增殖可以通过在5或7天结束时在增殖时掺入DNA中的放射性胸苷[3HTdr]或BrdU[胸苷的类似物]的量来测量。
MLR的组合。应答细胞可以是PBMC、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其他T细胞亚群。PBMC代表在接受者中存在的所有免疫细胞，并且测量的反应反映了应答者对刺激细胞[未经修饰或经修饰的PAM细胞]产生免疫反应的能力。测量的增殖由分别与MHC II类和I类相互作用的CD4+和CD8+T细胞两者组成。仅使用针对未经修饰或经修饰的PAM细胞的CD4+T细胞是为了测量对MHC II类糖蛋白DR和DQ的反应。为了观察对DQ的特异性反应，在培养物中不存在人抗原呈递细胞(APC)，使得细胞反应不是由APC呈递的猪抗原的结果。平行地，应答CD8+T细胞将用于评估对MHC I类糖蛋白SLA 1和2的免疫反应。这种类型的分析去除了如在PBMC中发现的应答APC对免疫反应的贡献。比较数据将证明这些各自的糖蛋白对遗传定义的应答者的免疫反应的贡献，并且反映了对PAM细胞进行的遗传修饰。
遗传修饰的PAM细胞的流式细胞术、表型分析。分析遗传修饰的细胞(例如，来自遗传修饰的动物的细胞或离体制备的细胞)的细胞表型，以测量由被修饰的基因编码的糖蛋白表达的变化。将细胞与带有荧光标记的抗体一起孵育，所述荧光标记结合所关注的糖蛋白，并且使用流式细胞术分析标记的细胞。对未经修饰的PAM细胞进行了分析，以鉴定MHC I类、II类(DR和DQ)和CD80/86的表达。经修饰的PAM细胞中的变化将参考此数据库。流式细胞术还将用于表征由SLA 3、6、7和8的基因编码的糖蛋白的表达，因为PAM细胞中的基因被与HLA C、E、F和G相关的接受者特异性序列修饰。
此外，这种类型的分析还用于确保由被敲除的基因编码的糖蛋白不被表达。此技术还可以用于从具有混合表型的细胞集合中分选出经遗传修饰的细胞。
可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定以确定抗HLA抗体是否识别来自本公开的生物制品的细胞。可以使用通过添加含有先前表征的抗HLA抗体(或对照血清)的特定人血清制备的测定板。将经IFN-γ处理的供体细胞重悬并添加至测定板中，与补体来源(例如兔血清)一起孵育。在室温下孵育至少1小时之后，添加吖啶橙/溴化乙锭溶液。通过以下方式确定细胞毒性百分比：对在荧光显微镜下可视化的死细胞和活细胞计数，减去在不存在抗HLA抗体的情况下获得的自发裂解值，并用量表评分。
NK细胞反应性，调节以降低细胞毒性。通过NK细胞(单独或组合)激活、识别和消除靶细胞的潜在机制诱导其裂解颗粒(穿孔素、颗粒酶和溶细胞素)内容物的释放。例如，NK细胞通过抑制性NK细胞受体识别在靶细胞上自身主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的缺乏，从而导致直接的NK细胞毒性。异种移植就是这种情况。NK细胞受HLA C调节，HLA C被抑制性NK细胞抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、KIR2DL2/2DL3、KIR2DL1和KIR3DL1识别。NK细胞抑制受体免疫球蛋白样转录物2(ILT2)与MHC I类和CD94-NKG2A识别的HLA-E相互作用。HLA F和G在滋养层上具有相似的作用。可以在体外测量接受者NK细胞对未经修饰的PAM细胞的细胞溶解活性，其中将人NK细胞添加到未经修饰的PAM细胞的贴壁单层中并培养4小时。细胞裂解通过放射性Cr51的释放或通过流式细胞术测量的发色团来测量。可以使用这种细胞毒性测定来评估具有经修饰的SLA 3、6、7或8以分别反映HLA C、HLA E、HLA G或HLA F的PAM细胞。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
进行了一项研究，通过流式细胞术鉴定了IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激对从
Figure BDA0003331279010000441
(3D4/21细胞，目录号CRL-2843TM)购买的猪肺泡巨噬细胞(PAM)表型的影响。
将PAM细胞在RPMI-1640/10％FBS中解冻，并在三个不同的培养板中培养两天。在第3天，对于巨噬细胞激活，将培养基更换为含有100ng/mL IFN-γ(板1)和100ng/mL IFN-γ加10ng/mL LPS(板2)的RPMI-1640/20％FBS培养基。在RPMI-1640/20％FBS中的未经处理的细胞用作对照(板3)。孵育24小时后，使用TrypLE处理将贴壁细胞从板上分离。将细胞重悬于FACS缓冲液(1X PBS pH＝7.4、2mM EDTA、0.5％BSA)中。通过台盼蓝排除法确定细胞计数和生存能力。在4℃下将总共1x105个细胞用小鼠抗猪SLA I类、SLA II类DR、SLA II类DQ抗体染色30分钟，并用APC缀合的CD152(CTLA-4)-mulg融合蛋白(结合猪CD80/CD86)染色45分钟。使用FACS缓冲液将细胞洗涤两次，并将抗体染色的细胞重悬于100μL含有抗小鼠APC缀合的多克隆IgG二抗的FACS缓冲液中。随后在4℃下孵育30分钟。使用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。将所有细胞重悬于200μL FACS缓冲液中。在Novacyte流式细胞术中获取样品，并使用NovoExpress分析数据。
分析程序基于NovoExpress流式细胞术分析软件。任何等效的软件都可以用于数据分析。取决于所使用的软件，分析演示可能略有不同。门可能命名不同，并且％值可能略有不同。
如图29所示，未经处理的PAM细胞分别导致99.98％、29.68％和2.28％的SLA I类、SLA II类DR和DQ分子表达。这些细胞为4.81％CD80/86+。在IFN-γ的存在下培养细胞24小时增加了所有SLA分子表达(99.99％SLA I类+伴有中值荧光强度增加、42.27％DR+、57.36％DQ+)和CD80/86水平(47.38％)。与仅用IFN-γ处理的细胞相比，含IFN-γ的细胞与LPS导致相似水平的SLA分子和CD80/86表达。
将PAM细胞用猪IFN-γ处理24小时，并用一级MAb和荧光素缀合的二抗和对共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)具有高亲和力的APC缀合的CD152染色。在用IFN-γ处理后，与未刺激的PAM细胞相比，这些细胞显示出增加的SLA和CD80/86共刺激分子表达。虽然未刺激的细胞为99.98％SLA I类+、29.68％DR+2.28DQ+和4.81％CD80/86+，但IFN-γ刺激的细胞为99.99％SLA I类+、42.27％DR+、57.36％DQ+、47.38％CD80/86+。与仅用IFN-γ处理的细胞相比，含有IFN-γ细胞与LPS导致相似水平的SLA分子和CD80/86表达。
在基础条件下，巨噬细胞表达低水平的SLA II类和CD80/86共刺激分子。IFN-γ和IFN-γ-LPS处理24小时诱导SLA II类和CD80/86共刺激分子以及SLA I类分子的表达。延长孵育将可能进一步增加这些分子的表达。
此外，还进行了一项研究，以评价人PBMC(外周血单核细胞)、CD8和CD4阳性T细胞在与猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞共培养时的免疫增殖反应性。将人供体PBMC或它们的CD4+T细胞与未经处理的、IFN-y激活的和负载KLH的PAM细胞共培养7天。如图30A和图30B所示，分别使用从供体#11、#50和#57分离的细胞作为阳性和阴性对照进行单向同种异体和自体MLR实验。对丝裂霉素C(X)处理的和未经处理的PAM细胞以及每种人供体细胞进行背景对照。使用溴脱氧尿苷(BrdU)ELISA测定来测定增殖反应。在第6天，BrdU添加完成。在第7天收集培养基用于细胞因子(IFN-y和IL-2)分析并测定增殖反应。在共培养的第7天，在OlympusCK40显微镜下以200X放大倍数观察细胞。
如图31所示，在IFN-γ的存在下培养PAM细胞72小时使SLA II类DQ分子表达从2.55％增加到95.82％。负载KLH的PAM细胞导致与未经处理的细胞相似水平的SLA II类DQ分子表达。所有同种异体对照均具有超过基线值的阳性增殖反应，并且丝裂霉素C处理的PBMC和PAM细胞与基线值相比具有降低的增殖反应。如图32A和图32B所示，人PBMC和CD4+增殖反应导致同种异体反应高于PAM细胞的异种反应。三种不同的人CD4+T细胞的增殖反应显示出类似的异种反应，其中PAM细胞SI(刺激指数)值介于15和18.08之间。在来自PBMC供体#57的异种培养物中增殖反应最高(在使用PAMX、PAM-IFNyX、KLHx的情况下的SI＝3.12、2.75和3.79)。
通过CRISPR-Cas9遗传修饰创建多个独立的单变量人源化中试猪细胞系的基因编辑模式
可以利用已知的基因组编辑技术进行遗传修饰，所述基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑以及成簇的规则间隔回文重复序列Cas9(CRISPR-Cas9)。这些可编程核酸酶能够实现DNA双链断裂(DSB)的靶向产生，这促进了细胞修复机制的上调，从而导致非同源末端连接(NHEJ)或同源指导的修复(HDR)的易错过程，后者用于整合外源供体DNA模板。CRISPR-Cas9还可以用于对遗传材料进行精确修饰。例如，能以在以下文献中所描述的方式进行经由CRISPR-Cas9的遗传修饰：Kelton,W.等人,“Reprogramming MHC specificity by CRISPR-Cas9-assistedcassette exchange,”Nature,Scientific Reports,7:45775(2017)(“Kelton”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，本公开包括使用CRISPR-Cas9重新编程以介导整个等位基因(例如MHC、HLA、SLA等)的快速且无痕的交换。
根据本公开，将CRISPR-Cas9用于介导猪细胞中特定天然基因座上整个MHC等位基因的快速且无痕的交换。使用具有两种gRNA的Cas9多重靶向来引入MHC等位基因侧翼的单链断裂或双链断裂，从而使得能够用模板HLA/MHC序列(以单链或双链DNA模板提供)替换。
在一些方面，可以通过本领域已知的敲除方法进一步修饰供体动物的MHC的多态性蛋白质基序的表达。例如，敲除一个或多个基因可以包括从非人动物的基因组中缺失一个或多个基因。敲除还可以包括从非人动物中去除全部或部分基因序列。还考虑敲除可以包括用一个或多个核苷酸替换非人动物基因组中基因的全部或部分。敲除一个或多个基因还可以包括取代一个或多个基因中的序列，从而破坏一个或多个基因的表达。敲除一个或多个基因还可以包括替换一个或多个基因中的序列，从而破坏一个或多个基因的表达，而不会在天然供体猪的SLA/MHC基因中发生移码或框架破坏。例如，替换序列可以在一个或多个基因的开头产生终止密码子，这可能导致无功能的转录物或蛋白质。例如，如果在一个或多个基因内产生终止密码子，则所产生的转录物和/或蛋白质可能被破坏、沉默并使得失去功能。
在另一个方面，本发明利用在野生型猪的SLA-DR的外显子区域通过核苷酸替换终止密码子的改变来避免激发接受者的天然细胞介导的免疫反应(CD8+T细胞)，包括制备缺乏SLA-DR、SLA-1、SLA-2的功能性表达的细胞。例如，本发明利用TAA。在其他实施方案中，本发明利用TAG。在其他实施方案中，本发明利用TGA。
在一个方面，本发明利用在野生型猪的第二个相同的重复B2微球蛋白基因的外显子区域插入或产生(通过核苷酸替换)终止密码子来降低猪中B2微球蛋白mRNA的表达水平。应当理解，B2微球蛋白是主要的免疫原，特别是非gal异种抗原。
在一个方面，对接受者的HLA/MHC基因进行测序，并根据接受者的HLA/MHC基因制备模板HLA/MHC序列。在另一个方面，来自世界卫生组织(WHO)数据库的已知人HLA/MHC基因型可以用于本公开的猪的遗传重新编程。
例如，使用聚合酶链式反应制备CRISPR-Cas9质粒，并将接受者的HLA/MHC序列作为模板克隆到质粒中。鉴定猪细胞中SLA/MHC基因座上的CRISPR切割位点，并将靶向切割位点的gRNA序列克隆到一种或多种CRISPR-Cas9质粒中。然后将CRISPR-Cas9质粒施用于猪细胞中，并在猪细胞的MHC基因座处进行CRIPSR/Cas9切割。
猪细胞中的SLA/MHC基因座被与已知的人HLA/MHC序列或接受者的测序HLA/MHC基因匹配的一个或多个模板HLA/MHC序列精确替换。在执行SLA/MHC重新编程步骤之后对猪细胞进行测序，以便确定是否已成功重新编程猪细胞中的SLA/MHC序列。来自HLA/MHC序列重新编程的猪的一种或多种细胞、组织和/或器官被移植到人接受者中。
修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC使得与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同或几乎相同的在新猪细胞中的特定MHC分子的表达。在一个方面，本公开涉及对仅限于猪基因组的特定SLA区域的特定部分进行修饰以在猪中保持有效的免疫特性，同时当生物制品被移植到人接受者中时是致耐受性的，使得可以减少或避免免疫抑制剂的使用。与本公开的方面形成对比，现有技术的异种移植研究需要使用免疫抑制剂来抵抗排斥。在一个方面，猪基因组被重新编程以破坏、沉默与HLA-A、HLA-B和DR对应的猪基因、导致这些猪基因的无功能性表达，并通过HLA-C、HLA-E、HLA-F和/或HLA-G的取代进行重新编程。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。在一个方面，将猪基因组重新编程以敲除SLA-1；SLA-6,7,8；SLA-MIC2；和SLA-DQA；SLA-DQB1；SLA-DQB2，并敲入HLA-C；HLA-E；HLA-G；和HLA-DQ。在某些方面，在重新编程的猪基因组中降低HLA-C表达。通过对猪细胞进行重新编程以使其对人的免疫系统不可见，这种重新编程由此可以最小化甚至消除免疫反应，所述免疫反应基于供体猪细胞原本表达的猪MHC分子原本发生。
制备并测试猪细胞中的各种细胞标志物组合，以制备人患者身体所接受的生物学上重新编程的猪细胞用于各种用途。对于这些测试，使用可从
Figure BDA0003331279010000491
(3D4/21)获得的猪主动脉内皮细胞、成纤维细胞和/或转化的猪巨噬细胞细胞系。
仅敲除和敲除加敲入细胞集合是通过设计和合成靶基因的引导RNA产生的。每个引导RNA由两种组分构成：CRISPR RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)。这些组分可以连接形成称为单引导RNA(sgRNA)的连续分子，或者退火形成两片式引导(cr:tracrRNA)。
可以将CRISPR组分(gRNA和Cas9)以DNA、RNA或核糖核蛋白(RNP)复合物形式传递至细胞中。DNA形式涉及将gRNA和Cas9序列克隆到质粒中，然后将所述质粒引入细胞中。如果需要永久表达gRNA和/或Cas9，则可以使用慢病毒将DNA插入宿主细胞的基因组中。可以酶促地(通过体外转录)或合成地产生引导RNA。合成的RNA通常比IVT衍生的RNA更纯，并且可以进行化学修饰以抵抗降解。Cas9也可以作为RNA递送。核糖核蛋白(RNP)形式由gRNA和Cas9蛋白组成。将RNP预先复合在一起，并且然后引入细胞中。这种形式易于使用，并且已被证明在许多细胞类型中都非常有效。
在设计并产生引导RNA之后，通过几种可能的转染方法之一将CRISPR组分引入细胞中，所述可能的转染方法诸如脂质转染、电穿孔、核转染或显微注射。在将引导RNA和Cas9引入细胞培养物中之后，它们在一些细胞内的靶位点处产生DSB。然后，NHEJ途径修复断裂，从而可能在该过程中插入或缺失核苷酸(插入缺失)。由于NHEJ可能不同地修复每条染色体上的靶位点，因此每个细胞可能具有不同的插入缺失集、或插入缺失和未编辑序列的组合。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。
还将进一步理解的是，对本文提供的源动物基因组的破坏和修饰可以通过几种方法来进行，所述方法包括但不限于通过使用成簇的规律间隔短回文重复序列(“CRISPR”)，其可以用于产生具有专门定制的基因组的动物。参见例如，Niu等人,“Inactivation ofporcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas-9,”Science 357:1303-1307(2017年9月22日)。这样的基因组修饰可以包括但不限于本文所公开的任何遗传修饰、和/或设计成减少源自此类源动物的制品的生物负荷和免疫原性以使免疫排斥最小化的任何其他定制基因组修饰。
最初被称为微生物适应性免疫系统的CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)最近已适应于哺乳动物基因编辑。CRISPR/Cas系统是基于细菌和古细菌中的适应性免疫机制，以通过DNA或RNA干扰防御外来遗传元件的入侵。通过哺乳动物密码子优化，CRISPR/Cas已适应于精确的DNA/RNA靶向，并且在哺乳动物细胞和胚胎中非常高效。用于基因组编辑的最常用和充分表征的CRISPR/Cas系统是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系统；此系统使用Cas9核酸酶和短引导RNA(gRNA)的组合来靶向特异性DNA序列进行切割。与直接位于PAM序列(例如NGG)5'的靶DNA互补的20个核苷酸的gRNA将Cas9指导至靶DNA并介导双链DNA的切割以形成DSB。因此，CRISPR/Cas9可以在任何N20-NGG位点实现基因靶向。
因此，本发明还涵盖经遗传修饰的非人动物，其基因组包含编码人或人源化MHC I多肽和/或β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含本文所述的氨基酸序列的保守氨基酸取代。
本领域技术人员将会理解，除了编码本文所述的人或人源化MHC I多肽和/或β2微球蛋白的核酸残基之外，由于遗传密码的简并性，其他核酸也可能编码本发明的多肽。因此，除了在其基因组中包含编码具有保守氨基酸取代的MHC I和/或β2微球蛋白多肽的核苷酸序列的经遗传修饰的非人动物之外，还提供了其基因组包含由于遗传密码的简并性而与本文所述的不同的核苷酸序列的非人动物。
在另外的或替代的方法中，本公开包括重新编程或利用MHC-I(B类)分子的抑制和共刺激作用。具体而言，本公开包括“寻找和替换”供体动物基因组中与HLA基因的部分对应的部分，例如以在可能的情况下过表达HLA-G，保留和过表达与HLA-E对应的部分，和/或“寻找和替换”与HLA-F对应的部分的过程。如本文所用，术语“寻找和替换”包括鉴定同源/类似/直系同源的保守遗传区域，并通过基因编辑技术用对应的人组分替换一个或多个部分。
另一个方面包括寻找和替换在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G中表达的β2微球蛋白。同源/类似/直系同源的保守细胞因子介导的补体抑制或以其他方式免疫调节细胞标志物或表面蛋白，将增强供体-接受者细胞界面的总体免疫耐受性。
在另外或替代性的方法中，本发明利用免疫基因组学重新编程来减少或消除MHC-I(A类)组分，以避免接受者激发天然细胞介导的免疫反应。在另一个方面，与HLA-A和HLA-B的外显子区域对应的供体动物(例如猪)基因组中的外显子区域被从供体动物的基因组中破坏、沉默或以其他方式无功能表达。在另一个方面，与HLA-A和HLA-B的外显子区域对应的在供体动物(例如猪)基因组中的外显子区域在供体动物基因组中被破坏、沉默或以其他方式无功能表达，并且与HLA-C的外显子区域对应的在供体动物(例如猪)基因组中的外显子区域可以被调节，例如减少。在一个方面，本公开包括与没有这种免疫基因组学重新编程的情况下如何表达相比，沉默、敲除或引起源动物的直系同源的HLA-C的最低表达。
此外，包含每种MHC-I蛋白的异源二聚体结构的β2微球蛋白是物种特异性的。因此，在本公开的一个实施方案中，其被重新编程。与其对应物相比，编码这种流行的构建块蛋白质的遗传指令并不位于MHC基因座中。因此，在本公开的一个实施方案中，除了如本文所述的对相应靶标特异的那些之外，还包括遗传修饰。
图33是根据本公开的人源化猪细胞的示意性描绘。如其中所示，本公开涉及重新编程编码特定多肽或糖蛋白的外显子、重新编程和上调特定多肽或糖蛋白、以及重新编程核基因组以具有特定多肽或糖蛋白的非功能性表达，所有这些都在本文中有详细描述。
人源化中试猪细胞系的表征和对免疫学所产生的影响的体外评价
可以分析和分选经遗传修饰的细胞，例如来自经遗传修饰的动物的细胞或离体制备的细胞。在一些情况下，可以通过流式细胞术(例如荧光激活的细胞分选)分析和分选遗传修饰的细胞。例如，可以使用基于识别由基因编码的多肽的标记(例如荧光标记)的流式细胞术从其他细胞中检测和纯化表达所关注基因的遗传修饰细胞。在此应用中，SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DR和SLA-DQ在未经修饰的PAM细胞上的表面表达是使用针对在那些糖蛋白上的表位的标记过的抗体建立的。在特定基因敲除(例如SLA-1、SLA-2和SLA-DR)的情况下，通过流式细胞术的分析用于证明即使在细胞与干扰素γ一起孵育之后也缺乏这些糖蛋白的表达。SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和SLA-DQ的基因将被修饰，使得在细胞表面上表达的糖蛋白将分别反映HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和HLA-DQ糖蛋白。因此，对HLA表位特异的一组不同的抗体将用于检测由经修饰的基因编码的糖蛋白的表达，并且针对SLA相关糖蛋白的抗体将不与经修饰的PAM细胞的细胞表面结合。
当敲除表面糖聚糖表位时，获得了不表达糖部分的细胞系，因此在人血清中不存在天然的预先形成的抗体的结合。这使用流式细胞术和人血清以及标记的山羊抗人IgG或IgM抗体；或者针对糖的特异性抗体；或标记的糖特异性同工凝集素来检测。结果是没有抗体(同工凝集素)与最终细胞系的结合。阳性对照是没有遗传修饰的原始细胞系(WT)。此外，分子分析证明了那些基因的变化。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育长达72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
通过混合淋巴细胞反应(MLR)研究来评价经修饰的猪细胞的免疫反应。应答细胞可以是PBMC、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其他T细胞亚群。PBMC代表在接受者中存在的所有免疫细胞，并且测量的反应反映了应答者对刺激细胞产生免疫反应的能力(例如，未经修饰的PAM细胞和经修饰的PAM细胞的比较)。可替代地，可以使用PAEC或成纤维细胞。测量的增殖由分别与MHC II类和I类相互作用的CD4+和CD8+T细胞两者组成。仅使用针对未经修饰或经修饰的PAM细胞的CD4+T细胞测量对MHC II类糖蛋白DR和DQ的反应。例如，在PAM细胞中SLADR被敲除的MLR中，CD4+T细胞增殖反应将降低；或者当SLA-DQ基因通过使用来自“接受者”[应答者]的序列进行修饰时，增殖反应将降低，因为在这种情况下，应答者将DQ糖蛋白识别为自身，然而在DR敲除中，DR不存在并且因此不能产生信号。
应答CD8+T细胞用于评估对MHC I类糖蛋白、SLA-1和SLA-2的免疫反应。1×105个纯化的人CD8+T细胞(A)或人PBMC(B)受到渐增数量的来自四倍敲除猪10261或野生型猪的受辐照的(30Gy)猪PBMC的刺激。在5d+16h小时之后通过3H-胸苷掺入来测量增殖。数据代表在单次实验中用来自一名人献血者的细胞获得的一式三份培养物的平均cpm±SEM。使用来自第二名献血者的应答细胞和来自四倍敲除猪10262的刺激细胞观察到类似的应答模式。在用四倍敲除猪的PBMC刺激之后，人CD8+T细胞的增殖减少。(Fischer等人,Viable pigsafter simultaneous inactivation of porcine MHC Class I and three xenoreactiveantigen genes GGTA1,CMAH and B4GALNT2,Xenotransplantation,2019)。不表达SLA-1和SLA-2的经修饰的敲除PAM细胞将不产生CD8+T细胞反应。这与使用PBMC作为应答者的反应形成对比。参见图34。
可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定以确定抗HLA抗体是否识别来自本公开的生物制品的细胞。可以使用通过添加含有先前表征的抗HLA抗体(或对照血浆)的特定人血浆制备的测定板。将血浆在含钙和镁的HBSS培养基中以1:50至1:36450开始连续稀释，与经修饰或未经修饰的PAM细胞一起在4℃下孵育30分钟，随后与新鲜重构的幼兔补体一起在37℃下孵育1小时。然后将细胞用荧光素双乙酸酯(FDA)和碘化丙啶(PI)染色15分钟，并通过流式细胞术进行分析。为每个测定运行适当的补偿对照。在ACEA NovoCyte流式细胞仪上采集和分析细胞。也可以用干扰素γ处理PAM细胞，以增加MHC分子的表面表达。
在以下条件下确定细胞群：
a.死细胞：PI+、FDA-
b.损伤细胞：PI+、FDA+
c.活细胞：PI-、FDA+
进行适当的计算以确定每个血浆浓度(稀释)的细胞毒性％，并且将结果在Prism中绘图。根据细胞毒性曲线，确定了50％杀伤(IC50)的所需稀释度。这在图36A和图36B中使用针对WT或GalTKO猪PBMC的人血浆进行了说明，其中针对在糖蛋白上缺乏α1,3-半乳糖的细胞鉴定出降低的细胞毒性。
NK对未经修饰和经修饰的PAM细胞的细胞毒性，其中SLA 3、SLA 6、SLA 7和SLA 8的基因被修饰使得在细胞表面上表达的糖蛋白将分别反映HLA C、HLA E、HLA F和HLA G糖蛋白。在无血清AIM-V培养基中在4小时51Cr释放测定中测试了新鲜分离的和IL-2激活的人NK细胞的细胞毒性活性。将标记的未经修饰和经修饰的PAM细胞以在40:1至5:1范围内的四种E:T比率与连续2倍稀释的NK细胞一起一式三份培养。在37℃下孵育4小时之后，停止测定，在伽马计数器上分析51Cr的释放，并计算特异性裂解的百分比。与未经修饰的PAM细胞相比，来自特定的遗传匹配“接受者”的NK细胞将对经修饰的PAM细胞具有降低的杀伤。图34中说明了由在针对NK细胞的转染的PAEC细胞中的HLA E提供的保护。
猪淋巴母细胞样细胞上的HLA E表达抑制了异种人NK细胞毒性。2名供体(KH和MS)对分别用HLA E/A2或HLA E/B7转染的13271-E/A2或13271-E/B7(实心菱形)或未转染的13271细胞(空心三角形)的NK细胞毒性。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
在单个中试猪细胞系中进行多个同时的遗传修饰以实现相对人源化表型以及因此作为多重CRISPRCas9遗传修饰模式的直接结果的CD8+、CD4+和自然杀伤细胞免疫反应性降低
在一些方面，猪细胞系中的遗传修饰插入图33中所列的表格中所列的修饰。在一些方面，除了图33中列出的遗传修饰之外，三种主要的猪细胞表面聚糖(α-Gal、Neu5Gc和Sda)不被表达，以便减少超急性排斥现象和抗体介导的免疫途径的有害激活，即补体级联的激活。通过这一步骤，可以大致实现与非MHC细胞标志物相关的同种异体“类似”细胞的创建。
分析和分选经遗传修饰的细胞，例如来自经遗传修饰的动物的细胞或离体制备的细胞。在一些情况下，可以通过流式细胞术(例如荧光激活的细胞分选)分析和分选遗传修饰的细胞。例如，可以使用基于识别由基因编码的多肽的标记(例如荧光标记)的流式细胞术从其他细胞中检测和纯化表达所关注基因的遗传修饰细胞。所关注的基因可以是小到几百对cDNA碱基、或大到约十万对碱基的包含外显子-内含子编码序列和获得空间和时间控制的表达所必需的调控序列的基因座。优选地，重组DNA区段的大小介于25kb与大于500kb之间。在任何情况下，重组DNA区段都可能小于25kb和大于500kb。
将进一步理解的是，结合供体猪细胞中的α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的消除(例如，“单敲除”、“双重敲除”或“三重敲除”)，使供体猪细胞、组织和器官表达具体如本文所述的已知的人MHC基因型或接受者的MHC呈现出与缺乏本公开的特定SLA/MHC重新编程的三重敲除猪相比其细胞将具有降低的免疫排斥的一种猪。
通过混合淋巴细胞反应(MLR)研究来评价经修饰的猪细胞的免疫反应。通过CD8+T细胞的免疫反应来测量MHC Ia多肽的修饰或不表达对免疫反应的影响。通过NK细胞的免疫反应来测量MHC Ib多肽的修饰对免疫反应的影响。通过CD4+T细胞的免疫反应来测量MHCII多肽的修饰或不表达对免疫反应的影响。在本文中的MLR研究不仅测量了定点诱变取代的功效，而且还评价和确定了单独修饰(单独地和作为整体)的影响，因为测量是随着进行另外的定点诱变取代来重复进行的。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定以确定抗HLA抗体是否识别来自本公开的生物制品的细胞。可以使用通过添加含有先前表征的抗HLA抗体(或对照血清)的特定人血清制备的测定板。将经IFN-γ处理的供体细胞重悬并添加至测定板中，与补体来源(例如兔血清)一起孵育。在室温下孵育至少1小时之后，添加吖啶橙/溴化乙锭溶液。通过以下方式确定细胞毒性百分比：对在荧光显微镜下可视化的死细胞和活细胞计数，减去在不存在抗HLA抗体的情况下获得的自发裂解值，并用量表评分。
当敲除或以其他方式沉默表面糖聚糖时，获得了不表达糖部分的细胞系，因此在人血清中不存在天然的预先形成的抗体的结合。这是使用流式细胞术和人血清以及标记的山羊抗人IgG或IgM抗体；或者针对糖的特异性抗体来检测。结果是没有抗体与最终细胞系的结合。阳性对照是没有遗传修饰的原始细胞系(WT)。此外，分子分析证明了那些基因的变化。
在使用CRISPR技术敲除或以其他方式沉默SLA I类分子的表达时，所得的细胞系缺乏上述糖部分以及SLA I类表达。通过流式细胞术和分子基因进行分析以证明没有表面表达和在基因水平上进行的变化。使用与人PBMC和受辐照的细胞系的混合淋巴细胞反应(MLR)评估细胞反应性。与WT细胞系相比，存在T细胞增殖(主要是CD8+T细胞)的减少。
针对SLA II类分子、DR和DQ表达的反应性也被最小化或消除(没有猪DP)。在分子水平、细胞表面表达以及与人PBMC的体外反应性上进行分析。存在针对所得细胞系的反应性的显著向下调节。
为了测试细胞反应性，将所有细胞与猪IFN-γ一起孵育72小时，然后将人CD4+T细胞添加到猪细胞系中并培养7天。读数是激活/增值的形式，这取决于可用的资源。
为了观察对DQ的特异性反应，在培养物中不存在人抗原呈递细胞(APC)，使得细胞反应不是由APC呈递的猪抗原的结果。
用于移植的细胞、组织和器官的人源化的“定制的”无指定病原体的(非人)供体的产生
其他人已试图开发纯合的转基因猪，这是一个缓慢的过程，需要长达三年的时间，使用传统方法在胎儿成纤维细胞中进行同源重组，随后进行体细胞核移植(SCNT)，并且然后培育杂合转基因动物以产生纯合转基因猪。开发那些用于异种移植的转基因猪的尝试由于缺乏多能干细胞而受到阻碍，而是依赖于胎儿成纤维细胞作为进行基因工程改造的细胞。例如，第一批缺乏α(1,3)半乳糖基转移酶(GTKO)的任何功能性表达的活猪的生产最早报告于2000年。与此类先前的尝试形成对比，本公开提供了用于制备如本文所公开的非转基因重新编程猪的更快且根本不同的程序。在一些方面，猪胎儿成纤维细胞使用基因编辑进行重新编程，例如通过使用CRISPR/Cas进行精确重新编程并将经遗传修饰的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移植到猪去核卵母细胞中以产生胚胎；并且d)将所述胚胎移植到代孕猪中并使所移植的胚胎在代孕猪中生长成经遗传修饰的猪。
在确认研究结果后，繁殖遗传重新编程的猪，以便繁殖几个猪群体，每个群体都具有从上述测定中确定的所需人细胞修饰中的一种。研究猪在完全生长后的细胞活性，以确定所述猪是否表达所需的性状以避免异种移植后对猪细胞和组织的排斥。此后，繁殖具有超过一种所需人细胞修饰的进一步遗传重新编程的猪，以获得表达在异种移植后将不被人患者身体排斥的细胞和组织的猪。
从猪中产生诱导多能干细胞(iPSC)提供了超越使用来自胎儿成纤维细胞的原代细胞的机会。iPSC几乎无限增殖的能力(这与原代体细胞在它们衰老之前可以经历的有限数量的细胞分裂形成对比)可能意味着iPSC在核移植之前将耐受适应几个基因的定向变化所需的多重选择步骤，尤其是对于基因敲除和敲入。iPSC相对于体细胞的另一个优势是，据预测克隆效率应该与分化状态和相关的表观遗传状态呈负相关。本公开中提供的PAM细胞是转化的细胞系，但基因工程改造模式可以移植到猪iPSC中。然后将特定的经遗传修饰的iPSC系用于体细胞核移植(SCNT)，将经遗传修饰的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移植到猪去核卵母细胞中以产生胚胎；并且将所述胚胎移植到代孕猪中并使所移植的胚胎在代孕猪中生长成经遗传修饰的猪。这样做的优势在于所移植的细胞核含有特定的基因组，因此仔猪无需经过培育即可获得纯合的子代。仔猪的基因型和表型与iPSC相同。
经基因修饰的iPSC的特定群体可以作为特定细胞系冷冻保存，并且根据需要用于该遗传背景所需的猪的开发。培养解冻的iPSC，并且将细胞核移植到去核卵母细胞中以产生用于植入代孕猪中的囊胚/胚胎。这创建了一个活的经遗传修饰的iPSC库用于产生患者特定组织、器官或细胞移植所需的猪。
重申一下，针对这种未满足的临床需求的前一种/先前的方法恰好遵循了“一刀切”的经典医学教条。代替遵照这种局限性的方法，我们务实地展示了利用当前技术进步和基本原理来实现显著改善临床结果指标的“患者特异性”解决方案的能力。前者，我们称为“下游”方法-其必须与按顺序解决所有自然免疫过程相抗衡。后者是我们的方法，我们乐观地称为“上游”方法-代表使未完成的科学工作以协调的转化医学工作结束的一种方法。
在另一个方面，本文公开了一种用于制备本申请中所描述的遗传修饰动物的方法，所述方法包括：a)获得MHC I特异性增强体的组分、MHC I-结合肽的转运蛋白和/或C3中的一种或多种的表达降低的细胞；b)从所述细胞产生胚胎；并且c)使所述胚胎生长成遗传修饰的动物。在一些情况下，所述细胞是受精卵。
在某些方面，在将HLA/MHC序列重新编程的猪用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源之前，使它们繁殖至少一代或至少两代。在某些方面，CRISPR/Cas9组分也可以用于灭活负责PERV活性的基因，例如pol基因，从而同时从猪供体中完全消除PERV。
在某些方面，本公开包括无SLA和表达HLA的生物学重新编程猪的胚胎发生和活产。在某些方面，本公开包括对无SLA和表达HLA的生物学重新编程的猪进行配种，以产生无SLA和表达HLA的后代。在某些方面，通过猪合子的胞质内显微注射将CRISPR/Cas9组分注射到猪合子中。在某些方面，在对CRISPR/Cas9遗传修饰的猪进行选择性配种之前，将CRISPR/Cas9组分注射到猪中。在某些方面，在从猪收获细胞、组织、合子和/或器官之前，将CRISPR/Cas9组分注射到供体猪中。在某些方面，CRISPR/Cas9组分包括用于受控基因编辑的所有必需组分，所述受控基因编辑包括利用控制性gRNA分子的自灭活，如美国专利第9,834,791号(Zhang)所述，所述专利以全文引用的方式并入本文。
在确认研究结果后，繁殖遗传重新编程的猪，以便繁殖几个猪群体，每个群体都具有从上述测定中确定的所需人细胞修饰中的一种。研究猪在完全生长后的细胞活性，以确定所述猪是否表达所需的性状以避免异种移植后对猪细胞和组织的排斥。此后，繁殖具有超过一种所需人细胞修饰的进一步遗传重新编程的猪，以获得表达在异种移植后将不被人患者身体排斥的细胞和组织的猪。
可以在与医疗制品相关的各种文档中描述任何上述方案或其类似变体。此文档可以包括但不限于方案、统计分析计划、研究人员手册、临床指南、药物指南、风险评估和调解程序、处方信息以及可能与药物制品相关的其他文档。特别预期的是，这样的文档可以与细胞、组织、试剂、装置和/或遗传物质一起作为试剂盒物理包装，这可能是有益的或者由监管机构提出。
在另一个方面，本文公开了一种用于制备本申请中所描述的遗传修饰动物的方法，所述方法包括：a)获得MHC I特异性增强体的组分、MHC I-结合肽的转运蛋白和/或C3中的一种或多种的表达降低的细胞；b)从所述细胞产生胚胎；并且c)使所述胚胎生长成遗传修饰的动物。在一些情况下，所述细胞是受精卵。
从这些猪的每一头上采集的肌肉和皮肤组织样品被解剖并培养以长出成纤维细胞。然后将所述细胞收获并用于体细胞核移植(SCNT)以产生克隆。在第30天收获了多个胎儿(最多8个)。胎儿被分别解剖并平板接种在150mm培养皿上以长出胎儿成纤维细胞。在整个培养过程中，胎儿细胞系保持分离，并在每个管或培养容器上标记上胎儿编号。当汇合时，将细胞收获并以约100万个细胞/mL冷冻在含有10％DMSO的FBS中进行液氮低温储存。
从不同的实施例补充：在某些方面，将CRISPR/Cas9组分注射入猪卵母细胞、卵子、合子或胚细胞中，然后移植到寄养母亲体内。
从人源化的“定制的”无指定病原体(非人)供体创建、获得用于移植的细胞、组织和器官的个性化的致耐受性细胞、组织和器官供体源动物设施(“SAF”)
参考图37，显示了屏障源动物位置，包括但不限于可以用于安置、繁殖、维持、照料和利用封闭的猪群体(包括被指定为无病原体(“DPF”)的封闭群体(“DPF封闭群体”)102)的源动物设施(“SAF”)100。如本文所包含，SAF具有在特定的隔离屏障条件下操作的正压、生物收容特性。
如本文所描述，DPF封闭群体102由维持和繁殖以收获用于人异种移植和其他疗法的各种生物制品的源动物构成，其中此类制品具有减少的生物负荷并表现出由异种移植和其他治疗程序导致的降低的免疫原性。在一些方面，本公开的异种移植制品的免疫原性低于由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品和/或同种异体移植物。例如，如实施例1和2所示，当使用单一敲除猪作为供体动物时根据本公开制备的生物制品提供了出乎意料的高临床益处，因为尽管存在Neu5Gc和猪B4GALNT2，但是根据本公开制备的生物制品比同种异体移植物具有较低的免疫原性，具有血管形成，并且在整个研究期间内均对排斥具有抗性。
如本文中进一步所描述，SAF 100及其每个附随区域(例如，房间、套房或其他区域)可以用于安置和维持从其收获和/或处理生物制品的源动物。SAF 100及其区域被设计成最小化和消除对所收获和/或处理的生物制品的污染以及此类制品之间的交叉污染的可能性。
在SAF 100内，在一些方面，对所利用的动物区域进行通风。例如，用经过高效微粒空气(HEPA)过滤的新鲜空气从建筑物的屋顶对动物区域进行通风，例如每小时有至少10-15次换气。另外，在SAF房间(包括在异种移植药物处理套房中)中使用了一个或多个层流通风橱(例如，II类A2型层流空气生物安全柜)，以提供额外的通风，从而最小化或消除交叉污染。
在一些方面，也对所利用的区域进行温度控制和监测。例如，加热和冷却所述区域以将温度维持在例如《实验动物的护理和使用指南》(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)规定的范围内。所使用的动物饲养房间也会发出警报并集中监测高温或低温，并且如果温度超过所要求的温度，则会立即通知工作人员。
在一些方面，SAF 100对源动物具有多个级别的围堵。例如，源动物被收容在由被不锈钢闩锁固定的围栏和笼子组成的主要收容层中。关于第二收容层，功能指定区域(例如，房间、套房或其他区域)可以具有闩锁的内门、以及用卡控制访问过道的前房间。第三收容层可以包括外围栅栏。
整个SAF位于单一建筑物内。主要入口是通过经由可编程识别(ID)卡进入的单门。所有其他外门均会发出警报，保持锁定，并且仅供紧急使用。
总体上，安全性也是考虑因素以确保SAF 100的安全性，并控制进入SAF 100的个体，从而使外部污染物进入SAF 100并到达源动物的风险最小化。因此，在一个方面，SAF100的主要入口是经由可编程识别(ID)卡118通过单门116。所有其他外门120均会发出警报，保持锁定，并且仅供紧急使用。
将理解的是，如本文所公开的SAF 100及其特征被设置为实例，并且将进一步理解的是，具有各种特征的其他设施也可以用于执行本文所公开的方法和生产制品。
在一些方面，SAF 100动物计划由经验丰富的专业工作人员的团队进行许可和/或认证和监督、评估和操作。例如，所述程序已在美国国立卫生研究院(NIH)实验动物福利办公室(OLAW)的USDA动植物健康检查服务(USDA Animal and Plant Health InspectionService)(作为获得许可的动物研究机构)中注册和/或认证(确认符合公共卫生和安全(PHS)法规，实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)(在主治兽医的指导下对安置在SAF的源动物进行兽医护理)、以及其他联邦、州和地方监管机构)。
在一些方面，为了确保源动物的福利，SAF人员和源动物的看护者应根据由AAALAC认证的《动物福利法》(Animal Welfare Act)(7U.S.C.2131,以及下列等等)并按照《实验动物的护理和使用指南》(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)中所阐述的标准遵守由适当的机构动物护理和使用委员会批准的动物畜牧、组织收获和动物终止的程序。
在一些方面，看护者在根据本发明处理和护理被管理的源动物方面具有广泛的训练和经验。例如，每位看护者都接受文件化的培训计划(其涉及管理这些源动物的处理和护理的标准操作程序)，并且熟练地进行日常健康评估并确保对需要的任何动物进行及时护理。此外，在进入如本文所述的隔离区域(例如房间、套房或其他区域)之前以及按照医疗监督计划，可以对看护者进行擦洗和换衣程序的培训，以确保工作人员的健康和源动物的健康。
为了最小化和消除SAF的污染风险，进入SAF的任何人员或访客都应穿戴人员防护设备，或在进入任何收容区域之前换上设施专用的服装和鞋类。希望进入动物区域的访客必须在探访前至少24小时没有任何与活猪的接触，或者必须在进入之前在设施内冲淋。
将理解的是，本文所阐述的方法和程序是关于如何确保污染不会到达SAF 100内的源动物的实例。将进一步理解的是，还可以使用多种方法来实现源动物的无指定病原体的环境。
源动物
在一些方面，如本文所述，可以将猪用作源动物。如本文所用，除非另有说明，否则术语“猪”(swine)、“猪”(pig)和“猪”(porcine)是通用术语，是指相同类型的动物，而不考虑性别、大小或品种。将理解的是，根据本发明可以利用任何数量的源动物，包括但不限于猪、非人灵长类动物、猴、绵羊、山羊、小鼠、牛、鹿、马、狗、猫、大鼠、骡子和任何其他哺乳动物。源动物也可以包括任何其他动物，包括但不限于鸟类、鱼类、爬行动物和两栖动物。
将进一步理解，在下文中用作源动物的任何动物(包括猪)，无论这种猪可以如何配置、工程改造或以其他方式改变和/或维持，都可以根据本公开产生、培育、繁殖和/或维持来产生和维持动物和所得生物制品以用于或用于准备或追求临床异种移植。
例如，本公开包括具有特定遗传特征、育种特征和无病原体特征的某些组合的非人动物，例如猪。此类动物可以包括如上文和本文所描述的免疫基因组学重新编程的猪，所述免疫基因组学重新编程的猪具有生物学重新编程的基因组使得其不表达一个或多个细胞外表面聚糖表位(例如编码α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的基因被破坏，使得由所述基因编码的表面聚糖表位不被表达)，以及对猪SLA的其他修饰以表达MHC-I或MHC-II，和对PD-1和CTLA4的调节，如上文和本文所描述。由于本文所述的程序，所述猪至少不含以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)抗体滴度中的钩端螺旋体属(Leptospira)种、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、亮毛杜鹃和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌(Brucella suis)；
根据减少生物负荷的程序来饲养和维持，所述程序包括将所述猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
如先前所述，在一些方面，猪源动物可以具有一种或多种遗传修饰的组合，包括具有在美国专利第7,795,493号(“Phelps”)中公开的猪的一个或多个特征的“敲除”和/或“敲入”猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。这种猪缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位，所述表位负责移植后在人体内的超急性排斥。在Phelps中公开了多种生产敲除/敲入猪的方法，所述方法包括：通过一个或多个点突变(例如，通过在外显子9的第二个碱基处的T至G点突变)和/或如在Phelps(以引用的方式并入本文)的第9列第6行至第10列第13行；第21列第53行至第28列第47行；以及第31列第48行至第38列第22行处所公开的遗传靶向事件来使α-1,3-GT基因的一个或两个等位基因失活。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
类似地，在其他方面，猪源动物包括具有在美国专利第7,547,816号(“Day”)中公开的猪的一个或多个特征的“敲除”和“敲入”猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。这种猪也缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位，所述表位负责移植后在人体内的超急性排斥。在Day中公开了多种生产敲除/敲入猪的方法，所述方法包括：将卵母细胞去核，将卵母细胞与具有无功能的α-1,3-GT基因的猪细胞融合，随后植入代孕母亲体内，如在Day(以引用的方式并入本文)的第4列第61行至第18列第55行更全面地描述的。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
类似地，在其他方面，猪源动物包括具有在美国专利第7,547,522号(“Hawley”)中公开的猪的一个或多个特征的GGTA Null(“敲除”和“敲入”)猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。这种猪也缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位，所述表位负责移植后在人体内的超急性排斥。如在Hawley中所公开，敲除/敲入猪的生产包括利用同源重组技术，并且将卵母细胞去核，随后与具有无功能的α-1,3-GT基因的细胞融合并植入代孕母亲体内(如在第6列第1行至第14列第31行更全面地公开的)。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
在又其他方面，猪源动物包括具有如在美国专利第9,883,939号(“Yamada”)中描述的猪的一个或多个特征的猪和缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位的猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。在某些方面，用于根据本公开使用或修饰的猪源动物包括具有在U.S.2018/0184630(Tector,III)中描述的猪的一个或多个特征的猪，所述专利的公开内容以全文引用的方式并入本文。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
在又其他方面，猪源动物包括具有在美国专利第8,106,251号(Ayares)、第6,469,229号(Sachs)、第7,141,716号(Sachs)中公开的猪的一个或多个特征的猪，每篇所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
在一些方面，猪可以来源于一个或多个近亲繁殖系数为0.50或更高的高度近交的猪畜群(无论经遗传修饰与否(即，野生型))。近亲繁殖系数较高表示源自源动物的制品可能具有用于猪至人异种移植的更一致的生物学特性(例如，在一个方面近亲繁殖系数为0.80或更大)。在Mezrich等人,“Histocompatible Miniature Swine:An Inbred Large-Animal Model,”Transplantation,75(6):904-907(2003)中公开了动物的近亲繁殖系数。高度近交的猪畜群的实例包括在以下文献中公开的小型猪的后代小型猪：Sachs等人,“Transplantation in Miniature Swine.I.Fixation of the MajorHistocompatibility Complex,”Transplantation 22:559(1976)，其是特别是对于最终用于临床移植的器官具有合理的大小匹配的高度近交系。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
源动物也可以包括如在美国专利公开第US2017/0311579号(Tector)中描述的缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的动物猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
因此，应当理解，可以将具有一系列生物学特性(包括但不限于基因组修饰和/或其他基因工程改造特性)的多种源动物用于降低由异种移植引起的在人体内的免疫原性和/或免疫排斥(例如，急性排斥、超急性排斥和慢性排斥)。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免血栓性微血管病。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免肾小球病。将进一步理解的是，本文列出的源动物的列表不是限制性的，并且本发明涵盖具有单独或组合用于降低免疫原性和/或免疫排斥的一种或多种修饰(基因的或其他方式)的任何其他类型的源动物。
在一些实施方案中，早产猪胎儿和新生仔猪作为DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的后代出生，如根据本发明在本文中所示和所述的。
此类早产猪胎儿和新生仔猪被用作异种移植疗法的细胞、组织和器官的来源，包括但不限于再生或直接移植疗法。将理解的是，此类细胞、组织和器官可以新鲜使用或在根据本发明的冷冻保存之后使用(例如，在-80℃范围内的冷冻保存)。
在一个方面，从此类早产猪胎儿中收获间充质细胞、多能细胞、干细胞和/或其他未分化的细胞，并将其用于如本文所述的再生疗法和其他疗法，然而此类未分化的细胞可以高比例发现于猪胎儿以及新生仔猪中。由于这些细胞在妊娠早期来源于胎儿，因此它们的分化程度较低且更具有灵活性，这为再生疗法提供了更大的潜力。此外，由于这些细胞可能源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪，如本文所示和所述的，所以它们不具有导致被人免疫系统排斥的恼人的免疫原性、致病性和/或其他恼人因子，并且所述细胞将在人接受者内持续存在并分化，从而利用这些遗传和细胞构建模块恢复了模型组织的生长功能。
举例来说，可以通过本领域已知的再生细胞疗法方法(例如，通过利用生物支架)利用此类细胞产生用于异种移植的一系列器官和/或组织，包括但不限于：皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、脑、脑、软骨、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫、子宫和阴道、蜂窝组织、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、cartaginous、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、肉膜状组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织。
因此，基于其与成年猪相比的特征，可以将早产猪胎儿和新生仔猪用作根据本发明的组织、细胞和器官的来源。
封闭群体
一般封闭群体
现在参考图37，在一个方面，在外部确保动物安全以考虑作为候选者添加到安置在SAF 100内的一般封闭群体128中，以帮助在单独的隔离区域152中繁殖也安置在SAF 100内的DPF封闭群体102。控制在外部确保安全的动物向SAF的运输，以减少对潜在传染因子的暴露。此类缓解技术包括但不限于在运输期间使用灭菌的HEPA过滤笼子、使用氯己定清洗的运货车、以及不包含其他动物。
