JP2023538663A - 付帯ゲノム破壊を最小限に抑えたサイレンシング、ヒト化、及び個別化のための、移植のための免疫学的に適合性のある細胞、組織、臓器、及び方法 - Google Patents

付帯ゲノム破壊を最小限に抑えたサイレンシング、ヒト化、及び個別化のための、移植のための免疫学的に適合性のある細胞、組織、臓器、及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023538663A
JP2023538663A JP2023513097A JP2023513097A JP2023538663A JP 2023538663 A JP2023538663 A JP 2023538663A JP 2023513097 A JP2023513097 A JP 2023513097A JP 2023513097 A JP2023513097 A JP 2023513097A JP 2023538663 A JP2023538663 A JP 2023538663A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sla
human
reprogrammed
pig
wild
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023513097A
Other languages
English (en)
Inventor
ポール ダブリュ． ホルツァー
ジョン アドキンス
ロドニー エル． モンロイ
エリザベス ジェイ． チャン
ケイトリン ロジャース
Original Assignee
ゼノセラピューティクス インコーポレイテッド
アレクシス バイオ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ゼノセラピューティクス インコーポレイテッド, アレクシス バイオ インコーポレイテッド filed Critical ゼノセラピューティクス インコーポレイテッド
Publication of JP2023538663A publication Critical patent/JP2023538663A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8778—Swine embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

移植のための個別化された、ヒト化された、移植可能な細胞、組織、及び臓器のリポジトリを生成及び保存するための生物学的システムであり、生物学的システムは、生物学的及び代謝的に活性（生存）であり、生物学的システムは、ヒトレシピエントへの移植のために非ヒト動物ドナーにおいて遺伝的に再プログラムされたタンパク質、細胞、組織、及び／または臓器を含み、非ヒト動物ドナーは、遺伝的に再プログラムされたブタドナーから単離された細胞、組織、及び／または臓器の異種移植のための遺伝的に再プログラムされたブタドナーである。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２４日に出願されたＵ．Ｓ．６３／０６９，５６９の優先権利益を主張する。
２０１４年から２０１９年までの過去５年間で、平均して約６，４００人の候補者が、待機リストに登録されている間に、臓器移植を受けずに死亡した。ほぼ同数の患者は、必要な手術のための移植を受けるには病気が重すぎたため、待望の移植を受けることができなかった。利用可能なドナーとレシピエントのアンメットニーズとの間の相違比率はわずかには改善されてきてはいるものの、この不均衡は今日まで続いており、依然として相当なものであり、供給の不十分さは依然として散々なものである。もちろん、臓器移植を必要としている患者は、ある種から別の種への臓器移植（同種移植）を表すヒトドナーからの臓器を待っている。
同種移植は、安全性、物流、倫理的、法的、制度的、及び文化的な複雑な問題を含む、多くの重大な多面的な問題を提示している。安全性の観点から、ヒトドナーから得られる同種組織は、重大な感染性疾患リスクをはらんでいる。例えば、移植分野の一部の研究者は、「［ヒト］サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、臓器移植のレシピエントに影響を及ぼす単一で最も重要な感染性因子であり、これらの患者の少なくとも３分の２は、移植後にＣＭＶ感染を有する」と報告している。Ｄｅｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｏｆ ｐｉｇ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１８，１５（１）：１７１、Ｒｕｂｉｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９０，１２ Ｓｕｐｐｌ ７：Ｓ７５４－７６６。
組織移植に関する規制には、ドナースクリーニング及び外来性病因物質の検査のための基準、ならびに組織移植物の加工及び分配を規定する厳密な規制が含まれる。同種移植中にウイルスの伝染が生じている。臓器移植及び細胞移植の間には、外因性のレトロウイルス（ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））の伝染がヒト組織によって生じており、こうしたヒト組織は、ウイルス（ヒトサイトメガロウイルスなど）、さらには狂犬病まで有するものもある。臓器の生存度及び死後スクリーニングを巡っては技術的及び時間的な制約が存在するため、完璧に検査を行うことが困難であり、このリスクを排除することはできない。
レシピエントとドナーとの間に免疫学的な相違があることが、一連の合併症及び追加リスクをレシピエント自身にもたらす免疫抑制レジメンを用いることなく移植片生着期間を延ばすことの妨げとなっている。患者が（非自己）ドナー（生存または死亡）から臓器を受け入れる場合、レシピエントの免疫系は、そうした移植物を外来物として認識することになる。この認識が生じると、免疫系の自然プロセスを抑制する薬物療法が同時に利用されない限り、レシピエントの免疫系が動員され、そうした臓器が「拒絶」されることになる。同種皮膚移植片への応答は、先天性免疫系及び適応性免疫系の両方の関与を伴う強力な免疫応答である。Ａｂｂａｓ ＡＫ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ ＡＨＨ，Ｐｉｌｌａｉ Ｓ（２０１７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。
免疫抑制剤の使用に関して、免疫抑制剤は、急性及び慢性拒絶スキーマにおける移植された移植片の生存を延長する。しかしながら、これらは、最も日常的な病原体からの感染に対してさえ患者を脆弱なものとし、生涯にわたって継続的な使用を必要とするが、患者は、感染のリスク、さらにはがんへのリスクが増大することになる。免疫抑制剤は、自然の免疫学的プロセスを鈍化させる可能性がある。残念ながら、これらの薬物は、多くの場合、臓器移植後の生涯の要件であり、それ以外の日常的な病原体に対するレシピエントの感受性を増加させる。こうした薬物は、外来臓器の存在を移植レシピエントが寛容することを可能にする一方で、免疫系が損なわれることと関連して感染性の疾患及び症状のリスクを上昇させるものでもあり、これに伴って、「ヒト同種移植片によって多岐にわたる生物の伝染が生じる可能性がある」。Ｆｉｓｈｍａｎ，ＪＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｏｎｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１２，５５（５）：７２０－７２７。
こうした難点はあるものの、ほとんどの末期臓器不全患者にとって臓器移植は紛れもなく好ましい治療であり、この理由の大半は、実行可能な代替法が存在しないことによるものである。一方で、奏功する救命治療介入として臓器移植が出現したものの、この治療介入は、移植に利用可能な臓器の不足と隣り合わせであり、こうして臓器移植が出現したことによって、不幸なことに、誰を生かして誰を死なせるかを決定しなくてはならないというイデオロギー的に頭の痛い立場に医療専門家は立たされている。究極的には、同種移植材料の重大な欠点を最少化すると同時に、そうした同種移植材料をそのように有効なものにする作用機構と同じ作用機構を与えると想定される代替の補助治療選択肢があれば、世界の患者にとって計り知れないほど有益なものとなろう。
より永続的な臓器または他の組織が見つかり、利用される一方で、一般に、応急的な治療に対するものを含めて、臓器及び他の移植組織に対する差し迫ったニーズが存在することがきっかけとなり、応急的異種移植及び／または永続的異種移植のための他の動物を含めて、非ヒト起源の臓器、細胞、及び組織の利用を検討するに至っている。
非ヒト動物ドナーの臓器をヒトレシピエントに移植するなどの異種移植は、移植に利用できる臓器の不足を減らす可能性があり、世界中の何千人もの人々を助ける可能性がある。ブタドナーは、そのサイズ及び生理機能がヒトと適合すると考えられることから、ヒトへの異種移植において使用するための臓器、組織、及び／または細胞の潜在的な非ヒト供給源であるとみなされてきた。しかしながら、ヒトまたは他の霊長類への標準的な非修飾ブタ組織を使用した異種移植は、移植された組織の拒絶を伴う。
野生型ブタドナーの臓器は、ヒトへの移植に際し、ヒト免疫系による拒絶を引き起こし、そこでは、自然ヒト抗体がブタドナー細胞上のエピトープを標的とすることで、移植された臓器、細胞、または組織の拒絶を引き起こし、不全に至らしめる。こうした拒絶反応は、細胞性（リンパ球媒介性）拒絶反応または液性（抗体媒介性）拒絶反応であり得、こうした拒絶反応には、限定されないが、超急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応（生存期間を限定する血小板減少凝固障害を伴い得る）、及び急性液性異種移植拒絶反応（ＡＨＸＲ）が含まれる。ブタドナーからヒトへの異種移植に関する他の障害には、疾患または寄生虫の種間伝播のリスクが含まれる。
他の多くの試みは、他者によって、異種移植製品の供給源としての役割を果たすようにブタドナーを修飾するために行われてきたが、そのような試みは、現在のところ奏功したブタドナーモデルをもたらさなかった。そのような商業的、学術的及び他のグループは、介入、遺伝子改変、キメラ作用を通じて免疫寛容性を誘導する努力、導入遺伝子の包含、レシピエントの自然免疫学的応答（複数可）を低減することを目的とした外因性免疫抑制薬の同時使用、及び他のアプローチに焦点を当ててきた。これらのグループは、すべてのレシピエントのために１つの標準化された供給源動物を作成することを目指して、「すべてのサイズに適合する」供給源動物を作成しようと探求してきた。
具体的には、ある特定のグループは、ＰＥＲＶを含まないトランスジェニックブタドナーを作成し、トランスジェニック骨髄を治療に利用することに焦点を当て（例えば、ｅＧｅｎｅｓｉｓ、Ｉｎｃ．ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８５３９を参照されたい）；幹細胞足場を利用してトランスジェニックブタドナーを作成することに焦点を当て（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ［ＵＳ２０１９０１１１１８０Ａ１］を参照されたい）；キメラ作用を組み合わせて、治療にトランスジェニック骨髄を利用して、患者Ｔ細胞を寛容にすることに焦点を当てている（例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ［ＵＳ２０１８００７０５６４Ａ１を参照されたい）。ヒト免疫系による認識後の不適合性問題に対処することを意図したこれらの「下流」アプローチは、異種移植での長期使用に好適な産物を産生するか、または上記のトランスジェニック及び他の改変で生存するブタドナーを産生することに成功していない。
上記のアプローチとは対照的に、本発明は、第一着手として、ヒト免疫系からの検出を逃れるようにブタドナー細胞のゲノムを修飾することにより、患者のＴ細胞及び抗体が外来物質を破壊するためにプライミングされたときに続く免疫カスケードを回避することにより、「患者特有の」（または臨床的に関連する場合、「集団特有の」）解決策を達成する。この「上流」アプローチは、一態様では、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせを通じて達成され、その設計は、付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、ゲノム組織破壊を回避し、かつそれらは動物の免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときにドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する。それ故に、本発明は、異種移植の科学を臨床的な現実に変換することに対して長年存在するアンメットニーズに対処する。
この「上流」アプローチは、一態様では、正確な部位特異的変異原性遺伝子置換または修飾の特定の組み合わせを通じて達成され、その設計は、付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、ゲノム組織破壊を回避し、かつそれらは動物の免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときにドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する。それ故に、本発明は、異種移植の科学を臨床的な現実に変換することに対して長年存在するアンメットニーズに対処する。
一態様では、本開示は、遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーから、遺伝的に操作された非ヒト動物ドナー、細胞、産物、ベクター、キット、抗体、タンパク質、ワクチン、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ニューロン細胞、及び／または遺伝物質を産生するための生物学的システムを作成する方法を含む。本開示は、移植のための個別化された、ヒト化された、移植可能な細胞、組織、及び臓器のリポジトリを生成及び保存することを含む。
第１の態様では、本開示は、野生型非ヒト動物ドナーにおける特定のタンパク質、エピトープ、または分子のサイレンシング、ノックアウト、不活性化、または最小限の発現を引き起こして、ヒトに移植されたときに免疫寛容性である生物学的製品を産生する遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーを作成することを含む。第２の態様では、本開示は、野生型非ヒト動物ドナーにおける特定のタンパク質、エピトープ、または分子をコードする遺伝子をヒト化して、ヒトに移植されたときに免疫寛容性である生物学的製品を産生する遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーを作成することを含む。第３の態様では、本開示は、野生型非ヒト動物ドナーにおける特定のタンパク質、エピトープ、または分子をコードする遺伝子を個別化して、ヒトに移植されたときに免疫寛容性である生物学的製品を産生する遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーを作成することを含む。ある特定の態様では、第１、第２、及び第３の態様が組み合わされて、ヒトに移植されたときに免疫寛容性である生物学的製品を産生する遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーを作成する。いくつかの態様では、記載される態様のうちの１つ、２つ、または３つすべては、非ヒト動物ドナーのゲノムの最小限の付帯ゲノム破壊を伴う。いくつかの態様では、最小限の付帯ゲノム破壊は、野生型非ヒト動物ドナーのゲノムの遺伝子内のヌクレオチド配列の特定の長さ（本明細書では「フレーム」または「カセット」と称される）を置き換える方法を伴う。いくつかの態様では、フレームまたはカセットを置き換えることは、標準化された長さのヌクレオチド配列の使用を伴う。
第１の態様の一態様では、非ヒト動物ドナーのゲノムは、ガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及びＳｉａ－アルファ２，３－［ＧａｌＮＡｃ－ベータ１，４］Ｇａｌ－ベータ１，４－ＧｌｃＮＡｃ Ｓｄａから選択される１つ以上の表面糖鎖エピトープを提示しないように遺伝的に操作される。第１の態様の別の態様では、ＳＬＡ－１及びＳＬＡ－２をコードするＭＨＣクラスＩ配列は、野生型非ヒト動物ドナーのゲノム内でサイレンシング、ノックアウト、または不活性化される。第１の態様の別の態様では、ＳＬＡ－ＤＲをコードするＭＨＣクラスＩＩ配列は、野生型非ヒト動物ドナーのゲノム内でサイレンシング、ノックアウト、または不活性化される。第１の態様の別の態様では、ＳＬＡ－ＤＲβ１をコードするＭＨＣクラスＩＩ配列は、野生型非ヒト動物ドナーのゲノム内でサイレンシング、ノックアウト、または不活性化される。第１の態様の別の態様では、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の２つのコピーのうちの１つは、野生型非ヒト動物ドナーのゲノム内でサイレンシング、ノックアウト、または不活性化される。いくつかの態様では、終止コドンは、野生型非ヒト動物ドナーのゲノムに挿入される。
第２の態様の一態様では、非ヒト動物ドナーのゲノムは、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＭＩＣ領域、及び第１の態様に従ってサイレンシングされていない非ヒト動物ドナーの内因性Ｂ２Ｍの他のコピーのうちの１つ以上をヒト化するように遺伝的に操作される。
第３の態様の一態様では、非ヒト動物ドナーのゲノムは、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＳＬＡ－ＤＱ－Ｂ領域のうちの１つ以上を個別化するように遺伝的に操作される。
本明細書に記載の態様のいずれかまたはすべてにおいて、アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をコードする遺伝子は、遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、その遺伝子によってコードされる表面糖鎖エピトープの機能的発現を欠くように破壊される。
他の態様では、本開示は、ガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及びＳｄａから選択される表面糖鎖エピトープの機能的発現を欠き、かつヒト捕捉参照配列のヒト化表現型を発現するように遺伝的に再プログラムされ、ヒトレシピエントのゲノムの表現型を個別化される核ゲノムを含む、遺伝的に再プログラムされたブタドナーを調製する方法であって、方法は、
ａ．ブタ胎児線維芽細胞、ブタ接合体、ブタ間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはブタ生殖細胞を得ることと、
ｂ．ａ）中の当該細胞を、機能的アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を欠くように遺伝的に改変することと、
ｃ．ｉ）ヒトレシピエントのゲノムのＨＬＡ－Ｃのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－３、ならびにｉｉ）ヒトレシピエントのゲノムのそれぞれＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８、ならびにｉｉｉ）ヒトレシピエントのゲノムのＨＬＡ－ＤＱのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱの、領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換のために、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲまたは任意のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術）を用いて、ｂ）中の当該細胞を遺伝的に再プログラムすることであって、
野生型ブタドナーのゲノムの内因性エクソン及び／またはイントロン領域が、再プログラムされておらず、
再プログラムされたゲノムが、以下のＡ～Ｄ：
Ａ）再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトβ２－のオルソロガスなエクソンからのヌクレオチドでの、野生型ブタドナーの２つのβ２－のうちの第１の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むこと；
Ｂ）再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とオルソロガスであるヒト化ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチド配列であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むこと；
Ｃ）再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、野生型ブタドナーの２つの内因性β２－ポリペプチドの第２の機能的発現を欠くように再プログラムされていること；
Ｄ）再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２のオルソロガスなエクソンからのヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むこと；を含み、
当該再プログラムが、いかなるフレームシフトまたはフレーム破壊も導入しない、遺伝的に再プログラムすることと、
ｄ．ｃ）中の遺伝的に再プログラムされた細胞から胚を生成することと、
ｅ．胚を代用ブタに移植し、移植された胚を代用ブタ内で成長させることと、を含む。
別の態様では、本開示は、異種移植のためのブタドナー組織または臓器を産生する方法を含み、当該ブタドナー組織または臓器の細胞は、レシピエント固有の表面表現型によって特徴付けられるように遺伝的に再プログラムされ、方法は、
ａ．有望なヒト移植レシピエントからＤＮＡを含有する生体試料を得ることと、
ｂ．生体試料の全ゲノム配列決定を行って、ヒト捕捉参照配列を得ることと、
ｃ．ヒト捕捉参照配列を、遺伝子座（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）ＳＬＡ－３をコードするエクソン領域、
（ｉｉ）ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８をコードするエクソン領域、（ｉｉｉ）ＳＬＡ－ＤＱをコードするエクソン領域、
（ｉｖ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする１つ以上のエクソン、
（ｖ）ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、及びＴＦＰＩのエクソン領域でブタドナーの野生型ゲノムと比較することと、
ｄ．当該遺伝子座（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上について、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０～２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、もしくは３５０、または３～３５０塩基対の長さの範囲内の任意の範囲もしくは整数のヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された、合成ヌクレオチド配列を作成することであって、当該合成ヌクレオチド配列が、ブタドナー遺伝子座（ｉ）～（ｖｉ）にそれぞれ対応する、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩの多型かつ高度に免疫原性の遺伝子領域のオルソロガスな遺伝子座（ｖｉ）～（ｘ）でヒト捕捉参照配列とオルソロガスである、作成することと、
ｅ．（ｉ）～（ｖ）のヌクレオチド配列を、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された、当該合成ヌクレオチド配列で置き換えることと、
ｆ．ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された、当該合成ヌクレオチド配列を有する遺伝的に再プログラムされたブタドナーから、異種移植のためのブタドナー組織または臓器を得ることと、を含む。
別の態様では、本開示は、本開示の核ゲノムを含む遺伝的に再プログラムされたブタドナーにおけるオフターゲット編集またはゲノム改変についてスクリーニングする方法であって、
ａ．ブタドナー核ゲノムの遺伝的な再プログラムを行う前に、ブタドナーからのＤＮＡを含有する生体試料について全ゲノム配列決定を行い、それによって、第１の全ゲノム配列を取得することと、
ｂ．ブタドナー核ゲノムの再プログラム後に、全ゲノム配列決定を行って、第２の全ゲノム配列を取得することと、
ｃ．第１の全ゲノム配列及び第２の全ゲノム配列を整列させて、配列アラインメントを取得することと、