首先对候选动物进行检疫，以检查健康状况和是否适合纳入一般封闭群体128中。例如，在一些方面，首先将来自外部的动物安置在SAF内的检疫纳入区域130中，并伴随完整的健康记录(包括但不限于出生日期、疫苗接种、感染、和抗生素史)、纯种系谱和基因测试结果。这些动物在检疫纳入区域130中居住至少七(7)天，直到已评估伴随的记录并采取其他健康筛选措施(包括筛选一些传染因子)。
在一些方面，健康不良、具有可疑的医学状态或由于此类医学问题而无法接受治疗的动物将不被接受到一般封闭群体128中和/或将以其他方式从检疫区域130中淘汰。接受标准的实例包括但不限于：(a)源动物出生时没有任何在畜群中不曾预料并且可能影响动物的健康质量的先天性缺陷；(b)源动物已按年龄接受了所有疫苗接种，且并所述疫苗是杀灭剂；(c)已对源动物一生中发生的任何感染进行了检查并进行了临床干预，并且确定感染和任何治疗(如果适用)均不影响动物的健康质量；(d)已经审查了监督测试的结果，并且已经验证了在过去3个月内对源动物进行了测试(所有源动物在处死时都进行了测试，并且所有测试都必须为阴性)；(e)如果动物以任何需要医学关照的方式受到伤害，则进行了审查并且确认伤害和医学干预(如果适用)的影响对动物的健康没有影响；和/或(f)已执行PERV测试并记录了结果。
在一些方面，通过了此筛选过程和时间表的动物被移出检疫纳入区域130，并进入SAF 100内的一般保持区域132，以加入或创建现有的或新形成的一般封闭群体128。将理解的是，一般保持区域132被保持在封闭群体条件下，所述封闭群体条件基本上类似于在DPF隔离区域152中的DPF封闭群体102中所应用的条件。
将进一步理解的是，除了它们的后代之外，在外部确保安全的候选动物将永远不会成为DPF封闭群体的成员。如本文进一步描述的，来自一般封闭群体128的仔猪将被用于创建和/或繁殖DPF封闭群体。
DPF封闭群体
怀孕母猪和DPF仔猪
在一个方面，从外部或从一般封闭群体128获得怀孕母猪134(或小母猪)生产仔猪以产生和/或添加到DPF封闭群体102畜群中。例如，在一个方面，将母猪134放置在SAF内的母猪检疫区域136中直到分娩(在这一方面，通过剖腹产术)时为止，以便避免使仔猪暴露于潜在的病原体，包括猪巨细胞病毒(pCMV)。当仔猪在自然分娩期间穿过母猪的阴道时，可能发生仔猪中的pCMV传染。仔猪由于其通过如本文所述的剖腹产术分娩，防止了这种传染，并且通过本文所述的方法生产的仔猪不含pCMV。
在剖腹产术手术之前，例如手术的早晨，在无菌环境中根据标准手术室规程在SAF100内准备了手术室138，所述手术室有两侧：用于母猪剖腹产术的A侧140、和接收作为发现于或添加到DPF封闭群体中的候选者的仔猪144的B侧142。
母猪134被带入手术室138中以进行俘虏式栓系安乐死(captive bolteuthanasia)。紧随其后，将母猪134放置于左侧卧位，并用氯己定广泛地准备腹部和躯干，并以无菌方式用布帘覆盖。迅速切开侧腹切口，并分裂腹肌以进入腹膜。在双重夹紧和分开脐带后，将子宫外置化、切开并取出仔猪144。在俘虏式栓系安乐死后立即执行手术程序对于仔猪144的生存至关重要。
在出生时实施对仔猪144的感染控制。将仔猪144放置于无菌盐浴溶液中的温热的1％氯己定(或其他灭菌剂，诸如必妥碘)中，然后转移给仔猪处理者至复苏区域148以进行复苏、复温和管饲第一剂量的初乳。母猪的134屠体已被工作人员用缝线缝合上并按照适当的程序进行处理。
随后在单独的无菌仔猪检疫室150中对仔猪144进行检疫，然后转移到无指定病原体的隔离区域(“DPF隔离区域”)152，以创建或加入DPF封闭群体102。将理解的是，DPF隔离区域152可以具有适合于将DPF封闭群体管理和维持到如本文所述的配种、饲养、分娩、收获和总体管理所需的程度的任何尺寸。
在一个方面，支持DPF封闭群体的DPF隔离区域152是在较大的SAF 100内部的大约500ft2的限制访问的正压屏障隔离套房，具有支持至少9只动物(每只至多20kg)的动物畜牧能力。将理解的是，DPF隔离区域152可以显著大于此，并且根据本文所述的制品和方法，取决于对源动物数量的要求和对制品的需求，可以包括多个区域(包括但不限于多个房间和套房)。
在一些方面，在DPF隔离区域152中在无指定病原体的条件下对仔猪进行跟踪并处理仔猪。例如，在DPF隔离区域152中穿戴个人防护设备(“PPE”)(包括面罩、手套、鞋套和发帽)进行仔猪的处理。动物由干净的人员处理，这些人员没有进入安置其他猪的任何动物房间或设施。为了进行跟踪，仔猪在出生后3天进行耳朵切迹，并在断奶时(通常3-5周)用手工标记的塑料耳标对耳朵进行标记。
将理解的是，在DPF隔离区域152中的DPF封闭群体102中饲养一些仔猪作为异种移植制品的来源，并且使DPF封闭群体102中的一些仔猪成熟并用于繁殖一般封闭群体128。在繁殖一般封闭群体128的情况下，将成熟的动物从DPF隔离区域152中移出并添加到一般封闭群体128中进行配种。由于将DPF隔离区域152控制为DPF，一旦这些或任何其他动物离开DPF隔离区域152，那些动物就永远不会返回到DPF隔离区域152中。
采取预防措施以防止DPF封闭群体102内的任何动物暴露于污染(例如，从DPF封闭群体102外部的动物获得的血液、血液制品或组织)。如果DPF封闭群体102中的任何动物无意中暴露于从DPF封闭群体102外部的动物获得的血液、血液制品或组织，则将那些动物从DPF封闭群体102中移出，并且将永远不会返回到DPF封闭群体102中。所有肠胃外干预均使用无菌技术和无菌设备，并且进行常规程序，诸如疫苗接种、用药物或生物制剂治疗、静脉放血和活组织检查。通过卡访问将DPF隔离区域152仅限制于特殊授权和培训的工作人员。
在本发明的另一个方面，在一些方面，由DPF隔离区域152中的培训过的和白大褂工作人员处理和人工饲养新生仔猪，以确保它们的健康并且使它们被保持为无指定病原体的。
繁殖
能以多种方式繁殖DPF封闭群体102。例如，如本文所述，母猪134可以从外部或一般封闭群体128中获取，进行检疫，并使其仔猪144经由剖腹产术分娩，将所述仔猪进行复苏、消毒、检疫并置于DPF隔离区域152中。可以将新生仔猪保持在26-30℃或80-85°F。在一些方面，使用加热灯使动物保持温暖。新生仔猪最初被安置在SAF中的无菌中型板条箱中，底部配备有无菌毛巾/帷帘。
也能以其他方式繁殖DPF封闭群体102。例如，在一个方面，通过完全发生在DPF隔离区域152内的在DPF封闭群体102中的动物之间的自然交配来繁殖DPF封闭群体102。将理解的是，由于人工授精或不涉及自然交配的其他配种技术的结果，在DPF隔离区域152内的DPF封闭群体102中也可能发生怀孕。
在此类方面中，DPF隔离区域152内的DPF封闭群体102中的怀孕母猪154(或小母猪)携带整个妊娠，并且通过阴道活产来分娩仔猪且剖腹产术是不必要的。重要的是，由在DPF隔离区域152内的自然交配和阴道活产所产生的仔猪是无指定病原体的，包括无pCMV感染。
在阴道活产后，立即将仔猪从母猪上取下，以防止母猪伤害仔猪。然后，在如本文所述的方法中，仔猪从出生后由DPF隔离区域152中的人进行人工饲养。
在DPF封闭群体102或一般封闭群体128中交配的情况下，本文所公开的猪的配种通常是纯合至纯合的配种。在妊娠前两周，然后在整个怀孕期间，向雌性给予激素。此外，与DPF封闭群体102一样，一般封闭群体128也可以通过在一般封闭群体128中的动物之间的自然交配进行繁殖，并且也可以由于人工授精或其他不涉及自然交配的辅助生殖技术(ART)而发生。
已经开发和改进了各种技术，以从遗传优良的动物中获得大量后代，或从不育(或亚不育)动物中获得后代。这些技术包括：人工授精、配子或胚胎的冷冻保存(冷冻)、诱导多发排卵、胚胎移植、体外受精、对精子或胚胎进行性别确定、核移植、克隆等。
将人工授精(AI)用于从遗传优良的雄性中获得后代已有超过200年了。冷冻保存(冷冻)和储存精液的方法的改进使更多的牲畜生产者可使用AI。以与冷冻保存精液相同的方式，胚胎冷冻允许具有高遗传质量的动物得以全球商业化。
多发排卵和胚胎移植：胚胎移植技术的发展允许生产者从遗传优良的雌性获得多个后代。取决于物种，可以通过手术或非手术技术从具有优良遗传价值的雌性(也称为胚胎供体)中回收受精的胚胎。然后将遗传优良的胚胎移植到遗传价值较低的雌性(也称为胚胎接受者)体内。在牛和马中，有效的技术无需手术即可回收受精的胚胎，但是在每个正常生殖周期中仅产生一个或有时两个胚胎。在猪和羊中，必须通过手术技术回收胚胎。为了增加可以从遗传优良的雌性中回收的胚胎数量，用激素方案对胚胎供体进行处理以诱导多发排卵或超排卵。
体外受精：作为从供体动物收集胚胎的一种替代方法，最近已经开发了体外(在实验室中)生产胚胎的方法。所述方法也被称为体外胚胎生产。可以从不育或年老的雌性卵巢中、或从常规的胚胎供体(如上所述)中获得未成熟的卵母细胞(雌性卵)。卵子(卵)收集是使用超声和引导针从卵巢中抽吸未成熟的卵母细胞的一种非手术技术。一旦已经从卵巢中取出未成熟的卵母细胞，就让它们成熟、进行受精并体外培养至多七天，直到它们发育到适合于移植或冷冻的阶段。
自1980年代中期以来，已经开发了将核从卵裂球(来自早期以及推测未分化的分裂期胚胎的细胞)或体细胞(成纤维细胞、皮肤、心脏、神经或其他体细胞)移植到去核的卵母细胞(去除细胞核的未受精的雌性卵细胞)中的技术。这种“核移植”产生了它们本身是其他动物(转基因动物、遗传优良的动物、或生产大量乳或具有一些其他所需性状的动物等)几乎相同的副本的多个动物副本。此过程也被称为克隆。迄今为止，体细胞核移植已用于克隆牛、绵羊、猪、山羊、马、骡子、猫、兔、大鼠和小鼠。
所述技术涉及从待克隆动物的适当组织(成纤维细胞)中培养体细胞。然后将来自培养的体细胞的核显微注射到从相同或近缘物种的另一个个体获得的去核卵母细胞中。通过一个尚不了解的过程，来自体细胞的细胞核被重新编程为适合于指导胚胎正常发育的基因表达模式。在体外进一步培养和发育之后，胚胎被移植到雌性接受者中，并且最终导致活的后代诞生。通过核移植繁殖动物的成功率通常低于10％，并且取决于许多因素，包括物种、接受者卵子的来源、供体核的细胞类型、核移植前对供体细胞的处理以及核移植所使用的技术等。
最常用的ART依赖于受精作为第一步骤。卵和精子的这种结合伴随着来自父系和母系的遗传物质的重组，并且通常被称为“对遗传层面的改组(shuffling the geneticdeck)”。将理解的是，这些配种技术既可以在DPF封闭群体内作为DPF隔离区域152内的配种步骤使用，也可以在一般封闭群体中和/或从外部用作雌性的配种步骤。
在利用ART使一般封闭群体中的雌性和/或来自外部的雌性受精的情况下，从此类雌性出生的仔猪可以是如本文所述的，即，母猪134可以从外部或一般封闭群体128中获取，进行检疫，并通过剖腹产术分娩其仔猪144，并对所述仔猪进行复苏、消毒、检疫、并放置于DPF隔离区域152中。
封闭群体的维护
指定的病原体可以包括任何数量的病原体，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫和/或朊病毒(和/或与可传播的海绵状脑病(TSE)相关的其他病原体)。指定的病原体可以包括但不限于任何和全部人畜共患病毒和来自以下科的病毒：腺病毒科(adenoviridae)、指环病毒科(anelloviridae)、星状病毒科(astroviridae)、杯状病毒科(calicivirdae)、圆环病毒科(circoviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、细小RNA病毒科(picornaviridae)和呼肠孤病毒科(reoviridae)。
指定的病原体还可以包括但不限于腺病毒、虫媒病毒、动脉炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、杯状病毒、心病毒、圆环病毒2、圆环病毒1、冠状病毒、脑心肌炎病毒、附红细胞体、猪嗜血杆菌、疱疹病毒和疱疹相关病毒、虹膜病毒、嵴病毒、钩端螺菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、支原体、正粘病毒、papovirus、副流感病毒3、副粘病毒、细小病毒、pasavirus-1、瘟病毒、细小双节RNA病毒(PBV)、微小核糖核酸病毒、猪圆环病毒样(po-circo-like)病毒、猪星状病毒、猪bacovirus、猪博卡病毒2、猪博卡病毒4、猪肠病毒9、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪脊髓灰质炎病毒、猪嗜淋巴细胞疱疹病毒(PLHV)、猪粪便相关环状病毒(PoSCV)、posavirus-1、天花病毒、狂犬病相关病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、立克次体、萨佩罗病毒(sapelovirus)、札幌病毒、猪葡萄球菌(staphylococcus hyicus)、中间葡萄球菌(staphylococcus intermedius)、葡萄球菌表皮(staphylococcus epidermidis)、凝固酶阴性葡萄球菌、猪痘病毒、猪流感、捷申病病毒(teschen)、环曲病毒、猪细环病毒2(TTSuV-2)、可传播的胃肠炎病毒、水疱性口炎病毒、和/或任何和/或全部其他病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫和/或朊病毒(和/或与TSE相关的其他病原体)。在一些方面，特别是在猪畜群中，因为未在猪的自然条件下报告TSE，因此未进行TSE的测试。在其他方面，作为本公开的方法的一部分，进行了对TSE的测试。
有可以在动物畜群中测试的大量病原体，并且没有法规指南或标准，也没有该领域中关于应在供体动物中测试哪些特定组的病原体以及哪些特定组的病原体应从供体动物群体中除去以确保安全且有效的异种移植的了解。换句话说，在本公开之前，没有待测试和排除的有限数量的已鉴定的、可预测的病原体。
重要的是，本公开提供了由本发明人鉴定出对于进行安全且有效的异种移植而排除在外至关重要的特定组的病原体，如下表1中所示。
表1
Figure BDA0003331279010000751
在某些方面，本公开的制品来源于具有低于本公开中讨论的多种或全部病原体的检测水平的抗体滴度水平的动物。在某些方面，测试了移植有本公开的制品的受试者，并发现其具有低于本公开中讨论的多种或全部病原体的检测水平的抗体滴度水平。
在一些方面，本公开包括测试特定组的病原体的方法，所述特定组的病原体由不超过18-35，例如35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18种病原体组成，所述特定组的病原体包括表1中鉴定的每种病原体。在一些方面，本公开包括产生、维持和使用不含所述18-35，例如35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18种病原体的供体动物，所述特定组的病原体包括表1中鉴定的每种病原体。
如本文所述，在DPF封闭群体102内通过阴道活产出生的仔猪没有被pCMV感染，但是仍然连续进行pCMV测试。如本文所述，对猪巨细胞病毒(pCMV)和猪内源性逆转录病毒(PERV)的测试应常规且连续地进行筛选和维持，并且对于DPF封闭群体应常规且连续地进行。在本发明的一些方面，本文所述的源动物仅对PERV A和B呈阳性，而一些对PERV A、B和C呈阳性。在其他方面，源动物不含PERV A、B和/或C(通过利用CRISPR和其他技术)。
关于PERV，应当理解，已知大多数(如果不是全部)猪都对PERV A和B呈阳性。虽然认识到PERV，但是从用猪衍生的组织进行治疗传播PERV的风险预计很小。迄今为止，在所有的猪组织以及在所有品种的猪中有八种PERV mRNA表达，并且对暴露于猪细胞、组织和器官(包括胰岛)的人的临床前和临床异种移植研究均未能证明PERV的传播。参见例如，MorozovVA,Wynyard S,Matsumoto S,Abalovich A,Denner J,Elliott R,“No PERV transmissionduring a clinical trial of pig islet cell transplantation,”Virus Res 2017；227:34-40。万一发生人感染，这种情况不太可能，在普通的临床使用中PERV在体外易受核苷和非核苷逆转录酶抑制剂的影响。参见例如,Wilhelm M,Fishman JA,Pontikis R,Aubertin AM,Wilhelm FX,“Susceptibility of recombinant porcine endogenousretrovirus reverse transcriptase to nucleoside and non-nucleosideinhibitors,”Cellular&Molecular Life Sciences 2002；59:2184-90；Schuurman,H.,“Regulatory aspects of clinical xenotransplantation,”Int.J.Surg.,23,(2015),第312-321页。使用本公开的异种移植制品的实验数据表明，在接受者的器官中未检测到PERV遗传物质，并且猪DNA和细胞没有从异种移植器官迁移到接受者的循环中。
维持DPF封闭群体102以确保动物依然没有指定病原体，并且在SAF100的所有水平上(即配种、维持、繁殖)应用了适当的动物护理和福祉标准。如果动物或其亲本对表1中的任何病原体检测呈阳性，则不允许动物进入DPF封闭群体中。例如，对病原体和其他生物标志物进行连续检测，包括本文中所鉴定的众多病原体(包括但不限于pCMV和其他病原体)。根据需要收集环境和血液样品，以进行基因分型和病原体测试。由设施兽医评估针对病原体或其他健康担忧而获得的一个或多个测试结果，所述设施兽医可能会建议进行后续测试和观察，并根据需要对设施或设施内的区域(例如，房间、套房或其他区域)进行检疫。应对源动物例行护理过程中使用的任何抗微生物剂进行仔细记录，并仅使用灭活的疫苗。抗微生物剂的实例包括头孢唑林、杆菌肽、新霉素和多粘菌素。
在一些方面，每3个月进行对源动物的例行健康监测和病原体(例如，不定因子)的筛选。获得一般和DPF封闭群体中的每只动物的血清、鼻拭子和粪便样品，并且每3个月提供一次分析测试以检测此类病原体。安乐死后立即通过俘虏式栓系获得用于测试的源动物血清、鼻拭子和粪便样品，并如本文所公开的进行评估，包括以下中的一项或多项：进行无菌测定并确认在所述无菌测定中需氧和厌氧细菌不生长；进行支原体测定并确认在所述支原体测定中支原体集落不生长；进行内毒素测定并确认在内毒素测定中所述生物制品不含内毒素，进行MTT还原测定并确认在所述MTT还原测定中所述制品具有至少50％的细胞生存能力；进行流式细胞术并确认如通过所述流式细胞术确定所述制品不具有半乳糖基-a-1,3-半乳糖表位；进行对18至35种病原体特异的病原体检测测定并确认所述制品不含蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
在一些方面，所有猪都要进行例行健康监测，其包括对所有疾病、医学护理、程序、所施用的药物、疫苗接种、身体检查、所接受的任何治疗、和每天喂食时通过肉眼健康检查进行的表明动物能够站立、自由移动和在临床上看起来正常的一般健康评估和观察、以及与动物的外观、活动和食欲有关的观察进行文档编制，以及在动物畜牧业日志上记录任何缺陷。在一些方面，向动物接种针对猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌(Hemophilus Parasuis)、猪链球菌、多杀巴斯德菌(Pasteurella Multocida)、支气管脓毒症博德特菌和猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix Rhusiopathiae)的疫苗。所有六个月或以上的猪都可以接种针对猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体(Canicola-Grippotyphosa-Hardjo-Icterohaemorrhagiae-Pomona)、流感和细小病毒的疫苗。可以例如每六个月进行一次重复疫苗接种。
在一些方面，健康监测通常将作为清洁和喂养的日常畜牧程序的一部分进行，以使进入猪保持区域(例如，房间、套房或其他区域)的情况最小化。在进入之前，人员必须穿戴个人防护设备(PPE)，并确保其鞋子没有严重污染(例如，可见的灰尘或泥土)。然后，他们将在进入之前穿上一次性鞋套/靴套。与未在无指定病原体设施中安置的任何动物接触的人员如果受到污染，将更换PPE。如果对于动物饲养所而言是外源的或判断有必要，则所有工具(铲子、其他必要的工具)将进行不少于2分钟的氯己定浸泡。去除固体废物和脏的垫层。每两周至少一次用稀释的Quat-PV或漂白剂对动物保持区域进行消毒。
在一些方面，垫层每天使用经过辐照的垫层刨花进行替换。替换量为所移除量的大约相等量。每周至少替换一次所有垫层。动物畜牧业日志中记录了包括健康状态检查、清洁和水位在内的日常活动。工作人员每天收集适当标记的垃圾和生物废物，并进行焚化。
关于仔猪，新生儿由隔离套房中培训过的白大褂工作人员处理和护理。在安置仔猪之前，对所有供给、房间和板条箱进行消毒。无菌帷帘和毛巾用于衬板条箱的底部。室温控制在80-85°F。通过使用加热灯，将动物板条箱维持在85-95°F。在前2星期内，将仔猪维持在板条箱中，此后将仔猪安置在具有辐照的刨花的地板上。每天清洁板条箱，并且每天都去除和补充刨花。最初每隔1至2小时使用饲管向仔猪饲喂新鲜制备的无菌初乳(为猪配制的牛初乳IgG、Sterling Nursemate ASAP或等效物)，直到仔猪从饲喂器自我进食。在早期几天内，将仔猪每天称重两次，并且每天检查两次健康状况并记录下来。从第14天开始，每天向仔猪饲喂3次奶替代品(Ralco Birthright或等效物)，并进一步补充辐照过的仔猪谷物(无抗生素的蠕变饲料、Blue Seal 813或等效物)。记录每只仔猪在每次饲喂时进食的量。在仔猪出生后的前7天内进行疫苗接种、基因分型、耳朵切迹和尖齿修剪。在一些方面，疫苗使用灭活剂。仔猪在出生后第7天接种针对猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、多杀巴斯德菌、支气管脓毒症博德特菌和猪红斑丹毒丝菌的疫苗，并在28日龄时加强免疫。在一个方面，疫苗是灭活剂。所有六个月或以上的猪都接种针对猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体(Canicola-Grippotyphosa-Hardjo-Icterohaemorrhagiae-Pomona)、流感和细小病毒的疫苗。每六个月进行一次重复接种。
将异种移植制品的源动物在由给定程序的管理者采用的标准操作程序管理的特定隔离屏障条件下维持在正压的生物收容机构中，并在受控条件下接受特殊护理以减少不定因子。为了确保旨在用于异种移植用途的源动物的封闭群体的福利，SAF、人员和源动物的看护者应遵守动物畜牧、组织收获和动物处死的程序。在特定的隔离屏障条件下，将源动物安置在正压的生物收容机构中。
在一些方面，食物和垫层被运送到装卸码头、运输并储存在仅内部走廊的工作人员可访问的在清洁笼子清洗区域之外的特定饲料室内。所有的垫层和饲料都通过辐照灭菌，并用双袋包装以确保无菌。特定制造商将用于仔猪和更成熟动物的饲料限定为谷物饲料。其不含有任何牲畜蛋白质。供水通过使用被分配到无菌盘中的设施无菌系统或购买的无菌水来提供。保持对饲料、水和其他消耗品的存储和运送的记录，并根据方案包含制造商、批号和其他相关信息。
在一些方面，维持动物记录以描述提供给源动物持续至少两代的饲料，然后将其用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源。这包括来源、供应商以及所使用饲料类型(包括其内容物)。禁止使用源自动物的饲料。不向源动物提供含有动物蛋白或被在2008年颁布的关于源动物(21CFR 589.2000)、或用于源动物的含有明显药物污染或杀虫剂或除草剂残留物的饲料(21CFR 589.2001)的FDA饲料禁令所禁止的其他牲畜材料的饲料。
在一些方面，以足够的质量提供纯净水，以防止动物不必要地暴露于传染性病原体、药物、杀虫剂、除草剂和肥料。向新生动物提供明确符合畜群资格的初乳。在一些方面，将配制用于猪的牛初乳IgG、Sterling Nursemate ASAP或等效物用于喂养新生动物。
来源于DPF封闭群体的生物制品
生物制品
如本文所述，用于异种移植的生物制品源自根据本发明生产和维持的源动物，包括源自如本文所述的DPF封闭群体102。此类生物制品包括但不限于肝、肾、皮肤、肺、心脏、胰腺、肠、神经和其他器官、细胞和/或组织。
本公开提供了异种移植制品的连续制造方法，所述异种移植制品在进行冷冻保存的异种移植组织中具有降低的免疫原性、降低的抗原性、增加的生存能力、增加的线粒体活性、特别需要的病原体特征以及出乎意料的长保质期。连续制造方法在避免超急性排斥、延迟异种移植物排斥、急性细胞排斥、慢性排斥、疾病的跨物种传播、寄生物的跨物种传播、细菌的跨物种传播、真菌的跨物种传播、以及病毒的跨物种传播方面令人惊讶且出乎意料地有效。连续制造方法在产生其中供体动物正常生存而没有可检测的病理变化的封闭畜群方面令人惊讶且出乎意料地有效。
此类生物制品的收获发生在开始于处死源动物直到完成最终制品的生产的单一、连续且设备齐全的隔离生产事件中。通过俘虏式栓系安乐死对动物实施安乐死，如有必要，可以将其在无菌无孔袋中移动到手术室中，在所述手术室中将进行从源动物中收获生物制品的程序。手术团队的所有成员都应穿戴完全无菌的手术设备，例如，穿着无菌衣服以在接收源动物之前维持无指定病原体条件，并且在一些情况下戴上双层手套以使污染最小化，并且对手术区域和工具进行灭菌。将源动物以无菌方式从袋子和容器中取出。手术人员用杀菌剂(例如氯己定)将源动物擦洗例如至少1-10分钟，例如在将要进行手术的整个动物区域上刷洗，定期将氯己定倒在所述区域上以确保覆盖度。用打开的必妥碘刷子擦洗动物的一个或多个手术区域，并在将要进行手术的整个动物区域上用无菌水冲洗例如1-10分钟。对于手术，操作员将按照程序和其他标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体的条件。在处死动物的15小时内从源动物中收获用于异种移植的所有器官、细胞或组织。
生物制品还可以包括但不限于本文公开的那些(例如，在具体的实例中)，以及从源动物中收获的任何和所有其他组织、器官和/或纯化的或基本上纯的细胞和细胞系。在一些方面，用于如本文所述的异种移植的组织包括但不限于蜂窝组织(areolar)、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、cartaginous、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、肉膜状组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(Epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织。在一些方面，用于如本文所述的异种移植的器官包括但不限于皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、软骨、角膜、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫和阴道。
在一些方面，用于如本文所述的异种移植的纯化的或基本上纯的细胞和细胞系包括但不限于血细胞、血液前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、堆积细胞、内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、粒膜细胞、造血细胞、朗格汉斯细胞胰岛、角质形成细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、黑素细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cell)、神经细胞、其他肌肉细胞、胰腺α-1细胞、胰腺α-2细胞、胰腺β细胞、胰腺胰岛素分泌细胞、脂细胞、上皮细胞、主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、星形细胞、嗜碱性粒细胞、骨细胞、骨前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、肝细胞、角质形成细胞、库普弗(Kupffer)细胞、肝星状细胞、淋巴细胞、微血管内皮细胞、单核细胞、神经元干细胞、神经元、嗜中性白细胞、胰岛细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、血小板、原始干细胞、雪旺细胞、平滑肌细胞、甲状腺细胞、肿瘤细胞、脐静脉内皮细胞、肾上腺细胞、抗原呈递细胞、B细胞、膀胱细胞、宫颈细胞、视锥细胞、卵细胞、上皮细胞、生殖细胞、毛细胞、心脏细胞、肾细胞、leydig细胞、叶黄素细胞、巨噬细胞、记忆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、起搏器细胞、肾小管周细胞、垂体细胞、浆细胞、前列腺细胞、红细胞、视网膜细胞、杆状细胞、支持细胞(Sertoli cell)、体细胞、精细胞、脾细胞、T细胞、睾丸细胞、子宫细胞、阴道上皮细胞、白细胞、纤毛细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、子宫内膜细胞、成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、卵泡细胞、杯状细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、粘液细胞、未角质化的上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和鳞状上皮细胞。
器官是组合在一起以在体内执行一种或多种特定功能的一组相关细胞。在生物学上，皮肤是人体最大且生长最快的器官，并且被分类为外皮系统的主要组分，外皮系统是“高级”动物中发现的十种大型器官系统之一。皮肤起着多种关键的作用，包括调节温度、对外界提供动态屏障、以及充当支持庞大的感觉受体网络的导管。皮肤执行对于身体的生存和健康至关重要的多种功能。皮肤愈合以防止创伤后失血，通过散发热量来调节体温，并作为针对寒冷、吸收、分泌、热调节、感官检测和定位、以及屏障保护的一个层。实际上，不仅已经认识到皮肤移植的成功与其他器官的移植有关，而且皮肤移植体似乎比其他器官(例如，免疫特权器官(诸如肝))对排斥更敏感，并且甚至皮肤移植体已经被建议用作“前哨移植物”，即在人接受者中使用皮肤移植物作为同一接受者中对移植的实体器官排斥的早期预测因子。例如，如在Ali等人Transplant Proc.2016年10月；48(8):2565-2570中所报告，在一些肠和多脏器移植接受者中进行腹壁移植的经验提供的证据表明，排斥可能在肠同种异体移植物中出现之前表现在皮肤组分中，从而提供了期间腹壁排斥的治疗可能防止肠排斥的出现的“前导时间”。
此外，美国法典第42章第274节和第301节明确在其人体器官的正式定义中列出了皮肤，即“经修订的《国家器官移植法》(National Organ Transplant Act)第301节所涵盖的‘人体器官’(‘Human organ’)意指人(包括胎儿)的肾、肝、心脏、肺、胰腺、骨髓和其他造血干/祖细胞(不考虑其收集方法)、角膜、眼睛、骨骼、皮肤和肠，包括食管、胃、小和/或大肠、或胃肠道的任何部分。”类似地，《人体器官移植条例》(Human Organ TransplantOrdinance，HOTO)是一项防止器官交易并保护供体和接受者的自决权的国际认可的条例。这项全球立法将皮肤(以及外皮系统的整个部分)正式列为器官，并且更广泛地将器官定义为“由组织的结构化排列组成的人体的任何部分，如果将所述组织完全去除，则无法被身体再生。”接下来，移植(transplant)的正式医学定义是：“从身体的一个部分或从一个个体中去除组织，并且特别是通过手术将其植入或插入另一个身体或个体中。”HOTO将移植定义为“在移植(transplant)手术期间，无论持久性如何，将器官从一个人转移到另一个人”。
关于皮肤，移植物(graft)通常由用于实现临时的浅表伤口覆盖的脱细胞和/或重构的均质真皮薄片组成。此类移植物(graft)不保留原始组织结构，也不保留有代谢活性的原本天然存在的细胞，并且因此不会变成血管化的；未进行毛细管向内生长或血管间的连接。因此，免疫排斥不是关注的事情-皮肤移植物(graft)被移植物下面的完整宿主上皮细胞的生长所“驱逐”而非排斥。因此，尽管术语移植物(graft)可以正确地应用于此类解决方案，但是使移植体(transplant)与移植物(graft)区分开的主要特性是增加的复杂性、组织和包括一种或多种类型的组织的特性。在当前情况下，从根本上将皮肤移植体(transplant)与现有技术中已知的移植物(graft)区分开。例如，皮肤异种移植体(xenotransplant)由在最终经历免疫介导的排斥之前执行与患者原始皮肤相同的功能的活细胞组成。因此，在这种情况下，根据本公开的皮肤异种移植体(skin xenotransplant)是器官移植体(organ transplant)而不是移植物(graft)。
在从猪身上收获生物制品方面，其中所述收获包括对猪实施安乐死并从所述猪身上无菌取出生物制品；加工所述生物制品，包括在收获之后使用在3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)还原测定中不会将细胞生存能力降低至小于50％的细胞生存能力并且不会将线粒体活性降低至小于50％线粒体活性的灭菌程序进行灭菌；将所述生物制品储存在无菌容器中；并且所述非人动物是用于异种移植从非转基因遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官的非转基因遗传重新编程的猪，所述非转基因遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组已被重新编程以将野生型猪的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获序列的已知人主要组织相容性复合物序列的直系同源外显子区域的核苷酸，其中所述重新编程不引入任何移码或框架破坏。在以下公开内容和权利要求中提供了进一步的具体方面、细节和实例，并且那些方面、细节和实例的任何和所有组合构成本公开的方面。
在其他方面，异种肾脏源自根据本发明生产的基因工程改造的重新编程的和无指定病原体的猪，并且被移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少十四个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
在另一个方面，异种肺源自根据本发明生产的基因工程改造的重新编程的和无指定病原体的猪，并且被移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少30天的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少3个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少6个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少12个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
在另一个方面，异种心脏源自根据本发明生产的基因工程改造的重新编程的和无指定病原体的猪，并且移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少20个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
在另一个方面，异种神经组织源自根据本发明生产的基因工程改造的重新编程的和无指定病原体的猪，并且被移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少75天的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少3个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少6个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少12个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。zx
在另一个方面，异种肝脏源自根据本发明生产的基因工程改造的重新编程的和无指定病原体的猪，并且移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60天的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少3个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少6个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少12个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
在一些实施方案中，公开了根据本发明生产的猪肝脏用作人的身体外过滤器的用途。在Levy等人,“Liver allotransplantation after extracorporeal hepatic supportwith transgenic(hCD55/hCD59)porcine livers:Clinical results and lack of pig-to-human transmission of the porcine endogenous retrovirus,”Transplantation,69(2):272-280(2000)(“Levy”)(所述文献的全部内容以引用的方式并入本文)的一项研究中，提议经遗传修饰的转基因猪肝脏的全器官体外灌注可支撑等待人肝脏移植的患者防止暴发性肝衰竭。据报告，所使用的猪肝对于人CD55(衰变加速因子)和人CD59是转基因的，然而，这些肝不能抑制[α]-gal抗体的显著增加。
根据本发明，在一个方面，源自根据本发明的遗传重新编程的源动物的肝脏被用于体外灌注作为用于人患者的临时过滤器，直到患者接受人移植物。将理解的是，也可以利用具有另外的遗传修饰的猪，包括对本文其他地方公开的任何数量的性状进行遗传重新编程的猪。
在一个方面，如图38所示，体外回路利用充氧器(例如，Minimax
Figure BDA0003331279010000861
中空纤维充氧器)、泵(例如，带有BP50Pediatric Bio
Figure BDA0003331279010000862
离心泵的Bio-Medicus型号540Bio-
Figure BDA0003331279010000863
)和保温器(Bio-Medicus型号370BioCalTM温度控制器)。该回路还利用滚子泵(例如，Sarns型号7000；Sarns,Ann Arbor,MI)来补充回到患者的重力不足。用桥和夹子来将灌注的肝和患者分开。
在DPF隔离区域内的手术区域中，将源动物放置在一般麻醉剂(氯胺酮、甲苯噻嗪、安氟醚)下或通过俘虏式栓系实施安乐死。然后在无指定病原体条件下对源动物进行肝切除术。
在用作体外过滤器之前，可以以本领域已知的任何方式来保存肝，包括但不限于如Levy中所公开的(例如，“4℃乳酸化林格氏/白蛋白溶液，以及将套管插入门静脉(28FResearch Medical，型号SPC-641-28)和下腔静脉(36F Research Medical，型号SPC-641-36)中”)。
总胆管可以通过任何方式插管，包括但不限于Levy中所述(例如，“使用静脉内延长管(Extension Set 30，Abbott Hospitals,Inc.,Chicago,IL)以允许随后定量胆汁产生。”)
可以将源自源动物的肝制品包装起来并按照人供体肝的现行惯例运输到程序的地点。
可以例如通过用12F儿科动脉套管(例如，Medtronic DLP,Grand Rapids,MI)经皮将套管插入人患者的颈内静脉进行静脉回流、以及用19F股动脉套管(例如，MedtronicBio-Medicus,Eden Prairie,MN)经皮将套管插入患者的股静脉进行静脉流出来执行利用肝过滤制品的程序。将这些插管连接到旁路回路，所述旁路回路具有掺入其中的离心泵(例如，Bio-Medicus)、热交换器(Medtronic Bio-Medicus)、充氧器(例如，MedtronicCardiopulmonary,Anaheim,CA)和滚子泵(例如，Sarns)。
该回路用晶体预处理并运行一段时间(例如20分钟)，然后将从遗传重新编程的源动物获得的肝脏以800ml/min的稳定流速掺入，保持在临时补充有温溶液的晶体浴中。
在其他方面，异种胰腺源自根据本发明生产的基因工程改造的重新编程的和无指定病原体的猪，源自根据本发明生产的遗传重新编程的猪的异种胰腺被移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少20个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
虽然已经参考某些说明性方面(包括特征的各种组合和子组合)相当详细地描述和示出了本公开的主题，但是本领域技术人员将容易理解涵盖在本公开的范围内的其他方面及其变化和修改。此外，对这些方面、组合和子组合的描述并非旨在传达所要求保护的主题需要除了明确叙述于权利要求中的那些之外的特征或特征的组合。因此，本公开的范围旨在包括所附权利要求的精神和范围内的所有修改和变型。
在其他方面，根据本发明生产源自基因工程改造的重新编程的和无指定病原体的猪的异种真皮组合制品。
一些用于治疗烧伤和其他疾病的皮肤移植制品利用培养的表皮自体移植物(参见例如，由Vericel Corporation生产的在
Figure BDA0003331279010000881
商标名称下的制品)。此类表皮自体移植物可以用于有烧伤(包括严重烧伤)的患者，并且由于所述材料源自患者自己的皮肤，因此导致对移植的表皮材料的排斥减少或没有。
然而，此类制品仅限于表皮，并且不包括皮肤的真皮部分。参考图39，将理解的是，真皮(其通常占皮肤厚度的95％)执行与表皮(其是通常占皮肤厚度的5％的皮肤外面部分)显著不同的功能。
由于仅表皮自体移植物缺乏执行真皮关键功能的能力，因此此类制品与有活力的真皮组合使用。在一些损伤中，伤口床包括患者自身真皮的剩余部分，这是在将培养的表皮自体移植物移植到患者身上的程序中使用的理想真皮。然而，在一些情况下，烧伤更为严重，并且患者自身的真皮不再存在或不再有活力。在那些情形中，需要不同的真皮，因为仅表皮自体移植物将是不够的。
在一个方面，将由源自根据本发明的无指定病原体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的真皮组织组成的全层厚度皮肤移植物伤口敷料与培养的表皮自体移植物结合或组合使用。利用该组合的一种治疗过程如下。
具有严重烧伤伤口的患者在受伤后48-72小时内被送往手术室。在对患者进行护理后尽可能快地进行活组织检查，并根据用于产生培养的表皮自体移植物的已知程序分离表皮皮肤细胞并使其单独生长(参见例如，由Vericel Corporation生产的商标名称为
Figure BDA0003331279010000891
的制品)。
根据患者身体的损伤的多少，从健康区域获取表皮自体移植物以治疗烧伤区域和/或随后产生用于移植过程的表皮自体移植物网。
用本文所述的皮肤制品(例如，根据本发明生产的源自无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤制品)治疗严重烧伤区域。此类治疗包括临时伤口覆盖，直到利用足够的自体移植物长期治疗患者。
在应用表皮自体移植物之前，需要对伤口床进行大量清创术以确保有足够的基底。为了确认伤口床已准备好进行表皮自体移植，应用本文所述的皮肤制品(例如，根据本发明生产的源自无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤制品)以确认附着。一旦确认附着，就去除临时的伤口覆盖制品，并且在一些方面，用网状的自体移植物覆盖伤口床，并且将一种或多种培养的表皮自体移植物制品放置在顶部以封闭自体移植物网中的间隙。
清创术可以包括机械清创术、化学清创术、酶促清创术或其组合。机械清创术可以包括外科手术切除，例如去除真皮薄层直至可见健康组织的切向切除，或去除全层的真皮直至下层筋膜的筋膜切除术。切向切除术使较少有活力组织随坏死组织一起被切除，但通常导致更高的失血量，比筋膜切除术具有更大的生理应激因子，并且更可能导致“不完全的”清创术，一些失活的组织保留在原位。在筋膜切除术中，失血量和手术时间减至最少，但通常有大量健康组织随着烧伤组织一起被去除。清创剂可以包括能够通过去除外来物质和死组织来清洁烧伤伤口的剂。许多此类剂是已知的。在酶促清创术中，使用胶原酶或其他蛋白水解酶来分解细胞外基质的蛋白质，从而无需手术就可以清除掉失活的组织，同时优选地使健康组织基本上保持完整。酶促清创术涉及将蛋白水解酶和任选地其他外源酶应用于伤口表面，以分解坏死组织。酶促清创术可能是一个相对缓慢的过程，与其他局部制剂、浸泡和重复敷料相结合需要数周的时间段。可替代地，可以使用多酶制品(例如，从菠萝植物的茎中提取的那些多酶制品，例如在WO 98/053850和WO 2006/0006167中公开的，以及以商品名称
Figure BDA0003331279010000901
出售的制品中所提供的)来实现快速的酶促清创术。酶促清创术的程序通常利用酶，诸如菠萝蛋白酶衍生物、清创酶、胶原酶、木瓜蛋白酶衍生物、链激酶、舒替兰酶、纤维蛋白溶酶、脱氧核糖核酸酶、磷虾衍生物、胰蛋白酶或其组合。自溶性清创术依靠增强由于巨噬细胞和内源性蛋白水解活性而在伤口中发生的坏死组织和焦痂从健康组织中的选择性液化、分离和消化的自然过程。这通过使用闭塞性、半闭塞性或潮湿的交互式敷料来实现。酶促清创剂包括富含菠萝蛋白酶的酶制品、其他胶原酶、或能够清除失活的组织或伤口碎片的其他酶制品。NexoBridTM(MediWound Ltd.)是一种富含这种菠萝蛋白酶的制品，专门针对热变性的胶原进行降解，从而导致部分厚度或全层厚度的伤口需要伤口覆盖或敷料制品。此类制品和方法描述于美国专利第8,540,983号；第8,119,124号；第7,128,719号；第7,794,709号；第8,624,077号；和US2009/0010910A1，所述专利中每一篇以引用的方式并入本文。
在一些方面，伤口床可以包括或者可以是慢性伤口或急性伤口。慢性伤口包括但不限于静脉腿溃疡、压力性溃疡和糖尿病性足溃疡。急性伤口包括但不限于烧伤、创伤性损伤、截肢伤口、皮肤移植物供体部位、咬伤、冻疮伤口、皮肤擦伤和手术伤口。
在没有真皮的情况下，使用根据本发明生产的源自无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤制品。从此类制品中去除表皮(例如，在使用VERSAJETTMHydrosurgery系统在猪上收获真皮之前)，使得仅保留真皮。然后，将主题猪真皮放置于患者的皮下组织上，作为本文所述的培养的表皮自体移植物过程的底物。
制品特性、测试和治疗用途
在一些方面，本文所描述和公开的异种移植制品是临时的，即它们在异种移植患者中的使用是非永久性的，主要用于治疗急性疾病和损伤，与不是根据本发明生产的制品相比能够被利用更长的时间段。将理解的是，本文所描述和公开的制品的一些方面也可以是永久的或更永久的，其中移植的器官、组织和/或细胞在长得多的时间段内被人接受者接受而没有不良排斥。
在其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品是有活力的活细胞(例如，充满活力的、有生物活性的)制品；不同于由无法完成血管形成过程的最终灭菌的无活力的细胞构成的合成的或其他基于组织的制品。此外，在一些方面，本公开的制品没有被戊二醛或放射治疗灭活或“固定”。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品被最小程度地操作(例如，没有相关细胞、器官或组织的物理改变)，使得此类制品基本上处于其天然状态。
在某些方面，本文所描述和公开的异种移植制品从非人动物(例如非转基因的遗传重新编程的猪)获得，包括从非转基因的遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官，所述非转基因的遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组已被重新编程以将野生型猪的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获序列的已知人主要组织相容性复合物序列的直系同源外显子区域的核苷酸，并且其中所述遗传重新编程的猪的细胞不呈现一个或多个表面聚糖表位，其中所述重新编程不引入任何移码或框架破坏。例如，编码α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的基因被破坏，使得由所述基因编码的表面聚糖表位不被表达。在以下公开内容和权利要求中提供了进一步的具体方面、细节和实例，并且那些方面、细节和实例的任何和所有组合构成本公开的方面。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品能够与人接受者进行器质性结合，包括但不限于与血管形成、胶原生长(例如就皮肤而言)和/或来自移植接受者的其他相互作用(诱导移植物附着、器质性结合或接受者的其他临时或永久性接受)相容。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品用于异种移植中，而无需使用或至少减少使用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法来实现期望的治疗效果。
在其他方面，本文所描述和公开的一些异种移植制品(例如皮肤)通过冷冻保存来储存、新鲜储存(无冷冻)或通过其他方法储存以保存与本发明一致的此类制品。存储涉及使用保持细胞和组织生存能力的条件和过程。
在一些方面，存储可能涉及在无菌等渗溶液(例如，有或没有抗生素的无菌盐水)的任何组合中将器官、组织或细胞储存在冰上，储存在冷冻保存液体中，冷冻保存在-40℃左右或-80℃左右的温度下，以及本领域已知的其他方法。这样的存储可以发生在主要收容系统和次要收容系统中。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品用于同源用途，即，用执行与供体相同的一种或多种基本功能的对应器官、细胞和/或组织修复、重建、替换或补充接受者的器官、细胞和/或组织(例如，将猪肾用作人肾的移植体，将猪肝用作人肝的移植体，将猪皮肤用作人皮肤的移植体，将猪神经用作人神经的移植体，等等)。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品具有低的生物负荷，使可能用于增加异种移植后制品的生物负荷和人体对制品的免疫排斥的病原体、抗体、遗传标记和其他特性最小化。这可能包括通过PRR TLR检测PAMP并排斥主题异种移植制品的先天免疫系统。
将理解的是，本文所公开和描述的方面可以以任何数量的组合来应用以产生包含由本发明所涵盖的方面的一个或多个特征和/或方面的一系列或不同方面。
将理解的是，根据本发明，存在源自DPF封闭群体的制品有许多治疗应用。例如，此类制品可以用于治疗器官、细胞或组织的急性和/或慢性疾病、病症或对器官、细胞或组织的损伤，以及可以利用本文公开的制品的任何和所有其他疾病。此类治疗和/或疗法可以包括利用此类制品修复、重构、替换或补充(在一些方面是临时的，并且在其他方面是永久的)人接受者的对应器官、细胞和/或组织，所述器官、细胞和/或组织与供体执行一种或多种相同的基本功能。
具体的治疗应用包括但不限于肺移植、肝移植、肾移植、胰腺移植、心脏移植、神经移植和其他完全或部分移植。关于皮肤，治疗应用还包括但不限于对烧伤、糖尿病性溃疡、静脉溃疡、慢性皮肤病况以及其他皮肤疾病、损伤和/或病况(包括但不限于严重且广泛的深度部分厚度和全层厚度损伤、疾病和/或病况)的治疗(参见例如，本文的实施例2)；用于具有包含大于或等于30％的全身表面积的深度真皮或全层烧伤的成年和小儿患者，任选地与分层厚度自体移植物联合使用，或单独用于由于其创伤/烧伤的严重性和程度而不可以选择分层厚度自体移植物的患者；用根据本发明衍生的肝制品治疗肝衰竭、创伤、疾病、损伤和/或病况；治疗周围神经损伤、以及其他神经疾病、损伤和/或病况；以及利用从DPF封闭群体中收获的材料进行的细胞和其他疗法，包括美国专利第7,795,493号(“Phelps”)中公开的治疗用途，包括针对某些病症的细胞疗法和/或输注(如在第30列第1行至第31列第9行所公开的)和治疗某些病症或病理学(如在第31列第10至42行所公开的)，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
将理解的是，本文的疗法的具体叙述决不限制本文所公开和描述的制品的治疗应用类型，其涵盖以下器官、组织和/或细胞的急性和/或慢性疾病、病症、对以下器官、组织和/或细胞的损伤：皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、脑、脑、软骨、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫、子宫、阴道、蜂窝组织、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、cartaginous、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、肉膜状组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(Epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织；血细胞、血液前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、堆积细胞、内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、粒膜细胞、造血细胞、朗格汉斯细胞胰岛、角质形成细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、黑素细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cell)、神经细胞、其他肌肉细胞、胰腺α-1细胞、胰腺α-2细胞、胰腺β细胞、胰腺胰岛素分泌细胞、脂细胞、上皮细胞、主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、星形细胞、嗜碱性粒细胞、骨细胞、骨前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、肝细胞、角质形成细胞、库普弗(Kupffer)细胞、肝星状细胞、淋巴细胞、微血管内皮细胞、单核细胞、神经元干细胞、神经元、嗜中性白细胞、胰岛细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、血小板、原始干细胞、雪旺细胞、平滑肌细胞、甲状腺细胞、肿瘤细胞、脐静脉内皮细胞、肾上腺细胞、抗原呈递细胞、B细胞、膀胱细胞、宫颈细胞、视锥细胞、卵细胞、上皮细胞、生殖细胞、毛细胞、心脏细胞、肾细胞、leydig细胞、叶黄素细胞、巨噬细胞、记忆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、起搏器细胞、肾小管周细胞、垂体细胞、浆细胞、前列腺细胞、红细胞、视网膜细胞、杆状细胞、支持细胞(Sertoli cell)、体细胞、精细胞、脾细胞、T细胞、睾丸细胞、子宫细胞、阴道上皮细胞、白细胞、纤毛细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、子宫内膜细胞、成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、卵泡细胞、杯状细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、粘液细胞、未角质化的上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和鳞状上皮细胞。此列表绝不意味着限制治疗急性和/或慢性疾病、病症、损伤、器官或组织衰竭、以及可以利用本文公开的制品的任何和所有其他疾病的治疗用途的阵列。
关于烧伤的治疗，包括但不限于例如II度烧伤和III度烧伤，在一些方面，根据本发明衍生的皮肤制品用于治疗具有严重且广泛的深度部分厚度和/或全层厚度烧伤伤口的人患者。此类制品包含在使用前不会离体扩增并且在预期的治疗持续时间内不会从应用部位迁移的最终分化的细胞类型。因此，致瘤性的潜力可忽略不计。
此类制品粘附在伤口床上，并在烧伤后立即提供屏障功能。此类制品具有非最终灭菌的有活力的细胞，允许移植物组织在接受者中的血管形成。在一些方面，表皮保持完全完整，并且真皮组分得以保持，而没有改变各种细胞和组织的结构形态或组织。该生理机制支持移植物材料的延长生存，并提供至少一种临时的屏障功能，与同种异体移植物相比具有相等或更佳的显著的临床影响。在一些方面，如果存在或发展出感染的临床体征，例如疼痛、水肿、红斑、发热、流水、臭味或不明原因的发烧，则直到感染的临床体征在预定的时间段内(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、1周、2周、3周或4周)减轻或消除或者如果受试者的感染测试呈阴性都不应用本公开的制品。在一些方面，清洁伤口，确认其血管形成良好且无渗出。如果还使用了真皮替代物(诸如尸体同种异体移植物)，则在应用制品之前从被移植的同种异体移植物中去除表皮层，而不去除植入的真皮。表皮层可以根据设施的标准操作程序用皮刀或其他器械去除。
通常在临床实践中使用的移植物由用于实现临时的浅表伤口覆盖的脱细胞和/或重构的均质真皮薄片组成。此类常规移植物不保留原始组织结构，也不保留有代谢活性的原本天然存在的细胞，并且因此不会变成血管化的；未进行毛细管向内生长或血管间的连接。相比之下，本文所述的皮肤制品从根本上不同于此类移植物，因为本公开的制品包括与患者原始皮肤执行相同功能的活细胞，即所述制品充当器官移植体。皮肤执行与体内平衡、温度调节、液体交换和感染预防有关的另外的关键作用。没有足够量的皮肤可能会损害执行这些功能的能力，从而导致由于感染和体液损失引起的高死亡率和发病率的发生。皮肤移植体已被可靠地使用，具有防止具有严重创伤的患者出现这些结果的显著的临床益处；而不管移植物是临时的还是永久的。因此，与其他提议的移植体不同，将减少或不需要使用免疫抑制药物。实际上，在其损伤已经表现出一定水平的固有免疫功能的烧伤患者中，此类方案将是禁忌的。因此，本公开的异种移植制品(xenotransplantation product)不应与由形成为片状或网状的重构的均质野生型猪真皮组成的传统“异种移植物(xenograft)”制品(诸如EZ-DermTM或Medi-SkinTM)相混淆。此类猪异种移植物不形成血管，并且主要仅可用于浅表烧伤的临时覆盖。与之形成鲜明对比的是，本公开的异种移植制品含有与源组织相同构型和不变形态的有代谢活性的最低程度操作的细胞。
在一些方面，本公开包括使用异种移植的供体皮肤作为预测来自同一动物供体的其他器官的排斥的测试。使用人供体皮肤进行此类预测性测试的技术先前已经在例如以下文献中进行了描述：Moraes等人,Transplantation.1989；48(6):951-2；Starzl等人,Clinical and Developmental Immunology,第2013卷,文章ID 402980,1-9；Roberto等人,Shackman等人,Lancet.1975；2(7934):521-4，所述文献的公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文。Moraes报告说，交叉匹配程序在预测早期肾移植排斥方面非常准确。Shackman报告说，从活的人预期的肾供体中获取的皮肤移植物的命运与来自同一供体的肾移植的结果密切相关。根据本公开，在一个方面，本公开包括使用人患者中的异种移植皮肤样品以确定在人患者中是否存在排斥从同一动物供体异种移植的其他器官的风险的方法。
本文所述的皮肤移植方法可以用于治疗皮肤移植物可用于例如覆盖部分厚度和全层厚度伤口(包括但不限于烧伤，例如部分厚度或切除的全层厚度的烧伤伤口)；撕脱的皮肤(例如在四肢)；糖尿病伤口(例如不愈合的糖尿病足伤口、静脉淤滞性溃疡)的任何损伤。
在一些方面，本公开的异种移植制品具有满足法规要求的药代动力学和药效动力学特性。此类特性的表征需要一种关于药物吸收、分布、代谢和排泄的经典含义的独特方法。出于考虑药代动力学的目的，异种移植制品的“吸收”可以通过异种移植制品经历的血管形成过程来描述。例如，在手术后不久，皮肤异种移植制品可能以温暖、柔软和粉红色的形式呈现，然而野生型或传统的异种移植物则以未形成血管的“白色移植物”出现。在一些方面，如通过DNA PCR测试证明在移植位点之外的外周血中存在或不存在猪细胞所证实的，移植体的分布限于移植体的部位。
在其他方面，根据本发明生产的生物制品的细胞在异种移植后不会迁移到接受者中，包括迁移到接受者的循环中。这包括PERV或PERV感染的猪细胞不会迁移到接受者中。可以通过许多方式来确认此类细胞不会迁移到接受者中，所述许多方式包括通过DNA-PCR分析外周血单核细胞(PBMC)和来自移植部位的样品以及高度灌注的器官(例如肝、肺、肾和脾)的样品来确定并以其他方式证明在接受者中没有发生猪细胞(DNA)或猪逆转录病毒(RNA)组分迁移到在外周血中。
此外，异种移植制品的生物利用度和作用机理不受大小的影响。异种移植制品的分布限于施用的部位。例如，在皮肤移植体的情况下，最初由创伤或烧伤损伤产生的清创伤口床是施用部位。本公开包括测试以检测来自异种移植制品的细胞在施用部位之外的外周血、伤口床、脾和/或肾中的分布。在某些方面，这样的测试将证明来自异种移植制品的细胞在施用部位之外的外周血、伤口床、脾和/或肾中不存在。这样的测试可以包括DNA PCR测试在从其中获得制品的动物类型中存在的各种细胞标记，例如PERV、猪MHC和其他猪DNA序列。在某些方面，来自异种移植制品的细胞和核酸仍然限于施用部位。
异种移植制品的代谢，传统上定义为活的生物体通常通过专门的酶或酶促系统对药物的代谢分解，可以与上述在没有外源性免疫抑制药物的情况下发生的天然宿主排斥现象相吻合。通过与预期用于未来人使用的相同配制品和相同施用途径，此类异种移植制品在临床上可使用的时间里经历了与同种异体移植物比较物类似的延迟的免疫排斥过程。
以类似的方式，可以对异种移植制品的排泄建模，并通过由于抗体介导的血管损伤引起的移植体坏死缺血、最终引起组织死亡而导致的临床“坍陷”现象来凭经验进行监测。
与当前的护理标准相比，本公开的异种移植制品的已证明的功效以及安全性、可用性、贮存性、保质期和分布提供了显著的优势。
在一些方面，本公开的异种移植制品的“剂量”被表示为每单位移植面积的制品中有活力的细胞的百分比。因此，在一些方面，本公开的异种移植制品可以被认为类似于药物制品中的活性药物成分。
通过避免：(a)免疫或炎性细胞渗入异种移植制品或此类细胞在其他相关区室诸如血液和脑脊髓液中发生改变；(b)异种移植制品的纤维化包封，例如，导致功能受损或异种移植制品的损耗；(c)异种移植制品坏死；(d)移植物抗宿主病(GVHD)；和(e)旨在减少排斥或炎症反应的包封或屏障的体内功能和耐久性，增加了本公开的异种细胞、组织或器官的存活率。
使用FITC-IB4标记和流式细胞术，从仔猪获得血液样品并测试其表型、血细胞表面上α-半乳糖表达的缺乏。在这个发展阶段，所有后代都将在出生时进行基因分型。已经建立了一种PCR测定，以通过使用从耳朵切迹或PBMC分离的DNA确定猪是否具有野生型半乳糖-α1,3半乳糖转移酶基因(Gal-T)，或者对于Gal-T基因敲除(Gal-T-KO)是杂合的还是纯合的。按照Qiagen DNeasy试剂盒说明使用DNeasy试剂盒从PBMC(或皮肤组织)中分离基因组DNA。对基因组DNA和对照模板DNA、野生型Gal-T(+/+)杂合子Gal-T-KO(+/-)和纯合子Gal-T-KO(-/-)进行PCR。
将皮肤移植物的打孔活组织检查物与维持在75-cm2的烧瓶中的培养基(补充有10％胎牛血清和谷氨酰胺、青霉素和链霉素的达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco’smodified Eagle’s medium))中的亚汇合靶细胞、人293(肾上皮)和猪ST-IOWA细胞系共培养。使活组织检查物与靶细胞保持接触5天，其后除去培养基和剩余组织，并根据需要通过传代培养来维持靶细胞共培养物。通过培养上清液中逆转录酶(RT)活性的存在来确定靶细胞的PERV感染。将传播测定维持至少60天，然后才能视为阴性。
进行制品表征以测量安全性、身份、纯度和效力。安全性测试包括细菌和真菌的无菌性、支原体和病毒因子。本公开包括冷冻保存和存档以根据需要进一步测试所有最终的异种移植制品(即，器官的细胞或组织或活组织检查物)的样品，无论是新鲜的还是来自离体培养物。在一些情况下，例如，如果异种移植制品是整个的完整器官，则将相关的替代样品(例如，相邻组织或对侧器官)存档。
关于皮肤，猪皮肤的储存和冷冻保存还没有被充分表征，特别是在生存能力方面，因为大多数猪异种移植物是有意失活的，或者用戊二醛或放射处理“固定的”。这种信息对于支持使用活的猪皮移植物(或猪皮移植体)作为临时且临床上有利的选择是必要的。
在将异种移植制品从源动物中取出后立即进行移植的程序中，诸如整个器官的异种移植，异种移植制品的测试结果可能在其临床使用之前无法获得。在此类情况下，对源动物本身的测试可能是在程序之前可能进行的所有测试。可以根据本公开对从此类异种移植制品或适当的相关生物替代物(例如，相邻组织或对侧器官)中获取的样品进行测试。微生物检查方法可以包括下表2中阐述的方面：
表2
Figure BDA0003331279010000991
Figure BDA0003331279010001001
本公开包括使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液或pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液来制备测试悬浮液；为了悬浮巴西曲霉孢子，可以将0.05％的聚山梨醇酯80添加到缓冲液中。本公开包括在2小时内或如果储存在2℃和8℃之间则在24小时内使用悬浮液。作为准备并且然后稀释巴西曲霉或枯草芽孢杆菌的营养细胞的新鲜悬浮液的替代，制备了稳定的孢子悬浮液，并且然后将适量的孢子悬浮液用于测试接种。可以将稳定的孢子悬浮液维持在2°至8°持续有效的时间段。为了验证测试条件，使用所选稀释剂代替测试制剂进行阴性对照。必须没有微生物的生长。如在制品测试中所述，当测试制品时也进行阴性对照。阴性对照失败需要进行调查。可以根据USP 61、USP 63、USP 71、USP 85EP第2.6.13节非无菌制品的微生物检查(Microbial Examination of Non-sterile Products)(测试特定微生物)来进行微生物检查，每篇所述文献均以全文引用的方式并入本文。
关于猪巨细胞病毒(PCMV)的测试，每季度对源动物进行PCMV筛选。然而，使然后持续饲养在封闭群体中的剖腹产来源的仔猪未感染有PCMV。在本文实施例1的研究过程中进行了对PCMV的分析，并且使用以下PCR方法在打孔活组织检查中未检测到PCMV。这些结果与鼻拭子的PCR结果一致。将实时定量PCR用于PCMV测试。使用Stratagene Mx3005P通过实时PCR定量靶DNA序列。为每个基因靶标产生序列特异性引物和TaqMan探针。每个25uL PCR反应均包括靶DNA、800nM引物、200nM TaqMan探针、20nM Rox参考试剂和1x Brilliant III超快主混合物(Ultra Fast Master Mix)。PCR循环条件如下：在95℃下进行1次循环持续5分钟，然后在95℃下进行50个变性循环持续10秒，以及在60℃下进行退火延伸持续30秒，在每次延伸后收集数据。将克隆到Invitrogen TOPO质粒中的经凝胶提取的扩增子的系列稀释液用作定量标准。检测到的靶DNA的线性动态范围为10至106个拷贝。为了定量PCMV DNA，在TaqMan PCR中一式三份运行300ng异种移植物猪肾DNA。已显示对PCMV DNA聚合酶基因具有特异性的引物和探针与PLHV-1没有交叉反应性。剖腹产来源的猪作为源动物的使用，与所得封闭群体的动物畜牧业以及屏障隔离条件的维持相结合，归因于所述动物不含PCMV。关于皮肤，本发明人注意到，鉴于与同种异体移植物相当的性能，在实施例1中使用单敲除猪(与三重敲除或甚至进一步遗传修饰的猪相反)获得的安全性和功效结果十分令人惊讶。
在一些方面，用于测试异种移植制品的分析程序还可以包括：
a.USP<71>无菌性。酌情将样品转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。对于细菌抑制和真菌抑制，TSB样品掺有<100菌落形成单位(CFU)的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的24小时培养物、以及<100个的巴西曲霉孢子的接种物。FTM样品将掺有<100CFU的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和产孢梭菌的24小时培养物的接种物。如果未观察到生长，则发现所述制品具有细菌抑制和真菌抑制作用，并且未通过USP<71>无菌性测试。
b.需氧和厌氧细菌培养物。酌情将样品转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现微生物生长的迹象，则将判断所述制品符合如USP<71>所述的无菌性测试。
c.支原体测定USP<63>。将新鲜样品添加到100mL支原体Hayflick肉汤中，并在37℃下孵育至多21天。在2-4天、7-10天、14天和21天后对样品进行传代培养。然后将板在37℃下孵育至多14天，并检查支原体集落的存在。如果未检测到任何集落，则发现所述制品符合USP<63>并且不含支原体。
d.内毒素USP<85>。对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(LAL)测试的抑制/增强。将在37℃下每个样品用40mL WFI提取样品1小时。然后将样品在LAL动力学发色测试中进行测试，在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。将根据USP<85>进行测定。
e.细胞生存能力的MTT测定。使用针对[3-4,5二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)代谢的生化测定相对于对照组织样品测试了药物制品的代谢活性。将新鲜异种移植制品组织的阳性和阴性对照样品(阳性对照)或异种移植制品组织的热灭活圆盘(阴性对照)或异种移植制品的测试物品放入含有MTT溶液(在DMEM中为0.3mg/mL，0.5mL)的琥珀色微量离心管中。将圆盘用MTT甲臜处理，并在37℃和5％CO2空气的气氛下孵育180±15分钟。通过除去圆盘来终止反应，并且通过在环境温度下孵育≤24小时或在4℃下冷藏≤72小时来提取甲臜。在这段时间期间，样品要避光。提取完成后取等分试样，并测量550nm(参考波长为630nm)下的吸光度，并将其与标准曲线进行比较。
f.细胞外聚糖表位的IB4测定。将使用荧光激活流式细胞术确定细胞上不存在半乳糖基-a-1,3-半乳糖(α-Gal)表位。用荧光色素标记的异凝集素-B4(FITC-I-B4)将全血中的白细胞染色，并与从野生型阳性对照和Gal-T-KO源动物获得的血液进行两次比较。首先，在出生时对所有源动物进行测试。第二，将对从源动物处死时收集的全血进行相同的测试，并且测试基因敲除的稳定性以及α-Gal的阴性表型。异凝集素与来自野生型猪的细胞上的表位结合，但在来自Gal-T-KO猪的细胞上不发生结合。所述测定用于确认在基因工程改造的源动物中不存在α-gal表位。自发地重新激活基因以及在处死后重新表达α-Gal部分非常不可能和不合理预期的；如前所证明，其包含只会破坏异种移植制品的功效，从而导致其类似于野生型猪组织并发生超急性排斥。
g.PERV病毒测定。PERV pol定量：使用Stratagene MX300P实时热循环仪(AgilentTechnologies)，在50个循环的PERV聚合酶定量TaqMan PCR中一式三份扩增10uL的RT反应的1:625稀释液。相似地处理10uL的“无RT酶”对照RT反应的1:25稀释液。PCR条件包括终浓度为800nM的PERV pol正向和反向引物以及终浓度为200nM的PERV pol探针。使用Brilliant III超快主混合物(600880Agilent Technologies)，并用ROX报告染料(600880Agilent Technologies)和0.04单位/μL UNG核酸酶(N8080096，Life Technologies)补充至20nM。循环条件包括：在50℃下10分钟进行一次循环，然后在95℃下10分钟进行一次循环以及在95℃下10秒进行50次循环，然后在60℃下30秒，在每个循环结束时收集数据。测量每纳克输入cDNA的PERV pol的绝对拷贝以及猪MHC-I和猪GAPDH核酸的绝对拷贝。测试如本文所述解冻的打孔活组织检查物和洗涤的异种移植制品中的PERV DNA和RNA的存在。
h.组织学和形态学。遵循所描述的制造过程对异种移植制品的样品进行取样以检查细胞形态和组织。在显微镜下通过可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织的正确细胞形态和组织、以及不存在异常细胞浸润群体。
i.释放测定取样方法。一旦产生了所有单位的最终异种移植制品批次，就独立随机地选择单位以用于所需接受标准的生产发布测定中。这些单位将被标记为向各个实验室承包商发布批次，并且将根据所需的cGMP条件进行各种分析测试。
类似地，在验证供人临床使用之前，所有最终异种移植制品都必须符合接受标准以选择供体猪作为材料，包括(i)审查关于限定的纯种系谱的医学记录；(ii)审查关于通过Flowmetrics获得的α-1,3-半乳糖测试结果的医学记录；(iii)审查关于完全疫苗接种历史的医学记录；(iv)审查关于猪一生中进行的监督测试的医学记录；(v)对源动物的不定因子筛选；(vi)审查关于猪一生中的感染的医学记录；和(vi)审查关于动物病史中记录的任何皮肤异常的医学记录。
在生产过程结束时在发布供临床使用之前进行最终异种移植制品控制策略和分析测试。所需的分析测试的结果将通过异种移植制品药物制品分析证书(COA)记录下来，所述分析证书附有与每个批次的异种移植制品药物制品有关的主批次记录。
下表3是对异种移植制品材料进行的测定和一系列测试的结果的列表。
表3
Figure BDA0003331279010001041
Figure BDA0003331279010001051
在另一个方面，将理解的是，包括基于源动物开发的不定因子控制策略，包括物种、品系、地理起源、组织类型和建议的适应症。对不定因子进行分析测试，以包括细菌、真菌、支原体和病毒微生物，包括如下：
j.无细菌状态–进行细菌学筛选以确认药物制品不含人关注的潜在生物因子。进行需氧和厌氧筛选两者以确保无菌性。如本文所述将样品解冻，并酌情转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现微生物生长的迹象，则将判断所述制品符合无菌性测试。
k.无真菌学(真菌)状态–进行真菌学筛选以确认药物制品不含关注的潜在真菌因子。如本文所述将样品解冻。解冻后，将样品转移到大豆-酪蛋白消化物琼脂中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现真菌生长的迹象，则将根据USP<71>判断所述制品符合无菌性测试。
l.无支原体状态-进行支原体筛选以确认药物制品不含支原体。如本文所述将样品解冻，并且添加至100mL支原体肉汤中并在37℃下孵育至多21天。在2-4天、7-10天、14天和21天后对样品进行传代培养。然后将板在37℃下孵育至多14天，并检查支原体集落的存在。如果未检测到任何集落，则发现所述制品符合USP<63>并且不含支原体。
m.无内毒素状态–进行无内毒素状态以确认药物制品不含关注的内毒素和相关因子。对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(LAL)测试的抑制/增强。如本文所述将样品解冻，并在37℃下每个样品用40mL WFI提取1小时。然后将样品在LAL动力学发色测试中进行测试，在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。将根据USP<85>进行测定。
n.进行的病毒测定–进行病毒测定以确认源动物不含关注的潜在病毒因子，从而确认了内源性病毒(参见下文)。这包括针对特定潜伏性内源性病毒(包括PERV)的共培养和RT-PCR测试。还对动物源进行体内测定，以监测动物健康和无病毒感染，这是批次发布标准的关键方面。由于猪组织中PERV的本土性质，因此这使得有资格作为阳性结果而不排除使用这种组织。然而，已在批次发布中鉴定和表征所述病毒，以提供信息监测异种移植制品的接受者。
o.细胞生存能力测定–进行MTT测定以确认异种移植制品中细胞的生物活性状态。与阳性对照(新鲜、未冷冻保存的)和阴性对照(热变性的)相比，通过线粒体活性的替代标志物提供了生存能力的证据。细胞的活性对于异种移植制品是必需的，以提供预期的临床功能。这是批次发布标准所必需的，并且目前已确定组织生存能力应不低于新鲜组织对照比较物所展示的代谢活性的50％。
p.组织学和形态学-在显微镜下通过对表皮和真皮层的苏木精和曙红(H&E)切片染色的可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织和细胞浸润群体的正确细胞形态和组织。进行此操作以确认在异种移植制品中存在的细胞的适当生理外观和身份。异种移植制品由最低程度操作的猪真皮和表皮组织层构成。这是批次发布标准所必需的。验证了表皮层中以下细胞层(从最表面到最深)的证据：
i.角质层
ii.颗粒层
iii.棘突层
iv.基底层
验证了真皮层中以下细胞结构的证据：
v.血管、脉管系统的证据
vi.神经
vii.各种腺体
viii.毛囊
ix.胶原
经基因工程改造的源动物在基因组中不含有任何外来的、引入的DNA；所采用的遗传修饰仅是单个基因的敲除，所述单个基因负责编码引起细胞表面抗原普遍表达的酶。将理解的是，异种移植制品在一个或多个方面不结合转基因技术，诸如CD-46或CD-55转基因构建体。
进行无内毒素状态以确认药物制品不含关注的内毒素和相关因子。确保无内毒素状态的方案如下：对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(Limulus amoebocytelysate，LAL)测试的抑制/增强。将样品解冻、提取并在LAL动力学发色测试中进行测试，根据USP<85>在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。
进行MTT测定以确认制品中细胞的生物活性状态。与阳性对照(新鲜、未冷冻保存的)和阴性对照(热变性的)相比，通过线粒体活性的替代标志物提供了生存能力的证据。细胞活性是制品所必需的，以提供预期的临床功能和对于一个方面在50％至100％线粒体活性范围内的生存能力参数。
在显微镜下通过对表皮和真皮层的苏木精和曙红(H&E)切片染色的可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织和细胞浸润群体的正确细胞形态和组织。进行此操作以确认在制品中存在的细胞的适当生理外观和身份。
对于皮肤异种移植制品，验证了表皮层中以下细胞层(从最表层到最深)的证据：角质层；颗粒层；棘突层；基底层。验证了真皮层中以下细胞结构的证据：血管、脉管系统的证据；神经；各种腺体；毛囊；胶原。
可以将异种移植制品进一步处理以确保其仍然不含需氧和厌氧的细菌、真菌、病毒和支原体。在无菌条件下，在收获之后立即、在收获后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒内、在10秒至1分钟内、在1分钟至1小时内、在1小时至15小时内、或在15小时至24小时内，使用适用的无菌技术，在药物制品处理套房中的层流通风橱中，例如使用UV辐照或抗微生物剂/抗真菌剂中的一种或多种对异种移植制品进行灭菌。在一个方面，可以将制品放置于抗微生物剂/抗真菌剂浴(“抗病原体浴”)中。抗病原体浴可以包括：一种或多种抗细菌剂，例如氨苄西林、头孢他啶、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢菌素、青霉素、四环素、万古霉素等；一种或多种抗真菌剂，例如两性霉素B、唑类、咪唑类、三唑类、噻唑类、克念菌素、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素、龟裂霉素、烯丙胺、棘球白素等；和/或一种或多种抗病毒剂。抗病原体浴可以包括载体或介质作为稀释剂，例如RPMI-1640培养基。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少2种抗细菌剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少2种抗细菌剂和至少一种抗真菌剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少四种剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括不超过4、5、6、7、8、9或10种剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括前述的任何组合。
可以使用UV光灭菌对制品进行灭菌。例如，将制品放置在UV灯下一段所需的时间，例如0.5、1、1.5、2、3、4、5、6分钟或更长时间，然后翻转到另一侧，并将相反侧放在UV灯下持续相同或不同的时间段。可以基于特定的生物剂或待灭菌的生物剂的类型来改变将给定样品暴露于UV的时间，例如，如下表11所示。例如，可以使用具有至少100uW/cm2的UV-C强度的UV灯对制品灭菌至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟，并且翻转使得其相反表面暴露于所述UV灯至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟，以获得经UV处理的制品；UV-C剂量为至少100,000uW秒/cm2且至多800,000、700,000、600,000、500,000、400,000、300,000或200,000uW秒/cm2；UV-C剂量为至少200,000uW秒/cm2且至多800,000、700,000、600,000、500,000、400,000或300,000uW秒/cm2；具有至少100uW/cm2的UV-C强度的UV灯持续至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟。
制品处理发生在开始于处死源动物直到完成最终制品的生产的单一、连续且设备齐全的隔离生产事件中。通过俘虏式栓系安乐死对动物实施安乐死，如有必要，可以将其在无菌无孔袋中移动到手术室中，在所述手术室中将进行从源动物中收获生物制品的程序。手术团队的所有成员都应穿戴完全无菌的手术设备，例如，穿着无菌衣服以在接收源动物之前维持无指定病原体条件，并且在一些情况下戴上双层手套以使污染最小化，并且对手术区域和工具进行灭菌。将源动物以无菌方式从袋子和容器中取出。手术人员用杀菌剂(例如氯己定)将源动物擦洗例如至少1-10分钟，例如在将要进行手术的整个动物区域上刷洗，定期将氯己定倒在所述区域上以确保覆盖度。用打开的必妥碘刷子擦洗动物的一个或多个手术区域，并在将要进行手术的整个动物区域上用无菌水冲洗例如1-10分钟。
在一个方面，关于皮肤，由根据本发明的源自猪的真皮组织组成的全层厚度皮肤移植物伤口敷料与所培养的表皮自体移植物结合或组合使用，以产生根据本公开的和可以在本公开的方法中使用的制品。在应用表皮自体移植物之前，需要对伤口床进行大量清创术以确保有足够的基底。为了确认伤口床已准备好进行表皮自体移植，应用本文所述的皮肤制品，例如源自本公开动物的生物皮肤制品以确认附着。一旦确认附着，就去除临时的伤口覆盖制品，并且在一些方面，用网状的自体移植物覆盖伤口床，并且将一种或多种培养的表皮自体移植物制品放置在顶部以封闭自体移植物网中的间隙。
清创术可以包括机械清创术、化学清创术、酶促清创术或其组合。机械清创术可以包括外科手术切除，例如去除真皮薄层直至可见健康组织的切向切除，或去除全层的真皮直至下层筋膜的筋膜切除术。切向切除术使较少有活力组织随坏死组织一起被切除，但通常导致更高的失血量，比筋膜切除术具有更大的生理应激因子，并且更可能导致“不完全的”清创术，一些失活的组织保留在原位。在筋膜切除术中，失血量和手术时间减至最少，但通常有大量健康组织随着烧伤组织一起被去除。清创剂可以包括能够通过去除外来物质和死组织来清洁烧伤伤口的剂。许多此类剂是已知的。在酶促清创术中，使用胶原酶或其他蛋白水解酶来分解细胞外基质的蛋白质，从而无需手术就可以清除掉失活的组织，同时优选地使健康组织基本上保持完整。酶促清创术涉及将蛋白水解酶和任选地其他外源酶应用于伤口表面，以分解坏死组织。酶促清创术可能是一个相对缓慢的过程，与其他局部制剂、浸泡和重复敷料相结合需要数周的时间段。可替代地，可以使用多酶制品(例如，从菠萝植物的茎中提取的那些多酶制品，例如在WO 98/053850和WO 2006/0006167中公开的，以及以商品名称
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出售的制品中所提供的)来实现快速的酶促清创术。酶促清创术的程序通常利用酶，诸如菠萝蛋白酶衍生物、清创酶、胶原酶、木瓜蛋白酶衍生物、链激酶、舒替兰酶、纤维蛋白溶酶、脱氧核糖核酸酶、磷虾衍生物、胰蛋白酶或其组合。自溶性清创术依靠增强由于巨噬细胞和内源性蛋白水解活性而在伤口中发生的坏死组织和焦痂从健康组织中的选择性液化、分离和消化的自然过程。这通过使用闭塞性、半闭塞性或潮湿的交互式敷料来实现。酶促清创剂包括富含菠萝蛋白酶的酶制品、其他胶原酶、或能够清除失活的组织或伤口碎片的其他酶制品。NexoBridTM(MediWound Ltd.)是一种富含这种菠萝蛋白酶的制品，专门针对热变性的胶原进行降解，从而导致部分厚度或全层厚度的伤口需要伤口覆盖或敷料制品。此类制品和方法描述于美国专利第8,540,983号；第8,119,124号；第7,128,719号；第7,794,709号；第8,624,077号；和US2009/0010910A1，所述专利中每一篇以引用的方式并入本文。
在一些方面，伤口床可以包括或者可以是慢性伤口或急性伤口。慢性伤口包括但不限于静脉腿溃疡、压力性溃疡和糖尿病性足溃疡。急性伤口包括但不限于烧伤、创伤性损伤、截肢伤口、皮肤移植物供体部位、咬伤、冻疮伤口、皮肤擦伤和手术伤口。
在没有真皮的情况下，使用根据本发明生产的生物制品。从此类制品中去除表皮(例如，在使用VERSAJETTM Hydrosurgery系统在猪上收获真皮之前)，使得仅保留真皮。然后，将主题生物制品放置于患者的皮下组织上，作为本文所述的培养的表皮自体移植物过程的基质。
在一个方面，将根据本公开衍生的肝用于体外灌注作为人患者的临时过滤器，直到患者接受人移植体为止。在DPF隔离区域内的手术区域中，将源动物放置在一般麻醉剂(氯胺酮、甲苯噻嗪、安氟醚)下或通过俘虏式栓系实施安乐死。然后在无指定病原体条件下对源动物进行肝切除术。可以将源自源动物的肝制品包装起来并按照人供体肝的现行惯例运输到程序的地点。可以例如通过用动脉套管经皮将套管插入人患者的颈内静脉进行静脉回流、以及用动脉套管经皮将套管插入患者的股静脉进行静脉流出来执行利用肝过滤制品的程序。将这些套管连接到旁路回路，旁路回路装有其中并入的离心泵、热交换器、充氧器和辊式泵。将该回路用晶体预处理并运行一段时间(例如10-30分钟)，然后将根据本公开的动物的肝以稳定的流速(例如600-1000ml/min)掺入，维持在偶尔补充有温的溶液(例如30-40℃)的晶体浴中。
将理解的是，在猪至人异种移植的上下文中，每个人接受者将具有该个体独特的主要组织相容性复合物(MHC)(I类、II类和/或III类)，并且将不匹配供体猪的MHC。因此，将理解的是，当将供体猪移植物引入接受者时，猪MHC分子它们本身充当非gal异种抗原，引起来自接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。
人白细胞抗原(HLA)基因在人群体中显示出难以置信的序列多样性。例如，仅HLA-B基因就有>4,000个已知的等位基因。据信，HLA基因中的遗传多样性(其中不同等位基因具有呈递不同抗原的不同效率)是进化赋予针对人所暴露的各种不同病原体的更好的群体水平抗性的结果。这种遗传多样性在异种移植期间也呈现出问题，其中接受者的免疫反应是决定植入结果和移植后存活的最重要因素。
根据本发明的一个方面，向供体猪提供了被生物工程改造以表达一组特定的已知人HLA分子的基因组。例如在IPD-IMGT/HLA数据库(可获自ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)和international ImMunoGeneTics information
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(可获自imgt.org)中可获得此类HLA序列。例如，HLA-A1、B8，DR17是白种人中最常见的HLA单倍型，频率为5％。因此，可以使用已知的MHC/HLA序列信息结合本文提供的公开内容来执行所公开的方法。
在一些方面，鉴定出接受者的人白细胞抗原(HLA)基因和MHC(I类、II类和/或III类)并对其进行作图。将理解的是，能以本领域已知的任何方式来确定人接受者的HLA/MHC序列。例如，HLA/MHC基因通常用靶向测序方法(长读段测序或长插入短读段测序)进行分型。常规上，已经以2位数分辨率(例如，A*01)确定了HLA类型，其近似于血清抗原分组。最近，已经将序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)方法用于以4位数分辨率(例如，A*01:01)进行HLA分型，这可以区分氨基酸差异。当前，与其他常规方法相比，用于HLA分型的靶向DNA测序是最流行的HLA分型方法。由于基于序列的方法直接确定编码区域和非编码区域，因此其可以实现分别以6位数分辨率(例如A*01:01:01)和8位数分辨率(例如A*01:01:01:01)进行HLA分型。从临床角度来看，以最高分辨率进行HLA分型期望将现有HLA等位基因与新等位基因或无效等位基因区分开。此类测序技术描述于例如Elsner HA,Blasczyk R:(2004)Immunogenetics of HLA null alleles:implications for blood stem celltransplantation.Tissue antigens.64(6):687-695；Erlich RL等人(2011)Next-generation sequencing for HLA typing of Class I loci.BMC genomics.12:42-10.1186/1471-2164-12-42；Szolek A等人(2014)OptiType:Precision HLA typing fromnext-generation sequencing data.Bioinformatics 30:3310–3316；Nariai N等人(2015)HLA-VBSeq:Accurate HLA typing at full resolution from whole-genomesequencing data.BMC Genomics 16:S7；Dilthey AT等人(2016)High-accuracy HLA typeinference from whole-genome sequencing data using population referencegraphs.PLoS Comput Biol 12:e1005151；Xie C.等人(2017)Fast and accurate HLAtyping from short-read next-generation sequence data with xHLA 114(30)8059-8064中，将所述文献中的每一篇以全文引用的方式并入本文。
已知的人HLA/MHC或单个接受者的测序的HLA/MHC序列可以用作模板来修饰猪白细胞抗原(SLA)/MHC序列以与已知的人HLA/MHC序列或人接受者的HLA/MHC序列匹配，例如具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同源性。在鉴定待使用的已知人接受者HLA/MHC序列或对人接受者进行基因测序以获得HLA/MHC序列后，可以根据所需的HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行生物学重新编程。例如，向本公开的猪施用几种靶向引导RNA(gRNA)序列，以用人接受者的模板HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。
将CRISPR-Cas9用于介导猪细胞中特定天然基因座上整个MHC等位基因的快速且无痕的交换。使用具有两种gRNA的Cas9多重靶向来引入MHC等位基因侧翼的单链断裂或双链断裂，从而使得能够用模板HLA/MHC序列(以单链或双链DNA模板提供)替换。在某些方面，将CRISPR/Cas9组分注射入猪卵母细胞、卵子、合子或胚细胞中，然后转移到寄养母亲体内。
在某些方面，本公开包括无SLA和表达HLA的生物学重新编程猪的胚胎发生和活产。在某些方面，本公开包括对无SLA和表达HLA的生物学重新编程的猪进行配种，以产生无SLA和表达HLA的后代。在某些方面，通过猪合子的胞质内显微注射将CRISPR/Cas9组分注射到猪合子中。在某些方面，在对CRISPR/Cas9遗传修饰的猪进行选择性配种之前，将CRISPR/Cas9组分注射到猪中。在某些方面，在从猪收获细胞、组织、合子和/或器官之前，将CRISPR/Cas9组分注射到供体猪中。在某些方面，CRISPR/Cas9组分包括用于受控基因编辑的所有必需组分，所述受控基因编辑包括利用控制性gRNA分子的自灭活，如美国专利第9,834,791号(Zhang)所述，所述专利以全文引用的方式并入本文。
可以利用已知的基因组编辑技术进行遗传修饰，所述基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑以及成簇的规则间隔回文重复序列Cas9(CRISPR-Cas9)。这些可编程核酸酶能够实现DNA双链断裂(DSB)的靶向产生，这促进了细胞修复机制的上调，从而导致非同源末端连接(NHEJ)或同源指导的修复(HDR)的易错过程，后者可以用于整合外源供体DNA模板。CRISPR-Cas9也可以用于去除细胞中的病毒感染。例如，能以在以下文献中所描述的方式进行经由CRISPR-Cas9的遗传修饰：Kelton,W.等人,“Reprogramming MHC specificity by CRISPR-Cas9-assisted cassette exchange,”Nature,Scientific Reports,7:45775(2017)(“Kelton”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，本公开包括使用CRISPR-Cas9重新编程以介导整个等位基因(例如MHC、HLA、SLA等)的快速且无痕的交换。
在一个方面，对接受者的HLA/MHC基因进行测序，并根据接受者的HLA/MHC基因制备模板HLA/MHC序列。在另一个方面，来自WHO数据库的已知人HLA/MHC基因型可以用于本公开的猪的遗传重新编程。例如，使用聚合酶链式反应制备CRISPR-Cas9质粒，并将接受者的HLA/MHC序列作为模板克隆到质粒中。鉴定猪细胞中SLA/MHC基因座上的CRISPR切割位点，并将靶向切割位点的gRNA序列克隆到一种或多种CRISPR-Cas9质粒中。然后将CRISPR-Cas9质粒施用于猪细胞中，并在猪细胞的MHC基因座处进行CRIPSR/Cas9切割。
猪细胞中的SLA/MHC基因座被与已知的人HLA/MHC序列或接受者的测序HLA/MHC基因匹配的一个或多个模板HLA/MHC序列替换。在执行SLA/MHC重新编程步骤之后对猪细胞进行测序，以便确定是否已成功重新编程猪细胞中的HLA/MHC序列。来自HLA/MHC序列重新编程的猪的一种或多种细胞、组织和/或器官被移植到人接受者中。
在某些方面，在将HLA/MHC序列重新编程的猪用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源之前，使它们繁殖至少一代或至少两代。在某些方面，CRISPR/Cas9组分也可以用于灭活负责PERV活性的基因，例如pol基因，从而同时从猪供体中完全消除PERV。
出于修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC的目的，已对人和猪组织相容性复合物的比较基因组组织进行作图。例如，这种SLA到HLA作图可以在以下文献中找到：Lunney,J.,“Molecular genetics of the swine major histocompatibility complex,the SLAcomplex,”Developmental and Comparative Immunology 33:362-374(2009)(“Lunney”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，鉴于本公开并使用Lunney等人的作图作为参考工具，本领域普通技术人员有效且高效地对猪细胞进行遗传重新编程。
修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC使得与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同或几乎相同的来自猪细胞的特定MHC分子表达。在一个方面，本公开涉及对仅限于猪基因组的特定SLA区域的特定部分进行修饰以在猪中保持有效的免疫特性，同时当生物制品被移植到人接受者中时是低免疫原性的，使得可以减少或避免免疫抑制剂的使用。与本公开的方面形成对比，现有技术的异种移植研究需要使用免疫抑制剂来抵抗排斥。在一个方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。在一个方面，将猪基因组重新编程以敲除SLA-11；SLA-6,7,8；SLA-MIC2；和SLA-DQA；SLA-DQB1；SLA-DQB2，并敲入HLA-C；HLA-E；HLA-G；和HLA-DQ。在某些方面，在重新编程的猪基因组中降低HLA-C表达。通过对猪细胞进行重新编程以使其对人的免疫系统不可见，这种重新编程由此可以最小化甚至消除免疫反应，所述免疫反应基于供体猪细胞原本表达的猪MHC分子原本发生。
因此，将理解的是，这方面(即，将SLA/MHC重新编程以表达专门选择的人MHC等位基因)当应用于用于异种移植目的的猪细胞、组织和器官时与来自缺乏这种重新编程的野生型猪或以其他方式遗传修饰的猪(例如转基因猪或具有非特定或不同遗传修饰的猪)的细胞、组织和器官相比将减少排斥。
将进一步理解的是，结合供体猪细胞中的α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的消除(例如，“单敲除”、“双重敲除”或“三重敲除”)，使供体猪细胞、组织和器官表达具体如本文所述的已知的人MHC基因型或接受者的MHC呈现出与缺乏本公开的特定SLA/MHC重新编程的三重敲除猪相比其细胞将具有降低的免疫排斥的一种猪。
根据本公开的冷冻保存和储存包括制备根据本公开的生物制品、放置于容器中、向容器中添加冷冻介质并密封。例如，将15％的二甲亚砜(DMSO)冷冻保护介质与胎儿猪血清(FPS)或供体血清(如果没有FPS)以1:1的比率组合，过滤(0.45微米)，并在使用前冷却至4℃。随后将容器以每分钟1℃的速率在控制速率的相冷冻机(phase freezer)中冷冻至-40℃，然后迅速冷却至-80℃的温度。DMSO在冷冻过程中会替换细胞内液体。以基于冷冻小瓶的最大内部体积(10ml)比异种移植制品的体积小约40-80％或50-70％的量使用冷冻保护介质(例如CryoStor)。为了解冻用于手术用途的冷冻保存的生物制品，将密封的小瓶放置于约37℃水浴中持续大约0.5至2分钟，此时打开容器并使用无菌技术将所述制品取出。随后，制品在温和搅拌下例如在盐水中经历三次一分钟连续洗涤，以稀释并系统地除去周围的残留DMSO并防止细胞生存能力丧失。然后可以通过外科手术使用制品。
将理解的是，可以使用材料、容器和过程进行处理、储存、运输和/或以其他方式处理异种移植制品，以确保保存无菌性并防止对其造成损害。在一些方面，可以使用无菌的非粘性材料来保护异种移植制品，例如，以支撑异种移植制品并防止所述制品粘附在表面上和/或防止异种移植制品在操作、存储或运输期间的自粘。异种移植制品的意外粘附可能破坏异种移植制品的完整性，并可能降低其治疗可行性。包含无菌非粘性材料提供了保护和/或物理支持，并防止粘附。在一些方面，无菌的非粘性材料没有生物或化学活性，并且不直接影响异种移植制品本身的代谢活性或功效。
通过以下非限制性条目列表进一步描述本公开的各方面：
条目1.一种用于产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库的生物系统，其中所述生物系统具有生物活性和代谢活性，所述生物系统包括用于移植到人接受者中的遗传重新编程的非人动物中的细胞、组织和器官，
其中所述非人动物是用于异种移植从遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官的所述遗传重新编程的猪，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组已被重新编程以将在野生型猪的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获参考序列的多个合成核苷酸，并且
其中所述遗传重新编程的猪的细胞不呈现一个或多个选自α-Gal、Neu5Gc和SDa的表面聚糖表位，
并且
其中编码α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的基因被改变，使得所述遗传重新编程的猪缺乏由所述基因编码的表面聚糖表位的功能性表达，
其中所述重新编程的基因组包含以下定点诱变取代：i)所述野生型猪的SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-A、HLA-B和HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及ii)所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及iii)所述野生型猪的SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-DR和HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代，
其中所述重新编程的基因组包含A-C中的至少一个：
A)其中所述重新编程的猪核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人接受者的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，
其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏所述野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达，并且
其中所述重新编程不引入任何移码或框架破坏。
条目2.如条目1所述的生物系统，其中所述遗传重新编程的猪是非转基因的。
条目3.如条目1或条目2所述的生物系统，其中所述野生型猪的基因组的内含子区域没有被重新编程。
条目4.如条目1-3中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述遗传重新编程的猪不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
条目5.如条目1-4中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述遗传重新编程的猪根据减少生物负荷的程序来维持，所述程序包括将所述猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述病原体，并且其中所述猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
条目6.如条目1-4中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处以及在编码SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、CTLA-4、PD-L1、EPCR、TBM、TFPI和β2微球蛋白的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-1、SLA-2和SLA-DR的功能性表达。
条目7.如条目1-5中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述野生型猪基因组在CTLA-4启动子和PD-L1启动子中的一个或多个处包含重新编程的核苷酸，其中与野生型猪的CTLA-4和PD-L1的内源性表达相比，所述CTLA-4启动子和所述PD-L1启动子中的所述一个或多个被重新编程以增加重新编程的CTLA-4和重新编程的PD-L1中的一者或两者的表达。
条目8.如条目1-6中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述合成核苷酸的总数等于所替换核苷酸的总数，使得在用所述合成核苷酸重新编程所述野生型猪的基因组之后的核苷酸数量没有净损失或净增加。
条目9.如条目1-7中任一条目或组合所述的生物系统，其中用所述多个合成核苷酸的重新编程不包括编码在所述野生型猪MHC序列与所述人捕获参考序列之间保守的氨基酸的密码子区域中的核苷酸的替换。
条目10.如条目1-8中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸的定点诱变取代。