ｄ．配列アラインメントを分析して、オフターゲット部位におけるブタドナーのゲノムに対する任意のミスマッチを識別することと、を含む、方法を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＨＣクラスＩａ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつＳＬＡ－３とヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｃとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｃのコドンを用いて野生型ブタドナーのＳＬＡ－３をコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、野生型ブタドナーのＳＬＡ－１及びＳＬＡ－２はそれぞれ、ｓｅ対を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＨＣクラスＩｂ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつそれぞれＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８とヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のそれぞれＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇのコドンを用いて野生型ブタドナーのＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８をコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＨＣクラスＩＩ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつそれぞれＳＬＡ－ＤＱとヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－ＤＱとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のそれぞれＨＬＡ－ＤＱのコドンを用いて野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱをコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含み、野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＲは、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらのうちの１つ、２つ、及び／または３つの連続した組み合わせを含み、いくつかの場合では、所望のサイレンシングされた（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得る。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とヒト捕捉参照配列由来のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のコドンを用いて野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含み、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された合成ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらのうちの１つ、２つ、及び／または３つの連続した組み合わせを含み、いくつかの場合では、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された合成ヌクレオチド配列が野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠くように、エクソン領域における所望のサイレンシングされた（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得る。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＩＣ－２由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつＭＩＣ－２とヒト捕捉参照配列由来のＭＩＣ－ＡまたはＭＩＣ－Ｂとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＭＩＣ－ＡまたはＭＩＣ－Ｂのコドンを用いて野生型ブタドナーのＭＩＣ－２の領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＣＴＬＡ－４由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４とヒト捕捉参照配列由来のＣＴＬＡ－４との間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＣＴＬＡ－４のコドンを用いて野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４をコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＰＤ－Ｌ１由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ野生型ブタドナーのＰＤ－Ｌ１とヒト捕捉参照配列由来のＰＤ－Ｌ１との間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＰＤ－Ｌ１のコドンを用いて野生型ブタドナーのＰＤ－Ｌ１をコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＥＰＣＲ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ野生型ブタドナーのＥＰＣＲとヒト捕捉参照配列由来のＥＰＣＲとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＥＰＣＲのコドンを用いて野生型ブタドナーのＥＰＣＲをコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＴＢＭ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ野生型ブタドナーのＴＢＭとヒト捕捉参照配列由来のＴＢＭとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＴＢＭのコドンを用いて野生型ブタドナーのＴＢＭをコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＴＦＰＩ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ野生型ブタドナーのＴＦＰＩとヒト捕捉参照配列由来のＴＦＰＩとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＴＦＰＩのコドンを用いて野生型ブタドナーのＴＦＰＩをコードする領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列を含む。
上記のアプローチとは対照的に、本発明は、第一着手として、ヒト免疫系からの検出を逃れるようにブタドナー細胞のゲノムを修飾することにより、患者のＴ細胞及び抗体が外来物質を破壊するためにプライミングされたときに続く免疫カスケードを回避することにより、「患者特有の」解決策を達成する。この「上流」アプローチは、第１の態様の一態様では、破壊（例えば、ブタドナー細胞がその細胞表面上でそのような発現しないように、アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及び／またはベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をノックアウトすることなど）、ある特定の遺伝子（例えば、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１）の発現の調節、ならびにブタドナーゲノムの特定の切片を、レシピエントヒト捕捉配列に基づいて合成操作された切片で置き換えること（例えば、例えばＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩなどのブタドナーの発現を調節するために、ある特定のＳＬＡ配列において）の異なる組み合わせを伴うブタドナーゲノムに対する最小限の修飾によって達成される。それ故に、本発明は、異種移植の科学を臨床的な現実に変換することに対して長年存在するアンメットニーズに対処する。
このよう修飾は、ドナーの細胞外抗原を選択的に変化させて、移植の受容の可能性を増加させることによって、「非自己」の認識から生じる、原因的、免疫学的相違及び関連する有害な免疫プロセスの程度を低下させる。
ある特定の態様では、本開示は、救命移植片を長く生着させるために、移植手順後に移植レシピエントが外因性の免疫抑制剤（または長期の免疫抑制レジメン）を多くかつ有害に使用する必要のない低免疫原性及び／または免疫寛容性の細胞、組織、及び臓器を創出することに重点を置いている（基礎を置いている）。このアプローチは、既存及び以前の定説的なアプローチに対抗しており、ドナーとレシピエントとの間の先天的及び不動の差異を受け入れ、それによって、レシピエントの自然に生じる免疫学的応答を低減／排除／負の方向に改変させる方法として使用される介入、遺伝子改変、及び／またはそれに伴う外因性免疫抑制薬物に焦点を当てる代わりに、基本的な科学的定説の他の点の領域の焦点を変更する（逆転しない場合）。
ある特定の他の態様では、本開示は、最小限に破壊された遺伝的に操作された非トランスジェニックブタドナーを提供する。例えば、本発明において、天然塩基対を含むブタドナーＳＬＡ上に現れる特定の異なる配列を除去し、同じ数の塩基対を含むが、レシピエントのヒト捕捉配列に基づいて再プログラムされた合成配列で置き換える。さらに、本発明において、レシピエントのヒト捕捉配列で再プログラムする標的となり得る天然塩基対を含むドナーブタドナーＳＬＡ上に現れるある特定の異なる配列を、アミノ酸の個々の立体及び物理化学的特性に基づいて保持する。この最小限の改変は、天然ブタドナーゲノムの他の態様を所定の位置に維持し、例えば、内因性エクソン及び／またはイントロン、ならびにブタドナーゲノム内に天然に存在する他のコドン、ならびにＳＬＡの３Ｄ立体配座及び相互作用を妨げない。
ある特定の他の態様では、本発明は、本明細書で提供されるプロセス及び方法に従って、指定された病原体環境で作成されたそのような及び他の修飾を伴うブタドナーを提供する。
ある特定の他の態様では、異種移植のためのかかるブタドナーに由来する製品は、生存可能であり、生細胞であり、移植レシピエントとの有機的結合を作製することが可能であり、移植レシピエントの血管形成及び／またはコラーゲン生成の誘導が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の他の態様では、そのような供給源動物に由来する製品は、凍結を含むがこれに限定されない、そのような製品に特徴的な生存度及び生存細胞を維持する様式で、保存される。
ある特定の他の態様では、そのような製品は、相同的使用のためのものとすることであり、こうした相同的使用は、すなわち、レシピエントの臓器、細胞、及び／または組織を、ドナーのものと同じ基本機能を果たす対応臓器、対応細胞、及び／または対応組織を用いて修復、再構築、置き換え、または補充を行うことである（例えば、ヒト皮膚用移植物としてブタドナー皮膚を使用すること、ヒト腎臓用移植物としてブタドナー腎臓を使用すること、ヒト肝臓用移植物としてブタドナー肝臓を使用すること、ヒト神経用移植物としてブタドナー神経を使用することなど）。
ある特定の他の態様では、本発明の別の目的は、そのような製品が、正常な免疫機能を抑制または妨害する免疫抑制剤または免疫抑制治療の使用を必要としてまたは必要とせずに、異種移植において利用されるようにすることである。
添付の図面は、参照によって本明細書に組み込まれ、本開示の一部をなすものであり、本発明の様々な態様の例示に役立ち、説明と併せることで、関連技術分野の当業者が本明細書に開示の態様を実現及び使用することが可能になるように本発明を説明する上でさらに役立つものである。図面では、同じ参照番号は、同一または機能的に類似の要素を指し示す。
ヒトトロホブラスト細胞及びトロホブラスト細胞の画像を示す。 Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合しているＭＨＣクラスＩ及びペプチドを模式的に示す。 細胞の表面上のＨＬＡクラスＩを模式的に示す。 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）と標的細胞との相互作用を模式的に示す。 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４＋）と標的細胞との相互作用を模式的に示す。 ＨＬＡ遺伝子の共優性発現及びヒト６番染色体上でのＨＬＡ遺伝子の位置を模式的に示す。 ヒトのＭＨＣクラスＩアイソタイプ及びＭＨＣクラスＩＩアイソタイプの血清学的抗原、タンパク質、及び対立遺伝子の数を列挙した表である。 細胞の表面上のＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩを模式的に示す。 ＭＨＣクラスＩタンパク質（Ａ）及びＭＨＣクラスＩＩタンパク質（Ｂ）の構造を示す。ペプチド結合領域（ＰＢＲ）を形成する２つの球状ドメインは原形質膜から最も離れて位置し、青色の影付きで示される。ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を含む２つのＩｇ様ドメインは、灰色の影付きで示される。 ＨＬＡゲノム遺伝子座マップを示す。 ヒトのＭＨＣクラスＩアイソタイプ及びＭＨＣクラスＩＩアイソタイプを模式的に示す。 ＨＬＡクラスＩ遺伝子の分子構成の模式図を示す。エクソンは長方形で表され、内因性エクソン及び／またはイントロンは線で表される。 ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の分子構成の模式図を示す。エクソンは長方形で表され、内因性エクソン及び／またはイントロンは線で表される。 細胞外ブタ細胞発現の「ヒト化」のための複合遺伝子改変設計を示す。 ヒト及びブタドナーの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ領域のゲノム構成の比較を示す。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩマップは、参照文献［１７］から適合され、ブタドナー白血球抗原（ＳＬＡ）クラスＩマップは、１つの完全に配列決定されたハプロタイプ（Ｈｐ－１．１、Ｈ０１）のみに基づいている［４］。すべての遺伝子がここに示されているわけではなく、スケールはおおよそであることに留意されたい。発現したＳＬＡクラスＩ遺伝子の数及び位置は、ハプロタイプ間で変動し得る。 ヒト及びブタドナーの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ領域のゲノム構成の比較を示す。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩマップは、参照文献［１７］から適合され、ブタドナー白血球抗原（ＳＬＡ）クラスＩＩマップは、１つの完全に配列決定されたハプロタイプ（Ｈ０１）のみに基づいている［４］。すべての遺伝子がここに示されているわけではなく、スケールはおおよそであることに留意されたい。発現したＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子及び偽遺伝子の数及び位置は、ハプロタイプ間で変動し得る。 ＳＬＡ複合体の物理的マップを示す。黒色のボックス：ＭＨＣ関連配列を含む遺伝子座。白色のボックス：ＭＨＣ関連配列を含まない遺伝子座。染色体の長腕から短腕の方向で、領域は、クラスＩＩ（ＩＩ）、クラスＩＩＩ（ＩＩＩ）、及びクラスＩ（Ｉ）の順序で存在する。 ＳＬＡ遺伝子の分子構成の模式図を示す。エクソンは灰色の楕円形で表され、内因性エクソン及び／またはイントロンは線で表される。遺伝子長は、Ｈｐ－１．１ゲノム配列に見られるものとほぼ同じである。 ペプチド配列の並列ゲノム解析を示す。 ＳＬＡ－ＤＱＡのα１（エクソン２）及びＳＬＡ－ＤＱＢのβ１（エクソン２）の位置及び長さを示す。 ＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢの内因性エクソン及び／またはイントロンのヌクレオチド配列を詳細に示すスプレッドシートを示す。 Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（野生イノシシ）のＳＬＡ－ＤＱベータ１ドメインを示す。 ＨＬＡ対立遺伝子の命名法を示す。各ＨＬＡ対立遺伝子名は、コロンによって仕切られた最大４組の桁に対応する特有の数を有する。対立遺伝子指定の長さは、対立遺伝子の配列及びその最も近い関連対立遺伝子の配列に依存する。すべての対立遺伝子に少なくとも４桁の名称が付けられ、この４桁は、最初の２組の桁に対応し、これより長い名称は、必要なときにのみ割り当てられる。最初のコロンの前の桁は型を表し、この型は、アロタイプが保有する血清学的抗原に対応することが多い。次の組の桁は、サブタイプの記載に使用され、ＤＮＡ配列が決定された順序で数が割り当てられる。これら２組の桁の数が異なる対立遺伝子は、コードタンパク質のアミノ酸配列を変化させる１つ以上のヌクレオチド置換に差異があるということになる。コード配列中に同義ヌクレオチド置換（サイレント置換または非コード置換とも呼ばれる）が存在することのみによって異なる対立遺伝子は、３組目の桁を使用することによって区別される。内因性エクソン及び／またはイントロン中の配列多型のみによって異なる対立遺伝子、または内因性エクソン及び／またはイントロンと隣接する５’非翻訳領域もしくは３’非翻訳領域中の配列多型のみによって異なる対立遺伝子は、４組目の桁を使用することによって区別される。 ＨＬＡ－ＤＱＡにおけるエクソンの長さを示す。 レシピエント固有のＨＬＡ－ＤＱＡと、データベースから取得したＨＬＡ－ＤＱＡとの間のヌクレオチド配列ライブラリーを示す。 ＨＬＡ対ＳＬＡ（ＤＱ－Ａ、エクソン２）の間の完全な相違を識別するヌクレオチド配列ライブラリーを示す。 ３人の患者についてのＤＱＡのヒト捕捉参照配列を示す。 ３人の患者についてのＤＱＢのヒト捕捉参照配列を示す。 ３人の患者についてのＤＲ－Ａのヒト捕捉参照配列を示す。 ３人の患者についてのＤＱＲ－Ｂ１のヒト捕捉参照配列を示す。 ３人の患者についてのヒト捕捉参照配列（ＤＱＡ）の例を示す。 ３人の患者についてのヒト捕捉参照配列（ＤＱＢ）の例を示す。 ３人の患者についてのヒト捕捉参照配列（ＤＲ－Ａ）の例を示す。 ３人の患者についてのヒト捕捉参照配列（ＤＲＢ）の例を示す。本明細書に開示されるように、ＤＲ－Ａ及び／またはＤＲＢはサイレンシングされる。 野生型ヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質と、ヒトＢ２Ｍ遺伝子及びブタドナーＢ２Ｍ遺伝子の概略分子構成を示す。 ヒトＢ２Ｍのエクソン２とブタドナーＢ２Ｍのエクソン２のアミノ酸配列の比較を示す。 ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）の表現型分析を示す。細胞を培地中で単独で培養した（対照）、または１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで７２時間活性化した、または３０μｇ／ｍＬのＫＬＨを２４時間負荷した。細胞をＳＬＡ－ＤＱについて染色し、抗マウスＡＰＣコンジュゲートポリクローナルＩｇＧ二次抗体を使用してマーカーを検出する。データは、対数スケールにおいて、カウント（ｙ軸）対蛍光強度（ｘ軸）のヒストグラムとして提示される。活性化細胞についてのＳＬＡ－ＤＱについての陽性細胞及び陰性細胞のパーセンテージをヒストグラムに示す。 ＢｒｄＵ（５－ブロモ－２’－デオキシウリジン）ＥＬＩＳＡのＳＩ値を示す。７日間のインキュベーション後、３つのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及びＰＢＭＣ（Ｂ）の、未処理及びＩＦＮ－ｙ活性化ＰＡＭ細胞（１５Ｋ）に対する増殖応答。 ＢｒｄＵ（５－ブロモ－２’－デオキシウリジン）ＥＬＩＳＡのＳＩ値を示す。７日間のインキュベーション後、３つのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及びＰＢＭＣ（Ｂ）の、未処理及びＩＦＮ－ｙ活性化ＰＡＭ細胞（１５Ｋ）に対する増殖応答。 本開示によるヒト化ブタ細胞の概略図を示す。 １×１０５の精製したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）またはヒトＰＢＭＣ（Ｂ）を、４倍ノックアウトブタ１０２６１または野生型ブタに由来する増加した数の照射（３０Ｇｙ）ブタＰＢＭＣで刺激したグラフを示す。増殖を、５日＋１６時間後に、３Ｈ－チミジン組み込みにより測定した。データは、単一の実験において１つのヒト血液ドナーからの細胞で得られた三連培養物の平均ＣＰＭ±ＳＥＭを表す。同様の応答パターンは、第２の血液ドナーからのレスポンダー細胞及び４倍ノックアウトピッグ１０２６２からの刺激用細胞を使用して観察された。４倍ノックアウトブタＰＢＭＣで刺激した後、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が減少した。（Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１９） １×１０５の精製したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）またはヒトＰＢＭＣ（Ｂ）を、４倍ノックアウトブタ１０２６１または野生型ブタに由来する増加した数の照射（３０Ｇｙ）ブタＰＢＭＣで刺激したグラフを示す。増殖を、５日＋１６時間後に、３Ｈ－チミジン組み込みにより測定した。データは、単一の実験において１つのヒト血液ドナーからの細胞で得られた三連培養物の平均ＣＰＭ±ＳＥＭを表す。同様の応答パターンは、第２の血液ドナーからのレスポンダー細胞及び４倍ノックアウトピッグ１０２６２からの刺激用細胞を使用して観察された。４倍ノックアウトブタＰＢＭＣで刺激した後、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が減少した。（Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１９） 本開示によるヒト化ブタ細胞の概略図を示す。 ＷＴ１２８－１１及びＧａｌ Ｔ－ＫＯ Ｂ－１７４ＰＢＭＣを用いて３日間別々に実行されたヒト血漿ドナーの増殖のグラフを示す。 未トランスフェクトの１３２７１細胞の溶解と比較した、２つのドナー（上部パネル：ＫＨ；下部パネル：ＭＳ）のＨＬＡ－Ｅ／Ａ２（左カラム）及びＨＬＡ－Ｅ／Ｂ７（右カラム）でトランスフェクトされた１３２７１細胞に対するＮＫ細胞傷害性を示す。結果は、特異的溶解のパーセンテージとして示され、４つの異なるＥ：Ｔ比で得られた。データは、３つの独立した実験を表す。中抜き三角形は、ＨＬＡ－Ｅトランスフェクト１３２７１細胞を表し、塗りつぶしダイヤモンドは、未トランスフェクト１３２７１細胞を表す。（Ｆｏｒｔｅ，ｅｔ ａｌ．，２００５） 血漿の各濃度（希釈）についての細胞毒性％のグラフを示し、その結果をＰｒｉｓｍにプロットする。細胞傷害性曲線に基づいて、５０％殺傷に必要な希釈（ＩＣ５０）を決定した。 血漿の各濃度（希釈）についての細胞毒性％のグラフを示し、その結果をＰｒｉｓｍにプロットする。細胞傷害性曲線に基づいて、５０％殺傷に必要な希釈（ＩＣ５０）を決定した。 本発明による供給源動物施設、ならびに対応する指定の病原体を含まない施設、動物、及び群を示す。 本発明による体外式の肝臓フィルター及び回路を示す。 本発明による組み合わせ皮膚製品を示す。 Ａは、ＰＯＤ－１５時点のＨ＆Ｅを示す。表面及び濾胞上皮に壊死を伴うものの組織が生存能を有することが高倍率Ｈ＆Ｅ画像によって示される。Ｂは、ＰＯＤ－２２時点のＨ＆Ｅを示す。高倍率画像によって、残存自家移植片（アスタリスク）が良好な全生存能を有することが示される。表面被覆組織に壊死は認められず、表面には幾分かの壊死が認められ、自家移植片への浸潤を伴う広範な線維化も併せて認められた（矢印）。 非ヒト霊長類レシピエントにおける全層欠損創傷の処置において応急的創傷閉鎖物として使用したブタ分層皮膚移植片の長手方向の進行を示す。左：ＰＯＤ－０、創傷部位２の同じ異種移植片。右：右：ＰＯＤ－３０時点での創傷部位２の同じ異種移植製品。 以下についてＰＯＤ－３０組織像を示す：上部中央：Ｈ＆Ｅ、創傷部位の低電力画像は、完全な上皮被覆を示す。点線は、残存異種移植製品を囲むものである。 Ａは、試験過程での４匹すべての対象（２００１、２００２、２１０１、２１０２）の血清中総ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。Ｂは、試験過程での４匹すべての対象（２００１、２００２、２１０１、２１０２）の血清中総ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 ＰＯＤ－０、ＰＯＤ－７、ＰＯＤ－１４、ＰＯＤ－２１、及びＰＯＤ－３０の時点でＬｕｍｉｎｅｘ２３－ｐｌｅｘによって測定した可溶性ＣＤ４０Ｌの全身濃度を示すグラフである。 ＰＯＤ－０、ＰＯＤ－７、ＰＯＤ－１４、ＰＯＤ－２１、及びＰＯＤ－３０の時点でＬｕｍｉｎｅｘ２３－ｐｌｅｘによって測定したＴＧＦ－アルファの全身濃度を示すグラフである。 ＰＯＤ－０、ＰＯＤ－７、ＰＯＤ－１４、ＰＯＤ－２１、及びＰＯＤ－３０の時点でＬｕｍｉｎｅｘ２３－ｐｌｅｘによって測定したＩＬ－１２／２３（ｐ４０）の全身濃度を示すグラフである。 本発明による皮膚製品を調製するための方法を示す。 異種移植製品の保管に使用される凍結保存用バイアルを示す。 異種移植製品の搬送プロセスを示す。 環境温度未満の温度（限定されないが、－１５０℃及び他の温度を含む）で異種移植製品を保管するための二次閉鎖系または二次容器系を示す。 Ａは、ＰＯＤ－１２時点での創傷部位のブタ分層皮膚移植片を示し、これらの創傷部位は、左から右の方向でそれぞれ創傷部位１、創傷部位２、創傷部位３、及び創傷部位４である。Ｂは、ＰＯＤ－１２（左）及びＰＯＤ－１４（右）の時点の創傷部位４のブタ分層皮膚移植片を示す。 Ａは、ＭＴＴ還元アッセイによるブタ組織試料の比較を新鮮なものと凍結保存（７年）したものとで行ったグラフであり、統計的に差がないことを示す。Ｂは、ＭＴＴ還元アッセイによるブタ組織試料の比較を熱不活化したものと凍結保存（７年）したものとで行ったグラフであり、生成ホルマザンの量に統計的に有意な差があることを示す。 ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品の画像を示す。 ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品の画像を示す。 ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品の画像を示す。 ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品の画像を示す。 ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品の画像を示す。 ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品の画像を示す。 ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品の画像を示す。 Ａは、ＳＬＡ－ＤＲＡの非発現をもたらすための、ヌクレオチド配列ＴＡＧＴＧＡＴＡＡを用いたＳＬＡ－ＤＲＡにおけるヌクレオチドの例示的な再プログラムを示す。Ｂは、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２の各々の非発現をもたらすための、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２の各々におけるヌクレオチド配列ＴＡＧＴＧＡＴＡＡを用いたヌクレオチドの例示的な再プログラムを示す。 Ｘｅｎｏ－００１－００－１患者試料についての、複数の時点、処理前、７日目、１６日目、及び３０日目における、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）と比較した抗異種性ＩｇＭ（Ａ）及びＩｇＧ（Ｂ）抗体結合データを示す。データを、１：２希釈で試験した血漿試料について示す。 ＰＡＭ細胞の表面発現を示す。 Ａ～Ｄは、培養細胞の顕微鏡写真を示す（凝集は陽性反応を示す）。 エクソン１における単一塩基対置換を介したＤＲ－Ｂ１の終止コドンノックアウトを示す。 エクソン２、アルファ－１ドメイン内のＣＲＩＳＰＲを介したＤＱ－Ａ１の大きな（２６４ｂｐ）断片欠失を示す。 ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡのＡＢＳ４５０値を示す。Ａは、マイトマイシンＣで処理したＰＡＭ「Ｘ」、ＰＡＭ、及び１０μｇ／ｍＬのＬＰＳを有するＰＡＭの３つの異なるＰＡＭ細胞濃度での増殖を示す。Ｂは、７日間のインキュベーション後、３つの異なる濃度のマイトマイシンＣで処理したＰＡＭ細胞（１０Ｋ、２５Ｋ、及び５０Ｋ）を用いた、３人のヒトＰＢＭＣドナー（＃１９、＃２９、及び＃５７）の増殖を示す。一方向同種異系及び自己対照も示される。 ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡのＳＩ値を示す。Ａは、マイトマイシンＣで処理したＰＡＭ「Ｘ」細胞の３つの異なるＰＡＭ細胞濃度での増殖を示す。一方向同種異系及び自己対照も示された。Ｂは、３つの異なるドナーＰＢＭＣの自己、同種異系、及び有糸分裂増殖応答を示す。 処理したマイトマイシンＣ（Ｘ）及び未処理のＰＡＭ細胞の増殖のためのＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡのＡＢＳ４５０値を示す。 ７日間のインキュベーション後、３つのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及びＰＢＭＣ（Ｂ）の、未処理及びＩＦＮ－γ活性化ＰＡＭ細胞（１５Ｋ）に対する増殖応答についてのＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡのＡＢＳ４５０値を示す。一方向同種異系及び自己対照も示される。 ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡの刺激指数を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及びＰＢＭＣ（Ｂ）を用いた一方向型同種異系及び自己対照を示す。 ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡの刺激指数を示す。７日間のインキュベーション後、３つのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及びＰＢＭＣ（Ｂ）の、未処理及びＩＦＮ－γ活性化ＰＡＭ細胞（１５Ｋ）に対する増殖応答。 Ｘｅｎｏ－００１－００－１患者試料についての、複数の時点、処理前、７日目、１６日目、及び３０日目における、相対的な蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に示される抗異種性ＩｇＭ（Ａ）及びＩｇＧ（Ｂ）抗体結合データを示す。データを、１：２希釈で試験した血漿試料について示す。 Ｘｅｎｏ－００１－００－１患者試料についての、複数の時点、処理前、７日目、１６日目、及び３０日目における、相対的な蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に示される抗異種性ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体結合データを示す。データを、１：２（Ａ）及び１：１０（Ｂ）希釈で試験した血漿試料について示す。 Ｘｅｎｏ－００１－００－１患者試料についての、複数の時点、処理前、７日目、１６日目、及び３０日目における、相対的な蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に示される抗異種性ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体結合データを示す。データを、対数スケールで１：２（Ａ）及び１：１０（Ｂ）希釈で試験した血漿試料について示す。 Ｘｅｎｏ－００１－００－１患者試料についての、複数の時点、処理前、７日目、１６日目、及び３０日目における、相対的な蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に示される抗異種性ＩｇＭ（Ａ）及びＩｇＧ（Ｂ）抗体結合データを示す。データを、１：２、１：１０、１：１００、及び１：１０００希釈で試験した血漿試料について示す。 Ｘｅｎｏ－００１－００－１患者試料についての、７日目、１６日目、及び３０日目における、異種移植前及び後の相対的な蛍光強度中央値に示される抗異種性ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体結合データを示す。 ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡張培養培地中の異種培養物が、ＡＩＭ－Ｖ培地中の培養物（ＳＩ＝５．２５）と比較して、ＢｒｄＵ組み込みＥＬＩＳＡアッセイにおいて有意に高い刺激指数（ＳＩ＝８６．９２）を示したことを示す。 ブタ細胞のヒト化：ＤＲ－Ｂ１ノックアウト／ノックイン結果を示す。 ＳＬＡ－ＤＱＢ１のエクソン２の２６４ｂｐの欠失を示す。 フローサイトメトリーを使用して、ＷＴ ＰＡＭ細胞、クローンＭ２１、ならびにクローンＢ１０及びＤ１０で評価されたＳＬＡ－ＤＱの発現を示す。クローンＭ２１は、ＳＬＡ－ＤＱからノックアウトするための開始クローンであり、ＳＬＡ－ＤＲを発現しなかったが、ＳＬＡ－ＤＱを発現した。クローンＢ－１０及びＤ１０は、ＳＬＡ－ＤＱを発現しなかった。すべての細胞を、アッセイを実行する前に、ＩＦＮγで４８時間処理した。 ＭＬＲ中のＷＴ ＰＡＭ細胞に対するヒトドナー＃５７ ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。応答性Ｔ細胞は増殖し、ＣＴＶの強度の減少を示す。この場合、増殖率は１３．２５％であった。 ＳＬＡ－ＤＱＡのエクソン２の２６４ｂｐの欠失を示す。 ＤＱＢ１及びＤＱＡの欠失を示すゲルクロマトグラフィーを示す。 ＳＬＡ－ＤＲＢ－ＫＯ、ＳＬＡ－ＤＱＡ－ＫＯ、ＳＬＡ－ＤＱＢ－ＫＯにおけるトリプル終止コドンの概略図を示し、ＣＴＴＣＡＧＡＡＡは、エクソン１においてＴＡＧＴＧＡＴＡＡに変化した。 ＨＬＡ－Ｂ２ｍドナー対ＸＴ－ＰＡＭ細胞間の配列アラインメントを示す。 Ａは、野生型ＰＡＭ細胞におけるＳＬＡ－Ｉ及びｐＢ２Ｍの発現を示す。Ｂは、クローンＡ１ ＰＡＭ細胞におけるＳＬＡ－Ｉ及びｐＢ２Ｍの発現の欠如を示す。
本開示の主題の態様は、すべての形態で具体化し得るものであり、これ以後に続く説明は、単に、こうした形態のいくつかを、本開示が包含する主題の具体例として開示することを意図するものにすぎない。したがって、本開示の主題は、そのように説明される形態または態様に限定されないものとする。
ＵＳ２０２０／０１０８１７５Ａ１（Ｈｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．）の開示は、あらゆる目的のために、本明細書に明示的に記載されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用される方法及び材料を本明細書に記載しているが、当該技術分野で既知の他の適切な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法、及び実施例は、例示的のみであり、限定的であることを意図しない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
「最良整列」または「最適整列」は、以下に記載されるように決定される同一性パーセンテージが最も高い整列を意味する。２つの核酸配列間の配列の比較は、従来、それらを最適に整列させた後にこれらの配列を比較することによって行われ、前述の比較は、類似の配列についての局所領域を特定及び比較するためにセグメントまたは「比較ウィンドウ」によって行われる。比較のために、配列は、手動で、またはアラインメントソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ局所相同性アルゴリズム（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ局所相同性アルゴリズム（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ類似性検索方法（１９８８）、ならびにこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）を使用することによって最適に整列され得る。いくつかの態様では、最適な整列は、ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックスまたは同様の機能を有するソフトウェアを有するＢＬＡＳＴプログラムを使用して取得される。核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「同一性パーセンテージ」は、これら２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較される核酸またはアミノ酸の配列は、これら２つの配列間の最適なアラインメントのために参照配列からの付加または欠失を含み得る。同一性パーセンテージは、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２つの配列間で同一である位置の数を決定し、この同一の位置の数を比較された位置の総数で割り、得られた結果に１００を掛けて、これら２つの配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
本明細書で使用される「保存的」及びその文法的等価物には、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む、保存的アミノ酸置換が含まれる。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を修飾することによって達成され得る。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能的特性、例えば、目的のペプチドを提示するＭＨＣ Ｉの能力を実質的に変化させない。類似の化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン等の脂肪族側鎖、セリン及びトレオニン等の脂肪族－ヒドロキシル側鎖、アスパラギン及びグルタミン等のアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン等の芳香族側鎖、リジン、アルギニン、及びヒスチジン等の塩基性側鎖、アスパラギン酸及びグルタミン酸等の酸性側鎖、ならびにシステイン及びメチオニン等の含硫側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基として、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸塩／アスパラギン酸塩、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。当業者は、本明細書に記載のヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩポリペプチド、及び／またはベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする核酸残基に加えて、遺伝暗号の縮退に起因して、他の核酸配列が本明細書に開示のポリペプチド（複数可）をコードし得ることを理解するであろう。したがって、そのゲノム中に保存的アミノ酸置換を伴うＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ及び／またはベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーに加えて、遺伝暗号の縮退に起因して本明細書に記載されるものと異なるヌクレオチド配列（複数可）を含む非ヒト動物も提供される。
本明細書で使用される「保存された」及びその文法的等価物は、それぞれ、比較される２つ以上の関連配列の同じ位置で未改変で生じるものである、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の場所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連性の高い配列間で保存されているものである。本明細書において、２つ以上の配列は、互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、ただし１００％未満同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、ただし１００％未満同一である場合、「保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。
本明細書で使用される「指定の病原体を含まない」という語句は、１つ以上の特定の病原体を含まない動物、動物群、そこから得られる動物製品、及び／または動物施設への言及を含む。好ましくは、そのような「指定の病原体を含まない」動物、動物群、そこから得られる動物製品、及び／または動物施設は、適切な標準的作業手順（ＳＯＰ）ならびにそのような指定の病原体が存在しないこと及び／または不活化されていることを保証する群飼育及び獣医学的管理の慣行（本明細書に開示及び記載の所定作業、検査、手順、飼育、及び獣医学的管理を含む）を利用しながら、そのような指定の病原体を検査する明確に規定された所定作業を使用して維持される。本明細書で使用される「含まない」などという用語、ならびに同様の用語は、「病原体を含まない」と併用される場合、対象病原体が存在しないか、生存していないか、活性でないか、またはその他の状況で対象病原体の標準的な検査方法もしくは他の検査方法によって検出不可能なことを示すことを意図するものであることがさらに理解されよう。病原体には、これらに限定されないが、集団に新たに出現した、または存在したが、発生率もしくは地理的範囲が急速に増加しているか、または米国国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）カテゴリーＡ、Ｂ、もしくはＣ優先病原体のうちの１つによって引き起こされる、新興の感染症も含まれ得る。
本明細書で使用する場合、「改変する」、「改変している」、「改変された」及び文法的等価物には、欠失、挿入、サイレンシング、修飾、再プログラム、破壊、変異、再配列、発現増加、ノックイン、ノックアウト、及び／またはいずれかまたはすべての他のそのような修飾またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、遺伝子に対する任意及び／またはすべての修飾が含まれる。
本明細書で使用される「内因性遺伝子座」及びその文法的等価物には、ドナー動物に形質転換される動物に見出される天然の遺伝子座が含まれる。
「機能的」、例えば、機能的ポリペプチドに関して、本明細書で使用される文法的等価物には、天然タンパク質に通常会合する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドが含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座における置き換え（例えば、内因性非ヒトＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、及び／またはベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における置き換え）は、機能的内因性ポリペプチドを発現しない遺伝子座をもたらす。同様に、タンパク質の機能的細胞外ドメインに関して本明細書で使用される「機能的」という用語は、例えば、ＭＨＣ Ｉの場合、抗原に結合する能力、Ｔ細胞共受容体に結合する能力など、その機能性を保持する細胞外ドメインを指すことができる。いくつかの実施形態では、内因性ＭＨＣ遺伝子座での置き換えは、ヒトＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的細胞外ドメイン）を発現しながら、内因性ＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的細胞外ドメイン）を発現しない遺伝子座をもたらす。
本明細書で使用される「遺伝子または分子マーカー」、及びそれらの文法的等価物は、多型遺伝子座、すなわち、多型ヌクレオチド（いわゆる一塩基多型またはＳＮＰ）または特定の遺伝子座における多型ＤＮＡ配列を含む。マーカーは、通常メンデル様式で遺伝され、目的の形質のマッピングに使用され得る、ゲノム内の固定位置を有する測定可能な遺伝的特徴を指す。したがって、遺伝子マーカーは、短いＤＮＡ配列、例えば、単一の塩基対変化を囲む配列、すなわち、単一のヌクレオチド多型もしくはＳＮＰ、または長いＤＮＡ配列、例えば、マイクロサテライトもしくは単純配列反復（ＳＳＲ）であってもよい。マーカーの性質は、使用される分子分析に依存し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルで検出され得る。遺伝子マッピングは、ＲＦＬＰ（制限断片長多型；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．３２：３１４－３３１、Ｔａｎｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：２５７－２６３）、ＲＡＰＤ［ランダム増幅多型ＤＮＡ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０），ＮＡＲ １８：６５３１－６５３５］、ＡＦＬＰ［増幅断片長多型；Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＮＡＲ ２３：４４０７－４４１４］、ＳＳＲ、またはマイクロサテライト［Ｔａｕｔｚ ｅｔ ａｌ．１９８９），ＮＡＲ １７：６４６３－６４７１］を含むが、これらに限定されない。適切なプライマーまたはプローブは、使用されるマッピング方法によって左右される。
本明細書で使用される「改善する」及びその文法的等価物には、当業者に認識される任意の改善が含まれる。例えば、移植の改善は、望ましくない効果または症状の減少、緩和、または軽減を包含し得る超急性拒絶反応を軽減することを意味し得る。いくつかの態様では、臨床的に関連する改善が達成される。
本明細書で使用される「遺伝子座」（遺伝子座の複数形）または「部位」及びそれらの文法的等価物は、例えば、遺伝子、遺伝子マーカーまたはＱＴＬが見出される染色体上の特定の場所（複数可）を含む。
本明細書で使用される「最小限に破壊された」及びその文法的等価物には、ドナー動物ゲノム上に現れる天然塩基対の特定の異なる配列を除去及び置き換えること、ならびに、ドナー動物ゲノム内の塩基対の数に正味の変化を伴わず、一方で、例えば、内因性エクソン及び／またはイントロンならびにドナー動物ゲノム内に天然に存在する他のコドンを含む、ドナー動物の天然ゲノムの他の態様を妨げることなく、各そのような配列を同じ数の塩基対を含む合成配列で置き換えることを含む、ドナー動物ゲノムの改変を含む。本開示は、正確な部位特異的変異原性遺伝子置換または修飾を促進することを含み、その設計は、動物の免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときにドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する、付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、ゲノム組織破壊を回避する。これには、ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣのヌクレオチドの部位特異的変異原性置換が含まれ、再プログラムは、天然ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣの特定のエクソン領域にいかなるフレームシフトまたはフレーム破壊ももたらさない非トランスジェニックを導入する。例えば、ドナー動物としてのブタドナーの場合、最小限に破壊されたブタドナーは、サイレンシングすることと、特定のＳＬＡエクソンを除去または非活性化して、ブタドナー細胞の細胞外発現またはＭＨＣクラスＩＩ、Ｉａ、及び／またはＩｂの非発現を調節することと、特定のナイーブな天然に存在するブタドナー細胞ＳＬＡエクソンを再プログラムして、ブタドナー細胞の細胞外発現またはＭＨＣクラスＩＩの非発現を調節することと、別の方法で操作された配列内またはその付近に存在するブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロンを保存または除去しないことと、ブタドナーＣＴＬＡ４及びＰＤ－１の発現を増加させることと、第１の態様によりアルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎアセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を除去または非活性化することと、の特定の改変を含み得る。
本明細書で使用される「オルソログ」、「オルソロガス」、及びそれらの文法的等価物は、遺伝子またはタンパク質またはＱＴＬと同じ機能を有するが、遺伝子または定量的形質遺伝子座を保有する種が分岐した時点から（すなわち、遺伝子または定量的形質遺伝子座が種によって共通の祖先から進化した時点から）配列において（通常）分岐した、別の種におけるポリヌクレオチドに対応する、ある種に由来するポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される「定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）」及びその文法的等価物には、問題の形質の基礎となる遺伝子に密接に連結されている一連のＤＮＡ（染色体アーム、染色体領域、ヌクレオチド配列、遺伝子等）が含まれる。「ＱＴＬマッピング」は、ＡＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＲＦＬＰ、ＳＮＰ、ＳＳＲ等の遺伝子または分子マーカー、可視多型及びアロザイムを使用して、ゲノム上の特定の領域の、目的の形質の遺伝物質への関連性の程度を決定して、ゲノムのマップを作成することを含む。マーカーは必ずしも遺伝子を伴うわけではないため、ＱＴＬマッピング結果は、その形質に関与する遺伝子を直接指摘するというよりは、ＤＮＡのストレッチと形質との関連性の程度を伴う。関連性の程度が有意かどうかを確認するために、異なる統計的方法が用いられる。分子マーカーは、マーカーと遺伝子または遺伝子座とが、独立した分類から予想されるよりも大きな遺伝的関連性を有する場合、遺伝子または遺伝子座に「連結されている」と言われ、すなわち、マーカーと遺伝子座は、隔離集団においてともに隔離され、同じ染色体上に位置する。「連結」は、マーカーの遺伝子座または遺伝子に対する遺伝的距離（または２つの遺伝子座または２つのマーカーに対する互いの遺伝的距離）を指す。連結が近いほど、マーカーを遺伝子または遺伝子座から分離する組換え事象が起こる可能性が低くなる。遺伝的距離（マップ距離）は、組換え頻度から計算され、センチモルガン（ｃＭ）［Ｋｏｓａｍｂｉ（１９４４），Ａｎｎ．Ｅｕｇｅｎｅｔ．１２：１７２－１７５］で述べられている。
本明細書で使用される「捕捉配列」または「参照配列」及びそれらの文法的等価物は、試料、動物（ヒトを含む）、または集団から得られた、配列決定された、または他の方法で公知になった核酸またはアミノ酸配列を含む。例えば、ヒト患者からの捕捉配列は、「ヒト患者捕捉配列」である。特定のヒト集団からの捕捉配列は、「ヒト集団特異的ヒト捕捉配列」である。ヒト対立遺伝子群からの捕捉配列は、「対立遺伝子群特異的ヒト捕捉配列」である。
本明細書で使用される「ヒト化」及びその文法的等価物には、内因性非ヒト遺伝子または対立遺伝子のすべてまたは一部が、オルソロガスなヒト遺伝子または対立遺伝子の対応する部分によって置き換えられる実施形態が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、「ヒト化」という用語は、内因性非ヒトＭＨＣ遺伝子またはその対立遺伝子もしくは断片のコード領域（例えば、エクソン）を、ヒトＭＨＣ遺伝子またはその対立遺伝子もしくは断片の対応する捕捉配列と完全に置き換えることを指し、一方で、非ヒト動物ドナーの内因性非コード領域（複数可）（プロモーター、５’及び／または３’非翻訳領域（複数可）、エンハンサー要素など）は置き換えられない。