条目11.如条目1-9中任一条目或组合所述的生物系统，其中在用于生产所述非人动物的种系细胞中进行定点诱变取代。
条目12.如条目1-10中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
条目13.如条目1-11中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-A捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-1外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目14.如条目1-12中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-B捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目14.如条目1-13中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-3的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目15.如条目1-14中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-E捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-6的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目16.如条目1-15中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-F捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-7的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目17.如条目1-16中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-8的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目18.如条目1-17中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含在所述野生型猪的MHC I类链相关基因2(MIC-2)的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目19.如条目1-18中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-1、SLA-2、SLA-DR或其组合的功能性表达。
条目20.如条目1-19中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQA1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQA的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目21.如条目1-20中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQB1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQB的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目22.如条目1-21中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DRA1和HLA-DRB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DRA和SLA-DRB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代，或其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DRA和SLA-DRB1的功能性表达。
条目23.如条目1-22中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA1和HLA-DQB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DQA和SLA-DQB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目24.如条目1-23中任一条目或组合所述的生物系统，其中核苷酸的所述定点诱变取代位于在所述野生型猪的核基因组与所述已知人序列之间不保守的密码子处。
条目25.如条目1-24中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人B2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪的B2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目26.如条目1-25中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列；
条目27.如条目1-26中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组已被重新编程，使得所述经遗传重新编程的猪缺乏野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达。
条目28.如条目1-27中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人捕获参考序列的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。
条目29.如条目1-28中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目30.如条目1-29中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-DQ和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目31.如条目1-30中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ和MIC-2处的核苷酸的定点诱变取代。
条目32.如条目1-31中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DR、SLA-1和/或SLA-2的功能性表达。
条目33.如条目1-32中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组使用外显子区域的无痕交换被重新编程，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
条目34.如条目1-33中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程而不引入任何净插入、缺失、截短或其他将通过移码、无义突变、或错义突变而导致蛋白质表达的破坏的遗传改变。
条目35.如条目1-34中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组的内含子区域中的核苷酸没有被改变。
条目36.如条目1-35中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程以在重新编程的外显子区域为纯合的。
条目37.如条目1-36中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得多肽的细胞外的表型表面表达在人接受者中是致耐受的。
条目38.如条目1-37中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达通过重新编程CTLA-4启动子序列而被增加。
条目39.如条目1-38中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自人捕获参考序列CTLA-4的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型CTLA-4的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目40.如条目1-39中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的CTLA-4具有至少95％同一性的人源化CTLA-4多肽序列。
条目41.如条目1-40中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得程序性死亡配体1(PD-L1)的表达通过重新编程PD-L1启动子序列而被增加。
条目42.如条目1-41中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人PD-L1的直系同源外显子的核苷酸对野生型PD-L1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目43.如条目1-42中任一条目或组合所述的生物系统，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由人捕获参考基因组表达的PD-L1具有至少95％同一性的人源化PD-L1多肽序列。
条目44.一种获自如条目1-43中任一条目或组合所述的生物系统的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官。
条目45.如条目44所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞是干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞或分化的干细胞。
条目46.如条目45所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述干细胞是造血干细胞。
条目47.如条目44所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人组织是神经、软骨或皮肤。
条目48.如条目44所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人器官是实体器官。
条目49.一种制备遗传重新编程的猪的方法，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组缺乏选自α-Gal、Neu5Gc和SDa的表面聚糖表位的功能性表达并且被遗传重新编程以表达人捕获参考序列的人源化表型，所述方法包括：
a.获得猪胎儿成纤维细胞、猪受精卵、猪诱导多能干细胞(IPSC)或猪生殖系细胞；
b.对a)中的所述细胞进行遗传改变以缺乏功能性α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶；
c.使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas对以下的外显子区域中的核苷酸进行定点诱变取代来对b)中的所述细胞进行遗传重新编程：i)所述野生型猪的SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-A、HLA-B和HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及ii)所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及iii)所述野生型猪的SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-DR和HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代，
其中所述野生型猪的基因组的内含子区域没有被重新编程，并且
其中所述重新编程的基因组包含A-C中的至少一个：
A)其中所述重新编程的猪核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪核基因组已经被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏所述野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达，其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人接受者的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，
其中所述重新编程不引入任何移码或框架破坏，
d.从c)中的所述遗传重新编程的细胞产生胚胎；并且
e.将所述胚胎移植到代孕猪中并使所述移植的胚胎在所述代孕猪中生长。
条目50.如条目49所述的方法，其中步骤(a)还包括将野生型猪的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自所述人捕获参考序列的主要组织相容性复合物序列的直系同源外显子区域的核苷酸，其中所述替换不引入任何移码或框架破坏。
条目51.如条目49-50中任一条目或组合所述的方法，其中所述替换包括用来自所述已知人主要组织相容性复合物序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸进行定点诱变取代。
条目52.如条目49-51中任一条目或组合所述的方法，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
条目53.如条目49-52中任一条目或组合所述的方法，其中所述直系同源外显子区域位于所述野生型猪的主要组织相容性复合物的一种或多种多态性糖蛋白处。
条目54.如条目49-53中任一条目或组合所述的方法，其还包括：
用所述胚胎使所述代孕猪受孕，孕育所述胚胎，并且通过剖腹产术从所述代孕猪中分娩出仔猪，
确认所述仔猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过测定抗体滴度确定的钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、亮毛杜鹃和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌；并且
根据减少生物负荷的程序来维持所述仔猪，所述程序包括将所述仔猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述仔猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
条目55.如条目49-54中任一条目或组合所述的方法，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处以及在编码SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、CTLA-4、PD-L1、EPCR、TBM、TFPI和β2微球蛋白的外显子区域处使用所述人捕获参考序列的重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-DR、SLA-1和SLA-2的功能性表达。
条目56.如条目49-55中任一条目或组合所述的方法，其中所述野生型猪基因组在CTLA-4启动子和PD-L1启动子中的一个或多个处包含重新编程的核苷酸，其中与野生型猪的CTLA-4和PD-L1的内源性表达相比，所述CTLA-4启动子和所述PD-L1启动子中的所述一个或多个被重新编程以增加重新编程的CTLA-4和重新编程的PD-L1中的一者或两者的表达。
条目57.如条目49-56中任一条目或组合所述的方法，其中所述合成核苷酸的总数等于所替换核苷酸的总数，使得在用所述合成核苷酸重新编程所述野生型猪的基因组之后的核苷酸数量没有净损失或净增加。
条目58.如条目49-57中任一条目或组合所述的方法，其中用所述多个合成核苷酸的重新编程不包括编码在所述野生型猪MHC序列与所述人捕获参考序列之间保守的氨基酸的密码子区域中的核苷酸的替换。
条目59.如条目49-58中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸的定点诱变取代。
条目60.如条目49-59中任一条目或组合所述的方法，其中在用于生产所述非人动物的种系细胞中进行定点诱变取代。
条目61.如条目49-60中任一条目或组合所述的方法，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
条目62.如条目49-61中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-A捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-1外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目63.如条目49-62中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-B捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目64.如条目49-63中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-3的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目65.如条目49-64中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-E捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-6的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目66.如条目49-65中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-F捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-7的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目67.如条目49-66中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-8的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目68.如条目49-67中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含所述野生型猪的MHC I类链相关基因2(MIC-2)的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目69.如条目49-68中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-1、SLA-2、SLA-DR或其组合的功能性表达。
条目70.如条目49-69中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-DQA1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQA的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目71.如条目49-70中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQB1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQB的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目72.如条目49-71中任一条目或组合的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DRA1和HLA-DRB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DRA和SLA-DRB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目73.如条目49-72中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA1和HLA-DQB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DQA和SLA-DQB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目74.如条目49-73中任一条目或组合所述的方法，其中核苷酸的所述定点诱变取代位于在所述野生型猪的核基因组与所述已知人序列之间不保守的密码子处。
条目75.如条目49-74中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人B2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪的B2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目76.如条目49-75中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列。
条目77.如条目49-76中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组已被重新编程，使得所述经遗传重新编程的猪缺乏野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达。
条目78.如条目49-77中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人捕获参考序列的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。
条目79.如条目49-78中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目80.如条目49-79中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-DQ和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目81.如条目49-80中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ和MIC-2处的核苷酸的定点诱变取代。
条目82.如条目49-81中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DR、SLA-1和/或SLA-2的功能性表达。
条目83.如条目49-82中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组使用外显子区域的无痕交换被重新编程，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
条目84.如条目49-83中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程而不引入任何净插入、缺失、截短或其他将通过移码、无义突变、或错义突变而导致蛋白质表达的破坏的遗传改变。
条目85.如条目49-84中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组的内含子区域中的核苷酸没有被改变。
条目86.如条目49-85中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程以在重新编程的外显子区域为纯合的。
条目87.如条目49-86中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得多肽的细胞外的表型表面表达在人接受者中是致耐受的。
条目88.如条目49-87中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达通过重新编程CTLA-4启动子序列而被增加。
条目89.如条目49-88中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自人捕获参考序列CTLA-4的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型CTLA-4的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目90.如条目49-89中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的CTLA-4具有至少95％同一性的人源化CTLA-4多肽序列。
条目91.如条目49-90中任一条目或组合所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得程序性死亡配体1(PD-L1)的表达通过重新编程PD-L1启动子序列而被增加。
条目92.如条目49-91中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人PD-L1的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型PD-L1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
条目93.如条目49-92中任一条目或组合所述的方法，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的PD-L1具有至少95％同一性的人源化PD-L1多肽序列。
条目94.一种诱导在接受者人中对异种移植的细胞、组织或器官的至少部分免疫耐受的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目95.一种减少对异种移植物的自然杀伤细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHCIa类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目96.一种减少对异种移植物的细胞毒性T细胞淋巴细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目97.一种预防或减少在接受者人体内对异种移植的细胞、组织或器官的凝血和/或血栓性缺血的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的内皮蛋白C受体(EPCR)、血栓调节蛋白(TBM)和组织因子途径抑制剂(TFPI)中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目98.一种减少对异种移植物的MHC Ia类介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-3和所述野生型猪的MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-1和SLA-2的功能性表达；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目99.一种减少对异种移植物的MHC Ib类介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-6、SLA-7和SLA-8以及所述野生型猪的MHC Ia类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目100.一种减少对异种移植物的MHC II类介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种以及所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目101.一种抑制对异种移植物的凋亡细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
产生或获得从如条目1-48中任一条目或组合所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
条目102.一种生产用于异种移植的供体猪组织或器官的方法，其中所述供体猪组织或器官的细胞被遗传重新编程成特征在于接受者特异性表面表型，所述方法包括：
从预期的人移植接受者获得含有DNA的生物样品；
对生物样品进行全基因组测序以获得人捕获参考序列；
在基因座(i)-(v)处比较所述人捕获参考序列与所述供体猪的野生型基因组：
(i)编码SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域；
(ii)编码SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域；
(iii)编码SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域；
(iv)一个或多个编码β2微球蛋白(B2M)的外显子；
(v)SLA-MIC-2基因的外显子区域、以及编码PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI中的至少一种的基因，
为所述基因座(i)-(v)中的一个或多个创建长度为10至350个碱基对的合成供体猪核苷酸序列，其中所述合成供体猪核苷酸序列在分别与猪基因座(i)-(vi)对应的直系同源基因座(vi)-(x)处与所述人捕获参考序列具有至少95％同一性：
(vi)编码HLA-A、HLA-B和HLA-C中的至少一种的外显子区域；
(vii)编码HLA-E、HLA-F和HLA-G中的至少一种的外显子区域；
(viii)编码HLA-DR和HLA-DQ中的至少一种的外显子区域；
(ix)一个或多个编码人β2微球蛋白(hB2M)的外显子；
(x)编码来自人捕获参考序列的MIC-A、MIC-B、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI中的至少一种的外显子区域，
将(i)-(v)中的核苷酸序列替换成所述合成供体猪核苷酸序列；并且
从具有所述合成供体猪核苷酸序列的遗传重新编程的猪获得用于异种移植的猪组织或器官。
条目103.如条目102所述的方法，其还包括确认具有所述合成供体猪核苷酸序列的遗传重新编程的猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过测定抗体滴度确定的钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、亮毛杜鹃和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌。
条目104.如条目102-103中任一条目或组合所述的方法，所述方法还包括根据减少生物负荷的程序维持所述遗传重新编程的猪，所述程序包括将所述遗传重新编程的猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述遗传重新编程的猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
条目105.如条目102-104中任一条目或组合所述的方法，其还包括从所述猪中收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪实施安乐死并从所述猪中无菌地去除所述生物制品。
条目106.如条目102-105中任一条目或组合所述的方法，其还包括在收获后使用不会如通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定所确定的将细胞生存能力降低至小于50％细胞生存能力的灭菌过程对所述生物制品进行处理，包括灭菌。
条目107.如条目102-106中任一条目或组合所述的方法，其还包括在保存细胞生存能力的存储条件下将所述生物制品储存在无菌容器中。
条目108.一种筛选在所述遗传重新编程的猪中的脱靶编辑或基因组改变的方法，所述遗传重新编程的猪包含如条目1-49中任一条目或组合所述的核基因组，所述方法包括：
在对供体猪核基因组进行遗传重新编程之前，对含有来自所述供体猪的DNA的生物样品进行全基因组测序，从而获得第一全基因组序列；
在对所述供体猪核基因组重新编程之后，进行全基因组测序以获得第二全基因组序列；
比对所述第一全基因组序列和所述第二全基因组序列以获得序列比对；
分析所述序列比对以鉴定在脱靶位点处与所述猪的基因组的任何错配。
条目109.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC Ia类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪SLA-3的外显子区域用编码在所述SLA-3与来自人捕获参考序列的HLA-C之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的HLA-C的密码子进行重新编程。
条目110.如条目109所述的合成核苷酸序列，其中所述野生型猪的SLA-1和SLA-2各自包含终止密码子。
条目111.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC Ib类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域分别用编码在所述SLA-6、SLA-7和SLA-8分别与来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的密码子进行重新编程。
条目112.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有如条目109和111两者或如条目110和111两者所述的合成核苷酸序列。
条目113.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC II类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪SLA-DQ的外显子区域用编码在所述SLA-DQ分别与来自人捕获参考序列的HLA-DQ之间不保守的氨基酸的分别来自所述人捕获参考序列的HLA-DQ的密码子进行重新编程，并且其中所述野生型猪的SLA-DR包含终止密码子。
条目114.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有如以下各项所述的合成核苷酸序列：条目109和113两者；条目110和113两者；或条目112和113两者。
条目115.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪β2微球蛋白的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域用编码在所述野生型猪的β2微球蛋白与来自人捕获参考序列的β2微球蛋白之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的β2微球蛋白的密码子进行重新编程，其中所述合成核苷酸序列包含在外显子区域中的至少一个终止密码子使得所述合成核苷酸序列缺乏所述野生型猪的β2微球蛋白多肽的功能性表达。
条目116.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MIC-2的野生型猪内含子区域并且在所述野生型猪MIC-2的外显子区域用编码在所述MIC-2与来自人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B的密码子进行重新编程。
条目117.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪CTLA-4的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪CTLA-4的外显子区域用编码在所述野生型猪的CTLA-4与来自人捕获参考序列的CTLA-4之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的CTLA-4的密码子进行重新编程。
条目118.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪PD-L1的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪PD-L1的外显子区域用编码在所述野生型猪的PD-L1与来自人捕获参考序列的PD-L1之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的PD-L1的密码子进行重新编程。
条目119.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪EPCR的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪EPCR的外显子区域用编码在所述野生型猪的EPCR与来自人捕获参考序列的EPCR之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的EPCR的密码子进行重新编程。
条目120.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪TBM的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪TBM的外显子区域用编码在所述野生型猪的TBM与来自人捕获参考序列的TBM之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的TBM的密码子进行重新编程。
条目121.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪TFPI的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪TFPI的外显子区域用编码在所述野生型猪的TFPI与来自人捕获参考序列的TFPI之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的TFPI的密码子进行重新编程。
在下面的实施例中进一步详细地描述了本发明，提供所述实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1
DPF封闭群体皮肤移植物(猴子研究)
已经发现，根据本发明生产的来源于DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤移植物表现出比来源于α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪、但不是来源于DPF封闭群体猪的皮肤移植物显著更长的排斥时间。
在猴子上评估α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪(不是来源于DPF封闭群体)的排斥时间的许多先前研究表明，排斥时间在11-13天的范围内。参见例如，Albritton等人Lack of Cross-Sensitization Between alpha-1,3-Galactosyltransferase KnockoutPorcine and Allogeneic Skin Grafts Permits Serial Grafting,Transplantation第97卷，第12期，2014年6月27日(接受者狒狒的Gal-T-K皮肤移植物在12或13天时被完全排斥)；Barone等人,Genetically modified porcine split-thickness skin grafts as analternative to allograft for provision of temporary wound coverage:preliminary characterization,Burns 41(2015)565-574(接受者狒狒的Gal-T-KO皮肤移植物在11天时被完全排斥)；以及Weiner等人,Prolonged survival of Gal-T-KO swineskin on baboons,Xenotransplantation,2010,17(2):147–152(狒狒的Gal-T-KO异种分层厚度皮肤移植物在11天时被完全排斥)。
在非临床研究中已经表明，本发明与其同种异体移植物比较物相比具有同等且令人惊讶地好的表现，而没有质量不一致、不靠性和可获得性有限的固有缺点。也就是说，令人惊讶地，至少第1号研究表明，根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤移植物的表现优于同种异体移植物。
申请人的两项最新研究(下文列出的第1号研究和第2号研究)证明，根据本发明生产的源自DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤移植物在研究2中在猴子上表现出显著更高的排斥时间，超过30天。本实施例中经基因工程改造的源动物在基因组中不含有任何外来的、引入的DNA；所采用的遗传修饰仅是单个基因的敲除，所述单个基因负责编码引起细胞表面抗原普遍表达的酶。该实施例中的异种移植制品不结合转基因技术，诸如CD-46或CD-55转基因构建体。
第1号研究
这项研究评估了全层厚度皮肤病变实验模型中在食蟹猴(Macaca fascicularis)中将DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪异种移植制品材料与同种异体移植物相比作为在自体移植物放置之前的临时伤口移植物。
主要终点包括筛选在移植物和接受者中的猪内源性逆转录病毒(PERV)，以及评估异种移植制品和同种异体移植物排斥以及它们对最终自体移植物成活的潜在影响。次要终点包括尸检时收集的肾、脾、肝、肺移植物和伤口床组织的微生物学和组织病理学分析。
这项研究中招募了四(4)只食蟹猴。在第0天，在每只动物的背侧区域上产生测量大约为2-3cm x 2-3cm的四(4)个全层厚度伤口床。
最初，在第0天，用异种皮肤(异种移植制品)、分层厚度Gal-T转基因猪异种移植制品材料或同种异体皮肤(同种异体移植物)(分层厚度同种异体移植物材料)治疗伤口。
在研究的第15天，移除异种移植制品和同种异体移植物，并替换成分层厚度自体皮肤移植物(自体移植物)，此后动物存活到研究的第22天(垂死牺牲动物1001和1004除外)。
用异种移植制品或同种异体移植物治疗并在第12或15天移除(图40A)并存活直至第22天(图40B)的食蟹猴模型中全层厚度伤口床的显微镜评估表明，没有证据表明异种移植制品或同种异体移植物中任何一种引起急性组织排斥，当与同种异体移植物检品相比时用异种移植制品检品的总体性能相当至稍微更好，并且在用异种移植制品或同种异体移植物检品预处理后自体移植物的性能一般至良好。异种移植制品的显著存活时间促使进行了后续研究(第2号研究)。
第2号研究
这项研究的目的是评估DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪异种移植制品材料在食蟹猴(macaca fascicularis)中的安全性和免疫原性。
主要终点包括在移植物放置之前和之后筛选猪内源性逆转录病毒(PERV)，以及评估异种移植制品的排斥。
这项研究中招募了四(4)只食蟹猴。在第0天在每只动物的背侧区域上产生两(2)个9cm2全层厚度伤口床。
用由真皮和表皮组织层组成的分层厚度Gal-T-敲除猪异种移植物材料治疗伤口。
图41显示了在非人灵长类动物接受者中用作治疗全层厚度伤口缺损的临时伤口闭合的猪分层厚度皮肤移植物的纵向进展。左：POD-0，在伤口部位2处的异种移植物。右：POD-30，在伤口部位2处的相同异种移植物。图42显示了以下的POD-30组织学图像：顶部、中心：H&E，伤口部位的低倍图像描绘了完整的上皮覆盖。虚线圈住的是残留的异种移植物组织。底部，左侧：H&E，大插入框的高倍图像。虚线的右下方是异种移植物的真皮组分，其中异种移植物的真皮基质用空心箭头表示。虚线的左侧是宿主真皮(黑色箭头)和宿主真皮基质。存在轻度炎症，并将其解释为对异种移植物检品的反应。底部，右侧：H&E，小插入框的高倍图像。虚线粗略地表明了异种移植物检品(虚线下方)和新的胶原组织(虚线上方)之间的连接，图像顶端是完整上皮。观察到响应于异种移植物的轻度炎症(空心箭头)。
图43A绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgMELISA(μg/mL)。图43B绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgG ELISA(μg/mL)。在一些方面，移植有本公开的制品的受试者将具有各自小于20,000μg/ml的血清IgM和IgG水平。在一些方面，移植有本公开的制品的受试者将具有比在移植之前测量的血清IgM和IgG水平高了低于或小于10％、5％、3％或1％的血清IgM和/或IgG水平。在一些方面，所要求保护的方法可以证明免疫反应发生率为移植有本公开的制品的受试者的小于5％、3％或1％。
图44A绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的可溶性CD40L的全身浓度。图44B绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的TGF-α的全身浓度。图44C绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的IL-12/23(p40)的全身浓度。
在30或31天时将动物处死，对于睾丸和附睾，将伤口部位收集并固定在10％的中性缓冲福尔马林(NBF)或改良的戴维森氏溶液(Davidson’s Solution)中。应当注意，尽管由于研究设计并且出于比较目的而将动物在30或31天处死，但是本公开的异种移植制品能够抵抗比本实施例中使用的研究时间更长的排斥时间。
用异种移植物治疗并在第30或31天处死的食蟹猴模型中的全层厚度伤口床的显微镜评估表明，宿主和异种移植组织能够很好地填补伤口缺损。
通过专门的(猪特异性)聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶PCR(RT-PCR)测试样品，在指定的术后间隔分别进行猪内源性逆转录病毒(PERV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的筛选。评估猪异种移植物、接受者的裂解的PBMC、接受者的伤口床、以及尸检时来自接受者的高灌注器官中的猪细胞迁移的存在。所有测试均用DNA和RNA以及测定性能的内部对照一式三份进行。对肾、脾、肝、肺、异种移植物、同种异体移植物、尸检时收集的伤口床组织进行微生物学(细菌、真菌、病毒)测定和组织病理学分析，并进行外周血分析以测试异种移植物相关的免疫原性生物标志物。对以下样品进行DNA PCR来测试在用本公开的制品治疗的食蟹猴模型的PBMC中的猪细胞迁移：(A.)(3)个全层厚度(异种移植物)伤口床，(B)(3)个全层厚度(同种异体移植物)伤口床；(C)(2)个脾样品；(D)(2)个肾样品。没有证据表明细胞向宿主的全身性迁移或人畜共患传播。如用猪MHC对照所确认，PERV的存在归因于伤口床中残留的猪细胞。我们的结果表明，猪DNA和细胞没有从移植物迁移到移植物接受者的循环中，同样，PERV或感染PERV的猪细胞也没有迁移通过伤口床。
下表4显示了对猪细胞迁移和传播的分析：
表4
Figure BDA0003331279010001421
Figure BDA0003331279010001431
表4的关键：
阴性(-)＝阴性
阳性(+)＝阳性
*＝由于不相关的、研究设计相关的后勤或保存问题而无法进行的测试或不可接受的样品
阳性(+)A对NHP 1004(PERV阳性)的伤口床进行了共培养研究，以确定在移植物与接受者(宿主)之间的界面上存在的检测到的病毒是否可能感染获准的人细胞。
在培养23天之后，异种移植物和接受者伤口床细胞与用于PERV感染和复制的获准的人细胞进行共培养未证明在靶细胞(HEK293)中有效的感染。
Figure BDA0003331279010001432
1.由Rosales等人开发的病理成分得分。47
2.pc＝血管周围细胞—在深层和浅表真皮中在真皮血管(小静脉、毛细血管和小动脉)周围的细胞数量；对涉及最多的血管进行评分；pc3>50个细胞/血管
3.pa＝血管周围真皮浸润面积—在40x放大倍数下由涉及最多的真皮血管所占据的面积百分比；pa3>75％
4.ei＝表皮浸润—每四个20x视野的单核细胞总数；ei3＝经表皮浸润，ei2>20个细胞
5.e＝表皮损伤和坏死—存在角质细胞凋亡和坏死；e3＝脱落，e2＝局灶性坏死，e1＝细胞凋亡
6.v＝动脉内膜炎—动脉内皮下的单核细胞；对涉及最多的动脉进行评分；v0＝无
7.c＝毛细血管炎—每个毛细血管横截面的细胞最大数；对涉及最多的毛细血管进行评分；c1＝2-4/毛细血管，c0＝0-1/毛细血管
8.cav＝慢性同种异体移植血管病变—内膜增厚伴管腔减少；以管腔减少百分比评分；cav0＝无
在研究过程中所有异种移植物的总体外观都是粉红色的，触感温暖并粘附在伤口床上。在POD-14时外科医生首先注意到表皮松解(轻度至中度)，但真皮粘附。在POD-21时的评估揭示伤口床重新形成肉芽并且有再生上皮的迹象，因此到POD-30时，20％至100％的伤口已经再生上皮。(表5)在这些皮肤异种移植物的临床过程期间，没有异种移植组织脱落和伤口床暴露。
在POD-30时获得的含有残留皮肤异种移植物和底层伤口床的苏木精和曙红(H&E)制备切片由不知情的病理学家进行显微镜评价。H&E染色显示最小至中度炎症反应。八个治疗部位中的四个中有上皮溃疡。伤口部位的反应通过用周围是新胶原的可变层的成熟的真皮胶原网络填充伤口缺损来表征。这种成熟的胶原网络在外观上与伤口部位边缘的宿主真皮不同，并且被解释为异种移植真皮。将皮肤异种移植物使用系统病理成分评分和班夫分类进行评估47。班夫分类可用于对异种移植排斥进行分类，并且辅以成分评分方法，从而为排斥的诊断提供一组更全面的临床阈值。此评估的结果和POD-30的班夫等级如表5所示。班夫2007年复合组织同种异体移植的工作分类(Banff 2007Working Classification forComposite Tissue Allografts)是基于表皮细胞凋亡、表皮浸润和血管周围/真皮浸润的水平48。班夫等级范围从II级(中度)到IV级(坏死性急性排斥)，大多数显示为III级(严重)。
Figure BDA0003331279010001451
POD＝手术后的天数
值是平均值(n＝4)±SD
Figure BDA0003331279010001452
与POD 0相比的显著数据点(p<0.05)，学生t检验
Figure BDA0003331279010001461
值包括在检测上限(12,000pg/mL)的数据
作为对细胞介导的免疫反应的评价，测量了初始伤口愈合过程特有的总共23种炎症和抗炎症细胞因子或者在对异种细胞的免疫反应中预期的那些。在整个研究期间，所测定的23种细胞因子/趋化因子中有12种始终低于检测水平：TNF-α、IFN-γ、TGF-β、G-CSF、GM-CSF、IL-1-β、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18和MIP-1-α。VEGF仅在三个单独的时间点超过检测水平，并且MIP-1-β的水平仅可辨别一次(数据未提供)。在研究期间内检测到的九种细胞因子/趋化因子列于表6中。观察到表中所显示的所有细胞因子/趋化因子增加到在POD-7(即采样的第一天)时的背景值以上。IL-2、IL-8、MCP-1和TGF-α在POD-7时达到峰值并随时间下降。IL-15和IL-12/23(p40)在POD-14时达到峰值，而sCD40L、IL-1ra和IL-6在POD-21时具有升高的峰值。一般来说，除了sCD40L在POD-30时仍然升高以外，所有因子都显示出到POD-30时恢复到正常值。有趣的是，IL-12/23(p40)的水平几乎不存在，直到在POD-14时显著升高，在研究的其余时间内浓度逐渐降低。
Figure BDA0003331279010001462
1.PBMC＝外周血单核细胞
2.GalT-KO＝α-1,3半乳糖基转移酶敲除
3.移植前＝POD-0；移植后＝POD-30
4.rMFI＝相对平均荧光强度
5.IgM＝免疫球蛋白M
6.IgG＝免疫球蛋白G
为了评估皮肤移植之后抗异种抗体的产生，通过流式细胞术测量接受者血清IgM和IgG与来自GalT-KO供体的外周血单核细胞(PBMC)靶标的结合。在移植前和在POD-30时分析血清IgM和IgG抗体水平。在表7中，总结了每个接受者的相对平均荧光强度(MFI)和结合的增加倍数。在所有动物中检测到抗异种IgM和IgG的增加。在移植前(POD-0)和移植后(POD-30)之间，IgM抗猪抗体增加了1.4至4.9倍，并且IgG抗猪抗体增加了28.7至70.8倍。这些结果证明对非Gal异种抗原的体液反应。
Figure BDA0003331279010001471
SD＝标准偏差，LOD＝检测极限，QC＝质量控制
Figure BDA0003331279010001472
由于在伤口床提取中存在细胞混合物，无法准确定量猪微嵌合状态
Figure BDA0003331279010001473
所有QC均提供正Ct，表明无抑制
分析了原始皮肤异种移植物的PERV拷贝数，并且如预期的那样，每个细胞都含有PERV A(32±1)、B(9±0.1)和C(16±0.1)的拷贝。评价了来自四名接受者的血清中循环PERV的存在；发现所有样品均呈PERV pol阴性且低于检测极限。也对来自四名接受者中的每一名的PBMC样品测试了PERV和微嵌合状态(即循环猪细胞的存在)，并且在所有时间点也被发现呈阴性。对在研究结束时(POD-30)采集的组织评价了PERV表达，并且再次发现呈阴性。动物2102的伤口床对于PERV的存在和微嵌合状态呈阴性。(表8)对于其他动物，任一个或全部两个伤口部位呈阳性。由于伤口床与异种移植物直接接触，这并不奇怪。预计在研究结束时，与移植物无关的一些猪细胞可能已经脱落或在移除过程中被留下来。对于微嵌合状态测定获得的正值证实了这一点，将PERV信号归因于猪细胞污染。总之，这些结果没有提供PERV传播的证据，这与之前的研究一致。
实施例2
以下实施例提供了从根据本发明生产的遗传重新编程的猪中收获和加工皮肤的过程的描述，所述皮肤将用作用于人移植的异种皮肤制品。在一些这些方面中，异种移植制品由分层厚度移植物组成，所述分层厚度移植物由含有来源于专门的遗传重新编程的无指定病原体(DPF)源动物的活的非最终灭菌的猪细胞的真皮和表皮组织层组成。
在一个方面，遗传重新编程的源动物是本公开中所描述的任何遗传重新编程的动物。在一个非限制性方面，本实施例中经基因工程改造的源动物在基因组中不含有任何外来的、引入的DNA；遗传修饰包括单个基因的敲除，所述单个基因负责编码引起细胞表面抗原普遍表达的酶。该实施例中的异种移植制品不结合转基因技术，诸如CD-46或CD-55转基因构建体。
本文公开的过程和技术仅是示例，并且不限制本发明的范围。将完全理解的是，虽然本实施例针对异种移植皮肤制品，但以下工艺中的几个步骤以及整个方法的各个方面都可以应用于其他器官或组织，包括但不限于肾、肺、肝、胰腺、神经、心脏、肠和其他器官或组织。将进一步理解的是，可以关于皮肤以外的其他器官或组织的收获和处理，对本实施例中公开的工艺和方法进行修改(包括增加或省略一个或多个工艺或方法步骤)。这种理解部分基于以下事实：其他器官和组织将具有不同的物理特性，并且因此，在某些实际方式中，此类其他器官或组织的收获和处理步骤将与本实施例不同(例如，肾、心脏、肝、肺或其他整个器官将不被切成一定尺寸并包装在由尼龙网支撑的冷冻小瓶中)。然而，将进一步理解，可以利用本领域已知的方法进行如应用于每个这种器官或组织的一个或多个工艺或方法步骤的增加或省略(例如，收获的肾、心脏、肝、肺或其他整个器官在一些方面将如本文所述被置于抗病原体浴中或暴露于UV光下以在收获后去除病原体，并被置于一个或多个封闭系统中)。例如，此类一个或多个封闭系统可以包括但不限于第一封闭系统(例如，利用惰性材料进行初始封闭以包围器官，从而防止器官与靠近所述器官的其他材料接触或粘附)和/或第二封闭系统(例如，含有所述器官和第一封闭系统(如果使用了第一封闭系统)的无菌且安全的外部容器)。此类一个或多个封闭系统内的此类器官被配置成作为整个器官被运输到临床部位，在温度、无菌性和其他条件下被储存、保护和运输，以维持如本文所述在临床部位进行移植的无菌性和细胞生存能力。
动物准备
皮肤制品处理发生在开始于处死源动物直到完成最终制品的生产的单一、连续且设备齐全的隔离生产事件中。
接收了源自遗传重新编程的源动物的异种皮肤移植物，最近在DPF隔离区域的另一部分通过俘虏式栓系安乐死对猪实施安乐死。源动物被容纳在无菌的无孔袋中，所述袋被容纳在塑料容器中，所述塑料容器被地送到DPF隔离区域中并放置在手术室中，在所述手术室中将进行从源动物中收集皮肤的程序。手术团队的所有成员都应穿戴完全无菌的手术设备，例如，穿着无菌衣服以在接收源动物之前维持无指定病原体条件，并且在一些情况下戴上双层手套以最小化污染。
在净化之前(例如，在用二氧化氯气体处理之前的24小时)以及在程序之前，为操作区域准备从源动物收获皮肤所需的材料。在操作之前，对切皮刀(Dermatome)(电子皮肤收获设备，例如Exsurco的Amalgatome)电源和延长线进行灭菌并将其放置在操作区域中。在二氧化氯气体处理期间不在房间中的任何材料(因此是非无菌的)将在进入房间之前用70％乙醇或异丙醇喷雾。
将源动物以无菌方式从袋和容器中移出，例如，人使用灭菌的手套和/或灭菌装置从袋和容器中提起源动物以帮助提起并使污染最小化。手术人员用氯己定将源动物擦洗至少2分钟，在将要进行手术的整个动物区域上刷洗，定期将氯己定倒在所述区域上以确保覆盖度。
将源动物的右侧腹和背部朝手术台放置，使左侧腹和背部暴露。暴露的表面被擦洗至最明显的手术边界，并被用毛巾夹固定的无菌帷帘束缚。然后，用打开的必妥碘刷子擦洗源动物，并在将要进行手术的整个动物区域上用无菌水冲洗大约2分钟。
这种氯己定和必妥碘的混合物将在源动物上放置大约2分钟，然后工作人员(穿着无菌衣服以维持无指定病原体条件)将用无菌水和无菌纱布冲洗并干燥源动物。去除源动物的毛发，以免影响膜或引入会降解细胞的其他元素。在死后立即在无指定病原体环境中使用灭菌的电推剪和/或直剃刀进行脱毛，并使用氯己定泡沫清洁刀片。工作人员将使用电推剪和/或直剃刀(在无菌浴中润滑)去除手术部位上剩余的所有毛发，注意不要刺穿皮肤。通过将源动物转到左侧腹上可以重复此程序(从擦洗到剃毛)，以便暴露右侧。将源动物用无菌水冲洗，并用无菌毛巾干燥，并用70％乙醇喷雾。外科医生将目视检查源动物，以确保擦洗的适当覆盖。在无菌擦洗和最终剃毛之后，源动物已准备好进行皮肤收获。
皮肤收获
操作员将按照程序和其他标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体条件。在处死动物的15小时内从源动物中收获用于异种移植的所有组织。
在一个方面，将源动物侧放在手术台上。在这方面，利用切皮刀圆形刀片(例如和
Figure BDA0003331279010001501
SD)进行收获。当工作人员将动物固定到位时，外科医生确定最合适的宽度(例如1、2、3或4英寸)，并使用圆形切皮刀以选定的厚度(例如，0.50mm、0.55mm、0.62mm)去除分层厚度皮肤移植物条。
作为进一步的实例，取决于所讨论的治疗需要，皮肤移植物的厚度可以在0.01mm至4mm的范围内。还应理解的是，在一些方面，也可以利用本领域已知的替代性收获和移植程序来利用收获全层厚度移植物。移植物尺寸可以在1cm2至1000cm2(或大约1ft2)的范围内。将理解的是，取决于应用和所利用的收获技术以及源动物的尺寸，更大的移植物尺寸也是可能的。将理解的是，对于所有方面，也可以利用其他深度，这取决于用于治疗和/或其他目的的手头任务的应用和需求。
在另一个方面，皮肤收获涉及首先通过外科手术从动物上去除皮瓣，然后将皮瓣的真皮侧朝下放置在收获板上(例如，由金属、塑料或其他适当的材料制成的实心板)，所述收获板设置在手术台上。在这方面，将无菌的衬垫材料添加到皮瓣的下方和收获板的顶部，以适当地提供适当的切皮刀装置功能。然后用钢夹将皮瓣牢固地固定在收获板上。将弯曲的毛巾夹用于与夹相对的皮瓣侧面上，直到皮肤结实且绷紧为止。外科医生将在切皮刀上选择最适当的厚度，并根据收获条件进行调整。外科医生将在固定的皮瓣上使用切皮刀，沿着切皮刀前进方向提供辅助维持张力。第二辅助还可以为皮瓣张力提供帮助，并可以使用鼠齿钳拉出从切皮刀中出来的移植物。
将移植物修剪成所需的尺寸。举例来说，尺寸可以是：5cm x 5cm，总表面积为25cm2，且均匀厚度为大约0.55mm；5cm x 15cm，总表面积为75cm2，且均匀厚度为大约0.55mm；8cm x 7.5cm，总表面积为60cm2，且均匀厚度为大约0.55mm；8cm x 15cm，总表面积为120cm2，且均匀厚度为大约0.55mm。将进一步理解的是，可以根据患者的需要产生可定制的尺寸(即，宽度、厚度和长度)，包括可以收获更大的皮肤片用于异种移植程序。
异种移植制品被进一步处理成不含需氧和厌氧细菌、真菌和支原体。在无菌条件下，在收获之后立即、在收获后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒内、在10秒至1分钟内、在1分钟至1小时内、在1小时至15小时内、或在15小时至24小时内，使用适用的无菌技术，在药物制品处理套房中的层流通风橱中，将异种移植制品放置于抗微生物剂/抗真菌剂浴(“抗病原体浴”)中。对于皮肤制品，这可能会在将皮肤制品修剪成适当的剂量大小和形状(例如，修剪成正方形、矩形或其他所需尺寸的形状)后发生。
抗病原体浴包括放置在无菌容器中的氨苄青霉素、头孢他啶、万古霉素、两性霉素B，并且异种移植制品按下表5中概述的进行稀释，并按下表6中概述的添加到RPMI-1640培养基中。在一个方面，在添加上述物品之前，从瓶中取出约10mL的培养基。
表5
Figure BDA0003331279010001521
表6
Figure BDA0003331279010001522
将理解的是，尽管本实施例针对异种移植皮肤制品，但是也可以将其他器官(包括但不限于肾、肺、心脏、肝、胰腺和其他器官)在根据本发明的抗病原体浴中浸浴。执行药物和其他化学品的组合的量以及暴露于这种抗病原体浴的持续时间以使此类暴露对细胞生存能力和线粒体活性的影响最小化，以实现所需的抗病原体结果并根据本发明对异种移植制品进行最低程度的操作。
作为通过抗病原体浴去除病原体的替代或补充，通过利用紫外光的工艺和系统使制品无指定病原体。在这方面，操作员按照机构标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体条件。操作员戴上针对紫外光和激光的护眼安全眼镜。
将紫外激光灯安装在层流通风橱中。灯的四个角中的每个角都放置在两个彼此叠置的容器盖子上，即，使用四对盖子来支撑灯，或者能够将灯放置在通风橱工作表面上方的临时或固定位置的其他支撑物品。从灯泡(总共2个灯泡管)到通风橱底部的距离为大约1.5英寸。通风橱的整个内部都喷有酒精，例如乙醇或异丙醇。打开灯，并且操作员根据灯的规格、灯泡数量以及灯泡与异种移植制品之间的距离，计算所需暴露的时间。
操作员将两个浴(一个氯己定和一个酒精)倒入两个单独的碗中，并将所述两个碗放在通风橱下。
将一包新的灭菌冷冻小瓶放置在通风橱下。拧开冷冻小瓶盖并将其放入氯己定浴中。然后将每个冷冻小瓶(不带盖)倒置，并将开口端投入氯己定浴中，每次一分钟，然后直立放置以风干。此后，利用无菌纱布用氯己定和酒精擦拭每个冷冻小瓶的外部。从氯己定浴中取出冷冻小瓶盖，并放在无菌纱布上。将每个小瓶的开口端分别投入酒精浴中1分钟，然后静置风干。
将最近从手术室的收获/获得阶段获得的异种移植制品经由进入层流通风橱的单向入口转移到制品处理室中。在转移给操作员之前，用70％乙醇擦掉进入无菌区域的任何物质。操作员将可以使用层流通风橱中的所有必需材料：异种移植制品(在无菌容器中)、冷冻小瓶、10mL注射器和针头、相冷冻机保持架以及预先剪切尼龙网。一次只能处理一种尺寸的制品，以确保对最终小瓶的适当控制。根据无菌、洁净技术，操作员就座在层流通风橱旁。
当使用UV光杀菌时，将制品放置在UV灯下持续所需的时间段，例如2分钟或更长时间，然后翻转到另一侧，并将相反侧放置在UV灯下持续相同的时间段，例如2分钟或更长时间。基于特定的生物剂或待灭菌的生物剂的类型来改变将给定样品暴露于UV的时间段，例如，如下表7所示。
表7
Figure BDA0003331279010001541
*使用125uW/cm2的UV-C强度
关于其他完整器官，制品产量将通常取决于给定源动物可以具有每个这种完整器官的数量(例如，一个肝、两个肺、两个肾、一个心脏、一个胰腺等)。
还将理解的是，尽管本实施例针对异种移植皮肤制品，但是其他器官(包括但不限于肾、心脏、肺、肝、胰腺和其他器官)可以暴露于紫外光下并使其不含根据本发明的指定病原体。执行UV暴露剂量、强度和暴露于这种紫外光的持续时间以使此类暴露对细胞生存能力和线粒体活性的影响最小化，以实现所需的抗病原体结果并根据本发明对异种移植制品进行最低程度的操作。
制造工艺
一般而言
通过持续的制造事件，源动物被处理成无菌异种移植制品。与源动物有关的制品的制造涉及几个条目，包括但不限于：
a)源动物的照料和畜牧养殖(包括，如本文所述，提供某些疫苗接种、仔细维持和分析纯种系谱记录、进行适当的动物畜牧养殖、以及将动物维持在隔离屏障条件下)；
b)制品制造(包括，如本文所述，从安乐死到收获，将源动物处理成主题制品)；
c)源动物的分析测试(包括，如本文所述，筛选不定因子，包括寄生虫学、细菌学和病毒学测定)；
d)源动物的分析测试(包括，如本文所述，确认源动物是α-1,3-半乳糖转移酶敲除或具有给定应用所需的其他特征)；和
e)源动物的分析测试(包括，如本文所述，内源病毒(PERV)的病毒测定)。
所得制品的制造和发布测试中也涉及几个条目，包括但不限于：
a)制品制造(包括，如本文所述，处理药物制品、储存药物制品和发布药物制品)；
b)药物制品的分析测试(包括，如本文所述，生存能力测试(例如通过MTT测定))，
c)无菌性测试(包括，如本文所述，需氧细菌培养、厌氧细菌培养、真菌培养、支原体测定、内毒素测试，USP<71>))，
d)不定因子测试(包括，如本文所述，用于例如内源性病毒(PERV)的PCR测定)；和
e)药物制品的分析测试(包括，如本文所述，组织学)。
对于皮肤，每只动物的制品产量的量可根据每只动物的尺寸而变化。举例来说，一些动物可以产生3,000与6,000cm2之间的制品。在一个方面，以连续过程从单一源动物收获单批次的皮肤制品。表8中提供了异种移植制品的批次说明，并且表9中提供了异种移植制品的批次配方。
表8
批次大小
Figure BDA0003331279010001561
表9
批次配方
Figure BDA0003331279010001562
Figure BDA0003331279010001563
先前的批次测试是在良好实验室规范(“GLP”)条件下执行的，以确保始终维持过程无菌性。在材料发布和临床使用之前确定最终制品的无菌性的保证。在验证用于人临床用途之前，所有异种移植制品都将满足某些接受标准，包括如本文所述。最终的药物制品控制策略和分析测试是在制造过程结束时在发布用于临床用途之前进行的。所需的分析测试结果将通过药物制品分析证书(COA)记录下来，所述分析证书附有与每个批次的异种移植制品有关的主批次记录。
通过获得肺、肝、脾、脊髓、脑、肾和皮肤的组织样品来生成和维护源动物样品档案。针对源动物组织收集这些组织以进行测试、存档和存储用于进行将来可能的测试。源动物组织和体液的存档样品应酌情储存在负(-)70摄氏度或更低的温度下用于保存样品。在其他方面，可以将固定的样品维持在室温下。在获得活细胞、组织或器官时，应从源动物中收集适当的组织样品以进行福尔马林固定和石蜡包埋并进行冷冻保存。冷冻保存应至少有十个0.5cc等分试样的柠檬酸或EDTA抗凝血浆；五个等分试样的有活力的白细胞(1x107/等分试样，用于随后分离核酸和蛋白质或用作共培养或其他组织培养测定的有活力的细胞来源)。
收获后的制品处理
先前收获且最低程度操作的异种移植皮肤制品(此处的皮肤完整性是具有标准细胞形态和组织的最低程度操作的真皮和表皮组织层)进入正压高于手术套房(被命名为10,000级(IS0-7)制品处理室)正压的单独的相邻房间。
手术室将按照操作准备程序进行设置，并且操作人员将穿着特卫强(Tyvex)套装，以进行通风橱工作。如果需要，助手也将穿着特卫强套装。用无菌技术完成换衣和穿衣。如果需要，手套和袖子用酒精喷雾。预先通过气态二氧化氯灭菌工艺进行灭菌的ABSL-2层流通风橱将用酒精(例如70％的乙醇)进行喷雾，并且将开始层流排气。利用无菌技术，先前通过高压釜灭菌的手术器械、冷冻小瓶、冷冻盘、烧瓶、注射器、针头、附加容器和所有处理设备将被放置在层流通风橱内。在转移给操作员之前，将外部包装用酒精喷雾。
如本文所述，在操作之前，应将尼龙网移植物衬背切成针对剂量水平的适当尺寸的正方形，密封在可高压灭菌的小袋中，并通过蒸汽灭菌。然后将小袋的外部用70％乙醇灭菌，并且放入通风橱中。10mL冷冻小瓶的外部包装将用70％乙醇消毒，并放入通风橱中。无菌的高压灭菌的手术器械包装应用70％乙醇喷雾并且转移给操作员。
应将无菌注射器和针头用70％乙醇喷雾并且转移给操作员。最近从猪供体中收获的移植物组织将被转移到通风橱中。在转移给操作员之前，用70％乙醇擦掉进入无菌区域的任何物质。操作员将可以使用通风橱中的所有必需材料：移植物(在无菌容器中)、冷冻小瓶、10mL注射器和针头、相冷冻机保持架以及剪切尼龙网。根据无菌、洁净技术，操作员应就座在通风橱旁。
参考图45，将提前对每个冷冻小瓶灭菌和标记，以减少冷冻保存之前的处理时间和材料对DMSO的不必要暴露。将含有每种异种移植制品的盆和在室温下RPMI 1640组织培养基以及抗生素(例如，抗病原体浴)放置在层流通风橱下。制品已在抗病原体浴中浸浴不少于30分钟，以对异种移植制品进行灭菌。
在一个方面，当使用UV光灭菌时，如上所述，使用UV灯对冷冻小瓶进行灭菌。在将制品插入每个小瓶中之后，将每个新的盖子放在每个新的瓶上并牢固地拧紧。将每个小瓶放置在灯下，并定期滚动，以使小瓶外部均匀地暴露于光。将小瓶放置在玻璃罐中，所述玻璃罐的内部先前已灭菌并且外部已由操作员使用酒精和氯己定进行灭菌(包括螺纹和盖)。用酒精擦拭小瓶，然后将其放入玻璃罐中。玻璃罐的外部在通风橱外面用酒精浸湿。在通风橱下，操作员将玻璃罐盖子浸浴，并且将罐的开口端投入酒精中，并用酒精(和任选的氯己定)擦拭罐的外部，包括罐的螺纹。利用纱布用酒精擦拭小瓶，并将其用器械将其放入每个玻璃罐中。然后固定玻璃罐的盖子，并且将罐交给助手。在所有这些过程中，助手会频繁并定期用酒精对操作员的手套和手臂进行喷雾。
在本实施例中，异种移植皮肤制品(其已在外科手术套房中用无菌剪刀剪切成一定形状并用10刃解剖刀修整)将用无菌不锈钢直尺重新测量，以验证是否满足技术规格和尺寸。视觉检查异种移植皮肤制品，以确保不存在裂痕、撕裂、可观察到的缺陷或厚度过大或不足。
在层流通风橱下，操作员将使用镊子从抗病原体浴中取出单个异种移植皮肤制品，并将其放在先前剪切成适合冷冻小瓶的一片尼龙网上，定位于尼龙网的中心，真皮侧与网接触(例如，真皮面朝下)，每个制品花费1分钟(应理解该时间可能更短或更长，并且每个制品至多5分钟)。将理解的是，无菌尼龙网包装组分尤其用于支撑异种移植制品并防止异种移植制品在卷起时自粘。
将进一步理解的是，无菌尼龙网包装组分可以具有允许将异种移植制品放置在无菌尼龙网包装组分上并适合位于无菌尼龙网包装组分的二维表面积(即长度和宽度，不包括厚度)内的任何尺寸(例如，异种移植制品的二维面积尺寸将小于无菌尼龙网包装组分的二维面积尺寸)。
将进一步理解的是，将根据异种移植制品尺寸和剂量来确定无菌尼龙网包装组分的尺寸。例如，无菌尼龙网包装组分为8cm x 7.5cm(60cm2)，以适合5cm x 5cm的异种移植皮肤制品(25cm2)(7.5克)，当将其放入冷冻小瓶中时使用7ml冷冻保护介质。甚至将进一步理解的是，无菌尼龙网包装组分的尺寸为8cm x 22.5cm(180cm2)，以适合5cm x 15cm的异种移植皮肤制品(75cm2)(22.5克)，当放在冷冻小瓶中时使用5ml冷冻保护介质。
包装期间异种移植皮肤制品的表皮或真皮区域的意外粘附可能会破坏异种移植皮肤制品的完整性并可能降低其治疗可行性。包含无菌尼龙网包装组分旨在提供内部物理支撑并防止自粘。无菌尼龙网包装组分没有生物或化学活性，并且不会直接影响异种移植皮肤制品本身的代谢活性或功效。
在许多实验过程期间，包括本文实施例1中描述的猴子研究，从未观察到使用这种无菌尼龙网包装组分会产生与异种移植制品的不利的、不希望的反应，或者降解和污染最终的异种移植制品，从而对接受者造成不良的反应或后果。移植程序中不使用无菌的尼龙网包装组分。在冷冻保存和解冻后，并且在使用异种移植制品之前，将其丢弃。因此，对于给定的应用，仔细选择了特定的材料和相关的规格。Medifab 100微米尼龙网(零件号03-100/32-Medifab)是根据cGMP标准制造的，并且被选中是因为其物理特性和经过认证的对人临床使用的可接受性。
然后，在层流通风橱下，操作员将紧紧卷起异种移植制品和尼龙网包装组分的该组合，并将该组合放置在冷冻小瓶(例如10ml小瓶)中，每个制品花费1分钟(应理解该时间可能更短或更长，并且每个制品至多5分钟)。在这方面，将网材料卷起以确保圆柱体的垂直高度为8cm，并均匀地适合在10ml冷冻小瓶内(例如，10cm长度和17mm直径)，并且一旦完成后就可以用螺纹密封盖进行固定。网材料被定向成使得保护性网材料位于异种移植制品的外部，并且一旦卷起完成，就没有暴露或可见的异种移植材料，并且其被完全包装在保护性插件中。无菌尼龙网包装组分的固有拉伸和材料特性是均匀的，并且材料的无弹性或刚度使其膨胀以填充冷冻小瓶的体积。因此，无论初始的“卷密度”如何，材料都将均匀地松散并因此被标准化。
然后，操作员将在层流通风橱下使用无菌注射器吸取足够的无菌冷冻保护介质(例如，5-7ml的含5％二甲亚砜(DMSO)的介质(Cryostor CS5,BioLife Solutions))以填充冷冻小瓶直到皮肤制品卷完全浸没为止，确保异种移植皮肤材料、网衬背和冷冻保护介质的组合与10ml填充线齐平，每个制品花费1分钟(应理解该时间可能更短或更长，并且每个制品至多5分钟)。
在层流通风橱下，操作员将用螺纹盖密封冷冻小瓶。内容物的身份和标签信息由操作员确认。在制品处理之前，将标签预先填入并应用到包含制品的冷冻小瓶外部。
将理解的是，本文所述的异种移植制品和包装组分的制备可以呈治疗剂量的形式。例如，异种移植药物制品由以下组成：
q.异种移植分层厚度皮肤药物物质
r.一级容器封闭系统，其包括
i.主要包装组分：无菌透明的聚丙烯10ml冷冻小瓶，带螺纹密封盖
ii.无菌尼龙网包装组分
iii.冷冻保护介质包装组分
异种移植制品的指定剂量为每cm2 300mg活的有代谢活性的猪异种移植药物物质，恒定厚度为0.55mm。示例性配制品包括：
s.剂量强度1：25cm2分层厚度皮肤移植物，均匀厚度为0.55mm，重量为大约7.5克。
t.剂量强度2：75cm2分层厚度皮肤移植物，均匀厚度为0.55mm，重量为大约22.5克。
示例性异种移植药物制品主要包装组分为带有螺纹密封盖的无菌透明的聚丙烯10ml冷冻小瓶。例如，Simport Cryovial,T310(10-ml)是由Simport Scientific制造的。该制品由不含BPA、不含重金属和不含LATEX的医疗级树脂构成，并符合USP VI级限制。
在异种移植药物制品制造过程期间使用了尼龙网包装组分。将准备好的异种移植药物制品放在无菌尼龙网包装组分(例如，Medifab 100微米尼龙网)上，该组分已预先修整为以下尺寸：
u.剂量强度1：宽度7.5cm，高度8cm；总面积60cm2
v.剂量强度2：宽度22.5cm，高度8cm；总面积180cm2
在药物制造过程期间还使用了冷冻保护介质包装组分。冷冻保存之前，将异种移植药物制品浸入以下体积的冷冻保护介质包装组分中：
w.剂量强度1：7ml的Cryostor CS5(含有5％DMSO)。
x.剂量强度2：5ml的Cryostor CS5(含有5％DMSO)。
为了确保冷冻保护介质的饱和度，在层流通风橱(ISO-5，FED STD 209E Class100条件)下，将指示量的CryoStor CS5介质(按剂量强度)通过10ml注射器应用到处于垂直位置的冷冻小瓶(诸如图46中所示的冷冻小瓶类型)中。冷冻介质填充空隙空间，并且重力确保填充过程从垂直定向的冷冻小瓶的底部开始直至顶点处的填充线。添加体积直至其达到制造商标定的10ml填充线为止。以这种方式填充小瓶也有助于去除气泡。一旦完成后，用螺纹盖密封。对饱和度和填充度进行视觉和物理验证，以确保异种移植制品的内容物不能在内部移位。
冷冻保存
将制品材料放在如上所述的包含冷冻小瓶和制品的适当冷冻机架中，并放入经过认证的Q-A控制速率相冷冻机中。使用经过认证的Q-A控制速率相冷冻机，通过一种标准化的控制速率冷冻过程将整个制品冷冻保存：
y.从4℃开始，内部腔室和样品温度探头将以每分钟1℃的速率降低，直至达到-40℃的温度为止。
z.一旦以控制的速率达到-40℃的温度，控制速率的冷冻机样品温度探头应从-40℃迅速降低至-80℃。
aa.然后将材料转移到GLP认证的-80℃冷冻机中直至使用。
从室温到-80℃，每个批次时间花费40分钟(应理解时间可能更短或更长，并且至多2小时)。在一些方面，可以使用渗透性冷冻保护剂(诸如DMSO)来保护形态和组织结构，并保持与新鲜皮肤相当的代谢活性水平。在一些方面，可替代地或另外地，冷冻保存可以包括甘油、庆大霉素、制霉菌素、L-谷氨酰胺和其他处理溶液中的一种或多种。在一些方面，不使用β-内酰胺抗生素。
包含冷冻保护介质包装组分旨在支持在异种移植制品所需的冻融循环期间的细胞存活。在包装期间未包括异种移植制品的冷冻保护介质包装组分可能会破坏异种移植制品的完整性或阻碍冷冻保存过程，并可能将异种移植制品的生存能力降低至可接受标准以下。在不包含冷冻保护介质的情况下冷冻保存异种移植制品导致对异种移植制品中包含的生物活性细胞的破坏。在冷冻过程期间发生冰晶的快速形成以及细胞膜和线粒体细胞器屏障的破坏，并且二甲亚砜成分起到交换细胞内液的作用。因此，冷冻保护介质减少了此类冰晶的形成以及总细胞体积的快速破坏性增加，这将负面地影响细胞生存能力并因此影响药物制品的功效。
在许多实验过程期间，包括本文实施例1中的猴子研究，从未观察到使用这种冷冻保护介质包装组分会产生与异种移植制品的不利的、不希望的反应，或者降解和污染最终的异种移植制品，从而对接受者造成不良的反应或后果。因此，选择特定的材料和相关的规格以满足意图用于人临床用途的异种移植制品所必需的适当标准。这包括鉴定一种具有最低亚临床水平的DMSO的冷冻保护介质，所述冷冻保护介质可以令人满意地发挥作用而无需在配制品中包含另外的异种移植材料(猪血清)。在移植程序中不使用冷冻保护介质包装组分。在解冻后，并且在使用异种移植用于治疗用途(包括作为药物制品)之前，将其丢弃。CryoStor CS5是根据cGMP标准制造的，并且被选中是因为其经过认证的对人临床使用的可接受性。
运输到临床站点
应将制品运输到临床站点，以将异种移植皮肤制品材料维持在-80℃的存储条件下。一个示例性运送容器是具有广泛的以下规格的EXP-6标准干蒸气运输机：
·动态保持时间10天
·保持温度-150℃或更低
·核心技术干蒸气液氮
·标本室直径2.8英寸(71mm)
·深度11.5英寸(292mm)
·干重9.7磅/4.4kg
·装料重量18.3磅/8.3kg
·国内尺寸21.07磅/9.56kg
·国际尺寸24.87磅/11.28kg
·外箱12英寸x 12英寸x 22英寸
·(305x305x559mm)
运输过程的各方面也在图47中示出，包括但不限于：(1)冷冻保存仓库；(2)在冷冻保存仓库中时在如本文所述的冷冻小瓶和介质中的异种移植制品；(3)将冷冻小瓶放在干蒸气运输容器(或二级封闭系统)中；(4)通过快递员运输容器和小瓶；(5)在递送地点对异种移植制品进行控制和监测(在负(-)150摄氏度或更低的条件下可以持续至少10天)；(6)从容器/二级封闭系统中取出如本文所述的冷冻小瓶和介质中的异种移植制品；(7)将在如本文所述的冷冻小瓶和介质中的异种移植制品置于冷冻机中的-80℃下储存的位置。
临床站点准备
在一个方面，药物制品作为冷冻保存的异种移植制品到达临床站点。在使用之前，异种移植制品必须在37℃的水浴中解冻，从小瓶中取出，并在室温下于一系列3个无菌的0.9％盐水浴中洗涤。
对于解冻过程，使用了无菌设备和无菌技术：
a)在三个500mL无菌手术碗中各准备200mL生理盐水。
b)将未打开的冷冻小瓶与皮肤制品一起置于温度约25℃的水浴中。在一些实施方案中，温度为约37℃。
c)在所述水浴中，轻轻旋转大约5分钟或直到组织在冷冻小瓶内移动，注意尽可能地最小化异种移植皮肤制品组织悬浮于解冻的DMSO中的不必要的暴露时间。
d)打开冷冻小瓶并使用无菌镊子快速去除组织和网，以转移到一碗生理盐水中。
e)使用无菌镊子，确保组织完全浸没在盐水中15秒，通过轻轻旋转来搅动以使覆盖最大化。下面的支撑网材料应与皮肤异种移植皮肤制品材料分开。如有必要，使用第二对无菌镊子分开。网可以留在碗中，也可以丢弃。
f)使用无菌镊子，将皮肤转移到第二碗洗涤液中。完全浸没并轻轻旋转15秒；这是连续稀释或“冲洗”。
g)重复前一步，使用无菌镊子将皮肤转移到第三次洗涤的生理盐水中。完全浸没并轻轻旋转约15秒。
h)冲洗过程的整个持续时间应在60秒内完成以使制品悬浮于解冻的DMSO中的不必要的暴露时间最小化，以便使制品功效最大化。
i)现在将组织解冻，冲洗并准备好应用。保留在生理盐水中直至使用，在约25℃下不超过2小时。
完成完整的解冻和冲洗过程之后，异种移植制品就准备好放置在伤口部位。一旦解冻后用盐水连续洗涤提供了足够的稀释溶剂，以除去残留的冷冻保护剂(5％DMSO溶液，CryoStor CS5)，并将细胞内液水平恢复至正常的体内平衡状态。含有亚临床水平的DMSO的冷冻保护介质的这种稀释和使用确保了解冻后残留在异种移植皮肤制品材料上的任何最少的残留DMSO都将是不明显的，并且极不可能具有临床意义。该过程还确保保留最大量的代谢活性细胞，并且从而使异种移植制品的功效最大化。
解冻的实例。以下是异种移植制品的解冻程序的一个实例。解冻可以在操作员戴着无菌手套的情况下在生物安全柜中发生，如下所述：(i)在三个500mL手术碗中各准备200mL生理盐水；(ii)通过将其用氯己定擦拭干净、然后用70％乙醇喷洒来制备水浴；(iii)在乙醇干燥之后，在水浴中添加无菌水溶液，并加热至37℃+/-2℃；(iv)将异种移植药物制品装在双层袋中，保留不打开并置于37℃水浴中；(v)轻轻旋转大约5分钟或直到组织在冷冻小瓶内移动；(vi)尽可能地使组织在解冻的DMSO中花费的时间最少；(vii)用乙醇喷洒外袋并从外袋中取出小瓶，并用70％乙醇喷洒异种移植药物制品冷冻小瓶，然后将其放入生物安全柜中；(viii)拧开冷冻小瓶，并用镊子快速去除组织和网，以转移到一碗生理盐水中；(ix)使用镊子确保组织完全浸入盐水中60秒，通过轻轻旋转搅动以使覆盖最大化；(x)网应与皮肤分开，必要时使用第二对镊子分开；(xi)网可以保留在碗中，也可以丢弃；(xii)使用镊子将皮肤转移到第二碗洗涤液中；(xiii)完全浸没并轻轻旋转60秒；(xiv)使用镊子将皮肤转移到第三碗洗涤液中，并且完全浸没并轻轻旋转60秒。现在将组织解冻，并准备好应用。用无菌盆中的无菌盐水使其保持湿润。
滚动惰性尼龙网衬背和异种移植皮肤制品的过程会导致异种移植制品的均匀“卷密度”。根据给定应用的预先准备的尺寸，将所有网材料切割成均一的尺寸，并从同一材料批次中获得，从而为特定批次中制造的所有皮肤制品单元提供均一的材料特性。
尼龙网插入物的固有拉伸和材料特性是均匀的，并且材料的无弹性或刚度导致其膨胀以填充一级容器封闭系统(冷冻小瓶)的体积。因此，无论初始的“卷密度”如何，材料都将均匀地松散并因此被标准化。
在ABSL-2层流通风橱内，在Class 100、ISO5条件下将指示量的CryoStor CS5介质(按剂量强度)通过10ml注射器应用到处于垂直位置的冷冻小瓶中。
冷冻介质填充空隙空间，并且重力确保填充过程从垂直定向的冷冻小瓶的底部开始直至顶点处的填充线。添加体积直至其达到制造商标定的10ml填充线为止。以这种方式填充小瓶也有助于去除气泡。
一旦完成后，用螺纹盖密封。通过摇动皮肤制品对饱和度和填充度进行视觉和物理保证，从而确保内容物不能在内部移位。冷冻小管的各方面也在图46中示出，其中各方面尤其可以包括10ml体积、17mm x 84mm的尺寸、便于取下盖的纵条纹、硅胶垫圈、由相同聚丙烯材料制成的具有相同膨胀系数的确保在所有温度下密封的盖和管、1和1/4匝螺纹设计、厚壁、较大的白色标记区域、以及允许轻松清空内容物的圆底。
二级封闭系统的各方面在图48中示出，其中各方面尤其可以包括特卫强–1073B医疗级结构、5英寸宽度x 12”高度、容纳15条(came)或2个冷冻小瓶箱的存储能力、保持-150摄氏度或更低的温度、利用干蒸气液氮、在正常运输条件下IATA额定动态保持时间10天、标本室直径2.8英寸(71mm)、标本室深度11.5英寸(292mm)、干重9.7磅/4.4kg、装料重量18.3磅/8.3kg、国内尺寸重量为21.07磅/9.56kg、国际尺寸重量为24.87磅/11.28kg、外箱尺寸为12英寸x 12英寸x 22英寸。
由于处理仅涉及制品的最小机械操作，并且在此封闭过程中不会引入其他化学或生物剂，因此预计不会在制品中存在任何另外的杂质或外部杂质。如本文所述进行将源动物用于制品制造过程所需的验收标准测试，并通过药物制品COA进行记录。如本文所述评估最终制品的病毒不定因子。
就保质期而言，如所述的异种移植制品的连续存储在-80℃下连续储存时支持长达至少7年(在一个实施方案中为6个月的保质期)的保质期长期稳定性(细胞生存能力)。异种移植制品连续冷冻保存的保质期为至少7年。表10显示了将测试异种移植制品的稳定性时间点。
表10
稳定性研究时间点
Figure BDA0003331279010001661
A＝初始制品发布测试
B＝异种移植制品的稳定性测试
根据一个方面，在以下表11中是可以在分析和释放证书中使用的条目。
表11
测试结果
Figure BDA0003331279010001671
实施例3
猪皮与人皮肤享有基本的特性，并且代表了用于临时覆盖严重烧伤的人尸体皮肤移植物的潜在替代品。在一项使用MHC匹配和不匹配的MHC II类皮肤移植体模型的研究中，检查了对猪移植物进行长期冷冻保存对移植物生存能力、移植物摄取和屏障功能的影响。
使用甲臜-MTT评估细胞生存能力，并通过移植到猪接受者上评估移植物的生物学特性。为了补充体内临床评估、组织学和形态学分析，进行了一系列MTT还原测定以评价在冷冻保存和长期存储后猪移植物的残余生存能力。线粒体将MTT还原为甲臜代谢产物，其可以观察为紫色。利用此现象，对通过分光光度计测量的光密度值变化的分析或根据标准曲线对产生的甲臜的量进行内推可以提供实验样品与阳性和阴性对照之间的细胞生存能力的差异评估。基于MHC匹配，有2个群组，每个群组2只动物(总计，N＝4)，并且每只猪接受4个移植物：一个自体移植物和三个具有相同MHC谱的同种异体移植物。临床评估了移植物的移植物摄取、附着和移植物排斥时间。还通过班夫(Banff)分级量表在组织学上评估排斥。
在保持所有其他因素恒定的情况下仅基于存储持续时间，对其他等效材料之间进行直接比较产生出有意义的差异存活时间。在以相同方式保存的储存15分钟与7年时间的等效移植物之间进行并行的体内评估。临床总体评估和照片以及独立的组织学评估确定相对于冷冻状态下的时间长度是否存在移植物存活的任何明显差异。串联起来，通过MTT还原测定定量的对移植物生存能力的单独体外评估表征了冷冻保存后细胞的代谢活性和各种存储条件。此外，使用标准组织学(H&E)染色进行的独立组织形态学分析提供了关于这些过程是否在结构水平上引起移植物材料的可观察到的变化的证据。这项研究有利地使用了已经储存的在这样的时间内不间断的材料、以及相关的手术记录和标准化的制度方案。此外，关于所采用的冷冻保存和解冻方案、试剂和方法，比较组之间的处理方法和方案被标准化并相同地应用。结合起来，这允许对存储的持续时间进行单独的并行的评估，并且减轻了对结果进行建模或外推或者以其他方式使用规范的预测方法的需要。此外，在该同种异体皮肤移植模型中使用MHC匹配的和II类不匹配的供体-接受者对作为内部对照，既可确认七年前获得的组织的身份，又可证实手术记录和文献的准确性。此外，同种异体移植物表现出的等效行为也证明，没有由于存储的持续时间改变移植物的抗原性。
没有技术故障；所有移植物都粘附在各自的伤口床上并重新形成血管。在群组1(MHC匹配的供体-接受者对)中，所有移植物均保持附着状态，并在手术后(POD)第12天表现出一致的健康状态(图49A)，但在POD-14时观察到坏死、进行性红斑和附着丧失的迹象(图49B)。对群组1中的6个移植物的临床评估显示在POD-14至18时排斥。在群组2中，MHC II类不匹配的同种异体移植物表现与到POD-4时的自体移植物相当。然而，到POD-8时，所有同种异体移植物均表现出轻度红斑，与排斥一致，并被POD-10时认为完全排斥。在新鲜的、最近保存的和长期保存的皮肤移植物之间的持续时间、附着质量或细胞生存能力方面，没有观察到统计学上显著的差异。从统计学上讲，冷冻保存的材料比死的材料更有活力，并且这一发现在体内是凭经验证明的，因为所有7年的移植物均表现出对伤口床的附着和延长的存活力。非活的同种异体移植物未表现出这种存活力。在不限制本发明的情况下，将理解的是，本发明的冷冻保存的时间段可以例如包括长达约7年的任何时间长度。
材料和方法：
该研究是根据IACUC批准的协议(2005N000279，修订版69)在移植科学中心(Center for Transplantation Sciences)进行的，并且符合美国农业部(USDA)的《动物福利法》(Animal Welfare Act)(9CFR第1、2和3部分)、《实验动物的护理和使用指南》(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)以及所有州、地方法律和法规。研究方案、手术程序和动物护理指南由IACUC常设委员会独立审查和监控。
本实验中总共招募了八只猪，并且全部都是Sachs-NIH近交小型猪群体的成员。在手术时，所有猪的总体重在10与20-kg之间，并且年龄在2与4个月之间。在本实验期间的任何时间都未施用免疫抑制方案。将动物24074和24075指定为群组1，并且它们代表MHC匹配的供体-接受者对。将动物24043和24070指定为群组2，并且它们代表MHC II类不匹配的供体-接受者对。单独地，对于体外MTT系列分析，另外有五只野生型哥廷根小型猪为阳性和阴性对照提供了组织。
猪供体用I.M.2mg/kg的telazol(盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮，Zoetis Inc.,Kalamazoo,MI)麻醉，并送至手术室进行气管插管。使用2％的异氟烷和氧气维持麻醉。手术前用醋酸氯己定(NolvasanR Surgical Scrub,Fort Dodge Animal Health,Fort Dodge,IA)和10％聚维酮碘(Betadine Solution,Purdue Products,L.P.,Stamford,CT)对皮肤表面进行消毒。然后给动物披上帷帘，使背部的右侧暴露在外。使用深度设置为0.056-cm(0.022英寸)的空气驱动的Zimmer切皮刀(Medfix Solution,Inc.,Tucson,AZ)从每只动物的肩胛骨与最下肋骨的下缘之间收获测量为大约25cm2(表面积)的分层厚度皮肤移植物。
收获皮肤移植物后，意图用于冷冻保存的移植物和储存有限持续时间的移植物经历了标准化的制度方案，并在解冻前在-80℃下维持15分钟。长期冷冻保存的移植物已在-80℃下连续储存了超过7年的时段。将先前尺寸为大约25cm2的所有移植物放置在无菌尼龙网衬背上以进行结构支撑，并卷起以放置在层流通风橱下的螺纹密封冷冻小瓶中。一旦准备好所有移植物，就将大约5mL的冷冻介质添加到小瓶中并密封。该方案要求冷冻介质通过将15％二甲亚砜(DMSO)冷冻保护介质(Lonza BioWhittaker)与胎儿猪血清(FPS)或供体血清(如果没有FPS)以1:1的比率组合、过滤(0.45微米)并在使用前冷却至4℃来制备。随后将小瓶以每分钟1℃的速率在控制速率的相冷冻机中冷冻至-40℃，然后迅速冷却至-80℃的温度，在此温度下对照组中的经历有限的存储时间的那些检品保持15分钟，或者在暴露于延长的冷冻保存时间的测试组中的那些实验移植物的情况下保持超过7年的时段。DMSO在冷冻过程中会替换细胞内液体。以基于冷冻小瓶的最大内部体积(10ml)比异种移植制品的体积小约40-80％或50-70％的量使用冷冻保护介质(例如CryoStor)。
为了解冻用于外科手术用途的移植物，将密封的小瓶置于37℃水浴中大约1分钟，在这时将小瓶打开，并使用无菌技术取出冷冻的移植物。随后，将移植物在生理盐水中伴随轻轻搅动进行3次1分钟系列洗涤，以便稀释并系统地去除周围的残余DMSO，并防止细胞生存能力丧失。然后在25℃的生理盐水中将移植物带到手术区进行移植。
连续进行了两个单独但相同的手术事件。整个手术计划包括总共四只(n＝4)供体-接受者猪，两个实验群组(群组1和群组2)中的每一个使用两只动物，并如先前所述根据SLA配置进行有意配对。总共移植了四个技术对照和十二个(n＝12)实验移植物，并且随后进行了观察。
每只动物都沿动物的右背部以线性(从尾部到头颅)方向接受四个深度部分缺损，分别从1到4排列。在收获最初的分层厚度移植物之后，用切皮刀通过另外的途径通过外科手术引入了深度部分伤口缺损。所得的伤口床是均匀的、没有可见的碎屑，并且显示出独立的点状出血。这些缺损被打断，而不是用切皮刀以单一连续途径来完成。替代地，在总体尺寸、深度和解剖位置方面，小心地创建了四个分离的但等效的伤口。
在解冻后，但在移植前，使用15号(尺寸)刀片对所有分层厚度皮肤移植物进行开窗术，以防止血清肿或血肿形成。将移植物检品独立地放置于准备好的伤口床上，并使用简单、不匀称的3-0尼龙缝线将其均匀缝合在适当的位置，并以移植物至伤口床的方式进行应用。每个移植物引入大约16个固定点，并在移植物周围均匀分布，所得的结位于伤口边缘，而不是移植物制品上。该技术确保存在最小但足够的残余张力，并使残余张力均匀，这对于最佳的移植物至伤口的附着、血肿的最小化和最佳的移植物存活力是必需的。
在伤口部位1(最尾部)放置了一个分层厚度自体移植物，用作技术对照。在伤口床创建期间收获该自体移植物检品，随后与所有实验移植物同时进行相同的冻融过程，并在相同的冷冻保存状态下保持与对于有限持续时间鉴定的对照移植物相同的持续时间(在-80℃下保持15分钟)。在伤口部位2，将来自其相应群组配对配偶的分层厚度同种异体移植物缝合在适当的位置。该移植物代表检品暴露于冷冻保存有限的持续时间(在-80℃下持续15分钟)。在伤口部位3，来自野生型供体的分层厚度同种异体移植物，其代表具有与在冷冻保存状态下经历了“延长的”存储(在-80℃下超过7年)的伤口部位2的那些移植物相同的SLA匹配的分层厚度移植物。在伤口部位4(最头颅端)处，来自基因工程改造敲除供体的分层厚度同种异体移植物，代表了具有与在冷冻保存状态(-80℃)下也经历了“延长”暴露超过7年的源自基因工程改造供体动物的在伤口部位2处的那些移植物相同的SLA匹配的分层厚度移植物。
将覆盖的压力敷料(由Xeroform凡士林纱布(Medtronic)、TelfaTM非粘性敷料(Covidien,Minneapolis,MN)组成和无菌纱布)保持在适当的位置，并用多个重叠的TegadermTM(3M,St.Paul,MN)片干燥。然后接受者穿上棉外套，以减少对移植物的干扰。在POD-2时除去移植物敷料，并且此后每天更换。术后总随访时间为20天。监测动物的疼痛迹象，包括发音、呼吸急促、食欲不振以及态度、行为和活动性的变化。应用芬太尼透皮贴剂用于术后镇痛。所有缝线均在POD-7时除去。
为了验证该测定方法并建立对于分层厚度皮肤猪皮的检品特定的边界条件，对新鲜样品(n＝5、5)和热变性样品(n＝5、5)进行了两个独立的测定系列。新鲜样品上产生的(几何)平均甲臜分别为0.221±0.022-mg/mL和0.300±0.035-mg/mL。相比之下，热变性样品上产生的(几何)平均甲臜分别为0.094±0.020-mg/mL和0.105±0.009-mg/mL。这些差异在两种情况下均具有统计学显著性(p<0.05)。
所有四个猪接受者耐受外科手术，并且完全康复而没有事故。全部十六个(n＝16)移植物重新形成血管，没有技术并发症的迹象，并且一致地表现出对下面伤口床的附着(即“良好摄取”)。在术后观察期过程中，没有因机械干扰而丢失移植物，也没有表现出任何伤口感染的临床迹象。在伤口部位1的所有四个(n＝4)自体移植物均永久愈合，并且在研究终点与周围组织没有区别，从而用作皮肤移植、冷冻保存和解冻技术的技术对照。
在群组1中，所有六个(n＝6)同种异体移植物均表现出对下面伤口床的等效附着，并在术后(POD)第2天和第4天一致地表现出与血管形成和灌注一致的临床体征。然而，值得注意的是已经冷冻保存延长的持续时间的同种异体移植物所表现出的颜色的反差(丧失)。与在伤口部位2处的自体移植物和同种异体移植物相比，所有这四个移植物均显得更苍白。在这两个动物中到POD-6时这种外观在所有移植物中都被完全消除了。到POD-8时所有六个(n＝6)同种异体移植物均表现出浅表表皮的轻度脱落，但是在POD-12时进行检查时移植物仍保持有活力、附着并以其他方式看起来健康。在动物24074中，伤口部位2和3处的移植物到POD-14时显示出坏死、进行性红斑和附着丧失的初始迹象，并呈现出增加的免疫介导的排斥的迹象，直到在POD-18时最终排斥为止。然而，伤口部位4(最头颅端)处的同种异体移植物没有类似地持续；替代地在POD-14时该移植物变得显著更黑并表现出完全坏死的迹象，并在临床上被评估为此时完全被排斥。值得注意的是，从在POD-12时有生存能力到POD-14时完全撕裂，移植物4的迅速损失与在伤口部位2和伤口部位3处相异且截然不同。对于动物24075上的移植物，所有移植物在POD-14时均被排斥。
在群组2中，动物呈现与群组1中的那些相似(到POD-4时)，并且彼此等效。总体而言，在群组1中，临床体征的进展与轻度不匹配的移植物相当，但步伐加快。经历了延长冷冻保存的移植物在POD-2和POD-4时比未经历冷冻保存的移植物显得更苍白，并且所有移植物到POD-6时均显示出灌注和血管形成的证据增加。到POD-8时，动物24043中的所有三个同种异体移植物均显示出明显的排斥迹象，并被视为完全排斥。到POD-10时，在动物24070中，所有三个同种异体移植物均显示出明显的排斥迹象，并被视为完全排斥。然而，所有同种异体移植物以相同的比率的存活，而与遗传学或存储时间长度无关。
对于经历有限或延长的冷冻保存持续时间的移植物，在伤口部位2和3处100％的同种异体移植物比较物(n＝4个中的4)在移植物存活的持续时间的临床评估方面是相同的。伤口部位2和4的比较是一致的(n＝3)，例外是动物24074在伤口部位4的同种异体移植物，其存活直到POD-14(n＝1)，被确定为在其相似物前四天在临床上被排斥。
总体而言，组织学评估与临床评估密切相关。手术后，所有移植物(包括自体移植物)在POD-2和POD-4时的初步观察期间均表现出急性炎症的早期迹象，其后来随着时间的推移而消退。与群组1中的那些相比，群组2中的所有同种异体移植物均一致地表现出加速的向免疫介导排斥的进展。
最终，群组1中的所有六个(n＝6)同种异体移植物和群组2中的动物24043的三个同种异体移植物(n＝3)独立地表现出与独立的总体临床评估毗连的组织学和显微镜排斥迹象。唯一的例外是在动物24070上植入的三个同种异体移植物，其中每个移植物在POD-10时获得4的班夫得分(共4分)，但直到POD-12时才被正式认为排斥，这比在POD-10时指定的对应临床名称晚了一个评估期(2天)。
对于经历有限或延长的冷冻保存持续时间的移植物，在伤口部位2和3处100％的同种异体移植物比较物(n＝4个中的4)在移植物存活的持续时间的组织学评估方面是相同的。伤口部位2和4的比较是一致的(n＝3)，例外是动物24074在伤口部位4的同种异体移植物，其在手术后14天存活(n＝1)，被确定为在其对应物前四天在组织学上被排斥。
如在任一种测试场合中应用的，MTT或中性红色染色技术都被认为进行组织学和显微镜评估无效，然而标准的苏木精和曙红染色证明了可观察到的热变性标本的组织破坏。
总体而言，使用具有随机截距的线性混合效应模型，在伤口部位3处的移植物的平均存活在比伤口部位2处的同种异体移植物的平均存活少了0.00天(95％CI：-1.10天，1.10天)。在伤口部位4处的移植物的平均存活比在伤口部位2处的同种异体移植物的平均存活少2.00天(95％CI：1.10天，3.10天)。组织学评估发现比总体评估的移植物平均多0.5天的存活，但是这在统计学上没有区别(p＝0.28)。八个实验移植物中的七个与它们的比较物表现相当。体内实验表明，经历短期存储与长期存储的移植物之间无统计学差异。除了在动物24074上在伤口部位4处的移植物被评估为比其比较物早四天被完全排斥外，移植物性能和存活力在两组之间没有区别。
如以前的出版物所述，在早期吸入和血管形成期间，冷冻保存的移植物显得明显更苍白。对于所有动物的伤口部位3和4处的移植物，这种对比都十分明显。最终，移植物完全消退，并以等效的程度附着在下面的伤口床上。
在三种独立的评估方法中，一致地证明了所表现的生存能力。MTT测定的统计学分析表明，在冷冻保存的标本和新鲜标本之间没有显著差异(图50A)，但是在新鲜标本和冷冻保存的标本与热变性标本之间观察到显著差异(图50B)。这在广义上表明，从统计学上讲，冷冻保存的材料比死的材料更有活力。该结果在体内结果中得到了证实，在所述体内结果中，所有7年移植物均表现出对伤口床的附着和延长的存活力，非活的移植物则不会表现出这种结果。
关于MTT还原测定，在标本与标本之间以及在群组与群组之间，由此类测定产生的绝对值之间存在相当大的变异性。实际上，甲臜产生的绝对值事实上比非冷冻保存的样品获得的那些更高；冷冻不可能增强细胞活性。
可以将猪皮冷冻保存多年，例如1、3、5、7年或更长时间，并保留细胞生存能力，并且遗传修饰Gal-T-KO当与使用相同的程序处理和储存的野生型猪皮相比时不会影响代谢稳定性。
此外，在该同种异体皮肤移植模型中使用MHC匹配的和II类不匹配的供体-接受者对作为内部对照以比较长期冷冻保存(7年)对同种异体皮肤移植物存活的影响。在长期冷冻保存后的细胞生存能力数据受到体内皮肤存活的支持。这也证明了移植物的遗传差异(野生型与Gal-T-KO)不影响移植物的存活。
假设是移植物摄取和总体存活与存储持续时间的长度成反比。换句话说，预期移植物被冷冻的时间越长，其存活并模仿保存较短持续时间的比较移植物的可能性越小。令人惊讶地，这些研究揭示，在本公开的情况下，可以将猪组织冷冻保存显著的时间(7年)，并保持足够的细胞生存能力。此外，当与经过相同处理的野生型皮肤相比时，遗传修饰(Gal-T-KO)不影响代谢活性。最后，结果证实了MTT还原测定能够可靠地提供一种准确、有用的诊断方法，并且适用于评估猪皮移植物的生存能力。
这项研究的有希望的结果表明，将猪皮冷冻保存和储存后勤相关的持续时间可能是可行的，并且我们的发现与当前的行业实践以及美国组织库协会(AmericanAssociation for Tissue Banks)针对人体尸体组织建立的多年“保质期”指南一致。
此外，这些数据表明，公开了保存和储存具有足够生存能力的猪异种移植制品的可扩展的、临床上有用的方法，并且可以有效地储存和分配活的猪异种移植制品。
实施例4
制品处理
一般而言
根据以下程序处理本公开的异种移植制品。
人员
操作员按照制度标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体条件。操作员戴上针对紫外光和激光的护眼安全眼镜。
层流通风橱的准备和制品处理
在层流通风橱中设置了紫外激光灯(型号#)。灯的四个角中的每个角都放置在两个彼此叠置的容器盖子上，即，使用四对盖子来支撑灯。从灯泡(总共2个灯泡管)到通风橱底部的距离为大约1.5英寸。通风橱的整个内部都喷有酒精，例如乙醇或异丙醇。打开灯，并且操作员根据灯的规格、灯泡数量以及灯泡与异种移植制品之间的距离，计算所需暴露的时间。
操作员将两个浴(一个氯己定和一个酒精)倒入两个单独的碗中，并将所述两个碗放在通风橱下。
将一包新的灭菌小瓶放置在通风橱下。拧开小瓶盖并将其放入氯己定浴中。然后将每个小瓶(不带盖)倒置，并将开口端投入氯己定浴中，每次一分钟，然后直立放置以风干。此后，利用无菌纱布用氯己定和酒精擦拭每个小瓶的外部。从氯己定浴中取出小瓶盖，并放在无菌纱布上。将每个小瓶的开口端分别投入酒精浴中1分钟，然后静置风干。
将具有根据实施例2制备的网衬背的异种移植制品“#46制品”(5x15cm)从其原始小瓶中取出，并且操作员将原始小瓶置于空碗中。操作员将#46制品置于打开的消毒器械包装的纸面上。操作员展开#46制品并将其放置在灯下持续2分钟，然后将其翻转到另一侧，取下网衬背，并且将其相反侧放在灯下持续2分钟，同时仍在同一张纸上。基于特定的生物剂或待灭菌的生物剂的类型可以改变将给定样品暴露于UV光的时间段，例如，如下表12所示：
表12
Figure BDA0003331279010001771
*使用125uW/cm2的UV-C强度
然后取出“#46制品，并切成两半。用手将每半部分卷起并放在如上所述进行灭菌的新小瓶中。将每个新的盖放在每个新的小瓶上，并牢固地拧紧。将每个小瓶放置在灯下，并定期滚动以使小瓶的外部均匀地暴露于光。将小瓶放置在玻璃罐中，所述玻璃罐的内部先前已灭菌并且外部已由操作员使用酒精和氯己定进行灭菌(包括螺纹和盖)。
对以下异种移植制品进行类似的处理，不同之处在于代替在进入灯下之前放置在无菌纸上，不将网从制品上取下并将制品皮肤侧朝上放置在灯下持续2分钟，然后将制品折叠起来使得每个制品的底部部分的第一半面向灯2分钟，然后将每个制品的第二半折叠起来使得每个制品的底部的另一半面向灯2分钟。一些制品被切成较小的部分并暴露在光下，一些制品持续长于2分钟，但从不少于2分钟。
使制品#40(5x15 cm)、#63(10x15 cm)、#69(10x15 cm)和#25经过上述过程，并且将制品#69和#25仅使用器械卷起，操作员未直接处理那些制品。与#46一样，在操作员将盖牢固地拧紧在每个小瓶上之后，将每个小瓶放置在灯下并滚动以均匀暴露于灯发出的光。随后将小瓶从灯下移开，并在放入玻璃罐中之前用酒精擦拭。