本明細書で使用される「個別化された（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ）」または「個別化された（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ）」、及びそれらの文法的等価物には、個々のヒトレシピエントまたは特定のヒトレシピエント亜集団のニーズまたは特別な状況に適応される非ヒト動物ドナー由来の遺伝子、対立遺伝子、ゲノム、プロテオーム、細胞、細胞表面、組織、または臓器が含まれる。
本明細書で使用される「免疫遺伝学的な再プログラム」及びそれらの文法的等価物を含む「再プログラム」、「再プログラムされた」は、別個の参照配列に基づいて、ドナー動物における内因性ヌクレオチドのオルソロガスなヌクレオチドでの置き換えまたは置換を指し、ここで、フレームシフト変異は、そのような再プログラムによって導入されない。加えて、再プログラムは、ドナー動物ゲノム中のヌクレオチドの総数の正味の損失もしくは正味の増加をもたらさないか、または別個の参照配列中のヌクレオチドの数の１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下、８％以下、９％以下、１０％以下、１２％以下、１５％以下、もしくは２０％以下に等しいドナー動物ゲノム中のヌクレオチドの総数の正味の損失もしくは正味の増加をもたらす。「再プログラム」の一例では、内因性非ヒトヌクレオチド、コドン、遺伝子またはその断片が、ヒト捕捉配列に基づいて対応する合成ヌクレオチド、コドン、遺伝子またはその断片と置き換えられ、そこでは、ドナー動物配列中の塩基対の総数は、ヒト捕捉配列の塩基対の総数と等しい。
本明細書で使用される「免疫寛容性」及びその文法的等価物は、移植時にレシピエントの免疫系による応答の低下によって許容される臓器、細胞、組織、または他の生物学的製品の特徴を含む。
本明細書で使用される「トランスジェニック」及びその文法的等価物は、遺伝子の相同性、内因性バージョン（ある場合）が全体的または部分的に保持されるように、異なる種からの非天然遺伝子をドナー動物のゲノムの非オルソロガス、非内因性位置に導入するように修飾されたドナー動物ゲノムを含む。本明細書で使用される「導入遺伝子」、「トランスジェニックな」、及び文法的等価物は、本明細書に記載され特許請求されるような再プログラムされたゲノム、ノックイン／ノックアウト、部位特異的変異原性置換もしくはその系列、または他の修飾を含まない。例として、「トランスジェニック」ブタドナーには、ｈＣＤ４６（「ヒト膜補助因子タンパク質」または「ＭＣＰ」）、ｈＣＤ５５（「ヒト減衰加速因子」、「ＤＡＦ」）、ヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及び／または他のヒト遺伝子を有するか、またはそれらを発現するものが含まれ、これらは、これらの遺伝子の内因性バージョンの置き換えなしに、ブタドナーゲノム内の非オルソロガス、非内因性の位置にヒト遺伝子配列を挿入することによって達成される。
免疫遺伝学的な再プログラム
本明細書に開示されるように、いくつかのヒトクラスＩ及び／またはクラスＩＩ ＭＨＣ分子のための免疫寛容性な非ヒト動物ドナー細胞、組織及び臓器が提供される。
ヒト免疫応答系は、侵入生物に対する非常に複雑で効率的な防御系である。Ｔ細胞は、細胞応答に関与する主要なエフェクター細胞である。抗体が治療薬（ＴＣＲ）として開発されたように、Ｔ細胞の表面上の受容体は、それらに特異性を与えるが、治療薬を開発するためのプラットフォームとして独自の利点を有する。抗体は、血液及び細胞外空間における病原体の認識、または細胞表面上のタンパク質標的に限定されるが、ＴＣＲは、細胞表面上のＭＨＣ分子によって提示される抗原（細胞内タンパク質に由来する抗原を含む）を認識する。提示された抗原を認識して活性化するＴ細胞のサブタイプに応じて、ＴＣＲ及びＴＣＲを保有するＴ細胞は、様々な免疫応答の制御に関与する。例えば、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞の抗体分泌細胞への分化の誘導による体液性免疫応答の調節に関与する。加えて、活性化されたヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞による細胞媒介性免疫応答を開始する。したがって、ＴＣＲは、抗体によって通常見られない標的を特異的に認識し、それらを担持するＴ細胞を駆動させて、多種多様な免疫応答を開始する。
Ｔ細胞は、細胞表面上に発現されたＴＣＲによって細胞表面上に提示された抗原を認識することが理解されるであろう。ＴＣＲは、ジスルフィド結合ヘテロ二量体であり、大部分は、α鎖及びβ鎖糖タンパク質からなる。Ｔ細胞は、組換えメカニズムを使用して、Ｂ細胞で動作する抗体多様性を生成するためのそれらのメカニズムと同様に、その受容体分子に多様性を生成する（Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７）。免疫グロブリン遺伝子と同様に、ＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞の発達中に再配列するセグメントから構成される。ＴＣＲポリペプチドは、可変領域、定常領域、膜貫通領域及び細胞質領域からなる。膜貫通領域はタンパク質を固定し、細胞内領域は受容体が占有されるときにシグナル伝達に関与するが、可変領域は抗原の特異的認識に関与し、定常領域は可変領域結合表面を支持する。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）及び結合（Ｊ）セグメントのみによってコードされる可変領域を含有し、β鎖は、さらなる多様性（Ｄ）セグメントを含有する。
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）分子及び主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子は、ペプチドを抗原提示細胞表面上にディスプレイしてその後にＴ細胞に認識されるようにする。図２を参照されたい。ヒト集団内で、古典的なＭＨＣＩ遺伝子産物及びＭＨＣＩＩ遺伝子産物の間の対立遺伝子の多様性は、ペプチド結合の差異、胸腺レパートリーバイアス、及び同種移植片拒絶反応の基礎をなしている。ＭＨＣ分子は、適応免疫のプロセスの中心をなす細胞表面糖タンパク質であり、ペプチドを捕捉し、それを抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上にディスプレイするように機能する。ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）分子は、ほとんどの細胞上に発現しており、アミノ酸残基数８～１０のサイズを有する内因性に由来するペプチドに結合し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される。図３及び図４を参照されたい。一方、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）は、特殊なＡＰＣ上にのみ存在し、残基数８～２６のサイズを有する外因性に由来するペプチドに結合し、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって認識される。図５を参照されたい。こうした差異は、ＭＨＣＩ分子及びＭＨＣＩＩ分子が、Ｔ細胞媒介性免疫応答の２つの異なる部分に関与することを示しており、ＭＨＣＩ分子は、ＣＤ８＋ＣＴＬによる破壊を受けるように進入病原体（ウイルスなど）を標的とし、ＭＨＣＩＩ分子は、サイトカインベースの炎症性メディエーターを誘導してＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞活性（Ｂ細胞の活性化、成熟、及び抗体産生を含む）を刺激する。いくつかの態様では、本開示の生物学的製品は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されず、抗ＨＬＡ抗体と結合せず、ＮＫ媒介性溶解に抵抗性である。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系またはＨＬＡ複合体は、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。こうした細胞表面タンパク質は、ヒトにおける免疫系の制御を担う。ＨＬＡ遺伝子複合体は、染色体６ｐ２１内の３Ｍｂｐの区間に存在する。図６を参照されたい。ＨＬＡ遺伝子は、高度に多型性であり、このことは、ＨＬＡ遺伝子が、異なる対立遺伝子を多く有し、これによって、そうしたＨＬＡ遺伝子が適応免疫系を微調整することが可能であることを意味する。図７を参照されたい。ある特定の遺伝子によってコードされるタンパク質は、抗原としても知られており、こうして抗原として知られることになったのは、そうした抗原が臓器移植物中の因子として歴史的に発見された結果である。クラスが異なれば、機能が異なる。図８及び図９を参照のこと。
ＨＬＡセグメントは、３つの領域（セントロメアからテロメア）、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、及びクラスＩに分割される（図１０を参照）。古典的なクラスＩ ＨＬＡ遺伝子及びクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子は、それぞれクラスＩ領域及びクラスＩＩ領域に含まれている一方で、クラスＩＩＩ遺伝子座は、免疫系に関与するタンパク質をコードする遺伝子を保有するが、構造的にはＭＨＣ分子と関連しない。古典的なＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの３種類である。こうした成熟ＨＬＡクラスＩ分子のα鎖のみが、それぞれＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子によってクラスＩ ＨＬＡ遺伝子座内にコードされる。図１１を参照されたい。対照的に、遺伝子によってコードされるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）鎖は、１５番染色体上に位置する。古典的ＨＬＡクラスＩＩ分子もまた、３つの型（ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲ）を有するものであり、それぞれのα鎖及びβ鎖は両方共、一対の隣接遺伝子座によってコードされる。こうした古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子及びＨＬＡクラスＩＩ遺伝子に加えて、ヒトＭＨＣ遺伝子座は、広範囲にわたって並んだＨＬＡ偽遺伝子ならびに非古典的なＭＨＣＩ分子及びＭＨＣＩＩ分子をコードする遺伝子を含む。ＨＬＡ偽遺伝子は、遺伝子重複がＨＬＡ進化の主な原動力であることを示すものである一方で、非古典的なＭＨＣＩ分子及びＭＨＣＩＩ分子は、αβＴＣＲに抗原を提示する機能とは全く異なる限られた機能を免疫系内で果たすことが多い。
ＨＬＡ遺伝子は、高度に多型性、多型性、少型性、及び単形性の範囲にわたり、多型末端上の遺伝子は、数百のアロタイプを有する。各ヒト細胞は、６つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（各親からの１つのＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ対立遺伝子）及び６～８つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（各親からの１つのＨＬＡ－ＤＰ及び－ＤＱ、ならびに１つまたは２つのＨＬＡ－ＤＲ、及びこれらの組み合わせ）を発現する。一卵性双生児ではない任意の２つの個体は、異なるＭＨＣ分子を発現する。
すべてがＨＬＡクラス１基であるＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡ（Ａ、Ｂ、及びＣ）は、細胞内からのペプチドを提示する。例えば、細胞がウイルスに感染した場合、ＨＬＡ系は、ウイルスの断片を細胞の表面に持ち込み、それにより細胞は免疫系によって破壊され得る。これらのペプチドは、プロテアソーム内で分解される消化されたタンパク質から産生される。概して、これらの特定のペプチドは、約９アミノ酸長の小さなポリマーである。ＭＨＣクラスＩによって提示される外来抗原は、細胞を破壊するキラーＴ細胞（ＣＤ８陽性または細胞傷害性Ｔ細胞とも称される）を引き付ける。ＭＨＣクラスＩによって提示される外来抗原は、この抗原を発現する細胞を破壊するＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用する。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、β２－ミクログロブリンと関連しており、ＨＬＡタンパク質とは異なり、１５番染色体上の遺伝子によってコードされる。
主要な遺伝子Ａ、Ｂ、及びＣに加えて、クラスＩは、副次的な遺伝子Ｅ、Ｇ、及びＦ（別名クラスＩｂ遺伝子）を含む。これらの遺伝子は、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、及びＣよりも多型性が低いが、免疫応答の調節因子として重要な役割を果たす。クラスＩｂ分子は、移植片拒絶に関与する細胞のサブセットによって発現される免疫調節細胞表面受容体のリガンドとして機能する。ＨＬＡ Ｅは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球の両方の細胞傷害性機能を阻害することができる。ＨＬＡ Ｇ及びＨＬＡ Ｆは、ＮＫ細胞のＩｇ様受容体に結合することによって、移植片耐性を促進することができる。ＨＬＡ Ｇ及びＨＬＡ Ｆのより高い発現は、免疫抑制なしで移植片耐性を促進する、細胞表面上の対応するペプチドのより高いレベルにつながる。１
ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯ、ＤＱ、及びＤＲ）は、細胞外からＴリンパ球に抗原を提示する。これらの特定の抗原は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞とも称される）の増殖を刺激し、これは、次に、抗体産生Ｂ細胞を刺激して、その特定の抗原に対する抗体を産生する。自己抗原は、制御性Ｔ細胞によって抑制される。影響を受ける遺伝子は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写を制御する４つの異なる制御因子をコードすることが知られている。これらのトランザクション因子は、クラスＩＩトランスアクチベーター及び調節因子Ｘ（ＲＦＸ）の３つのサブユニットである：ＲＦＸ含有アンキリン反復（ＲＦＸＡＮＫ）、ＲＦＸファミリーの５番目のメンバー（ＲＦＸ５）、及びＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）。各々のうちの１つにおける変異は、それぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称される４つの異なる相補群を定義する。
ＭＨＣクラスＩＩＩに対応するＨＬＡは、補体系の成分をコードする。ＨＬＡは他の役割を有する。それらは疾患の防御に重要である。それらは、臓器移植拒絶反応の主な原因である。それらは、がんに対して保護するか、または（感染によってダウンレギュレートされた場合）保護することができない場合がある。ＨＬＡの変異は、自己免疫疾患（例：Ｉ型糖尿病、セリアック病）に関連し得る。ＨＬＡはまた、他の人々の臭いの人々の知覚に関連している場合があり、少なくとも１つの研究では、孤立したコミュニティ内の配偶者間のＨＬＡ類似性の予想よりも低い割合が見出されたため、配偶者の選択に関与し得る。
抗原提示タンパク質をコードする遺伝子とは別に、他にも遺伝子が多数存在し（こうした遺伝子の多くが免疫機能に関与する）、ＨＬＡ複合体上に位置する。ヒト集団におけるＨＬＡの多様性は、疾患防御の一側面であり、結果として、無関係な２個体が、すべての遺伝子座上に同一のＨＬＡ分子を有する確率は極めて低い。ＨＬＡ遺伝子は、歴史的には、ＨＬＡが類似する個体の間で臓器移植が成功する能力の結果として同定されている。
クラスＩ ＭＨＣ分子は、腫瘍細胞を含むすべての有核細胞上に発現される。これらは、他の細胞のうち、Ｔ及びＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞及び好中球等に特異的に発現し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対して表面上にペプチド断片（典型的には８～１０アミノ酸長）を表示するように機能する。ＣＴＬは、独自の膜結合ＴＣＲによって認識されるＭＨＣ Ｉ結合ペプチドを保有する任意の細胞を死滅させることに特化している。細胞が、通常は存在しない細胞タンパク質に由来するペプチド（例えば、ウイルス、腫瘍、または他の非自己由来のもの）を表示する場合、そのようなペプチドは、ＣＴＬによって認識され、ＣＴＬは活性化され、ペプチドを表示する細胞を死滅させる。
ブタにおいて、ＭＨＣは、ブタ白血球抗原（ＳＬＡ）と称される。ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）ゲノムにおいて、ＳＬＡは、７番染色体にマッピングされ、セントロメアによって分割される。これは３つの領域からなる：クラスＩとクラスＩＩＩの領域は７ｐ１．１にマッピングされ、クラスＩＩの領域は７ｑ１．１にマッピングされる。ＳＬＡ複合体は、ハプロタイプに応じて２．４～２．７Ｍｂに広がり、少なくとも１２０個の機能遺伝子を有する約１５０個の遺伝子座をコードする。ブタは、そのサイズ及び生理機能がヒトと適合すると考えられることから、ヒトへの異種移植において使用するための臓器、組織、及び／または細胞の潜在的な非ヒト供給源であると長い間みなされてきた。ブタＳＬＡには、限定されないが、ＳＬＡ－１遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－２遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－３遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－４遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－５遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－６遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－８遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－９遺伝子座によってコードされる抗原、ＳＬＡ－１１遺伝子座によってコードされる抗原、及びＳＬＡ－１２遺伝子座によってコードされる抗原が含まれ得る。ブタクラスＩＩ ＳＬＡには、ＳＬＡ－ＤＱ遺伝子座によってコードされる抗原及びＳＬＡ－ＤＲ遺伝子座によってコードされる抗原が含まれる。
臓器、組織、及び幹細胞移植では、移植を成功させるための課題の１つは、可能な限り類似した組織タイプを有する宿主及びドナーを見つけることである。したがって、臓器、組織、及び幹細胞移植において、成功の鍵は、可能な限り類似した組織タイプを有する宿主及びドナーを見つけることである。組織適合性、または組織適合性は、レシピエントのＭＨＣが免疫系を駆動させてドナーの組織を拒絶しないように、ＭＨＣの同じまたは十分に類似した対立遺伝子を有する特性である。
移植では、ＭＨＣ分子は抗原として働き、レシピエント由来の免疫応答を誘発することで、移植拒絶反応を引き起こす。したがって、ドナーから特定のＭＨＣ分子の発現を排除することは、移植されたブタ細胞、組織、及び／または臓器のヒトレシピエントへの免疫学的拒絶反応を低減するのに役立つであろう。しかしながら、ＭＨＣ分子の完全な排除は、先天性免疫応答による拒絶をもたらし得る。ヒトＭＨＣクラスＩ及びＩＩは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。ドナー動物が生存し、繁栄するためには、ドナー動物に最小限の能力を有する免疫系を提供するある特定のＭＨＣ分子（例えば、ＳＬＡ）を保持することが必要である。ＭＨＣ遺伝子の欠失に依存する従来技術の戦略は、ドナー動物に重大なリスク、例えば、重度の複合免疫不全（ＳＣＩＤ）をもたらす。ブタゲノムを再プログラムしない従来技術の戦略は、ヒトレシピエントに拒絶反応の重大なリスクをもたらすか、または免疫抑制剤の有意かつ無限の使用を必要とする。
ヒト集団におけるＭＨＣ多様性が非常に高いため、臓器及び組織の安全かつ効果的な移植のために、レシピエントと十分に同一であるＭＨＣ分子を発現する異種移植用の細胞、組織、または臓器を得ることは困難であるか、または不可能である。さらに、ヒトとブタとの間の非ＭＨＣ分子の多様性及びアミノ酸多様性は、野生型ブタ細胞の免疫学的拒絶反応の原因である。異種移植片の免疫反応性は、ドナー集団におけるＭＨＣの自然な多様性に応じて変動し得る。一方、ヒトＭＨＣの自然な多様性はまた、免疫応答の強度を調節する。
図１２に示すように、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、細胞外ドメイン（α１、α２、及びα３の３つのドメインを含む）、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部を含む。α１及びα２ドメインは、ペプチド結合性切断を形成し、α３は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と相互作用する。クラスＩ分子は、多型α鎖（重鎖と称されることがある）と、一般に多型ではない、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）（軽鎖とも称される）と称されるより小さい鎖と、の２つの鎖からなる。これらの２つの鎖は、細胞表面上で非共有ヘテロ二量体を形成する。α鎖は、３つのドメイン（α１、α２、及びα３）を含む。図１２に示すように、α鎖遺伝子のエクソン１はリーダー配列をコードし、エクソン２及び３はα１及びα２ドメインをコードし、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通ドメインをコードし、エクソン６及び７は細胞質尾部をコードする。α鎖は、α１及びα２ドメイン（Ｉｇ様ドメインに類似する）、続いてベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）に類似するα３ドメインを含むペプチド結合性切断を形成する。
ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は、非グリコシル化の１２ｋＤａのタンパク質であり、その機能の１つは、ＭＨＣクラスＩ α鎖を安定化することである。α鎖とは異なり、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は膜に及ばない。ヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座は、１５番染色体上にあり、４つのエクソンと３つのイントロンの領域からなる。ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の循環形態は、血清、尿、及び他の体液中に存在し、非共有的にＭＨＣ Ｉ関連したベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は、生理学的条件下で循環するベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と交換することができる。
図１３に示すように、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、細胞外ドメイン（α１、α２、β１、及びβ１の３つのドメインを含む）、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部を含む。α１及びβ１ドメインは、ペプチド結合性切断を形成し、α１及びβ１は膜貫通ドメインと相互作用する。
前述の抗原に加えて、クラスＩ抗原は、非古典的クラスＩ抗原と呼ばれる他の抗原、特に抗原ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ及びＨＬＡ－Ｇを含み、この後者の抗原は、特に、ＨＬＡ－Ｃに加えて、正常なヒト胎盤の絨毛外性トロホブラストによって発現される。
一般的に図１を参照すると、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｍｅｄａｗａｒは、「胎児が９ヶ月間母体子宮内に快適に居住するヒト妊娠の成功は、免疫学の理念に反する」と誇らしげに述べた。言い換えると、彼は地球上で最も一般的で成功した移植は妊娠であることに気が付いた。
細胞表面マーカーのトロホブラスト発現は十分に特徴付けられており、そのような表現型をブタ細胞内で保持するために適切かつ必要な場所で複製することにより、重要で所望の細胞機能を得ることができる。文献によれば、絨毛外性トロホブラスト細胞は、ＨＬＡクラスＩａ分子（ＨＬＡ－Ｃ）及びＨＬＡクラスＩｂ分子のすべてを発現する。絨毛外性トロホブラスト細胞上で高度に発現されるＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｇの両方と比較して、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－Ｆは弱く発現される。例えば、Ｄｊｕｒｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，“ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉｂ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ，”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ５，Ａｒｔ．６５２（２０１４）を参照されたい。ＭＨＣ分子に加えて、ＰＤ－Ｌ１は、正常な妊娠におけるトロホブラスト細胞、特にシンシチオトロホブラスト細胞において上方制御される。ＨＬＡクラスＩＩ分子はトロホブラスト上に存在せず、母体リンパ球の存在下での胚の生存及び検出を促進し得る。例えば、Ｖｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，“ＰＤ－Ｌ１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａｓ ａｎｄ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３６（２）：１４６－１５３（２０１７）を参照されたい。
本発明は、ヒトトロホブラストの細胞外構成を模倣する免疫寛容性異種移植ブタドナー細胞の作成方法を提供する。この方法は、これらに限定されないが、特定のＳＬＡエクソンを除去または非活性化して、ブタドナー細胞の細胞外発現またはＭＨＣクラスＩＩ、Ｉａ、及び／またはＩｂの非発現を調節することと、特定のナイーブな天然に存在するブタドナー細胞ＳＬＡエクソンを再プログラムして、ブタドナー細胞の細胞外発現またはＭＨＣクラスＩＩの非発現を調節することと、別の方法で操作された配列内またはその付近に存在するブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロンを保存または除去しないことと、ブタドナーＣＴＬＡ４及びＰＤ－１の発現を増加させることと、アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を除去または非活性化することとを含む。ヒトトロホブラストの細胞外構成を模倣する免疫寛容性異種移植ブタドナー細胞を作成するための、このような発現の増加を引き起こすためのかかる除去、再プログラム、及び修飾、ならびにブタドナーゲノムの他の操作された態様は、以下のように記載される。
このアンメット臨床ニーズに対するかつて／以前の手法は、「万人に有効な（ｏｎｅ－ｓｉｚｅ ｆｉｔｓ ａｌｌ）」古典的な医学的定説に明確に従っている。本発明者らはこれを「下流」手法と称し、この手法では、次々に生じる自然免疫プロセスのすべてに対処することに取り組まなくてはならない。この限定的な見解を採用する代わりに、本発明は、臨床転帰測定を劇的に改善するために「患者固有の」解決策をとる。後者（本発明者らの手法）のことを、本発明者らは、「上流」手法と命名し、この手法は、満たされない科学的労力の集大成が調和のとれた橋渡し的成果となったものである。我々のアプローチの中心的な定理は、既存及び以前の独断的アプローチに対抗するものである。「下流」アプローチは、ドナーとレシピエントとの間の先天的及び不動の差異を受け入れ、レシピエントの自然に生じる免疫学的応答を低減／排除／負の方向に改変させる方法として使用される介入、遺伝子修飾、及び／またはそれに伴う外因性免疫抑制薬物に焦点を当てる。対照的に、本発明者らは、意図的に、基本的な科学的ドグマの分野に当てられた焦点を逆転させることを選択する。ドナーとレシピエントとの間の免疫学的不適合性、具体的には（限定されないが）主要組織適合遺伝子複合体（複数可）のそうした不適合を受け入れるのではなく、本発明者らは、供給源におけるこうした触媒抗原を改変し、それによって、ドナーとレシピエントとの間の細胞拒絶反応、組織拒絶反応、及び臓器拒絶反応の原因エフェクターである誘発機構をすべて排除する。このアプローチは、遺伝学、産科学、感染症、腫瘍学、農業、畜産、食品産業、及び他の領域の分野を含むがこれらに限定されない、異種移植の分野を超えて適用される。
本開示は、異種移植のための非トランスジェニックな遺伝的に再プログラムされたブタドナーを作成する際に上記の修飾を実施し、ブタドナーのＭＨＣ表面特徴付けはレシピエントのトロホブラストのものを模倣し、異種移植からの免疫応答は著しく低減される。ヒト絨毛外性トロホブラスト細胞は、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇを発現するが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲは発現しない。したがって、本実施形態は、ヒトトロホブラストの固有のＭＨＣ表面特徴付けと部位特異的変異原性置換とを組み合わせて、天然ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子に対するオフターゲット効果を最小限に抑えながら、異種移植に関連する免疫応答を最小限に抑えるか、または除去する。
ヒト免疫応答系は、侵入生物に対する非常に複雑で効率的な防御系である。Ｔ細胞は、細胞応答に関与する主要なエフェクター細胞である。抗体が治療薬、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として開発されたように、Ｔ細胞の表面上の受容体は、それらに特異性を与えるが、治療薬を開発するためのプラットフォームとして独自の利点を有する。抗体は、血液及び細胞外空間における病原体の認識、または細胞表面上のタンパク質標的に限定されるが、ＴＣＲは、細胞表面上のＭＨＣ分子によって提示される抗原（細胞内タンパク質に由来する抗原を含む）を認識する。提示された抗原を認識して活性化するＴ細胞のサブタイプに応じて、ＴＣＲ及びＴＣＲを保有するＴ細胞は、様々な免疫応答の制御に関与する。例えば、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞の抗体分泌細胞への分化の誘導による体液性免疫応答の調節に関与する。加えて、活性化されたヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞による細胞媒介性免疫応答を開始する。したがって、ＴＣＲは、抗体によって通常見られない標的を特異的に認識し、それらを担持するＴ細胞を駆動させて、多種多様な免疫応答を開始する。
図２に示すように、Ｔ細胞は、細胞表面上に発現されたＴＣＲによって細胞表面上に提示された抗原を認識する。ＴＣＲは、ジスルフィド結合ヘテロ二量体であり、大部分は、α鎖及びβ鎖糖タンパク質からなる。Ｔ細胞は、組換えメカニズムを使用して、Ｂ細胞で動作する抗体多様性を生成するためのそれらのメカニズムと同様に、その受容体分子に多様性を生成する（Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７）。免疫グロブリン遺伝子と同様に、ＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞の発達中に再配列するセグメントから構成される。ＴＣＲポリペプチドは、可変領域、定常領域、膜貫通領域及び細胞質領域からなる。膜貫通領域はタンパク質を固定し、細胞内領域は受容体が占有されるときにシグナル伝達に関与するが、可変領域は抗原の特異的認識に関与し、定常領域は可変領域結合表面を支持する。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）及び結合（Ｊ）セグメントのみによってコードされる可変領域を含有し、β鎖は、さらなる多様性（Ｄ）セグメントを含有する。
ＴＣＲは、自己主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の関連において抗原提示細胞の表面上に提示されるペプチド抗原を認識する。ＴＣＲによって認識される２つの異なるタイプのＭＨＣ分子は、抗原提示、クラスＩ ＭＨＣ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子に関与する。成熟Ｔ細胞サブセットは、それらが発現する共受容体分子によって定義される。これらの共受容体は、ＭＨＣ－抗原複合体の認識及びＴ細胞の活性化においてＴＣＲと併せて作用する。成熟ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連で抗原を認識し、共受容体ＣＤ４を有することによって区別される。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ決定因子の関連で抗原を認識し、ＣＤ８共受容体を有することによって区別される。
ヒトでは、ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）の頭字語）と称され、染色体６ｐ２１．３に位置するＨＬＡ領域によってコードされる８，９。ＨＬＡセグメントは、３つの領域（クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、及びクラスＩ）（セントロメア側からテロメア側の順で記載）に分かれる。図１０を参照のこと。古典的なクラスＩ ＨＬＡ遺伝子及びクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子は、それぞれクラスＩ領域及びクラスＩＩ領域に含まれている一方で、クラスＩＩＩ遺伝子座は、免疫系に関与するタンパク質をコードする遺伝子を保有するが、構造的にはＭＨＣ分子と関連しない。古典的なＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの３種類である。こうした成熟ＨＬＡクラスＩ分子のα鎖のみが、それぞれＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子によってクラスＩ ＨＬＡ遺伝子座内にコードされる。図１１を参照されたい。対照的に、Ｂ２Ｍ遺伝子によってコードされるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）鎖は、１５番染色体上に位置する。古典的ＨＬＡクラスＩＩ分子もまた、３つの型（ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲ）を有するものであり、それぞれのα鎖及びβ鎖は両方共、一対の隣接遺伝子座によってコードされる。こうした古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子及びＨＬＡクラスＩＩ遺伝子に加えて、ヒトＭＨＣ遺伝子座は、広範囲にわたって並んだＨＬＡ偽遺伝子ならびに非古典的なＭＨＣＩ分子及びＭＨＣＩＩ分子をコードする遺伝子を含む。ＨＬＡ偽遺伝子は、遺伝子重複がＨＬＡ進化の主な原動力であることを示すものである一方で、非古典的なＭＨＣＩ分子及びＭＨＣＩＩ分子は、αβＴＣＲに抗原を提示する機能とは全く異なる限られた機能を免疫系内で果たすことが多い。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子がヒト集団において示す配列多様性は途方もないものである。例えば、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子だけも４，０００を超える対立遺伝子の存在が知られている。ＨＬＡ遺伝子の遺伝的多様性においては、異なる抗原の提示効率が異なる様々な対立遺伝子が存在し、この遺伝的多様性は、ヒトが曝露される広範な異なる病原体に対する集団レベルの抵抗性が向上するように進化が生じた結果であると考えられる。この遺伝的多様性は、レシピエントの免疫応答が移植後の生着及び生存の結果を左右する最も重要な因子である異種移植の中においては問題になるものでもある。
ヒトにおいて、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃと称される古典的なクラスＩ遺伝子は、細胞表面上で非共有ヘテロ二量体を形成する２つの鎖からなる。図１２に示すように、α鎖は、３つのドメイン（α１、α２、及びα３）を含む。α鎖遺伝子のエクソン１はリーダー配列をコードし、エクソン２及び３はα１及びα２ドメインをコードし、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通ドメインをコードし、エクソン６及び７は細胞質尾部をコードする。α鎖は、α１及びα２ドメイン（Ｉｇ様ドメインに類似する）、続いてα３ドメインを含むペプチド結合性切断を形成する。
ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は、非グリコシル化の１２ｋＤａのタンパク質であり、その機能の１つは、ＭＨＣクラスＩ α鎖を安定化することである。α鎖とは異なり、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は膜に及ばない。ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座は、１５番染色体上にあり、４つのエクソンと３つのイントロンの領域からなる。ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）結合タンパク質複合体は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、分化クラスター１（ＣＤ１）タンパク質、非古典的な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、及び周知のＭＨＣクラスＩ分子を含む様々な免疫系経路において重要な役割を担う。
クラスＩ ＭＨＣ分子は、腫瘍細胞を含むすべての有核細胞上に発現される。これらは、他の細胞のうち、Ｔ及びＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞及び好中球等に特異的に発現し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対して表面上にペプチド断片（典型的には８～１０アミノ酸長）を表示するように機能する。ＣＴＬは、独自の膜結合ＴＣＲによって認識されるＭＨＣ Ｉ結合ペプチドを保有する任意の細胞を死滅させることに特化している。細胞が、通常は存在しない細胞タンパク質に由来するペプチド（例えば、ウイルス、腫瘍、または他の非自己由来のもの）を表示する場合、そのようなペプチドは、ＣＴＬによって認識され、ＣＴＬは活性化され、ペプチドを表示する細胞を死滅させる。
ＭＨＣ遺伝子座は、ゲノム内で最も高い多型を示す。すべてのクラスＩ及びＩＩ ＭＨＣ遺伝子は、ペプチド断片を提示することができるが、各遺伝子は、異なる結合特性を有するタンパク質を発現し、多型及び対立遺伝子性バリアントを反映する。任意の所与の個体は、免疫応答の過程で、細胞表面上でＢ細胞及びＴ細胞に提示することができる独自の範囲のペプチド断片を有する。
前述の抗原に加えて、クラスＩ抗原は、非古典的クラスＩ抗原と呼ばれる他の抗原、特に抗原ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ及びＨＬＡ－Ｇを含み、この後者の抗原は、特に、ＨＬＡ－Ｃに加えて、正常なヒト胎盤の絨毛外性トロホブラストによって発現される。
図１３に示すように、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、細胞外ドメイン（α１、α２、β１、及びβ１の３つのドメインを含む）、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部を含む。α２及びβ２ドメインは、ペプチド結合性切断を形成し、α１及びβ１は膜貫通ドメインと相互作用する。
ＭＨＣ－Ｉタンパク質に関して、本開示は、不活性化するか、または必要に応じて、「見つけて置き換える」オルソロガスなＳＬＡタンパク質の機能を、最小限の免疫認識をもたらすＨＬＡ類似体とともに保持するかのいずれかである。そのような遺伝子修飾は、第１の態様に従って、本明細書で「選択的サイレンシング」（及びその文法的変形）と称され得る。いくつかの態様では、ＳＬＡ－１の発現をコードし、その発現に関与する遺伝子をサイレンシングすると、高い問題性のある多型のＨＬＡ－Ａ類似体が除去される。同様に、ＳＬＡ－２に関連する遺伝子の不活性化または完全な除去は、ミスマッチしたＨＬＡ－Ｂタンパク質によってもたらされる負荷を低減するであろう。これは、細胞表面界面において、ヒトレシピエントのＴ細胞に、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂ陰性細胞として現れるであろう。古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質の最後に関して、参照ＨＬＡ－Ｃ配列を使用してＳＬＡ－３をコードする遺伝子のＨＬＡ－Ｃ部位特異的変異誘発は、そのような差異を有する同種移植を模倣するであろう。ＨＬＡ－Ｃの「多型性が低い」性質を考えると、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂと比較して、これは、自然界に天然に普及しているＨＬＡ－Ｃのサブクラスに基づく参照置き換え配列によるＳＬＡ－３の置き換えと、多数の既知の及びそれらの未知のＭＨＣ－Ｉ依存性プロセスの機能性及び非中断をもたらす最小限であるが必要なレベルの発現を可能にするメカニズムを引き出すことと、によってさらに改善されるであろう。
ＭＨＣ－Ｉタンパク質に関して、本開示は、不活性化するか、または必要に応じて、「見つけて置き換える」オルソロガスなＳＬＡタンパク質の機能を、最小限の免疫認識をもたらすＨＬＡ類似体とともに保持するかのいずれかである。いくつかの態様では、ＳＬＡ－１の発現をコードし、その発現に関与する遺伝子をサイレンシングすると、高い問題性のある多型のＨＬＡ－Ａ類似体が除去される。同様に、ＳＬＡ－２に関連する遺伝子の不活性化または完全な除去は、ミスマッチしたＨＬＡ－Ｂタンパク質によってもたらされる負荷を低減するであろう。これは、細胞表面界面において、ヒトレシピエントのＴ細胞に、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂ陰性細胞として現れるであろう。古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質の最後に関して、参照ＨＬＡ－Ｃ配列を使用してＳＬＡ－３をコードする遺伝子のＨＬＡ－Ｃ部位特異的変異誘発は、そのような差異を有する同種移植を模倣するであろう。ＨＬＡ－Ｃの「多型性が低い」性質を考えると、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂと比較して、これは、自然界に天然に普及しているＨＬＡ－Ｃのサブクラスに基づく参照置き換え配列によるＳＬＡ－３の置き換えと、多数の既知の及びそれらの未知のＭＨＣ－Ｉ依存性プロセスの機能性及び非中断をもたらす最小限であるが必要なレベルの発現を可能にするメカニズムを引き出すことと、によってさらに改善されるであろう。
さらに、ＨＬＡ－Ｅ、Ｆ、及びＧを含むＩ－ｂカテゴリーに含まれる非古典的ＭＨＣタンパク質の発現は、胎児の生存及びトロホブラスト（複数可）の相乗的存在の両方にとって極めて重要である。幸いにも、これらは、「古典的な」ＭＨＣ－Ｉａの種よりも有意に多型性が低い。これらの発現がなければ、細胞溶解の上方制御の強化は、ＮＫ細胞の認識の直接的な結果であり、活性化が観察される。ＭＨＣ－Ｉａ成分について記載されているのと同一の方法で、ＨＬＡ類似体を有するオルソロガスなＳＬＡタンパク質を不活性化するか、または必要に応じて「発見して、置き換える（置き換えた）」ことができる。図１４は、本開示に含まれる特定の変化を示す。
ＨＬＡ－Ｇは、強力な免疫阻害分子及び免疫寛容性分子であり得る。ヒト胎児におけるＨＬＡ－Ｇ発現は、ヒト胎児が母体免疫応答を回避することを可能にし得る。刺激機能も同種異系のＨＬＡ－Ｇに対する応答も、現在のところ報告されていない。ＨＬＡ－Ｇは、非古典的ＨＬＡクラスＩ分子であり得る。それは、遺伝的多様性、発現、構造、及び機能によって、古典的なＭＨＣクラスＩ分子と異なることができる。ＨＬＡ－Ｇは、低い対立遺伝子性多型によって特徴付けられ得る。ＨＬＡ－Ｇの発現は、トロホブラスト細胞、成体胸腺髄質、及び幹細胞に限定され得る。ＨＬＡ－Ｇ遺伝子（ＨＬＡ－６．０遺伝子）の配列は、ＧＥＲＡＧＨＴＹ ｅｔ ａｌにより記載されており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，９１４５－９１４９）：それは、４，３９６塩基対を含み、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子のものと相同である内因性エクソン及び／またはイントロン構成を示す。より正確には、この遺伝子は、８つのエクソン及び非翻訳の３’ＵＴ末端を含み、それぞれの対応は、エクソン１：シグナル配列、エクソン２：α１ドメイン、エクソン３：α２ドメイン、エクソン４：α３ドメイン、エクソン５：膜貫通領域、エクソン６：細胞質ドメインＩ、エクソン７：細胞質ドメインＩＩ、エクソン８：細胞質ドメインＩＩＩ、及び３’非翻訳領域である（ＧＥＲＡＧＨＴＹ ｅｔ ａｌ．，上記、ＥＬＬＩＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０，１４４，７３１－７３５）。しかしながら、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子は、フレーム内翻訳終結コドンがエクソン６の第２のコドンに位置するという点で他のクラスＩ遺伝子とは異なり、その結果、このＨＬＡ－６．０遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞質領域は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃタンパク質の細胞質領域のものよりもかなり短い。
細胞傷害性及びサイトカイン分泌を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性免疫は、多数の自己及び同種異系細胞に対する生物学的耐性において主要な役割を果たす。標的細胞認識の共通のメカニズムは、細胞表面上の自己ＭＨＣクラスＩペプチド複合体の欠如または修飾であるようであり、これはウイルス感染細胞、腫瘍細胞及び主要組織適合性ＭＨＣ非適合性移植細胞の排除をもたらし得る。ＮＫ細胞上に発現するＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＫＩＲが最近発見され、クローニングされた。ＫＩＲは、多型ＭＨＣクラスＩ分子に特異的であり、リガンド結合時に負のシグナルを生成し、ほとんどのシステムにおいて、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性からの標的細胞保護をもたらす。ＮＫ細胞自己免疫、すなわち、正常な自己細胞の溶解を防止するために、個体の所与のＮＫ細胞はすべて、少なくとも、自己ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＧ対立遺伝子の少なくとも１つを認識するＫＩＲ上で発現すると考えられる。
本開示によれば、ブタドナーからヒトへの異種移植との関連では、各ヒトレシピエントは、その個人に特有の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（クラスＩ、クラスＩＩ、及び／またはクラスＩＩＩ）を有し、このＭＨＣは、ブタドナーのＭＨＣとは適合となる可能が非常に低い。したがって、ブタドナー移植片がレシピエントに導入されると、ブタドナーＭＨＣ分子自体が抗原として働き、レシピエント由来の免疫応答を誘発することで、移植拒絶反応を引き起こす。
本開示のこの態様（すなわち、厳密に選択したヒトＭＨＣ対立遺伝子を発現するようにＳＬＡ／ＭＨＣを再プログラムすること）によれば、異種移植を目的とするブタドナーの細胞、組織、及び臓器に適用されると、野生型ブタドナーから得られるか、あるいはこの再プログラムが行われておらず、その他の方法で遺伝的に操作されたブタドナー（例えば、トランスジェニックブタドナー、または非特異的な遺伝的修飾もしくは異なる遺伝的修飾が行われたブタドナー）に由来する細胞、組織、及び臓器と比較して拒絶反応が低減されるであろう。
以前の修飾が組み込まれている場合、母体－胎児共生で見られるような保護的で局所的な免疫応答を生成する追加の細胞外リガンドの挿入または活性化は、軽微な抗原の差異の結果として残り得る有害な細胞媒介性免疫学的機能を最小限に抑えるための追加のステップである。したがって、ＳＬＡ－ＭＩＣ２のためのブタリガンドは、ヒト対応物であるＭＩＣＡを用いてオルソロガス的に再プログラムされる。ヒト主要組織適合性複合体クラスＩ鎖関連遺伝子Ａ（ＭＩＣＡ）は、内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び多くの腫瘍上で発現される細胞表面糖タンパク質である。これは、ヒト第６番染色体の短腕上に位置し、７つのエクソンからなり、そのうちの５つは、ＭＩＣＡ分子の膜貫通領域をコードする。正常状態のＭＩＣＡタンパク質は、上皮組織において低レベルの発現を有するが、細胞ストレスの様々な刺激に応答して上方制御される。ＭＩＣＡは非古典的なＭＨＣクラスＩ遺伝子として分類され、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上で発現される活性化受容体ＮＫＧ２Ｄによって認識されるリガンドとして機能する（ａｔｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｓｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／Ｇｅｎｅｓ／ＭＩＣＡＩＤ４１３６４ｃｈ６ｐ２１．ｈｔｍｌ）。