利用四个玻璃罐来储存每组小瓶。在交给操作员之前，助手通过喷瓶用酒精将玻璃罐的外部浸透。助手通过握住每个罐的底部并在通风橱外面交给操作员来将玻璃罐交给操作员。在从助手那里接收到玻璃罐后，操作员在通风橱下浸浴玻璃罐盖子，并将罐的开口端投入酒精中并用酒精擦拭罐的外部，包括罐的螺纹。
利用纱布用酒精擦拭小瓶，并将其用器械将其放入每个玻璃罐中。然后固定玻璃罐的盖子，并且将罐交给助手。在所有这些过程中，助手会频繁并定期用酒精喷雾操作员的手套和手臂。
此后，在程序结束时将制品放入相冷冻机中。
实施例5
在用于治疗人患者的严重且广泛的部分厚度和全层厚度烧伤的本公开异种移植制品的人体评价中，获得了以下结果：
患者出现混合深度的火焰引起的烧伤，导致(解剖学)右侧上躯干有14％的全身表面积(TBSA)缺陷—具体而言，边界：从右侧腋窝(上边界)至第六根右侧肋骨(下边界)，如图51A所示。
外科医生用人已故供体(HDD)同种异体移植物和本公开的异种移植制品暂时地移植部分受影响的伤口区域。伤口区的其余区域用负压伤口疗法(NPWT)覆盖。患者在手术期间接受了大约150cm2的HDD同种异体移植物(啮合成1:1.5的比率)和25cm2的本公开异种移植制品(啮合成1:1的比率)，这具体显示在图51B中。
两个临时伤口闭合敷料相邻放置，但不直接接触，并且在组织的周边用肘钉固定，覆盖上NPWT。
在POD-5时对第一次伤口敷料更换的临床目视检查时，观察到HDD同种异体移植物和本公开的异种移植制品两者都完全粘附到下面的伤口床上并且无法区分开来，如图51C所示。
患者没有经历不良事件，也没有观察到或报告严重的不良事件。
根据常规临床护理标准，在第一次伤口敷料更换时同时移除HDD同种异体移植物和本公开的异种移植制品。在机械移除后，下面的伤口床被同样地灌注(具有可见的点状出血)并且在其他方面看起来是等效的，如图51D所示。
与HDD同种异体移植物的伤口床相邻的本公开异种移植制品的伤口床的POD-5特写图像显示在图51E中。
在移除后的POD-5时，根据临床护理标准，整个受影响的区域通过植入从患者获得的自身(自体)移植物(自体分层厚度皮肤移植物)接受了最终的伤口闭合，如图51F所示。
根据协议，获得了感染性疾病、免疫反应和长期评价的血液样品，以及手术前、围手术期和手术后的照片。
在POD-14(从第一次手术开始)时，伤口敷料更换时的临床观察表明，在任何位置的伤口愈合率或质量都没有可辨别的差异，如图51G所示。
根据协议，获得了感染性疾病、免疫反应和长期评价的血液样品，以及手术前、围手术期和手术后的照片。
对基线血样(25mL)、第一次敷料更换(21mL)和两周血样(23mL)进行了通过定量RT-PCR检测PERV的测试。结果如下：
通过qPCR在从PBMC中分离的RNA或DNA和从血浆中分离的RNA中均未检测到PERV。在从PBMC中分离的RNA中没有发现如通过针对猪mtCOII基因的qPCR所确定的猪细胞的证据。
来源 Cq PERV pol Cq猪mtCOII PERV 猪细胞
DNA-PBMC <LOD <LOD 阴性 阴性
RNA-PBMC <LOD <LOD 阴性 阴性
RNA-血浆 <LOD <LOD 阴性 阴性
此外，还进行了一项研究以评估在丝裂霉素C处理的猪刺激细胞(α-半乳糖基转移酶敲除(KO)猪B173)的存在下人淋巴细胞应答外周血单核细胞(PBMC)随时间的增殖反应。在移植猪皮肤移植物之前和之后，从在发起人研究XT-001中招募的患者获得PBMC样品。从遗传修饰的α-半乳糖基转移酶敲除(KO)猪获得猪皮肤移植物。
患者PBMC样品事先通过Ficoll梯度离心制备并冷冻保存。来自皮肤供体猪(B173)的全血先前被运输到Xeno Diagnostics(XD)，并且PBMC通过Ficoll梯度离心分离并冷冻保存。在设置MLR的前一天，将样品在37℃下解冻、洗涤并在10％FBS/RPMI中静置过夜。猪PBMC经丝裂霉素C处理(刺激物)并与等数量的测试人PBMC(应答者)混合。将MLR与在第6天添加的BrdU一起孵育7天。在第7天，进行BrdU ELISA并测量增殖。
如图52所示，当与α-Gal KO猪173PBMC(与皮肤移植物来源相同)一起共培养时，从皮肤移植物患者XT-001获得的PBMC产生阳性异种MLR PBMC混合淋巴细胞反应(MLR)。采样日9月4日和9月19日的培养物中异种增殖反应最高。相比之下，采样日10月3日的异种增殖反应降低，并且接近自体MLR反应水平。总体而言，在所有测试时间段内，KO猪173的异种反应均小于人IRB 11同种异体比较物。
此外，还进行了一项研究以测量人血浆抗猪IgM和IgG与从α-半乳糖基转移酶敲除(KO)猪获得的猪外周血单核细胞(PBMC)随时间结合的水平。在移植猪皮肤移植物之前和之后，从在发起人研究XT-001中招募的患者获得血浆样品。从遗传修饰的α-半乳糖基转移酶敲除(KO)猪获得猪皮肤移植物。
在研究中，将血浆样品在56℃的干热浴中进行了30分钟的去补体。将样品冷却并在FACS结合/洗涤介质中连续稀释。然后将稀释的血浆样品与KO猪PBMC一起孵育，随后与二抗(PE-山羊抗人IgG和FITC-山羊抗人IgM)一起孵育。适当的补偿、荧光减一(FMO)和空白限(LOB)对照在同一测定中运行。在ACEA NovoCyte流式细胞仪上采集和分析细胞。使用中值荧光强度(MFI)和如下获得的相对MFI评估抗猪IgM和IgG的结合：相对MFI＝实际MFI值/LOB(MFI仅在没有血浆的情况下使用二抗获得)。
在四个时间点(包括移植前和移植后(第7天、第16天、第30天))测量人血浆IgM和IgG结合。所有以1:2和1:10稀释的实际测试样品均显示MFI值高于LOB值。如图53所示，如相对中值荧光强度的增加所显示，在第16天和第30天获得了高于预先存在的水平的抗异种IgM和IgG水平的增加。通过7AAD确定的平均测定后细胞生存能力值为92.82％。将细胞仅针对活的细胞进行设门，以确定IgM和IgG与猪PBMC的结合。
序列表
<110> 保罗·霍尔泽(Holzer, Paul)
乔恩·阿德金斯(Adkins, Jon)
伊莉莎白·张(Chang, Elizabeth)
罗德尼·蒙罗伊(Monroy, Rodney)
<120> 用于从人源化的、定制的、无指定病原体的(非人)供体移植的个性化细胞、组织和器官以及与之相关的方法和制品
<130> 4772-108
<160> 211
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201, ENSSSCE00045087536
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<211> 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087536 内含子2-3
<400> 8
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 9
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087540
<400> 9
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 10
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087536
<400> 10
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204内含子2-3
<400> 11
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 12
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087540
<400> 12
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 13
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085054
<400> 13
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201内含子2-3
<400> 14
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 15
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085455
<400> 15
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagg 885
<210> 16
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085054
<400> 16
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202内含子2-3
<400> 17
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 18
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085973
<400> 18
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 19
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085054
<400> 19
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203内含子2-3
<400> 20
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 21
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085973
<400> 21
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 22
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085054
<400> 22
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204内含子2-3
<400> 23
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 24
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085973
<400> 24
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205 5'上游序列
<400> 25
cggggccggg cacggccggg cacccggctt gggcggcggg tttcaggtgg 50
<210> 26
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205 ENSSSCE00045086917
<400> 26
atgggcccag ctggcggcgg cggacgtctc cccgcctggc cgagcggtgg cggcgtcggg 60
ctggcgggcg gaggcctgac tgacgcggat ctccccgcag aggatttcgt gtaccagttt 120
aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc ggctcttgac cagatacatc 180
tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg gggagtaccg ggcggtgacc 240
ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga aggacgtcct ggagcagacg 300
cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga tagaggaagg cacgaccctg 360
cagcggcgag 370
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205内含子1-2
<400> 27
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 28
<211> 1441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205 ENSSSCE00045087028
<400> 28
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagggtaag gagctctggg 900
gaaatgggga gacgggctgt ggttgggacc gtctgcaggg aggccttgtc tctagatgag 960
ctctttcctc ctgaccgtga aaggaaggag actgggatgg tggtgagaag aaacaaaata 1020
atctagggag acaatggagt ctgatttcac tgattgaaag gtagccccac tgcagaggtg 1080
acaggtggaa tttattctag ggcttttttc tagtgacaac tctattcatt tgggaggatt 1140
ttattttaga tcacttaagg ccttgtgggt agggagggaa tatatttcca gttaagttgc 1200
ttatctcatt tccctttggg gtgagtgaga cactgtgcca tgagacattt tgtgggacct 1260
cctgggcagg taatgtttct gctctgattc accaggggtt gtggggacag ggaaaggagg 1320
gaggaagggg tgaggtcagt gtacctgggc gcagtggtct cattcacagc ctatttactt 1380
ctgtgggatc cagagttagg ggagaagttt gctcagtttc tataggaagc tcctgaggtt 1440
g 1441
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205 3'下游
<400> 29
ttccccagaa ccaggccata actttggtgg cacctttctc tgaagctggg 50
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201 5'上游序列
<400> 30
ccaaaacctg acctggcagc tgggctttgg gtgtctttag agttctttct 50
<210> 31
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087534
<400> 31
cagctccatc ctcatcattg ctctacaact ccgaagagca agagctgaga ccaccttgag 60
aagagcatgg tcccaggccg agttctgatg tggggggccc tcgccctgac caccgtgatg 120
agcgcctgtg gaggtgaaga cattgcgg 148
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201内含子1-2
<400> 32
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 33
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087536
<400> 33
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201内含子2-3
<400> 34
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 35
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087540
<400> 35
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201内含子3-4
<400> 36
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 37
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087547
<400> 37
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtggtctgc gccctgggat 60
tgatcgtggg ccttgtgggc atcgtggtgg gcactgtctt catcattcaa ggcctgcgct 120
caggtggtcc ctctagacac caagggtcct tgtgagtcac actccagaag ggaag 175
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201内含子4-5
<400> 38
gtaaggattc agatttgtca gaaccccagt cctgcctctt gtctttgcag 50
<210> 39
<211> 1115
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201 ENSSSCE00045087550
<400> 39
ggtcaaaagc aaagagctac ctatagagac ctgagggctc cctggacacc cagcacaagt 60
cctcttgatt tctccacggt gtcactctct ctttactcct attgtgaatg gcaatgtcca 120
ccctaaggaa gatgacagtg tcaacacaaa acctctgacc ccacttggca tcttgctctg 180
agcagacaca gactatgacc ttgagaagca gaatctggag actcccacac tccacagtgt 240
ccctggctga tgacctgcag tacaccctgg gatacaagct ctttctccaa aagaaagcct 300
agttctccaa tctaacctca tccaggagag tgaaggacct gccattggct cctcaggtcc 360
agtgtgtaga tgagggatca gggaagagag gatgcctgct cctagaggca cagcagtttc 420
ataacctcag agaaaagctc taagccactc gtgttaatga caaatccaag agtgtgagat 480
gaagaccact ttcagtagag tgactcttct aatgcctggg aagacagtgt catcccagat 540
cgacaggtca ttatgttcac agataagaga attccagctc agcagcgcca tcaggtgact 600
gtgcaggagg caatggctgg gatgggtgtg agtcagcccc ggagccaatg agggacccta 660
gagccaaagg gaactctgcc atttgtcttg tggggttcag aagaacaaac tgccccttat 720
ccactccaca ctcaggtggc actggaggct gggatgctcc atgtgacaga tgcagacatc 780
tccatgctgg aaagtcattt ccagcagcac aaagatctgg gaaatccagt ccctgttcct 840
tataaggggg gtgggcacaa tgccaaccat ctgcatccca tgtacaggat gatgtttctg 900
aaaggtgtgc atgttaccca gactgggccg gtagcatctt ccctaaaatg attaaaactg 960
tagtatacac tctggaaata tacaacagag acaaattaat acacacacac acagagagat 1020
aagctgtgag gtgatgagaa agaaagatat agaaaataga gatgaaaaga gaaacacagc 1080
aagataaaga gatgccgata aagagtgata aagat 1115
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-201 3'下游序列
<400> 40
gcaaatagtg aaaaattgat tttctttctc ctctgtagac ctttacgcag 50
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 5'上游序列
<400> 41
aactggcaac agaggtgtca tcatagggga agtttctgat tggccaaaac 50
<210> 42
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087621
<400> 42
ctgacctggc agctgggctt tgggtgtctt tagagttctt tctcagctcc atcctcatca 60
ttgctctaca actccgaaga gcaagagctg agaccacctt gagaagagca tggtcccagg 120
ccgagttctg atgtgggggg ccctcgccct gaccaccgtg atgagcgcct gtggaggtga 180
agacattgcg g 191
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202内含子1-2
<400> 43
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 44
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087536
<400> 44
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202内含子2-3
<400> 45
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 46
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087540
<400> 46
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202内含子3-4
<400> 47
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 48
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087547
<400> 48
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtggtctgc gccctgggat 60
tgatcgtggg ccttgtgggc atcgtggtgg gcactgtctt catcattcaa ggcctgcgct 120
caggtggtcc ctctagacac caagggtcct tgtgagtcac actccagaag ggaag 175
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202内含子4-5
<400> 49
gtaaggattc agatttgtca gaacccgatc tcatgtctgt cctattgcag 50
<210> 50
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087625
<400> 50
gagcactgcc cgcctacaag agctgaagag tggatgtgct caacgaccta gaactatttt 60
ctggccaaat tcatcatata ccttctctct t 91
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202内含子5-6
<400> 51
cctacattct tcttctcacc tcttctttct ccacggtgtc actctctctt 50
<210> 52
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 ENSSSCE00045087664
<400> 52
tactcctatt gtgaatggca atgtccaccc taaggaagat gacagtgtca acacaaaacc 60
tctgacccca cttggcatct tgctctgagc agacacagac tatgaccttg agaagcagaa 120
tctggagact cccacactcc acagtgtccc tggctgatga cctgcagtac accctgggat 180
acaagctctt tctccaaaag aaagcctagt tctccaatct aacctcatcc aggagagtga 240
aggacctgcc attggctcct caggtccagt gtgtagatga gggatcaggg aagagaggat 300
gcctgctcct agaggcacag cagtttcata acctcagaga aaagctctaa gccactcgtg 360
ttaatgacaa atccaagagt gtgagatgaa gaccactttc agtagagtga ctcttctaat 420
gcctgggaag acagtgtcat cccagatcga caggtcatta tgttcacaga taagagaatt 480
ccagctcagc agcgccatca ggtgactgtg caggaggcaa tggctgggat gggtgtgagt 540
cagccccgga gccaatgagg gaccctagag ccaaagggaa ctctgccatt tgtcttgtgg 600
ggttcagaag aacaaactgc cccttatcca ctccacactc aggtggcact ggaggctggg 660
atgctccatg tgacagatgc agacatctcc atgctggaaa gtcatttcca gcagcacaaa 720
gatctgggaa atccagtccc tgttccttat aaggggggtg ggcacaatgc caaccatctg 780
catcccatgt acaggatgat gtttctgaaa ggtgtgcatg ttacccagac tgggccggta 840
gcatcttccc taaaatgatt aaaactgtag tatacactc 879
<210> 53
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-202 3'下游序列
<400> 53
tggaaatata caacagagac aaattaatac acacacacac agagagataa 50
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203 5'上游序列
<400> 54
ctttgggtgt ctttagagtt ctttctcagc tccatcctca tcattgctct 50
<210> 55
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087772
<400> 55
acaactccga agagcaagag ctgagaccac cttgagaaga gcatggtccc aggccgagtt 60
ctgatgtggg gggccctcgc cctgaccacc gtgatgagcg cctgtggagg tgaagacatt 120
gcgg 124
<210> 56
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203内含子2-3
<400> 56
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 57
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087536
<400> 57
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 58
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203内含子2-3
<400> 58
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 59
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087540
<400> 59
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203内含子3-4
<400> 60
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 61
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DLA-DQA-203 ENSSSCE00045087547
<400> 61
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtggtctgc gccctgggat 60
tgatcgtggg ccttgtgggc atcgtggtgg gcactgtctt catcattcaa ggcctgcgct 120
caggtggtcc ctctagacac caagggtcct tgtgagtcac actccagaag ggaag 175
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203内含子4-5
<400> 62
gtaaggattc agatttgtca gaaccttttt tttttgtttt cctttttcag 50
<210> 63
<211> 1324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203 ENSSSCE00045087920
<400> 63
gacagctcct gcggcatatg gaagttccca ggctaggggg caaatctgag acgtagctgc 60
tagccattcc acagccatac cagatcagag cctcctacac cgcagctgac tgcaacgctg 120
gatccttaat ccacagagca aggccaggga tcaaacccgc atcctcatgg gtactagttg 180
ggttcatatc ctgctgagac acagtgggaa ctcctggaac taattcctta catggaagag 240
gactgtcaat tatttagcaa aatgaatgaa aaaagactca ctcctaaatg tgtcatttta 300
aaaatttcag ggagttccca ttgtggctca gcggcaatga atctgactag catccatgag 360
gatgcaggtt caatccctgg ccttgcccag tgggttaagg atccggtgtt gccgtgagtt 420
gtggtgtagg tcacagatgt ggctcagatc ccacattgct gtgtctgtgg ctatggcaca 480
ggctgacagc tgcagcttag ctccaattca acccccagtc tgggaacttt acatttctta 540
tgtgacaaag agaccagtcc aaaaagtgcc ttattaccat acagcacttt gattttactt 600
gccccaaaaa ctagtaagct agatcccatt ttctcccatt tcctataacc agtgaaggaa 660
gaagggggta ttatttgttt tgttttacta ttgatatttc agtaacgatg gaagagcttg 720
tgtaaccaag aagggctgct tactacccac tgtctatgta acagtcacaa agatgtgctc 780
agcctaaccc ccaaagagtt ctgaagcttc aagggctctt cagagttgac ccaagttatg 840
gtgggatcac aaactttaca cctctgcaat gagcagtcac tgcagctgaa ttcccttggg 900
aagtgcagta aaactggaac tgggattcaa ttccacagtc attcaaggga tctaggttat 960
gactcagggt tacaacactt catacaccat cattctcagc aatggcctcc aggcttgcag 1020
tagaaggaaa agacaaagca gacagagctt aaacttgctt ttaaattcca tcggctggta 1080
ccagtcacaa ctccaaccta acctggaggg gaagctggga gatactgggt gacattattg 1140
aaggtgagac caaatgttca tgacaagtgg gctgttctca gatacaccca tgtatttttc 1200
tccaaggtat atgactacta aaactttggg attttttgtt agcaaacttg tttatatgta 1260
tttttaatta aatgatcaat aaaggattat attacccaat gaaatctggg tacaaaaaaa 1320
aaaa 1324
<210> 64
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-203 3'下游序列
<400> 64
gttgttccta tgaaactgtc actggaagga aagaaaaaag actctttctc 50
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 5'上游序列
<400> 65
tagagaagca aaaagaaacg cagcaaaccc acatgtggag gccaggcaaa 50
<210> 66
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088042
<400> 66
ggggcttggg ggggtagtgc ctgccagagg ggggtcacct caggagtctt cccggaagct 60
gtaactcagg aaatatggtt ggacaaatta ttagtgttgg cctcatctta tccatgagag 120
ctcagaaatt cccgccccgc ttgtccgtgg caggcataca cacctccgag atgattctca 180
tttcatcccc tccctccttt cactgagagt cccctcagct ctagtctgag aggaggcagc 240
ctcagaaccg ggggatttcc caaccccttc caggcctctt caaacaaagt cttcaactgg 300
caacagaggt gtcatcatag gggaagtttc tgattggcca aaacctgacc tggcagctgg 360
gctttgggtg tctttagagt tctttctcag ctccatcctc atcattgctc tacaactccg 420
aagagcaaga gctgagacca ccttgagaag agcatggtcc caggccgagt tctgatgtgg 480
ggggccctcg ccctgaccac cgtgatgagc gcctgtggag gtgaagacat tgcgg 535
<210> 67
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204内含子1-2
<400> 67
gtgagtgcaa agccgaggga cgtggcacct tcatgctgac cccgacctag 50
<210> 68
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087536
<400> 68
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204内含子2-3
<400> 69
gtatgtgttc atcattctgc ctttcaatca gtgctgtttt ctcaccacag 50
<210> 70
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045087540
<400> 70
aggttcctga ggtgactgtg ttttccaagt ctccagtgat actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtca tgtggacagc atctttcctc ctgtgatcaa catcacgtgg ttgaagaacg 120
ggcactctgt caaaggtttt tctgagacca gcttcctctc caaaaatgat cattccttcc 180
tcaagatcag ttatctcacc ttcctccctt ctgatgacga tttttatgac tgcaaagtgg 240
agcactgggg cctggataag ccacttctga aacactggg 279
<210> 71
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204内含子3-4
<400> 71
gtatggacga gttccacccc ttttggactt ctacaacctc acttttgcag 50
<210> 72
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088055
<400> 72
aacctgagat tccagccccc atgtcagagc tgacagagac tgtg 44
<210> 73
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204内含子4-5
<400> 73
gtctgcgccc tgggattgat cgtgggtggg cactgtcttc atcattcaag 50
<210> 74
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088069
<400> 74
gcctgcgctc aggtggtccc tctagacacc aagggtcctt gtgagtcaca ctccagaagg 60
gaag 64
<210> 75
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204内含子5-6
<400> 75
gtaaggattc agatttgtca gaacccgatc tcatgtctgt cctattgcag 50
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 ENSSSCE00045088082
<400> 76
gagcactgcc cgcctacaag agctga 26
<210> 77
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQA-204 3'下游序列
<400> 77
agagtggatg tgctcaacga cctagaacta ttttctggcc aaattcatca 50
<210> 78
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 5'上游序列
<400> 78
ctacatgggc acttccacag gtttttattc tctgaagggg ggatacgaga 50
<210> 79
<211> 163
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045084941
<400> 79
accactgagt gggagctgtg ttgactacca ttacttcttc gtttgccctc aattatgtct 60
gggatggtgg ctctgcggct ccccagaggc ctttggacag cggccttgac ggtgatgctg 120
gtggtgctgg gtgctccagt ggctgagggc agagactctc cac 163
<210> 80
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201内含子1-2
<400> 80
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 81
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085054
<400> 81
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 82
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201内含子2-3
<400> 82
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 83
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085455
<400> 83
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagg 885
<210> 84
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201内含子3-4
<400> 84
gtaaggagct ctggggaaat ggggatgacc actctctctc tcttctacag 50
<210> 85
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 ENSSSCE00045085731
<400> 85
ggctcgtgcg ctgaatcctg aagatacttt ggggttggtt tttgctcttc ttaaatgcct 60
gtctgttctt gcctggaatt cccatacccc tgccagcttg ttcctctctg aggtcagatc 120
ctacagtgac tctgatgcag tcacgagggc gcttcctgtg atccccacct caaggctctg 180
gctgtgaagc ttcttcctga actgacccca gcgcctctgc ctgagtgcag ccagctgtgt 240
ctactcagac cacaagggat tttcctgttc ctattttccc tcaacagact gtgcaagaga 300
agcacattga aaccatttac ctggctgtag agtgcttttt ttaaaatcat aattaaacat 360
gattatgagt ta 372
<210> 86
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-201 3'下游序列
<400> 86
tctgtgcacc gacccttctt aaatgggcag aggtaagaaa caatggcaga 50
<210> 87
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 5'上游序列
<400> 87
catgggcact tccacaggtt tttattctct gaagggggga tacgagaacc 50
<210> 88
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085952
<400> 88
actgagtggg agctgtgttg actaccatta cttcttcgtt tgccctcaat tatgtctggg 60
atggtggctc tgcggctccc cagaggcctt tggacagcgg ccttgacggt gatgctggtg 120
gtgctgggtg ctccagtggc tgagggcaga gactctccac 160
<210> 89
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202内含子1-2
<400> 89
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 90
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085054
<400> 90
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 91
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202内含子2-3
<400> 91
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 92
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045085973
<400> 92
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 93
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202内含子3-4
<400> 93
gtaaggggca gttggttttc tttccctgac atttgggctc tgctccccag 50
<210> 94
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA_DQB1-202 ENSSSCE00045086264
<400> 94
gggcacagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagcgg tgtcgggggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt cctcgggctg ggccttttca tccgtcacag gagtcagaag g 111
<210> 95
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202内含子4-5
<400> 95
gtaaggagct ctggggaaat ggggatgacc actctctctc tcttctacag 50
<210> 96
<211> 371
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 ENSSSCE00045086397
<400> 96
ggctcgtgcg ctgaatcctg aagatacttt ggggttggtt tttgctcttc ttaaatgcct 60
gtctgttctt gcctggaatt cccatacccc tgccagcttg ttcctctctg aggtcagatc 120
ctacagtgac tctgatgcag tcacgagggc gcttcctgtg atccccacct caaggctctg 180
gctgtgaagc ttcttcctga actgacccca gcgcctctgc ctgagtgcag ccagctgtgt 240
ctactcagac cacaagggat tttcctgttc ctattttccc tcaacagact gtgcaagaga 300
agcacattga aaccatttac ctggctgtag agtgcttttt ttaaaatcat aattaaacat 360
gattatgagt t 371
<210> 97
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-202 3'下游序列
<400> 97
atctgtgcac cgacccttct taaatgggca gaggtaagaa acaatggcag 50
<210> 98
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 5'上游序列
<400> 98
ctgagtggga gctgtgttga ctaccattac ttcttcgttt gccctcaatt 50
<210> 99
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045086523
<400> 99
atgtctggga tggtggctct gcggctcccc agaggccttt ggacagcggc cttgacggtg 60
atgctggtgg tgctgggtgc tccagtggct gagggcagag actctccac 109
<210> 100
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203内含子1-2
<400> 100
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 101
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085054
<400> 101
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 102
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203内含子2-3
<400> 102
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 103
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045085973
<400> 103
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 104
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203内含子3-4
<400> 104
gtaaggggca gttggttttc tttccctgac atttgggctc tgctccccag 50
<210> 105
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 ENSSSCE00045086652
<400> 105
gggcacagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagcgg tgtcgggggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt cctcgggctg ggccttttca tccgtcacag gagtcagaag ggtaagga 118
<210> 106
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203内含子4-5
<400> 106
gctctgggga aatggggaga cgggcggaag gagactggga tggtggtgag 50
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA_DQB1-203 ENSSSCE00045086845
<400> 107