加えて、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、及び他のものについてのブタリガンドは、過剰発現され、かつ／またはそれ以外の場合、ヒト対応物でオルソロガス的に再プログラムされる。ＰＤ－Ｌ１は、妊娠、同種移植片、及び自己免疫疾患における適応免疫系を抑制する主要な役割を有する膜貫通タンパク質である。それは、ヒトではＣＤ２７４遺伝子によってコードされ、９番染色体に位置する。ＰＤ－Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄系細胞に見られる受容体であるＰＤ－１に結合し、活性化または阻害を調節する。特に、ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上の受容体ＰＤ－１に結合することは、ＩＬ－２産生及びＴ細胞増殖の活性化を阻害する。ＣＴＬＡ４は、免疫応答を下方制御する免疫チェックポイントとしても機能するタンパク質受容体である。それは、ＣＴＬＡ４遺伝子によってコードされ、ヒトでは２番染色体に位置する。それは、構成的には制御性Ｔ細胞上で発現するが、活性化されたＴ細胞では上方制御される。例えば、そのプロモーターの再プログラムに基づいて、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１の遺伝子発現が増加する。遺伝子型とＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１発現との間には関係がある。例えば、Ｌｉｇｅｒｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＣＴＬＡ－４ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｅｘｏｎ １ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ｍａｙ；２（３）：１４５－５２では、ＣＴＬＡ４プロモーターの－３１８位（Ｔ（－３１８））にチミンを保有し、エクソン１の４９位にアデニンをホモ接合する個体は、細胞刺激後の細胞表面ＣＴＬＡ－４の発現及び非刺激細胞におけるＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡの発現の両方が有意に増加したことが示され、この文献は、あらゆる目的のために、参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。同様の上方制御は、ＰＤ－Ｌ１プロモーター再プログラムを使用してＰＤ－Ｌ１を過剰発現するために達成することができる。
さらに、図１４に示されるように、内皮タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）、トロンボモジュリン（ＴＢＭ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びその他についての抗凝固性ブタリガンドは、ヒト対応物を用いてオルソロガス的に再プログラムされる。内皮タンパク質Ｃ受容体は、ヒトの２０番染色体に位置するＰＲＯＣＲ遺伝子によってコードされる内皮細胞特異的な膜貫通糖タンパク質である。それは、抗凝固性セリンプロテアーゼであるタンパク質Ｃの活性化を促進し、活性化タンパク質Ｃ媒介性細胞保護シグナル伝達において重要な役割を果たす。トロンボモジュリンは、内皮細胞の表面に存在する一体型膜糖タンパク質である。それはＴＨＢＤ遺伝子によってコードされ、ヒトでは２０番染色体に位置する。抗凝固経路におけるタンパク質Ｃのトロンビン誘導活性化における補助因子として機能することに加えて、それは、Ｃ３ｂ不活性化を調節することにも機能する。組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）は、第Ｘａ因子を阻害することによって天然の抗凝固剤として機能する糖タンパク質である。それは、ヒトの第２番染色体に位置するＴＦＰＩ遺伝子によってコードされ、タンパク質構造は３つのタンデムに連結したＫｕｎｉｔｚドメインからなる。ヒトでは、ＴＦＰＩの２つの主要なアイソフォーム、ＴＦＰＩαとＴＦＰＩβが存在する。ＴＦＰＩαは、３つの阻害ドメイン（Ｋ１、Ｋ２、及びＫ３）ならびに正に荷電したＣ末端からなり、ＴＦＰＩβは、２つの阻害ドメイン（Ｋ１及びＫ２）ならびにＣ末端からなる。Ｋ１及びＫ２ドメインは、それぞれ第ＶＩＩ因子及び第Ｘａ因子に結合し、阻害することが知られているが、Ｋ３の阻害機能は未知である。ある特定の態様では、本開示は、救命したい臓器を長く生着させるために、移植手順後に移植レシピエントが外因性の免疫抑制剤（または長期の免疫抑制レジメン）を多くかつ有害に使用する必要のない低免疫原性及び／または免疫寛容性の細胞、組織、及び臓器を創出することに重点を置いている（基礎を置いている）。
図１４に提供される表は、ヒトトロホブラストの細胞外構成を模倣する免疫寛容性の異種移植ブタドナー細胞を作成するための様々な編集の要約を示す概念的設計を示す。図１４に示されるように、ＨＬＡ－Ａはトロホブラスト上で発現されないため、ＨＬＡ－Ａにオルソロガスなブタドナー遺伝子であるＳＬＡ－１は、トロホブラストを模倣するようにサイレンシングされる。図１４にさらに示されるように、ＨＬＡ－Ｇは、トロホブラストで発現され、ＮＫ細胞との相互作用を考慮すると、母体胎児免疫寛容性において重要な役割を有するため、ＨＬＡ－Ｇにオルソロガスなブタドナー遺伝子であるＳＬＡ－８は、「ヒト捕捉」参照配列との置き換えによってヒト化される。
したがって、複数の供給源動物を、多くの生物学的特性（限定されないが、ゲノム修飾及び／または他の遺伝的に操作された特性を含む）を持たせて利用することで、異種移植から生じるヒトの免疫原性及び／または免疫学的拒絶反応（例えば、急性拒絶反応、超急性拒絶反応、及び慢性拒絶反応）を低減できることが理解されよう。ある特定の態様では、本開示を使用することで、本開示の生物学的製品をヒト患者に移植することによって生じる血栓性微小血管症を低減または回避することができる。ある特定の態様では、本開示を使用することで、本開示の生物学的製品をヒト患者に移植することによって生じる糸球体症を低減または回避することができる。本明細書に示される供給源動物のリストは限定ではなく、本発明は、単独または組み合わせで免疫原性及び／または免疫学的拒絶反応の低減に役立つ１つ以上の修飾（遺伝的なもの、またはその他のもの）を有する任意の他の型の供給源動物を包含することがさらに理解されよう。
ブタドナー白血球抗原（ＳＬＡ）とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）との間のＭＨＣ差異を再プログラムするために、本開示は、これらの２つの種、例えば、機能に対応する多数の遺伝子との間の高度に保存されたＭＨＣ－遺伝子座を使用することを含む。ＭＨＣクラスＩａ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃは、ブタドナーにおける類似のパートナー（それぞれ、ＳＬＡ１、２、及び３）を有する。ＭＨＣクラスＩＩにおいては、本開示による免疫遺伝学的な再プログラムの間に利用されるべき多数のマッチも存在する。
図１５に例示されるように、ＭＨＣ遺伝子は、クラスＩ、クラスＩＩ、及びクラスＩＩＩの３つのクラスに分類され、これらのすべては、ヒト第６番染色体にコードされる。ＭＨＣ遺伝子は、ブタドナー及びヒトゲノムの中で最も多型な遺伝子であり、ＭＨＣ多型は、進化的利点を提供する上で重要であると推測され、配列の変化は、細胞傷害性Ｔ細胞に対する病原体のより良好な提示を可能にする、ペプチド結合の差異をもたらす。
既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣまたは個々のレシピエントの配列決定されたＨＬＡ／ＭＨＣ配列（複数可）をテンプレートとして利用することで、既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣ配列またはヒトレシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ配列と一致するように、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性を有するように、ブタドナー白血球抗原（ＳＬＡ）／ＭＨＣ配列を正確な置換で再プログラムすることができる。使用される既知のヒトレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣ配列が同定されるか、またはヒトレシピエントの遺伝子配列決定を行って、ＨＬＡ／ＭＨＣ配列が得られると、所望のＨＬＡ／ＭＨＣ配列に基づいてブタドナーの細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ配列に対して３つの再プログラムを行うことができる。例えば、標的を定めるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を、本開示のブタドナーにいくつか投与することで、ブタドナーの細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ配列がヒトレシピエントのテンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列によって再プログラムされる。
「ＭＨＣ Ｉ複合体」等という用語は、本明細書で使用される場合、ＭＨＣ Ｉ α鎖ポリペプチドとベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドとの間の複合体を含む。「ＭＨＣ Ｉポリペプチド」等という用語は、本明細書で使用される場合、ＭＨＣ Ｉ α鎖ポリペプチド単独を含む。典型的には、用語「ヒトＭＨＣ」及び「ＨＬＡ」は、互換的に使用され得る。
ドナーＳＬＡ／ＭＨＣを修飾してレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣと一致させる目的については、図１６及び図１７に示されているように、ヒト及びブタドナー組織適合遺伝子複合体のゲノム構成を比較してマッピングすることが行われている。例えば、かかるＳＬＡからＨＬＡへのマッピングは、Ｌｕｎｎｅｙ，Ｊ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｏｎｏｒ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｔｈｅ ＳＬＡ ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３：３６２－３７４（２００９）（“Ｌｕｎｎｅｙ”）に見出されることができ、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。さらに、図１２及び図１３に示すようなＨＬＡの遺伝子座及び様々なＨＬＡ遺伝子の概略分子構成を、図１７及び図１８に示すようなＳＬＡの遺伝子座及び様々なＳＬＡ遺伝子の概略分子構成と比較することにより、細胞外及び膜貫通ドメインにおけるエクソンの配置及び数が、ＨＬＡ ＭＨＣとＳＬＡ ＭＨＣとの間で共通であることが容易に識別される。したがって、当業者であれば、本開示を考慮して、Ｌｕｎｎｅｙらのマッピングを参照ツールとして使用して効果的かつ効率的にブタドナー細胞を遺伝的に再プログラムする。
ドナーブタのＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子は、置換テンプレートの作成における参照テンプレートとして使用される。本開示の実施において、ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子は、オンラインアーカイブまたはＥｎｓｅｍｂｌ等のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を介して取得され得る。図１９、図２０、図２１、及び図２２に示すように、ＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢ遺伝子の正確な位置、それぞれの遺伝子（内因性エクソン及び／またはイントロン）の長さ、ならびにＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢの正確なヌクレオチド配列をマッピングする。本開示の代替的な態様では、ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子を配列決定してもよい。本開示の代替的な態様では、ブタドナーの全ゲノムは配列決定され得る。一態様では、参照テンプレートとして使用することができるブタドナーの配列決定されたＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子には、限定されないが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱ、ＳＬＡ－ＤＱ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）が含まれる。別の態様では、塩基テンプレートとして使用することができるブタドナーの配列決定されたＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子には、限定されないが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱＡ、ＳＬＡ－ＤＱＢ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のエクソン領域が含まれる。いくつかの態様では、他のＳＬＡ、ならびに再プログラムされたＳＬＡ領域の内因性エクソン及び／またはイントロン領域は破壊されず、それによって、ヒトに移植されたときに免疫寛容性である細胞、組織、及び臓器を提供する最小限に破壊された再プログラムされたブタドナーゲノムを産生する。
本発明の一態様によれば、特定の一連の既知ヒトＨＬＡ分子を発現するように生物学的に操作されたゲノムを有するブタドナーが提供される。そのようなＨＬＡ配列は入手可能であり、例えば、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／にて利用可能）及びｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｉｍｇｔ．ｏｒｇにて利用可能）から利用可能である。図２３には、そのような遺伝子の命名法が示される。例えば、ＨＬＡ－Ａ１，Ｂ８，ＤＲ１７は、コーカサス人種の中で最も一般に見られるＨＬＡハプロタイプであり、その頻度は５％である。したがって、開示の方法は、本明細書で提供される本開示と組み合わせて既知のＭＨＣ／ＨＬＡ配列情報を使用して実施され得る。ＨＬＡ配列は、オンラインアーカイブまたはＥｎｓｅｍｂｌ（ｖｅｇａ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）などのデータベースを通じて入手可能である。図２４に示すように、ＨＬＡ－ＤＱＡ遺伝子の正確な位置、それぞれの遺伝子の長さ（エクソンならびに内因性エクソン及び／またはイントロン）、及びＨＬＡ－ＤＱＡの正確なヌクレオチド配列を得ることができる。
いくつかの態様では、レシピエントのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子ならびにＭＨＣ（クラスＩ、クラスＩＩ、及び／またはクラスＩＩＩ）が同定され、マッピングされる。ヒトレシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ配列を把握することは、当該技術分野で知られる任意の数の方法を用いることによって可能であることが理解されよう。例えば、ＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子は、通常、標的配列決定法（ロングリードシークエンシングまたはロングインサートショートリードシークエンシング）によって型が決定される。慣例的には、ＨＬＡ型は、２桁分解能（例えば、Ａ＊０１）で決定されており、この分解能は、血清学的抗原分類とほぼ同じである。より最近では、４桁分解能（例えば、Ａ＊０１：０１）でのＨＬＡの型決定に配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）法が使用されており、この分解能によれば、アミノ酸差異を区別可能である。現在のところ、ＨＬＡの型を決定するための標的ＤＮＡ配列決定は、他の従来法と比較して最も一般的なＨＬＡ型決定手法である。配列ベースの手法では、コード領域及び非コード領域の両方が直接的に決定されるため、それぞれ６桁分解能（例えば、Ａ＊０１：０１：０１）及び８桁分解能（例えば、Ａ＊０１：０１：０１：０１）でのＨＬＡ型決定が達成され得る。現存するＨＬＡ対立遺伝子を新たな対立遺伝子またはヌル対立遺伝子と区別する上では、臨床的観点から、最高分解能でＨＬＡの型を決定することが望ましい。かかる配列決定技術は、例えば、Ｅｌｓｎｅｒ ＨＡ，Ｂｌａｓｃｚｙｋ Ｒ：（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＨＬＡ ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．６４（６）：６８７－６９５、Ｅｒｌｉｃｈ ＲＬ，ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｏｃｉ．ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１２：４２－１０．１１８６／１４７１－２１６４－１２－４２、Ｓｚｏｌｅｋ Ａ、ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＯｐｔｉＴｙｐｅ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：３３１０－３３１６、Ｎａｒｉａｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＨＬＡ－ＶＢＳｅｑ：Ａｃｃｕｒａｔｅ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ａｔ ｆｕｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：Ｓ７、Ｄｉｌｔｈｅｙ ＡＴ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｉｇｈ－ａｃｃｕｒａｃｙ ＨＬＡ ｔｙｐｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｒａｐｈｓ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １２：ｅ１００５１５１、Ｘｉｅ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｓｈｏｒｔ－ｒｅａｄ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｘＨＬＡ １１４（３０）８０５９－８０６４に記載されており、これらの各々は参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
異種移植におけるＭＨＣクラスＩ発現の完全な破壊は、動物の生存能に有害な影響を有することが示されている。ある研究では、ブタ細胞上のＳＬＡクラスＩ発現は、ブタベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のエクソン２を標的とすることによって無効化された。産生された子ブタのゲノム配列決定は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における修飾を示し、これは、フレームシフト、未成熟終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらの１、２、及び／または３の連続した組み合わせをもたらし、いくつかの場合では、所望のサイレンシング（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得、最終的には機能的ノックアウトをもたらし得る。しかし、この研究の子ブタは、予期しない疾患プロセスのために、４週間以上生存せず、そのような破壊的遺伝子組換えが、動物の生存能に悪影響を及ぼし得ることが明らかになった。Ｓａｋｅ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｅｔａ－２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｂ２Ｍ）ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｐｉｇｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１９；２６：ｅ１２５２５。
一態様では、置換テンプレートは、ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣのヌクレオチドの部位特異的変異原性置換のために作成され、再プログラムは、天然ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣの特定のエクソン領域にいかなるフレームシフトまたはフレーム破壊ももたらさない非トランスジェニックの最小限に必要とされる改変を導入する。置換テンプレートのヌクレオチド配列（複数可）は、以下にさらに記載されるように、ａ）移植レシピエントからＤＮＡを含有する生体試料を入手することと、ｂ）移植レシピエントの試料中のＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子を配列決定することと、ｃ）種々の遺伝子座においてレシピエントのヌクレオチド配列をブタドナーのヌクレオチド配列と比較することと、ｄ）当該遺伝子座のうちの１つ以上の置換テンプレートを作成することと、によって特定される。
図２５Ａ及び図２５Ｂのスプレッドシートは、それぞれ３つの個々のレシピエントのＤＱＡ及びＤＱＢのエクソンのヒト捕捉参照配列を示す。上述のように、既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣまたは個々のレシピエントの配列決定されたＨＬＡ／ＭＨＣ配列（複数可）をテンプレートとして利用して、一致するようにブタドナー白血球抗原（ＳＬＡ）／ＭＨＣ配列を正確な置換で再プログラムすることができる。図２５Ｃに示すように、オンラインデータベースを介して取得された既知のヒトＨＬＡ－ＤＱＡと、個々のレシピエントの配列決定されたＨＬＡ－ＤＱＡを、ヌクレオチド配列ライブラリーで比較することができる。図２６Ｄは、オンラインデータベースを介して取得されたブタドナーのＳＬＡ－ＤＱＡと、既知の及び配列決定されたレシピエントのＨＬＡ－ＤＱＡのエクソン２領域の比較を示す。ＳＬＡ－ＤＱＡ及びＨＬＡ－ＤＱＡの両方のエクソン２領域は、２４９ヌクレオチドを含有する。図２５Ｄに示すように、ＳＬＡ－ＤＱＡ及びＨＬＡ－ＤＱＡのエクソン２領域の間のアラインメントされた２４９ヌクレオチドの１１％が完全に相違していることが観察され得る。したがって、本開示は、ヒト及びブタドナーＭＨＣ複合体の特定のエクソンにおける非保存ヌクレオチド配列の同定方法を開示する。さらに、既知または配列決定されたヒト捕捉参照テンプレートを使用することにより、部位特異的変異誘発を行うことができ、ここで、ＳＬＡ遺伝子と既知またはレシピエントのＨＬＡ遺伝子の特異的エクソン領域との間の特異的非保存ヌクレオチド配列は、フレームシフトを引き起こすことなく置き換えられる。ＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢ遺伝子の部位特異的変異誘発を図２６Ａ及び図２６Ｂに示し、ここで、レシピエント特異的ＨＬＡ－ＤＱＡ及びＨＬＡ－ＤＱＢのエクソン２領域のヌクレオチド配列を使用して、ヒト捕捉置換配列を作成する。したがって、ＭＨＣ遺伝子のエクソン領域に特異的な合成置換テンプレートの使用は、天然ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子におけるいかなるフレームシフトまたはフレーム破壊ももたらさない、非トランスジェニックな最小限に破壊されたゲノムをもたらす。
フレームシフトを引き起こす破壊的遺伝子組換えは、動物の生存能に悪影響を及ぼし得る。したがって、本発明は、ＭＨＣ遺伝子においてフレームシフトを引き起こすことなく、ＭＨＣタンパク質の発現を阻害する方法を開示する。図２５Ｅ及び図２５Ｆのスプレッドシートは、それぞれ３つの個々のレシピエントのＤＲ－Ａ及びＤＲＢのエクソンのヒト捕捉参照配列を示す。図２６Ｃ及び図２６Ｄに示すように、リーダーエクソン１の最初の３つのヌクレオチド配列を終止コドンに置き換えることにより、フレームシフトを引き起こすことなくＤＲ分子の発現を阻害することができる。具体的には、ＨＬＡ－ＤＲＡ及びＤＲＢについて、エクソン１の最初の３つの配列、ＡＴＧは、終止コドン、ＴＡＡで置き換えられる。したがって、合成置換テンプレートを使用することによって、本発明は、所望のＭＨＣ分子の発現を阻害する方法を提供し、ここで、ゲノムの非トランスジェニックで最小限の改変は、天然ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子においていかなるフレームシフトまたはフレーム破壊ももたらさない。
さらに、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の各々のヘテロ二量体構造を含むベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質は、種特異的である。ブタゲノムアセンブリＳＳＣ１０．２に基づいて、Ｂ２Ｍタンパク質全体をコードする、約４５．５ｋｂのセグメント重複が、ブタ１番染色体において同定され、ここで、ブタにおける２つのコピー間の完全に同一のコード配列で同定されたＢ２Ｍ遺伝子の機能的重複が同定された。１０種の哺乳動物種におけるＢ２Ｍ重複の系統解析により、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及びクジラのようなクジラ偶蹄目ではＢ２Ｍ重複の存在が確認されたが、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、及びヒトのような非クジラ偶蹄目の種ではそうではなかった。重複ブロックの端部における長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）の密度（３９～６６％）は、ブタゲノムの平均（２０．１２％）より２～３倍高いことが見出され、重複事象におけるその役割が示唆された。ブタにおけるＢ２Ｍ ｍＲＮＡ発現レベルは、それぞれ、ヒト及びマウスの１２．７１倍及び７．５７倍（２－ΔΔＣｔ値）であった。クジラ偶蹄目のみのゲノム中に部分的に残存する重複Ｂ２Ｍ配列の同定は、事象が系統特異的であったことを示す。Ｂ２Ｍ重複は、ブタにおける比較的多数のＭＨＣクラスＩ重鎖遺伝子によってコードされるタンパク質と複合体を形成するＭＨＣクラスＩ軽鎖タンパク質Ｂ２Ｍの利用可能性を増加させることによって、ブタの免疫系に有益であり得る。図２７に示すように、ＭＨＣクラスＩ分子に対するＢ２Ｍ分子を観察することができる。さらに、上記及び図２７に示されるように、ブタドナーは、Ｂ２Ｍ遺伝子の重複を有し、ヒトは、１つ有する。したがって、本開示の一実施形態では、ブタドナーＢ２Ｍ遺伝子の第１のコピーは、以前に開示されたように、部位特異的変異誘発を通じて再プログラムされる。図２８に示すように、ブタドナーＢ２Ｍのエクソン２のアミノ酸配列は、ヒトのアミノ酸配列と比較され、非保存領域が特定される。加えて、ブタドナーＢ２Ｍ遺伝子の第２のコピーの発現は、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらの１、２、及び／または３の連続した組み合わせをもたらし、いくつかの場合では、以前に開示されるように、所望のサイレンシング（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得る。したがって、本開示の一実施形態では、遺伝子組換えを含み、ブタドナーＢ２Ｍ遺伝子の第１のコピーは、部位特異的変異誘発を通じて再プログラムされ、第２の重複したＢ２Ｍ遺伝子は発現されず、再プログラムは、Ｂ２Ｍ遺伝子のフレームシフトをもたらさない。
パイロットブタ細胞株の選択及び特徴付け
一次マクロファージ及び他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、免疫応答の研究に有用であるが、一次細胞の長期的な使用は、細胞の短い寿命によって制限される。加えて、一次細胞は、細胞が老化に達する前に一度だけ遺伝的に操作され、評価されることができる。ブタモデルでは、研究者らは、これらのタイプの研究にブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）を頻繁に使用してきた。マクロファージまたは代表的なＡＰＣの所望の特徴（ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子ならびにＣＤ８０／８６の発現）を有する不死化細胞株は、ゲノムの複数の修飾を実施し、同じ遺伝的背景を使用して免疫反応性への影響に対処するのに理想的であろう。生存不死化ブタ細胞株を生成する能力は、異種移植における免疫応答の研究に関連しない線維芽細胞及び上皮細胞株に限定されてきた。
不死化ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）株は、ブタのＬａｎｄｒａｃｅ株［Ｗｅｉｎｇａｒｔｌ ２００２］から開発され、ＡＴＣＣ（登録商標）［３Ｄ４／２１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２８４３（商標）］を通じて市販されている。別のそのような細胞株は、３Ｄ４／２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８４５（商標））である。細胞株は、ある程度の割合の培地の条件に依存する非特異的エステラーゼ及び食作用を示した。細胞は、血清非含有条件下で、アンカー依存性として、またはコロニー内で成長させることができる。骨髄／単球マーカー（例えば、ＣＤ１４）を検出した。不死化細胞株の所望の特徴は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩであった。ＭＨＣクラスＩは、すべての細胞上で広く発現することが示されたが、ＭＨＣクラスＩＩ、ＤＲ、及びＤＱにおいて、３Ｄ４／２１細胞の発現は、最初は低く、１８％及び４％であると報告された。ＰＡＥＣは活性化され、ＤＲ発現はＩＦＮ－γへの曝露によって上方制御され得ることが示されている。３Ｄ４／２１細胞をＩＦＮ－γに曝露し、ＩＦＮ－γへの曝露の２４時間後に、クラスＩＩ発現は、ＤＲ：２９．６８％～４２．２７％に、及びＤＱ：２．２８％～５７．３６％に、増大した。加えて、ＣＤ８０／８６が細胞表面上で発現され、これらの糖タンパク質は、Ｔ細胞活性化及び増殖の第２のシグナルに必須である。ＰＡＭ細胞、３４Ｄ／２１は、ＭＨＣに関連する遺伝子の遺伝子変化が不死化細胞株を使用して記録されることができるということと、表現型にもたらされる変化がフローサイトメトリーを使用して評価されることができ、目的の糖タンパク質の発現または発現の欠如、細胞免疫応答、混合リンパ球応答（ＭＬＲ）に対処することができるという、ブタＡＰＣの所望の特徴を有する。
細胞性免疫応答を試験するために、一方向ＭＬＲが設定され、そこでは、１つの細胞セットが刺激細胞として識別され、これらはドナー細胞または非修飾もしくは修飾ＰＡＭ細胞であり、もう１つの細胞セットはレスポンダー細胞であり、これらはレシピエントからの細胞であり（これらは、ＭＨＣ分子の同様の発現を共有するレシピエントからのものであり得る）、修飾ＰＡＭ細胞である。刺激細胞を薬剤で処理して、細胞の増殖を防止し、これは、ＤＮＡを共有結合的に架橋し、ＤＮＡ合成及び細胞増殖を阻害する、放射線またはマイトマイシンＣとのインキュベーションのいずれかであり得る。したがって、刺激細胞は、培養物中で増殖しないが、レスポンダー細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩでの相互作用に応答して増殖し、この増殖は、ＭＬＲで測定される。刺激因子細胞及びレスポンダー細胞の両方を含む細胞培養物を調製し、５～７日間インキュベートし、増殖／活性化を測定する。増殖は、５日または７日の終わりに、増殖時にＤＮＡに組み込まれる放射性チミジン［３ＨＴｄｒ］またはＢｒｄＵ［チミジンの類似体］の量によって測定することができる。
ＭＬＲの組み合わせ。レスポンダー細胞は、ＰＢＭＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＴ細胞の他の亜集団のいずれかであり得る。ＰＢＭＣは、レシピエント内に存在するすべての免疫細胞を表し、測定された応答は、刺激細胞［未修飾または修飾ＰＡＭ細胞］への免疫応答をマウントするレスポンダーの能力を反映する。測定された増殖は、それぞれＭＨＣクラスＩＩ及びＩと相互作用するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方からなる。ＣＤ４＋Ｔ細胞のみを非修飾または修飾ＰＡＭ細胞に対して使用することは、ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質、ＤＲ及びＤＱに対する応答を測定することである。ＤＱに特異的な応答を観察するには、細胞応答が、ヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されるブタ抗原の結果とならないように、ＡＰＣが培養物に存在しないようにされる。並行して、レスポンダーＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して、ＭＨＣクラスＩ糖タンパク質、ＳＬＡ１及び２に対する免疫応答を評価する。このタイプの分析は、ＰＢＭＣに見られるように、レスポンダーＡＰＣからの免疫応答への寄与を除去する。比較データは、これらのそれぞれの糖タンパク質の遺伝的に定義されたレスポンダーの免疫応答への寄与を実証し、ＰＡＭ細胞に対して行われた遺伝子組換えを反映する。
フローサイトメトリー、遺伝的に操作されたＰＡＭ細胞の表現型分析。遺伝的に操作された細胞、例えば、遺伝的に操作された動物由来の細胞またはエクスビボで作成された細胞の細胞表現型を分析して、修飾された遺伝子によってコードされる糖タンパク質の発現の変化を測定する。細胞は、目的の糖タンパク質に結合する蛍光標識を有する抗体とともにインキュベートされ、標識された細胞は、フローサイトメトリーを使用して分析される。この分析は、ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩ（ＤＲ及びＤＱ）ならびにＣＤ８０／８６の発現を識別するために、非修飾ＰＡＭ細胞に対して実施された。修飾ＰＡＭ細胞の変化は、このデータベースに参照される。ＰＡＭ細胞内の遺伝子が、ＨＬＡ Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧに関連するレシピエント特異的配列で修飾されるため、フローサイトメトリーを使用して、ＳＬＡ３、６、７、及び８についての遺伝子によってコードされる糖タンパク質の発現を特徴付けることもできる。
加えて、このタイプの分析は、ノックアウトされる遺伝子によってコードされる糖タンパク質が発現されないことを確証するためにも使用される。この技術は、混合された表現型を有する細胞のプールから遺伝的に操作された細胞を選別するためにも使用することができる。
本開示の生物学的製品から得られる細胞を抗ＨＬＡ抗体が認識するかどうかを決定するためには、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイが実施され得る。事前に特徴付けられた抗ＨＬＡを含む特異的ヒト血清（または対照血清）を添加することによって調製されたアッセイプレートが使用され得る。ＩＦＮ－γで処理されたドナー細胞が再浮遊され、アッセイプレートに添加され、補体の供給源（例えば、ウサギ血清）とともにインキュベートされる。室温でのインキュベートを少なくとも１時間行った後、アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド溶液が添加される。蛍光顕微鏡で視覚化された死細胞及び生存細胞の数を数え、抗ＨＬＡ抗体の非存在下で得られる自発性溶解値を差し引き、尺度を用いてスコア付けすることによって細胞傷害性パーセントが決定される。
ＮＫ細胞の反応性、細胞傷害性を低下させるための調節。単独でまたは組み合わせて、ＮＫ細胞による標的細胞の活性化、認識、及び除去の潜在的なメカニズムは、それらの溶解性顆粒（パーフォリン、グランザイム、及び細胞溶解素）の含有量の放出を誘導する。一例として、ＮＫ細胞は、直接的なＮＫ細胞傷害性に繋がる阻害性ＮＫ細胞受容体によって、標的細胞上の自己主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の欠如を認識する。これは異種移植の場合である。ＮＫ細胞は、阻害性ＮＫ細胞阻害性キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＫＩＲ２ＤＬ２／２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、及びＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ Ｃによって調節される。ＮＫ細胞阻害性受容体、免疫グロブリン様転写産物２（ＩＬＴ２）は、ＨＬＡ－Ｅを認識するＭＨＣクラスＩ及びＣＤ９４－ＮＫＧ２Ａと相互作用する。ＨＬＡ Ｆ及びＧは、トロホブラスト上で同様の役割を有する。非修飾ＰＡＭ細胞に対するレシピエントＮＫ細胞の細胞溶解活性は、ヒトＮＫ細胞を非修飾ＰＡＭ細胞の接着単層に添加し、４時間培養することによって、インビトロで測定することができる。細胞溶解は、放射性Ｃｒ５１またはフローサイトメトリーによって測定される発色団の放出によって測定される。それぞれ、ＨＬＡ Ｃ、ＨＬＡ Ｅ、ＨＬＡ Ｇ、またはＨＬＡ Ｆをミラーリングするように修飾されたＳＬＡ３、６、７、または８を有するＰＡＭ細胞を、この細胞傷害性アッセイを使用して評価することができる。
細胞のノックインについては、ゲノム物質を挿入することで所望の配列が細胞ゲノムにノックインされ、この挿入は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して行われる。クラスＩＩ分子の発現を最適化するために、細胞がブタインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）中で７２時間インキュベートされ、このＩＦＮ－γによって発現が刺激される。次に、標的特異的抗体を使用してフローサイトメトリーによって発現が測定される。フローサイトメトリーでは、抗ＨＬＡ－Ｃ抗体、抗ＨＬＡ－Ｅ抗体、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体、もしくは他の抗ＨＬＡ抗体、またはパン抗ＨＬＡクラスＩ抗体もしくはパン抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体が使用され得る。本開示によれば、ノックイン後に細胞表面ＨＬＡ発現が確認される。
フローサイトメトリーによって、ＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－γ＋ＬＰＳによる刺激が、ＡＴＣＣ（登録商標）から購入したブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）（３Ｄ４／２１細胞カタログ番号ＣＲＬ－２８４３（商標））の表現型に及ぼす影響を特定する研究を実施した。
ＰＡＭ細胞をＲＰＭＩ－１６４０／１０％ ＦＢＳ中で解凍し、３つの異なる培養プレート中で２日間培養した。３日目に、マクロファージ活性化培養培地について、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（プレート１）及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ＋１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（プレート２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０／２０％のＦＢＳ培地で置き換えた。ＲＰＭＩ－１６４０／２０％ ＦＢＳ中の未処理細胞を対照として使用した（プレート３）。２４時間インキュベーション後、ＴｒｙｐＬＥ処理を使用して接着細胞をプレートから切り離した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ ｐＨ＝７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＳＡ）中に再懸濁した。細胞数及び生存率を、トリパンブルー排除法によって決定した。合計１×１０５個の細胞を、マウス抗ブタＳＬＡクラスＩ、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＲ、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＱ抗体で３０分間、及びＡＰＣコンジュゲートＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）－ｍｕｌｇ融合タンパク質（ブタＣＤ８０／ＣＤ８６に結合する）で４５分間、４℃で染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗体染色細胞を、抗マウスＡＰＣコンジュゲートポリクローナルＩｇＧ二次抗体を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。続いて４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を使用して細胞を２回洗浄した。すべての細胞を、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。試料をＮｏｖａｃｙｔｅフローサイトメトリーで取得し、データをＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓを使用して解析した。
分析手順は、ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓフローサイトメトリー分析ソフトウェアに基づく。任意の同等のソフトウェアをデータ分析に使用することができる。使用されるソフトウェアに応じて、分析プレゼンテーションは若干異なる可能性がある。ゲートの名前は異なる場合があり、％の値はわずかに異なっている可能性がある。
図２９に示すように、未処理のＰＡＭ細胞は、それぞれ９９．９８％、２９．６８％、及び２．２８％のＳＬＡクラスＩ、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＲ、及びＤＱ分子発現をもたらす。これらの細胞は、４．８１％のＣＤ８０／８６＋であった。ＩＦＮ－γの存在下で２４時間細胞を培養したところ、すべてのＳＬＡ分子発現が増加した（９９．９９％ ＳＬＡクラスＩ＋蛍光強度中央値の増加、ＤＲ＋４２．２７％、ＤＱ＋５７．３６％）及びＣＤ８０／８６レベルが増加した（４７．３８％）。ＬＰＳを有するＩＦＮ－γ含有細胞は、ＩＦＮ－γのみで処理した細胞と比較して、類似レベルのＳＬＡ分子及びＣＤ８０／８６発現をもたらした。
ＰＡＭ細胞をブタＩＦＮ－γで２４時間処理し、共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７－１）及びＣＤ８６（Ｂ７－２）に対して高い親和性を有する一次ｍＡｂ及びフルオレセインコンジュゲート二次抗体及びＡＰＣコンジュゲートＣＤ１５２で染色した。ＩＦＮ－γで処理すると、細胞は、非刺激ＰＡＭ細胞と比較してＳＬＡ及びＣＤ８０／８６共刺激分子発現を増加させた。非刺激細胞は、９９．９８％のＳＬＡクラスＩ＋、２９．６８％のＤＲ＋２．２８ＤＱ＋及び４．８１％のＣＤ８０／８６＋であったが、ＩＦＮ－γ刺激細胞は、９９．９９％のＳＬＡクラスＩ＋、４２．２７％のＤＲ＋、５７．３６％のＤＱ＋、４７．３８％のＣＤ８０／８６＋であった。ＬＰＳを有するＩＦＮ－γ含有細胞は、ＩＦＮ－γのみで処理した細胞と比較して、類似レベルのＳＬＡ分子及びＣＤ８０／８６発現をもたらした。
基底状態において、マクロファージは、低レベルのＳＬＡクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６共刺激分子を発現する。２４時間のＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－γ－ＬＰＳ処置は、ＳＬＡクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６共刺激分子ならびにＳＬＡクラスＩ分子の発現を誘導する。延長したインキュベーションは、恐らくこれらの分子の発現をさらに増加させるであろう。
さらに、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋陽性Ｔ細胞をブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞と共培養したときの、それらの免疫増殖応答性を評価する研究を行った。ヒトドナーＰＢＭＣまたはそれらのＣＤ４＋Ｔ細胞を、未処理、ＩＦＮ－ｙ活性化及びＫＬＨ負荷ＰＡＭ細胞と７日間共培養した。図３０Ａ及び図３０Ｂに示すように、ドナー＃１１、＃５０、及び＃５７から単離した細胞をそれぞれ陽性及び陰性対照として使用して、一元同種及び自己ＭＬＲ実験を行った。バックグラウンド対照を、マイトマイシンＣ（Ｘ）処理及び未処理のＰＡＭ細胞、ならびに各ヒトドナー細胞について行った。増殖応答は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ＥＬＩＳＡアッセイを利用して決定される。６日目、ＢｒｄＵ追加が完了した。７日目に、サイトカイン（ＩＦＮ－ｙ及びＩＬ－２）分析のために培地を収集し、増殖応答を決定した。細胞を、共培養の７日目に、２００倍の倍率でオリンパスＣＫ４０顕微鏡下で観察した。
図３１に示されるように、ＩＦＮ－γの存在下でのＰＡＭ細胞の７２時間の培養は、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＱ分子発現を２．５５％から９５．８２％に増加させた。ＫＬＨ負荷ＰＡＭ細胞は、未処理細胞と同様のレベルのＳＬＡクラスＩＩ ＤＱ分子の発現をもたらした。すべての同種異系対照は、ベースライン値に対して陽性の増殖応答を有し、マイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣ及びＰＡＭ細胞は、ベースライン値と比較して減少した増殖応答を有した。図３２Ａ及び図３２Ｂに示すように、ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ４＋増殖応答は、ＰＡＭ細胞による異種応答よりも高い同種異系応答をもたらした。３つの異なるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答は、同様の異種応答を示し、ＰＡＭ細胞ＳＩ（刺激指数）値は、１５～１８．０８であった。増殖応答は、ＰＢＭＣドナー＃５７からの異種培養で最も高かった（ＰＡＭを含むＳＩ、ＰＡＭ－ＩＦＮ－ガンマ、ＫＬＨ＝３．１２、２．７５、及び３．７９）。
パイロットブタ細胞の遺伝的再プログラム
遺伝的修飾は、既知のゲノム編集手法を利用して行うことができ、こうした手法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性遺伝子編集、及び規則的な間隔でクラスター化した反復回文配列Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９）などである。こうしたプログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を標的位置に生成させることが可能であり、このＤＳＢによって細胞の修復機構の上方制御が促進され、これによって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のエラープローンプロセスまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）のいずれかが生じ、これらのうち、ＨＤＲを外因性のドナーＤＮＡテンプレートの組み込みに使用する。ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９は、遺伝物質の正確な修飾を行うためにも使用され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９を介する遺伝的修飾は、Ｋｅｌｔｏｎ，Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，“Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ＭＨＣ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ ｏｒ ａｎｙ ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｃａｓ９－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ，”Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７：４５７７５（２０１７）（「Ｋｅｌｔｏｎ」）に記載の様式で実施することができ、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本開示は、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９を使用して、対立遺伝子全体（例えば、ＭＨＣ、ＨＬＡ、ＳＬＡなど）の迅速かつ無痕跡の交換を媒介して再プログラムを行うことを含む。
本開示によれば、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９を使用して、ブタドナー細胞中の特定の天然遺伝子座に位置するＭＨＣ対立遺伝子全体の迅速かつ無痕跡の交換を媒介する。２つのｇＲＮＡを用いてＣａｓ９によるマルチプレックス標的化を行うことで、ＭＨＣ対立遺伝子の隣に一本鎖切断または二本鎖切断が導入され、テンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列（一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖ＤＮＡテンプレートとして提供される）での置き換えが可能になる。
いくつかの態様では、ドナー動物のＭＨＣの多型タンパク質モチーフの発現は、当該技術分野で既知のノックアウト方法によってさらに修飾することができる。例えば、１つ以上の遺伝子をノックアウトすることは、非ヒト動物ドナーのゲノムから１つ以上の遺伝子を欠失させることを含み得る。ノックアウトすることは、非ヒト動物ドナーから遺伝子配列の全部または一部を除去することも含み得る。ノックアウトすることは、非ヒト動物ドナーのゲノム中の遺伝子のすべてまたは一部を１つ以上のヌクレオチドで置き換えることを含むことができることも企図される。１つ以上の遺伝子をノックアウトすることはまた、１つ以上の遺伝子における配列を置換し、それによって１つ以上の遺伝子の発現を妨害することを含むことができる。１つ以上の遺伝子をノックアウトすることはまた、天然ブタドナーのＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子におけるフレームシフトまたはフレーム破壊を伴うことなく、１つ以上の遺伝子における配列を置換し、それによって、１つ以上の遺伝子の発現を妨害することを含むことができる。例えば、配列を置き換えることは、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらの１、２、及び／または３の連続した組み合わせ（「トリプル」終止コドン）を導入することができ、いくつかの場合では、これは非機能的な転写物またはタンパク質をもたらし得る、所望のサイレンシング（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得る。例えば、終止コドンが１つ以上の遺伝子内に導入される場合、得られる転写及び／またはタンパク質は、サイレンシングされ、非機能性にすることができる。
別の態様では、本発明は、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらの１、２、及び／または３の連続した組み合わせを導入し、いくつかの場合では、レシピエントによる細胞媒介性免疫応答を回避するために、野生型ブタドナーのＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及び／またはＳＬＡ－ＤＲの領域で、所望のサイレンシング（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得、エピトープの機能的発現を欠く細胞を作成することを含む。例えば、本発明は、終止コドンＴＡＡを利用するが、終止コドン（複数可）（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらの１、２、及び／または３つの連続した組み合わせによって達成されてもよく、いくつかの場合では、所望のサイレンシング（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得る。