aagaaacaaa ataatctag 19
<210> 108
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-203 3'下游序列
<400> 108
ggagacaatg gagtctgatt tcactgattg aaaggtagcc ccactgcaga 50
<210> 109
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204 5'上游序列
<400> 109
ctgagtggga gctgtgttga ctaccattac ttcttcgttt gccctcaatt 50
<210> 110
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045086523
<400> 110
atgtctggga tggtggctct gcggctcccc agaggccttt ggacagcggc cttgacggtg 60
atgctggtgg tgctgggtgc tccagtggct gagggcagag actctccac 109
<210> 111
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204内含子1-2
<400> 111
gtaagtgcag ccaccattca ggggactgac tgacgcggat ctccccgcag 50
<210> 112
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085054
<400> 112
aggatttcgt gtaccagttt aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc 60
ggctcttgac cagatacatc tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacc ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga 180
aggacgtcct ggagcagacg cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga 240
tagaggaagg cacgaccctg cagcggcgag 270
<210> 113
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204内含子2-3
<400> 113
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 114
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045085973
<400> 114
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gc 282
<210> 115
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204内含子3-4
<400> 115
gtaaggggca gttggttttc tttccctgac atttgggctc tgctccccag 50
<210> 116
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA_DQB1-204 ENSSSCE00045086652
<400> 116
gggcacagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagcgg tgtcgggggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt cctcgggctg ggccttttca tccgtcacag gagtcagaag ggtaagga 118
<210> 117
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204内含子4-5
<400> 117
gctctgggga aatggggaga cgggcggaga agtttgctca gtttctatag 50
<210> 118
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-204 ENSSSCE00045086763
<400> 118
gaagctcctg aggttgttcc ccagaaccag gccataa 37
<210> 119
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA_DQB1-204 3'下游序列
<400> 119
ctttggtggc acctttctct gaagctggga ggaaagggtg aggtcagtgt 50
<210> 120
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205 5'上游序列
<400> 120
cggggccggg cacggccggg cacccggctt gggcggcggg tttcaggtgg 50
<210> 121
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205 ENSSSCE00045086917
<400> 121
atgggcccag ctggcggcgg cggacgtctc cccgcctggc cgagcggtgg cggcgtcggg 60
ctggcgggcg gaggcctgac tgacgcggat ctccccgcag aggatttcgt gtaccagttt 120
aagttcgagt gctacttctt caacggaacg cagcgggtgc ggctcttgac cagatacatc 180
tacaaccagg aggagcacgt gcgcttcgac agcaacgtgg gggagtaccg ggcggtgacc 240
ccgctggggc ggccggacgc cgactactgg aacggccaga aggacgtcct ggagcagacg 300
cgggccgagc tggacactgt gtgcaaacac aactaccaga tagaggaagg cacgaccctg 360
cagcggcgag 370
<210> 122
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205内含子1-2
<400> 122
gtgagtgcct gcccgccgcc cgcggttttc ccgtctgtta ctcccctcag 50
<210> 123
<211> 1441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA_DQB1-205 ENSSSCE00045087028
<400> 123
tgcaacctac agtgactatc tccccatcca aggcagaggc tctaaaccac cacaacctgc 60
tggtctgtgc ggtgacagat ttctatccaa gccaggtgaa agtccagtgg ttccggaatg 120
gccaggagga gacagctggc gttgtgtcca ctcctcttat taggaatgga gactggacct 180
accaggtgct cgtgatgcta gagatgaatc tccagcgagg agatgtctac acctgccgcg 240
tggagcactc cagcctccag agccccatct tggtggagtg gcgtaagggg cagttggttt 300
tctttccctg tgggccctgc agaacagagg gcaggcagag cttcccgggt ccatcccatc 360
tcattctttg tccccgacat cactactgag ctggacatca ctgggcacat gagtgctctt 420
gcctcatagc aagggcatca ggagaatctt tatctccttg tctttccaga tacagagcga 480
tcactacata ccatgacccc agagcccagc cctaggagct ctgcaggatt gactagtgcc 540
tggggcctta aggtctcaga ttatgaaagg agcagggatc cattttcctt ctcactcacc 600
ctcccactct gtccagggag ctattggctg gtccctcacc taggggtggt cagaatggac 660
aacggggttc ccctggcacc tctaccccct gtacctcaga ctagacttca ggcctcataa 720
aggagcacca tggggtgtgg tgacaaactc tgacatttgg gctctgctcc ccaggggcac 780
agtctgaatc tgcccagagc aagatgctga gcggtgtcgg gggcttcgtg ctggggctga 840
tcttcctcgg gctgggcctt ttcatccgtc acaggagtca gaagggtaag gagctctggg 900
gaaatgggga gacgggctgt ggttgggacc gtctgcaggg aggccttgtc tctagatgag 960
ctctttcctc ctgaccgtga aaggaaggag actgggatgg tggtgagaag aaacaaaata 1020
atctagggag acaatggagt ctgatttcac tgattgaaag gtagccccac tgcagaggtg 1080
acaggtggaa tttattctag ggcttttttc tagtgacaac tctattcatt tgggaggatt 1140
ttattttaga tcacttaagg ccttgtgggt agggagggaa tatatttcca gttaagttgc 1200
ttatctcatt tccctttggg gtgagtgaga cactgtgcca tgagacattt tgtgggacct 1260
cctgggcagg taatgtttct gctctgattc accaggggtt gtggggacag ggaaaggagg 1320
gaggaagggg tgaggtcagt gtacctgggc gcagtggtct cattcacagc ctatttactt 1380
ctgtgggatc cagagttagg ggagaagttt gctcagtttc tataggaagc tcctgaggtt 1440
g 1441
<210> 124
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-DQB1-205 3'下游序列
<400> 124
ttccccagaa ccaggccata actttggtgg cacctttctc tgaagctggg 50
<210> 125
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DRA样品11 01:01:01 外显子1
<400> 125
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 126
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品11 01:01:01外显子2
<400> 126
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 127
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品11 01:01:01外显子3
<400> 127
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catcgacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 128
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品11 01:01:01外显子4
<400> 128
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 129
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品19 01:01:02外显子1
<400> 129
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 130
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品19 01:01:02外显子2
<400> 130
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 131
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品19 01:01:02外显子3
<400> 131
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catagacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 132
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品19 01:01:02外显子4
<400> 132
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa tgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 133
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA1样品11 05:05:01外显子2
<400> 133
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 134
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA1样品19 01:01:01外显子2
<400> 134
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgaggagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 135
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA1 05:01:01外显子2
<400> 135
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 136
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 样品57 01:01:01外显子2
<400> 136
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgaggagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 137
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA1 03:03:01外显子2
<400> 137
ctgaccatgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttatggtccc tctgggcagt 60
acagccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggcagtt gcctctgttc cgcagattta gaagatttga cccgcaattt gcactgacaa 180
acatcgctgt gctaaaacat aacttgaaca tcgtgattaa acgctccaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 138
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA1样品29 05:01:01外显子2
<400> 138
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 139
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA1样品50 01:02:01外显子2
<400> 139
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
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<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA SLA-201 ENSSSCE00045087536
<400> 140
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 141
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA SLA-202 ENSSSCE00045087536外显子2
<400> 141
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 142
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA SLA-203 ENSSSCE00045087536外显子2
<400> 142
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 143
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DQA SLA-204 ENSSSCE00045087536外显子2
<400> 143
ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc ttacggtccc agcggctatt 60
atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga cctggagaag aaggagactg 120
tctggcggct gcctctgttt agtgaattta caagttttga cccgcagggt gcactgagga 180
atatagctac gttaaaacat aacttgaaca tcgtgactaa acgctccaac aacaccgcgg 240
ctgtcaatc 249
<210> 144
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01外显子1
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atgatcctaa acaaagctct gatgctgggg acccttgccc tgaccaccgt gatgagcccc 60
tgtggaggtg aagacattgt gg 82
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<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01外显子2
<400> 145
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 146
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01外显子3
<400> 146
aggttcctga ggtcacagtg ttttccaagt ctcccgtgac actgggtcag cccaacatcc 60
tcatctgtct tgtggacaac atctttcctc ctgtggtcaa catcacatgg ctgagcaatg 120
ggcactcagt cacagaaggt gtttctgaga ccagcttcct ctccaagagt gatcattcct 180
tcttcaagat cagttacctc accctcctcc cttctgctga ggagagttat gactgcaagg 240
tggagcactg gggactggac aagcctcttc tgaaacactg gg 282
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<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT.11 05:05:01外显子4
<400> 147
agcctgagat tccagcccct atgtcagagc tcacagagac tgtggtctgc gccctggggt 60
tgtctgtggg cctcgtgggc attgtggtgg gcactgtctt catcatccga ggcctgcgtt 120
cagttggtgc ttccagacac caagggccct tgtga 155
<210> 148
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01外显子1
<400> 148
atgatcctaa acaaagctct gctgctgggg gccctcgctc tgaccaccgt gatgagcccc 60
tgtggaggtg aagacattgt gg 82
<210> 149
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01外显子2
<400> 149
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 150
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01外显子3
<400> 150
aggttcctga ggtcacagtg ttttccaagt ctcccgtgac actgggtcag cccaacaccc 60
tcatttgtct tgtggacaac atctttcctc ctgtggtcaa catcacatgg ctgagcaatg 120
ggcagtcagt cacagaaggt gtttctgaga ccagcttcct ctccaagagt gatcattcct 180
tcttcaagat cagttacctc accttcctcc cttctgctga tgagatttat gactgcaagg 240
tggagcactg gggcctggac cagcctcttc tgaaacactg gg 282
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<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01外显子4
<400> 151
agcctgagat tccagcccct atgtcagagc tcacagagac tgtggtctgt gccctggggt 60
tgtctgtggg cctcatgggc attgtggtgg gcactgtctt catcatccaa ggcctgcgtt 120
cagttggtgc ttccagacac caagggccat tgtga 155
<210> 152
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01外显子1
<400> 152
atgatcctaa acaaagctct gatgctgggg gccctcgccc tgaccaccgt gatgagccct 60
tgtggaggtg aagacattgt gg 82
<210> 153
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01外显子2
<400> 153
ctgaccatgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttatggtccc tctgggcagt 60
acagccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggcagtt gcctctgttc cgcagattta gaagatttga cccgcaattt gcactgacaa 180
acatcgctgt gctaaaacat aacttgaaca tcgtgattaa acgctccaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 154
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01外显子3
<400> 154
aggttcctga ggtcacagtg ttttccaagt ctcccgtgac actgggtcag cccaacaccc 60
tcatctgtct tgtggacaac atctttcctc ctgtggtcaa catcacctgg ctgagcaatg 120
ggcactcagt cacagaaggt gtttctgaga ccagcttcct ctccaagagt gatcattcct 180
tcttcaagat cagttacctc accttcctcc cttctgatga tgagatttat gactgcaagg 240
tggagcactg gggcctggat gagcctcttc tgaaacactg gg 282
<210> 155
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01外显子4
<400> 155
agcctgagat tccaacacct atgtcagagc tcacagagac tgtggtctgc gccctggggt 60
tgtctgtggg cctcgtgggc attgtggtgg ggaccgtctt gatcatccga ggcctgcgtt 120
cagttggtgc ttccagacac caagggccct tgtga 155
<210> 156
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01外显子1
<400> 156
atgtcttgga aaaaggcttt gcggatcccc ggaggccttc gggcagcaac tgttaccttg 60
atgctggcga tgctgagcac cccagtggct gagggcagag actctcccg 109
<210> 157
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01外显子2
<400> 157
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 158
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:03:01外显子3
<400> 158
tggagcccac agtgaccatc tccccatcca ggacagaggc cctcaaccac cacaacctgc 60
tggtctgctc agtgacagat ttctatccag cccagatcaa agtccggtgg tttcggaatg 120
accaggagga gacaaccggc gttgtgtcca ccccccttat taggaacggt gactggacct 180
tccagatcct ggtgatgctg gaaatgactc cccagcatgg agacgtctac acctgccacg 240
tggagcaccc cagcctccag aaccccatca ccgtggagtg gc 282
<210> 159
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01外显子4
<400> 159
gggctcagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagtgg cattggaggc ttcgtgctgg 60
ggctcatctt cctcgggctg ggccttatta tccatcacag gagtcagaaa g 111
<210> 160
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01外显子1
<400> 160
atgtcttgga agaaggcttt gcggatcccc ggagaccttc gggtagcaac tgtcaccttg 60
atgctggcga tgctgagctc cctactggct gagggcagag actctcccg 109
<210> 161
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01外显子2
<400> 161
aggatttcgt gttccagttt aagggcatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gtcttgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggtgtaccg cgcggtgacg ccgcaggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggaggggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactacgagg 240
tggcgttccg cgggatcttg cagaggagag 270
<210> 162
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01外显子3
<400> 162
tggagcccac agtgaccatc tccccatcca ggacagaggc cctcaaccac cacaacctgc 60
tggtctgctc ggtgacagat ttctatccag gccagatcaa agtccggtgg tttcggaatg 120
atcaggagga gacagccggc gttgtgtcca ccccccttat taggaatggt gactggactt 180
tccagatcct ggtgatgctg gaaatgactc cccagcgtgg agatgtctac acctgccacg 240
tggagcaccc cagcctccag agccccatca ccgtggagtg gc 282
<210> 163
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01外显子4
<400> 163
gggctcagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagtgg cgttggaggc ttcgtgctgg 60
ggctgatctt ccttgggctg ggccttatca tccgtcaaag gagtcagaaa g 111
<210> 164
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01外显子1
<400> 164
atgtcttgga aaaaggcttt gcggatcccc ggaggccttc gggcagcaac tgttaccttg 60
atgctggcga tgctgagcac cccagtggct gagggcagag actctcccg 109
<210> 165
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01外显子2
<400> 165
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 166
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01外显子3
<400> 166
tgaccaggag gagacaaccg gcgttgtgtc cacccccctt attaggaacg gtgactggac 60
cttccagatc ctggtgatgc tggaaatgac tccccagcat ggagacgtct acacctgcca 120
cgtggagcac cccagcctcc agaaccccat caccgtggag tggc 164
<210> 167
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01外显子4
<400> 167
gggctcagtc tgaatctgcc cagagcaaga tgctgagtgg cattggaggc ttcgtgctgg 60
ggctcatctt cctcgggctg ggccttatta tccatcacag gagtcagaaa g 111
<210> 168
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLAAlleles.Org 9.05% USA外显子2 DQA1*01:01:01:01
<400> 168
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgaggagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 169
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLAAlleles.Org 14.17% USA 外显子2 DQA1*01:02:01:01
<400> 169
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 170
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLAAlleles.Org 13.14% USA 外显子2 DQA1*05:01:01:01
<400> 170
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 171
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLAAlleles.Org 11.08% USA 外显子2 DQA1*02:01:01:01
<400> 171
ctgaccacgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
tcacccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggaagtt gcctctgttc cacaaatttg gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtgct aaaacataac ttgaacatcc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 172
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 外显子1
<400> 172
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 173
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 外显子2
<400> 173
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 174
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01 外显子3
<400> 174
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catcgacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 175
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01外显子4
<400> 175
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 176
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03外显子1
<400> 176
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 177
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03外显子2
<400> 177
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 178
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03外显子3
<400> 178
tacctccaga ggtaactgtg ctcacaaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catagacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 179
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03外显子4
<400> 179
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggattgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 180
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01外显子1
<400> 180
atggccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 181
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01外显子2
<400> 181
aagaacatgt gatcatccag gccgagttct atctgaatcc tgaccaatca ggcgagttta 60
tgtttgactt tgatggtgat gagattttcc atgtggatat ggcaaagaag gagacggtct 120
ggcggcttga agaatttgga cgatttgcca gctttgaggc tcaaggtgca ttggccaaca 180
tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgacaaagcg ctccaactat actccgatca 240
ccaatg 246
<210> 182
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01外显子3
<400> 182
tacctccaga ggtaactgtg ctcacgaaca gccctgtgga actgagagag cccaacgtcc 60
tcatctgttt catcgacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg cttcgaaatg 120
gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa gaccaccttt 180
tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac gactgcaggg 240
tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg gg 282
<210> 183
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01外显子4
<400> 183
agtttgatgc tccaagccct ctcccagaga ctacagagaa cgtggtgtgt gccctgggcc 60
tgactgtggg tctggtgggc atcattattg ggaccatctt catcatcaag ggagtgcgca 120
aaagcaatgc agcagaacgc agggggcctc tgtaa 155
<210> 184
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01外显子1
<400> 184
atggtgtgtc tgaggctccc tggaggctcc tgcatggcag ttctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttggctggg gacaccagac 100
<210> 185
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11;01:01外显子2
<400> 185
cacgtttctt ggagtactct acgtctgagt gtcatttctt caatgggacg gagcgggtgc 60
ggttcctgga cagatacttc tataaccaag aggagtacgt gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggagttccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgatga ggagtactgg aacagccaga 180
aggacttcct ggaagacagg cgggccgcgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg 240
ttggtgagag cttcacagtg cagcggcgag 270
<210> 186
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01外显子3
<400> 186
tccatcctaa ggtgactgtg tatccttcaa agacccagcc cctgcagcac cacaacctcc 60
tggtctgttc tgtgagtggt ttctatccag gcagcattga agtcaggtgg ttccggaatg 120
gccaggaaga gaagactggg gtggtgtcca caggcctgat ccacaatgga gactggacct 180
tccagaccct ggtgatgctg gaaacagttc ctcggagtgg agaggtttac acctgccaag 240
tggagcaccc aagcgtgaca agccctctca cagtggaatg ga 282
<210> 187
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01外显子4
<400> 187
gagcacggtc tgaatctgca cagagcaaga tgctgagtgg agtcgggggc tttgtgctgg 60
gcctgctctt ccttggggcc gggctgttca tctacttcag gaatcagaaa g 111
<210> 188
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01外显子1
<400> 188
atggtgtgtc tgaagctccc tggaggctcc tgcatgacag cgctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttgtctggg gacacccgac 100
<210> 189
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01外显子2
<400> 189
cacgtttcct gtggcagcct aagagggagt gtcatttctt caatgggacg gagcgggtgc 60
ggttcctgga cagatacttc tataaccagg aggagtccgt gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggagttccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgacgc tgagtactgg aacagccaga 180
aggacatcct ggagcaggcg cgggccgcgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg 240
ttgtggagag cttcacagtg cagcggcgag 270
<210> 190
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01外显子3
<400> 190
tccaacctaa ggtgactgta tatccttcaa agacccagcc cctgcagcac cacaacctcc 60
tggtctgctc tgtgagtggt ttctatccag gcagcattga agtcaggtgg ttcctgaacg 120
gccaggaaga gaaggctggg atggtgtcca caggcctgat ccagaatgga gactggacct 180
tccagaccct ggtgatgctg gaaacagttc ctcgaagtgg agaggtttac acctgccaag 240
tggagcaccc aagcgtgaca agccctctca cagtggaatg ga 282
<210> 191
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01外显子4
<400> 191
gagcacggtc tgaatctgca cagagcaaga tgctgagtgg agtcgggggc tttgtgctgg 60
gcctgctctt ccttggggcc gggctgttca tctacttcag gaatcagaaa g 111
<210> 192
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01外显子1
<400> 192
atggtgtgtc tgaagttccc tggaggctcc tgcatggcag ctctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttggctggg gacacccgac 100
<210> 193
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01外显子2
<400> 193
cacgtttctt ggagcaggtt aaacatgagt gtcatttctt caacgggacg gagcgggtgc 60
ggttcctgga cagatacttc tatcaccaag aggagtacgt gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggagtaccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggacctcct ggagcagaag cgggccgcgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg 240
ttggtgagag cttcacagtg cagcggcgag 270
<210> 194
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01外显子3
<400> 194
tctatcctga ggtgactgtg tatcctgcaa agacccagcc cctgcagcac cacaacctcc 60
tggtctgctc tgtgaatggt ttctatccag gcagcattga agtcaggtgg ttccggaacg 120
gccaggaaga gaagactggg gtggtgtcca caggcctgat ccagaatgga gactggacct 180
tccagaccct ggtgatgctg gaaacagttc ctcggagtgg agaggtttac acctgccaag 240
tggagcaccc aagcctgacg agccctctca cagtggaatg ga 282
<210> 195
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01外显子4
<400> 195
gagcacggtc tgaatctgca cagagcaaga tgctgagtgg agtcgggggc ttcgtgctgg 60
gcctgctctt ccttggggcc gggctgttca tctacttcag gaatcagaaa g 111
<210> 196
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 11 05:05:01外显子2
<400> 196
ctgaccacgt cgcctcttat ggtgtaaact tgtaccagtc ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggggagg aaggagactg 120
tctggtgttt gcctgttctc agacaattta gatttgaccc gcaatttgca ctgacaaaca 180
tcgctgtcct aaaacataac ttgaacagtc tgattaaacg ctccaactct accgctgcta 240
ccaatg 246
<210> 197
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 50 01:02:01外显子2
<400> 197
ctgaccacgt tgcctcttgt ggtgtaaact tgtaccagtt ttacggtccc tctggccagt 60
acacccatga atttgatgga gatgagcagt tctacgtgga cctggagagg aaggagactg 120
cctggcggtg gcctgagttc agcaaatttg gaggttttga cccgcagggt gcactgagaa 180
acatggctgt ggcaaaacac aacttgaaca tcatgattaa acgctacaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 198
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQA1-PT. 57 03:03:01外显子2
<400> 198
ctgaccatgt tgcctcttac ggtgtaaact tgtaccagtc ttatggtccc tctgggcagt 60
acagccatga atttgatgga gacgaggagt tctatgtgga cctggagagg aaggagactg 120
tctggcagtt gcctctgttc cgcagattta gaagatttga cccgcaattt gcactgacaa 180
acatcgctgt gctaaaacat aacttgaaca tcgtgattaa acgctccaac tctaccgctg 240
ctaccaatg 249
<210> 199
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 11 03:01:01外显子2
<400> 199
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 200
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 50 06:02:01外显子2
<400> 200
aggatttcgt gttccagttt aagggcatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gtcttgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc gcgcttcgac agcgacgtgg 120
gggtgtaccg cgcggtgacg ccgcaggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggaggggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactacgagg 240
tggcgttccg cgggatcttg cagaggagag 270
<210> 201
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DQB1-PT. 57 03:01:01外显子2
<400> 201
aggatttcgt gtaccagttt aaggccatgt gctacttcac caacgggacg gagcgcgtgc 60
gttatgtgac cagatacatc tataaccgag aggagtacgc acgcttcgac agcgacgtgg 120
aggtgtaccg ggcggtgacg ccgctggggc cgcctgacgc cgagtactgg aacagccaga 180
aggaagtcct ggagaggacc cgggcggagt tggacacggt gtgcagacac aactaccagt 240
tggagctccg cacgaccttg cagcggcgag 270
<210> 202
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 11 01:01:01外显子1
<400> 202
taagccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 203
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 50 01:02:03外显子1
<400> 203
taagccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 204
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRA-PT. 57 01:01:01外显子1
<400> 204
taagccataa gtggagtccc tgtgctagga tttttcatca tagctgtgct gatgagcgct 60
caggaatcat gggctatcaa ag 82
<210> 205
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 11 11:01:01外显子1
<400> 205
taagtgtgtc tgaagctccc tggaggctcc tgcatgacag cgctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttgtctggg gacacccgac 100
<210> 206
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 50 15:01:01外显子1
<400> 206
taagtgtgtc tgaagctccc tggaggctcc tgcatgacag cgctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttgtctggg gacacccgac 100
<210> 207
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-DRB1-PT. 57 04:01:01外显子1
<400> 207
taagtgtgtc tgaagttccc tggaggctcc tgcatggcag ctctgacagt gacactgatg 60
gtgctgagct ccccactggc tttggctggg gacacccgac 100
<210> 208
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLA-B2M-208 ENSSSCE00000185155
<400> 208
Arg Pro Pro Lys Val Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Pro Asn Tyr Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Pro Gln
20 25 30
Ile Glu Ile Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Lys Met Asn Ala Glu Gln
35 40 45
Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Val His
50 55 60
Thr Glu Phe Thr Pro Asn Ala Val Asp Gln Tyr Ser Cys Arg Val Lys
65 70 75 80
His Val Thr Leu Asp Lys Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90
<210> 209
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 外显子2 B2M人ENSE00003751577
<400> 209
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp
20 25 30
Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu
35 40 45
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Leu Leu Tyr Tyr
50 55 60
Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn
65 70 75 80
His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90
<210> 210
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA-B2M-207 ENSE00003659794
<400> 210
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp
20 25 30
Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu
35 40 45
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr
50 55 60
Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val
65 70 75 80
Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90
<210> 211
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HLA B2M-214 ENSE00003659794
<400> 211
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp
20 25 30
Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu
35 40 45
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr
50 55 60
Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val
65 70 75 80
Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90

Claims (121)

1.一种用于产生和保存用于移植的个性化、人源化的可移植细胞、组织和器官的储存库的生物系统，其中所述生物系统具有生物活性和代谢活性，所述生物系统包括用于移植到人接受者中的遗传重新编程的非人动物中的细胞、组织和器官，
其中所述非人动物是用于异种移植从遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官的所述遗传重新编程的猪，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组已被重新编程以将在野生型猪的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自人捕获参考序列的多个合成核苷酸，并且
其中所述遗传重新编程的猪的细胞不呈现一个或多个选自α-Gal、Neu5Gc和SDa的表面聚糖表位，
并且
其中编码α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的基因被改变，使得所述遗传重新编程的猪缺乏由所述基因编码的表面聚糖表位的功能性表达，
其中所述重新编程的基因组包含以下定点诱变取代：i)所述野生型猪的SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-A、HLA-B和HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及ii)所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及iii)所述野生型猪的SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-DR和HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代，
其中所述重新编程的基因组包含A-C中的至少一个：
A)其中所述重新编程的猪核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人接受者的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，
其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏所述野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达，并且
其中所述重新编程不引入任何移码或框架破坏。
2.如权利要求1所述的生物系统，其中所述遗传重新编程的猪是非转基因的。
如权利要求1或权利要求2所述的生物系统，其中所述野生型猪基因组的内含子区域未被重新编程。
3.如权利要求1-3中任一项所述的生物系统，其中所述遗传重新编程的猪不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
4.如权利要求1-4中任一项所述的生物系统，其中所述遗传重新编程的猪根据减少生物负荷的程序来维持，所述程序包括将所述猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述病原体，并且其中所述猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
5.如权利要求1-4中任一项所述的生物系统，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处以及在编码SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、CTLA-4、PD-L1、EPCR、TBM、TFPI和β2微球蛋白的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-1、SLA-2和SLA-DR的功能性表达。
6.如权利要求1-5中任一项所述的生物系统，其中所述野生型猪基因组在CTLA-4启动子和PD-L1启动子中的一个或多个处包含重新编程的核苷酸，其中与所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1的内源性表达相比，所述CTLA-4启动子和所述PD-L1启动子中的所述一个或多个被重新编程以增加重新编程的CTLA-4和重新编程的PD-L1中的一者或两者的表达。
7.如权利要求1-6中任一项所述的生物系统，其中所述合成核苷酸的总数等于所替换核苷酸的总数，使得在用所述合成核苷酸重新编程所述野生型猪的基因组之后的核苷酸数量没有净损失或净增加。
8.如权利要求1-7中任一项所述的生物系统，其中用所述多个合成核苷酸的重新编程不包括编码在所述野生型猪MHC序列与所述人捕获参考序列之间保守的氨基酸的密码子区域中的核苷酸的替换。
9.如权利要求1-8中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸的定点诱变取代。
10.如权利要求1-9中任一项所述的生物系统，其中在用于生产所述非人动物的种系细胞中进行定点诱变取代。
11.如权利要求1-10中任一项所述的生物系统，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
12.如权利要求1-11中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-A捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
13.如权利要求1-12中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-B捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
14.如权利要求1-13中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-3的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
15.如权利要求1-14中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-E捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-6的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
16.如权利要求1-15中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-F捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-7的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
17.如权利要求1-16中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-8的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
18.如权利要求1-17中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含所述野生型猪的MHC I类链相关基因2(MIC-2)的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
19.如权利要求1-18中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-1、SLA-2、SLA-DR或其组合的功能性表达。
20.如权利要求1-19中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQA1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQA的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
21.如权利要求1-20中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQB1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQB的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
22.如权利要求1-21中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DRA1和HLA-DRB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DRA和SLA-DRB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代，或其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DRA和SLA-DRB1的功能性表达。
23.如权利要求1-22中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA1和HLA-DQB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DQA和SLA-DQB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
24.如权利要求1-23中任一项所述的生物系统，其中核苷酸的所述定点诱变取代位于在所述野生型猪的核基因组与所述已知人序列之间不保守的密码子处。
25.如权利要求1-24中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人B2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪的B2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
26.如权利要求1-25中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组已被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏所述野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达。
28.如权利要求1-27中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人捕获参考序列的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。
29.如权利要求1-28中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
30.如权利要求1-29中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-DQ和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
31.如权利要求1-30中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ和MIC-2处的核苷酸的定点诱变取代。
32.如权利要求1-31中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DR、SLA-1和/或SLA-2的功能性表达。
33.如权利要求1-32中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组使用外显子区域的无痕交换被重新编程，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
34.如权利要求1-33中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程而不引入任何净插入、缺失、截短或其他将通过移码、无义突变、或错义突变而导致蛋白质表达的破坏的遗传改变。
35.如权利要求1-34中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组的内含子区域中的核苷酸没有被改变。
36.如权利要求1-35中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程以在重新编程的外显子区域为纯合的。
37.如权利要求1-36中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得多肽的细胞外的表型表面表达在人接受者中是致耐受的。
38.如权利要求1-37中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达通过重新编程CTLA-4启动子序列而被增加。
39.如权利要求1-38中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自人捕获参考序列CTLA-4的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型CTLA-4的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
40.如权利要求1-39中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的CTLA-4具有至少95％同一性的人源化CTLA-4多肽序列。
41.如权利要求1-40中任一项所述的生物系统，其中所述核基因组被重新编程使得程序性死亡配体1(PD-L1)的表达通过重新编程PD-L1启动子序列而被增加。
42.如权利要求1-41中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人PD-L1的直系同源外显子的核苷酸对野生型PD-L1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
43.如权利要求1-42中任一项所述的生物系统，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的PD-L1具有至少95％同一性的人源化PD-L1多肽序列。
44.一种获自如权利要求1-43中任一项所述的生物系统的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官。
45.如权利要求44所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞是干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞或分化的干细胞。
46.如权利要求45所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述干细胞是造血干细胞。
47.如权利要求44所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人组织是神经、软骨或皮肤。
48.如权利要求44所述的遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人细胞、组织或器官，其中所述遗传重新编程的具有生物活性和代谢活性的非人器官是实体器官。
49.一种制备遗传重新编程的猪的方法，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组缺乏选自α-Gal、Neu5Gc和SDa的表面聚糖表位的功能性表达并且被遗传重新编程以表达人捕获参考序列的人源化表型，所述方法包括：
f.获得猪胎儿成纤维细胞、猪受精卵、猪诱导多能干细胞(IPSC)或猪生殖系细胞；
g.对a)中的所述细胞进行遗传改变以缺乏功能性α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶；
h.使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas对以下的外显子区域中的核苷酸进行定点诱变取代来对b)中的所述细胞进行遗传重新编程：i)所述野生型猪的SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-A、HLA-B和HLA-C的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及ii)所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代；以及iii)所述野生型猪的SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域中的核苷酸分别被来自所述人捕获参考序列的HLA-DR和HLA-DQ的直系同源外显子区域的核苷酸定点诱变取代，
其中所述野生型猪的基因组的内含子区域没有被重新编程，并且
其中所述重新编程的基因组包含A-C中的至少一个：
A)其中所述重新编程的猪核基因组包含用来自所述人捕获参考序列的已知人β2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪β2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代；
B)其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列；
C)其中所述重新编程的猪核基因组已经被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏所述野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达，其中所述重新编程的猪核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人接受者的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，
其中所述重新编程不引入任何移码或框架破坏，
i.从c)中遗传重新编程的细胞产生胚胎；和
j.将胚胎移植到代孕猪中并且使移植的胚胎在所述代孕猪中生长。
50.如权利要求49所述的方法，其中步骤(a)还包括将野生型猪的主要组织相容性复合物的多个外显子区域中的多个核苷酸替换成来自所述人捕获参考序列的主要组织相容性复合物序列的直系同源外显子区域的核苷酸，其中所述替换不引入任何移码或框架破坏。
51.如权利要求49-50中任一项所述的方法，其中所述替换包括用来自所述已知人主要组织相容性复合物序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸进行定点诱变取代。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
53.如权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述直系同源外显子区域位于所述野生型猪的主要组织相容性复合物的一种或多种多态性糖蛋白处。
54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，其还包括：
A)用所述胚胎使所述代孕猪受孕，孕育所述胚胎，并且通过剖腹产术从所述代孕猪中分娩出仔猪，
B)确认所述仔猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过测定抗体滴度确定的钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、亮毛杜鹃和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌；并且
C)根据减少生物负荷的程序来维持所述仔猪，所述程序包括将所述仔猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述仔猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
55.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处以及在编码SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ、CTLA-4、PD-L1、EPCR、TBM、TFPI和β2微球蛋白的外显子区域处使用所述人捕获参考序列的重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-DR、SLA-1和SLA-2的功能性表达。
56.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述野生型猪基因组在CTLA-4启动子和PD-L1启动子中的一个或多个处包含重新编程的核苷酸，其中与所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1的内源性表达相比，所述CTLA-4启动子和所述PD-L1启动子中的所述一个或多个被重新编程以增加重新编程的CTLA-4和重新编程的PD-L1中的一者或两者的表达。
57.如权利要求49-56中任一项所述的方法，其中所述合成核苷酸的总数等于所替换核苷酸的总数，使得在用所述合成核苷酸重新编程所述野生型猪的基因组之后的核苷酸数量没有净损失或净增加。
58.如权利要求49-57中任一项所述的方法，其中用所述多个合成核苷酸的重新编程不包括编码在所述野生型猪MHC序列与所述人捕获参考序列之间保守的氨基酸的密码子区域中的核苷酸的替换。
59.如权利要求49-58中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的直系同源核苷酸对所述野生型猪的所述主要组织相容性复合物处的核苷酸的定点诱变取代。
60.如权利要求49-59中任一项所述的方法，其中在用于生产所述非人动物的种系细胞中进行定点诱变取代。
61.如权利要求49-60中任一项所述的方法，其中所述人捕获参考序列是人患者捕获序列、人群体特异性人捕获序列或等位基因组特异性人捕获序列。
62.如权利要求49-61中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-A捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-1外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
63.如权利要求49-62中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-B捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
64.如权利要求49-63中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-C捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-3的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
65.如权利要求49-64中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-E捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-6的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
66.如权利要求49-65中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-F捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-7的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
67.如权利要求49-66中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自HLA-G捕获参考序列的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-8的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
68.如权利要求49-67中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含野生型猪的MHC I类链相关基因2(MIC-2)的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
69.如权利要求49-68中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-1、SLA-2、SLA-DR或其组合的功能性表达。
70.如权利要求49-69中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQA1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQA的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
71.如权利要求49-70中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含来自HLA-DQB1捕获参考序列的直系同源外显子区域对所述野生型猪的SLA-DQB的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
72.如权利要求49-71中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DRA1和HLA-DRB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DRA和SLA-DRB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
73.如权利要求49-72中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自所述人捕获参考序列的HLA-DQA1和HLA-DQB1的直系同源外显子区域的核苷酸对所述野生型猪的SLA-DQA和SLA-DQB1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
74.如权利要求49-73中任一项所述的方法，其中核苷酸的所述定点诱变取代位于在所述野生型猪的核基因组与所述已知人序列之间不保守的密码子处。
75.如权利要求49-74中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人B2微球蛋白的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型猪的B2微球蛋白的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
76.如权利要求49-75中任一项所述的方法，其中所述重新编程的猪核基因组包含编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽是与由所述人捕获参考基因组表达的β2微球蛋白糖蛋白的氨基酸序列具有至少95％同一性的人源化β2微球蛋白(hB2M)多肽序列。
77.如权利要求49-76中任一项所述的方法，其中所述核基因组已被重新编程，使得所述遗传重新编程的猪缺乏所述野生型猪的内源性β2微球蛋白多肽的功能性表达。
78.如权利要求49-77中任一项所述的方法，其中所述核基因组已被重新编程，使得在所述猪的内源性β2微球蛋白基因座处，所述核基因组已被重新编程以包含编码所述人捕获参考序列的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。
79.如权利要求49-78中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
80.如权利要求49-79中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-DQ和MIC-2的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
81.如权利要求49-80中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-DQ和MIC-2处的核苷酸的定点诱变取代。
82.如权利要求49-81任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组缺乏SLA-DR、SLA-1和/或SLA-2的功能性表达。
83.如权利要求49-82中任一项所述的方法，其中所述核基因组使用外显子区域的无痕交换被重新编程，其中不存在移码、插入突变、缺失突变、错义突变和无义突变。
84.如权利要求49-83中任一项所述的方法，其中所述核基因组被重新编程而不引入任何净插入、缺失、截短或其他将通过移码、无义突变、或错义突变而导致蛋白质表达的破坏的遗传改变。
85.如权利要求49-84中任一项所述的方法，其中所述核基因组的内含子区域中的核苷酸没有被改变。
86.如权利要求49-85中任一项所述的方法，其中所述核基因组被重新编程以在重新编程的外显子区域为纯合的。
87.如权利要求49-86中任一项所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得多肽的细胞外的表型表面表达在人接受者中是致耐受的。
88.如权利要求49-87中任一项所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达通过重新编程CTLA-4启动子序列而被增加。
89.如权利要求49-88中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自人捕获参考序列CTLA-4的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型CTLA-4的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
90.如权利要求49-89中任一项所述的方法，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的CTLA-4具有至少95％同一性的人源化CTLA-4多肽序列。
91.如权利要求49-90中任一项所述的方法，其中所述核基因组被重新编程使得程序性死亡配体1(PD-L1)的表达通过重新编程PD-L1启动子序列而被增加。
92.如权利要求49-91中任一项所述的方法，其中所述重新编程的基因组包含用来自已知人PD-L1的直系同源外显子的核苷酸对所述野生型PD-L1的外显子区域处的核苷酸的定点诱变取代。
93.如权利要求49-92中任一项所述的方法，其中所述重新编程的核基因组包含编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质是与由所述人捕获参考基因组表达的PD-L1具有至少95％同一性的人源化PD-L1多肽序列。
94.一种诱导在接受者人中对异种移植的细胞、组织或器官的至少部分免疫耐受的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
95.一种减少对异种移植物的自然杀伤细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
96.一种减少对异种移植物的细胞毒性T细胞淋巴细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
97.一种预防或减少在接受者人体内对异种移植的细胞、组织或器官的凝血和/或血栓性缺血的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的内皮蛋白C受体(EPCR)、血栓调节蛋白(TBM)和组织因子途径抑制剂(TFPI)中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
98.一种减少对异种移植物的MHC Ia类介导的排斥的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-3和所述野生型猪的MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白、SLA-1和SLA-2的功能性表达；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
99.一种减少对异种移植物的MHC Ib类介导的排斥的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-6、SLA-7和SLA-8以及所述野生型猪的MHC Ia类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
100.一种减少对异种移植物的MHC II类介导的排斥的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种以及所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
101.一种抑制对异种移植物的凋亡细胞介导的排斥的方法，所述方法包括：
a.产生或获得从如权利要求1-48中任一项所述的生物系统中获得的非人细胞、组织或器官，其中所述野生型猪基因组包含在SLA-MIC-2基因处和在编码所述野生型猪的MHC Ia类、MHC Ib类、MHC II类和β2微球蛋白中的一种或多种的外显子区域处使用所述人捕获参考序列重新编程的核苷酸，并且其中所述人细胞、组织或器官缺乏猪β2微球蛋白的功能性表达，并且其中所述野生型猪基因组包含在编码所述野生型猪的CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的外显子区域处的重新编程的核苷酸；并且
b.将所述非人细胞、组织或器官植入所述接受者人体内。
102.一种生产用于异种移植的供体猪组织或器官的方法，其中所述供体猪组织或器官的细胞被遗传重新编程成特征在于接受者特异性表面表型，所述方法包括：
a.从预期的人移植接受者获得含有DNA的生物样品；
b.对生物样品进行全基因组测序以获得人捕获参考序列；
c.在基因座(i)-(v)处比较所述人捕获参考序列与所述供体猪的野生型基因组：
(i)编码SLA-1、SLA-2和SLA-3中的至少一种的外显子区域；
(ii)编码SLA-6、SLA-7和SLA-8中的至少一种的外显子区域；
(iii)编码SLA-DR和SLA-DQ中的至少一种的外显子区域；
(iv)一个或多个编码β2微球蛋白(B2M)的外显子；
(v)SLA-MIC-2基因的外显子区域、以及编码PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI中的至少一种的基因，
d.为所述基因座(i)-(v)中的一个或多个创建长度为10至350个碱基对的合成供体猪核苷酸序列，其中所述合成供体猪核苷酸序列在分别与猪基因座(i)-(vi)对应的直系同源基因座(vi)-(x)处与所述人捕获参考序列具有至少95％同一性：
(vi)编码HLA-A、HLA-B和HLA-C中的至少一种的外显子区域；
(vii)编码HLA-E、HLA-F和HLA-G中的至少一种的外显子区域；
(viii)编码HLA-DR和HLA-DQ中的至少一种的外显子区域；
(ix)一个或多个编码人β2微球蛋白(hB2M)的外显子；
(x)编码来自人捕获参考序列的MIC-A、MIC-B、PD-L1、CTLA-4、EPCR、TBM和TFPI中的至少一种的外显子区域，
e.将(i)-(v)中的核苷酸序列替换成所述合成供体猪核苷酸序列；并且
f.从具有所述合成供体猪核苷酸序列的遗传重新编程的猪获得用于异种移植的猪组织或器官。
103.如权利要求102所述的方法，其还包括确认具有所述合成供体猪核苷酸序列的遗传重新编程的猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过测定抗体滴度确定的钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、亮毛杜鹃和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌。
104.如权利要求102-103中任一项所述的方法，所述方法还包括根据减少生物负荷的程序维持所述遗传重新编程的猪，所述程序包括将所述遗传重新编程的猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述遗传重新编程的猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触。
105.如权利要求102-104中任一项所述的方法，其还包括从所述猪中收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪实施安乐死并从所述猪中无菌地去除所述生物制品。
106.如权利要求102-105中任一项所述的方法，其还包括在收获后使用不会如通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定所确定的将细胞生存能力降低至小于50％细胞生存能力的灭菌过程对所述生物制品进行处理，包括灭菌。
107.如权利要求102-106中任一项所述的方法，其还包括在保存细胞生存能力的存储条件下将所述生物制品储存在无菌容器中。
108.一种筛选在所述遗传重新编程的猪中的脱靶编辑或基因组改变的方法，所述遗传重新编程的猪包含如权利要求1-49中任一项所述的核基因组，所述方法包括：
e.在对供体猪核基因组进行遗传重新编程之前，对含有来自所述供体猪的DNA的生物样品进行全基因组测序，从而获得第一全基因组序列；
f.在对所述供体猪核基因组重新编程之后，进行全基因组测序以获得第二全基因组序列；
g.比对所述第一全基因组序列和所述第二全基因组序列以获得序列比对；
h.分析所述序列比对以鉴定在脱靶位点处与所述猪的基因组的任何错配。
109.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC Ia类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪SLA-3的外显子区域用编码在所述SLA-3与来自人捕获参考序列的HLA-C之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的HLA-C的密码子进行重新编程。
110.如权利要求109所述的合成核苷酸序列，其中所述野生型猪的SLA-1和SLA-2各自包含终止密码子。
111.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC Ib类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的SLA-6、SLA-7和SLA-8的外显子区域分别用编码在所述SLA-6、SLA-7和SLA-8分别与来自人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的HLA-E、HLA-F和HLA-G的密码子进行重新编程。
112.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有如权利要求109和111两者或如权利要求110和111两者所述的合成核苷酸序列。
113.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MHC II类的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪SLA-DQ的外显子区域用编码在所述SLA-DQ分别与来自人捕获参考序列的HLA-DQ之间不保守的氨基酸的分别来自所述人捕获参考序列的HLA-DQ的密码子进行重新编程，并且其中所述野生型猪的SLA-DR包含终止密码子。
114.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有如以下各项所述的合成核苷酸序列：权利要求109和113两者；权利要求110和113两者；或权利要求112和113两者。
115.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪β2微球蛋白的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪的β2微球蛋白的外显子区域用编码在所述野生型猪的β2微球蛋白与来自人捕获参考序列的β2微球蛋白之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的β2微球蛋白的密码子进行重新编程，其中所述合成核苷酸序列包含在外显子区域中的至少一个终止密码子使得所述合成核苷酸序列缺乏所述野生型猪的β2微球蛋白多肽的功能性表达。
116.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪MIC-2的野生型猪内含子区域并且在所述野生型猪MIC-2的外显子区域用编码在所述MIC-2与来自人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的MIC-A或MIC-B的密码子进行重新编程。
117.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪CTLA-4的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪CTLA-4的外显子区域用编码在所述野生型猪的CTLA-4与来自人捕获参考序列的CTLA-4之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的CTLA-4的密码子进行重新编程。
118.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪PD-L1的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪PD-L1的外显子区域用编码在所述野生型猪的PD-L1与来自人捕获参考序列的PD-L1之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的PD-L1的密码子进行重新编程。
119.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪EPCR的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪EPCR的外显子区域用编码在所述野生型猪的EPCR与来自人捕获参考序列的EPCR之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的EPCR的密码子进行重新编程。
120.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪TBM的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪TBM的外显子区域用编码在所述野生型猪的TBM与来自人捕获参考序列的TBM之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的TBM的密码子进行重新编程。
121.一种合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列具有来自野生型猪TFPI的野生型猪内含子区域并且在编码所述野生型猪TFPI的外显子区域用编码在所述野生型猪的TFPI与来自人捕获参考序列的TFPI之间不保守的氨基酸的来自所述人捕获参考序列的TFPI的密码子进行重新编程。
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