一態様では、本発明は、上記のように、野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の第１及び／または第２の同一の重複遺伝子の領域における終止コドン（複数可）の挿入または作成（ヌクレオチド置き換えによる）を利用して、ブタにおけるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ｍＲＮＡ発現レベルを低減する。ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）が優位な免疫原、具体的には非Ｇａｌ異種抗原であることが理解されるであろう。
一態様では、レシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子が配列決定され、レシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子に基づいてテンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列が調製される。別の態様では、本開示のブタドナーを遺伝的に再プログラムするために、世界保健機関（ＷＨＯ）データベースから得られる既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子型が使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９プラスミドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製され、レシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ配列が、テンプレートとしてプラスミドにクローニングされる。ブタドナー細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子座でのＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術切断部位が同定され、切断部位を標的とするｇＲＮＡ配列が１つ以上のＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９プラスミドにクローニングされる。次に、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９プラスミドがブタドナー細胞に投与され、ブタドナー細胞のＭＨＣ遺伝子座においてＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９切断が行われる。
既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣ配列またはレシピエントの配列決定されたＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子と一致する１つ以上のテンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列を用いてブタドナー細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子座が正確に置き換えられる。ブタドナー細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ配列の再プログラムが成功しているかどうかを決定するために、ＳＬＡ／ＭＨＣ再プログラムステップの実施後にブタドナーの細胞が配列決定される。ＨＬＡ／ＭＨＣ配列が再プログラムされたブタドナーから得られる１つ以上の細胞、組織、及び／または臓器がヒトレシピエントに移植される。
ドナーＳＬＡ／ＭＨＣをレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣと一致するように修飾すると、既知のヒト遺伝子型または特定のヒトレシピエントのＭＨＣ分子と同一または実質的に同一の特定のＭＨＣ分子が新しいブタドナー細胞にて発現するようになる。一態様では、本開示は、ブタドナーのゲノムの特定ＳＬＡ領域の特定部分のみに限って修飾を施すことで、ブタドナーの効果的な免疫プロファイルを保つ一方で、免疫抑制剤の使用が低減または回避され得るようにヒトレシピエントに移植されたときに生物学的製品は免疫寛容性である。本開示の態様とは対照的に、先行技術分野の異種移植研究では、免疫抑制剤を使用して拒絶反応に抵抗する必要があった。
一態様では、ブタドナーゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＤＲ、及びブタドナーＢ２Ｍの２つのコピーのうちの１つに対応するブタドナー遺伝子の破壊し、サイレンシングし、非機能的発現を引き起こすように再プログラムされ（第１の態様）、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＱ－Ａ、及びＨＬＡ－ＤＱ－Ｂの置換を介して再プログラムされるように再プログラムされる（第３の態様）。さらに、第２の態様によれば、ブタドナーゲノムは、ブタドナーＢ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ２の他のコピーをヒト化するように再プログラムされる。
ある特定の態様では、再プログラムされたブタドナーゲノムではＨＬＡ－Ｃ発現が低減される。ヒトの免疫系にとって不可視となるようにブタドナー細胞を再プログラムすることによって、再プログラムが未実施であればブタドナー細胞から発現するブタドナーＭＨＣ分子に基づいて再プログラム未実施時には生じたであろう免疫応答が、この再プログラムによって最少化または除去されさえする。
ブタドナー細胞において細胞マーカーの様々な組み合わせを創出及び試験することで、様々な使用を目的とするヒト患者の体によって許容させるための生物学的に再プログラムされたブタドナー細胞が調製される。こうした試験については、ＡＴＣＣ（登録商標）（３Ｄ４／２１）から利用可能なブタ大動脈内皮細胞、線維芽細胞、または形質転換ブタマクロファージ細胞株が使用される。
標的遺伝子に対するガイドＲＮＡを設計及び合成することによって、ノックアウトのみを行った細胞プール及びノックアウト＋ノックインを行った細胞プールが生成される。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）という２つの要素から構成される。これらの要素は、連結されてシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称される連続分子を形成するか、またはアニーリングして、トランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、ツーピースガイドＲＮＡを形成し得る。
ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術要素（ｇＲＮＡ及びＣａｓ９）は、ＤＮＡ形式、ＲＮＡ形式、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体形式で細胞に送達され得る。ＤＮＡ形式は、ｇＲＮＡ配列及びＣａｓ９配列をプラスミドにクローニングすることを伴い、その後、このプラスミドが細胞に導入される。ｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ９の永続的な発現が望まれる場合、レンチウイルスを使用して宿主細胞のゲノムにＤＮＡが挿入され得る。ガイドＲＮＡは、酵素的（インビトロ転写を介して）または合成的に生成され得る。合成ＲＮＡは、典型的には、ＩＶＴ由来のＲＮＡよりも純度が高く、化学的に修飾して分解抵抗性にすることができる。Ｃａｓ９もＲＮＡとして送達され得る。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）形式は、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質からなる。ＲＮＰは、事前に一緒に複合体化され、その後に細胞に導入される。この形式は、使用が容易であり、多くの細胞型において高度に有効であることが示されている。
ガイドＲＮＡの設計及び生成後、いくつかの可能なトランスフェクション方法（リポフェクション、電気穿孔、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、またはマイクロインジェクションなど）のうちの１つを介して、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術要素が細胞に導入される。細胞培養物へのガイドＲＮＡ及びＣａｓ９の導入後、これらのガイドＲＮＡ及びＣａｓ９によって細胞のいくつかの内部の標的部位にＤＳＢが生成される。次に、この切断がＮＨＥＪ経路によって修復され、その際、当該プロセス中にヌクレオチドが挿入または欠失（インデル）される可能性がある。ＮＨＥＪによる各染色体上の標的部位の修復は異なり得るため、各細胞は、異なるインデルセットまたはインデル組み合わせ及び非編集配列を有し得る。
細胞のノックインについては、ゲノム物質を挿入することで所望の配列が細胞ゲノムにノックインされ、この挿入は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して行われる。
本明細書で提供される供給源動物のゲノムに対する破壊及び修飾は、いくつかの方法によって実施できることがさらに理解されよう。こうした方法には、限定されないが、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（「ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術」）を使用するものが含まれ、この方法を利用すると特定の目的に合うゲノムを有する動物を創出することができる。例えば、Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｉｇｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｏｒ ａｎｙ ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｃａｓ－９，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７：１３０３－１３０７（２２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７）を参照されたい。そのようなゲノム修飾には、限定されないが、本明細書に開示の任意の遺伝的修飾、及び／またはそのような供給源動物から得られる製品のバイオバーデン及び免疫原性を低減して免疫学的拒絶反応が最少化するように設計された任意の他の目的適合型ゲノム修飾が含まれ得る。
ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術関連タンパク質（Ｃａｓ）は、元々は微生物適応免疫系として知られており、最近では哺乳類遺伝子編集に適用されている。ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ系は、外来遺伝要素の侵入をＤＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉を介して防ぐための細菌及び古細菌の適応免疫機構を基礎としている。哺乳類コドン最適化を経て、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓは、正確なＤＮＡ／ＲＮＡ標的化に適用されており、哺乳類細胞及び胚に高度に有効である。最も一般に使用され、集中的に特徴付けられたゲノム編集用のＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ系は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩＩ型のＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術系であり、この系では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び短いガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を組み合わせて使用して切断対象の特定のＤＮＡ配列が標的とされる。ＰＡＭ配列（例えば、ＮＧＧ）のすぐ５’側に位置する標的ＤＮＡに相補的な２０ヌクレオチドのｇＲＮＡがＣａｓ９を標的ＤＮＡに導き、二本鎖ＤＮＡの切断を媒介することでＤＳＢが形成される。したがって、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９を使用すれば、任意のＮ２０－ＮＧＧ部位における遺伝子標的化を達成することができる。
したがって、本発明にも包含されるのは、ゲノムがヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩポリペプチド、及び／またはベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーであり、ポリペプチド（複数可）は、本明細書に記載のアミノ酸配列（複数可）の保存的アミノ酸置換を含む。
当業者は、本明細書に記載のヒトまたはヒト化ＭＨＣ Ｉポリペプチド、ＭＨＣ ＩＩポリペプチド、及び／またはベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする核酸残基に加えて、遺伝暗号の縮退に起因して、他の核酸が本発明のポリペプチド（複数可）をコードし得ることを理解するであろう。したがって、そのゲノム中に保存的アミノ酸置換を伴うＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩポリペプチド、及び／またはベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的に操作された非ヒト動物ドナーに加えて、遺伝暗号の縮退に起因して本明細書に記載されるものと異なるヌクレオチド配列（複数可）を含む非ヒト動物ドナーも提供される。
追加的または代替的な手法では、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ（クラスＢ）分子の抑制作用及び共刺激作用を再プログラムまたは活用することを含む。具体的には、本開示は、ＨＬＡ遺伝子の一部に対応するドナー動物ゲノムの一部を「発見し、置き換える」プロセスを含み、このプロセスは、例えば、ＨＬＡ－Ｇが過剰発現するように行われ、可能な場合、ＨＬＡ－Ｅに対応する部分は保持し、過剰発現させ、及び／またはＨＬＡ－Ｆに対応する部分を「発見し、置き換える」ことが行われる。本明細書で使用される場合、「発見し、置き換える」という用語は、相同／類似／オルソロガスな保存された遺伝子領域の同定、ならびに遺伝子編集技術を通じて、１つ以上の切片を対応するヒト成分で置き換えることを含む。
別の態様は、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｅ、－Ｆ、及び－Ｇにおいて発現されるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドを発見し、置き換えることを含む。サイトカイン媒介性の補体を抑制またはその他の様式で免疫調節する相同的／類似的／オルソロガスな保存された細胞マーカーまたは表面タンパク質は、ドナー－レシピエント細胞界面での全体的な免疫寛容を増強すると想定される。
追加的または代替的な手法では、本発明は、レシピエントによって自然細胞媒介性免疫応答が誘発されないようにするために、免疫遺伝学的な再プログラムを利用してＭＨＣ－Ｉ（クラスＡ）要素を低減または除去する。別の態様では、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂのエクソン領域に対応するドナー動物（例えば、ブタドナー）ゲノム内のエクソン領域は、ドナー動物上で破壊され、サイレンシングされ、またはそれ以外の場合、非機能的に発現される。別の態様では、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂのエクソン領域に対応するドナー動物（例えば、ブタドナー）ゲノム中のエクソン領域が、ドナー動物のゲノムにおいて破壊、サイレンシングされるか、または非機能的に発現され、ＨＬＡ－Ｃのエクソン領域に対応するドナー動物（例えば、ブタドナー）ゲノム中のエクソン領域が調節され得る、例えば、軽減される。一態様では、本開示は、供給源動物のオルソロガスなＨＬＡ－Ｃのサイレンシング、ノックアウト、または発現最少化（こうしたことは、そのような免疫遺伝学的な再プログラムを行わない場合に想定されるそのようなものの発現程度と比較したときのものである）を行うことを含む。
さらに、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の各々のヘテロ二量体構造を含むベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質は、種特異的である。したがって、本開示の一実施形態では、それは再プログラムされる。その対応物とは対照的に、この普及している構築ブロックタンパク質をコードする遺伝子指令は、ＭＨＣ遺伝子座に位置しない。したがって、本開示の一実施形態では、遺伝子組換えは、本明細書に記載されるそれぞれの標的に特異的な遺伝子組換えに加えて、遺伝子組換えを含む。
図３３は、本開示によるヒト化ブタ細胞の概略図である。そこに示されるように、本開示は、特定のポリペプチドまたは糖タンパク質をコードするエクソンを再プログラムすること、特定のポリペプチドまたは糖タンパク質を再プログラム及び上方制御すること、及びゲノムを再プログラムして、特定のポリペプチドまたは糖タンパク質の非機能的発現を有することを含み、これらのすべてが本明細書に詳細に記載される。
いくつかの態様では、図３３に列挙される表に列挙される修飾を挿入するための、ブタ細胞株における遺伝子修飾。いくつかの態様では、図３３に列挙される遺伝子組換えに加えて、３つの優勢なブタドナー細胞表面グリカン（ガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及び／またはＳｄａ）は、超急性拒絶現象及び抗体媒介性免疫経路の有害な活性化、すなわち補体カスケードの活性化を低減するために発現されない。このステップにより、非ＭＨＣ細胞マーカーに関して同種異系「様」細胞の作成が大幅に達成される。
遺伝的に操作された細胞、例えば、遺伝的に操作された動物由来の細胞、またはエクスビボで作製された細胞を分析し、選別する。ある場合には、遺伝的に操作された細胞は、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別によって分析及び選別され得る。例えば、目的の遺伝子を発現する遺伝的に操作された細胞は、その遺伝子によってコードされるポリペプチドを認識する標識（例えば、蛍光標識）に基づくフローサイトメトリーを使用して、他の細胞から検出及び精製することができる。目的の遺伝子は、数百対ほどの小さなｃＤＮＡ塩基であってもよく、または空間及び時間において制御された発現を得るために必要なエクソン－内因性エクソン及び／イントロンコーディング配列及び調節配列を含む遺伝子座の約１００，０００対もの大きな塩基であってもよい。好ましくは、組換えＤＮＡセグメントのサイズは、２５ｋｂ～５００ｋｂ超である。いずれにせよ、組換えＤＮＡセグメントは、２５ｋｂより小さく、５００ｋｂより長くてもよい。
既知のヒトＭＨＣ遺伝子型または本明細書に具体的に記載されるレシピエントのＭＨＣをブタドナーの細胞、組織、及び臓器が発現するようにすることを、アルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）（例えば、「シングルノックアウト」、「ダブルノックアウト」、または「トリプルノックアウト」）と組み合わせると、本開示の厳密なＳＬＡ／ＭＨＣ再プログラムが行われていないトリプルノックアウトブタドナーと比較して免疫学的拒絶反応が低減された細胞を有するブタドナーが得られることがさらに理解されよう。本開示は、ブタドナー細胞中のアルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）の発現を防止するために、ブタドナーゲノムを再プログラムする新規の手順を提供する。特に、野生型ブタドナーゲノムは、アルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をコードする遺伝子の各々において、ＡＴＧ開始コドンの後の最初の９つのヌクレオチドを、ヌクレオチド配列ＴＡＧＴＧＡＴＡＡで置き換えるように、再プログラムされる。したがって、本開示による再プログラムされたゲノムを有するブタドナー細胞は、アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を発現しない。この新規の遺伝子修飾を有するブタドナーは、「トリプルノックアウト」ブタドナーと称される。本開示はまた、ヌクレオチド配列ＴＡＧＴＧＡＴＡＡを用いて本明細書に開示される他の遺伝子を再プログラムして、それらの遺伝子の非発現をもたらすことを含む。ヌクレオチド配列ＴＡＧＴＧＡＴＡＡを使用することにより、望ましくないタンパク質またはその変異体の意図しない発現をもたらし得る遺伝子の偶発的な再活性化を回避するために、安全かつ安定した非発現効果を達成することができる。
修飾されたブタドナー細胞の免疫応答は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）研究を通じて評価される。ＭＨＣ Ｉａポリペプチドの修飾または非発現の免疫応答への影響は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を通じて測定される。ＭＨＣ Ｉｂポリペプチドの修飾の免疫応答への影響は、ＮＫ細胞の免疫応答を通じて測定される。ＭＨＣ ＩＩポリペプチドの修飾または非発現の免疫応答への影響は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫応答を通じて測定される。本明細書におけるＭＬＲ研究は、部位特異的変異原置換の有効性を測定するだけでなく、測定値が追加の部位特異的変異原置換が行われるにつれて反復的に測定されるため、個々の修飾の影響を個々に及び全体として評価及び識別する。
細胞のノックインについては、ゲノム物質を挿入することで所望の配列が細胞ゲノムにノックインされ、この挿入は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して行われる。クラスＩＩ分子の発現を最適化するために、細胞がブタインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）中で７２時間インキュベートされ、このＩＦＮ－γによって発現が刺激される。次に、標的特異的抗体を使用してフローサイトメトリーによって発現が測定される。フローサイトメトリーでは、抗ＨＬＡ－Ｃ抗体、抗ＨＬＡ－Ｅ抗体、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体、もしくは他の抗ＨＬＡ抗体、またはパン抗ＨＬＡクラスＩ抗体もしくはパン抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体が使用され得る。本開示によれば、ノックイン後に細胞表面ＨＬＡ発現が確認される。
本開示の生物学的製品から得られる細胞を抗ＨＬＡ抗体が認識するかどうかを決定するためには、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイが実施され得る。事前に特徴付けられた抗ＨＬＡを含む特異的ヒト血清（または対照血清）を添加することによって調製されたアッセイプレートが使用され得る。ＩＦＮ－γで処理されたドナー細胞が再浮遊され、アッセイプレートに添加され、補体の供給源（例えば、ウサギ血清）とともにインキュベートされる。室温でのインキュベートを少なくとも１時間行った後、アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド溶液が添加される。蛍光顕微鏡で視覚化された死細胞及び生存細胞の数を数え、抗ＨＬＡ抗体の非存在下で得られる自発性溶解値を差し引き、尺度を用いてスコア付けすることによって細胞傷害性パーセントが決定される。
表面糖鎖をノックアウトまたは代替的にサイレンシングすると、糖部分を発現しない細胞株が得られるため、ヒト血清中に見られる天然の事前生成抗体による結合が生じない。このことは、フローサイトメトリー、ならびにヒト血清及び標識型のヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体もしくはヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体、または糖に対して特異的な抗体を使用して検出される。こうした抗体が最終的な細胞株に結合しないという結果が得られる。遺伝的修飾を含まない元の細胞株（ＷＴ）が陽性対照とされる。さらに、分子解析によって、そうした遺伝子の変化が実証される。
ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術を使用するＳＬＡクラスＩ分子の発現のノックアウトまたは代替的なサイレンシングでは、得られる細胞株は、上記の糖部分ならびにＳＬＡクラスＩの発現を欠く。フローサイトメトリー及び分子遺伝子の分析が実施されることで、表面発現が存在せず、遺伝子レベルで変化が生じたことが実証される。ヒトＰＢＭＣ及び照射細胞株を用いる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用して細胞反応性が評価される。ＷＴ株と比較して、主にＣＤ８＋Ｔ細胞においてＴ細胞増殖の減少がある。
ＳＬＡクラスＩＩ分子、ＤＲ及びＤＱの発現に対する反応性もまた、最小限に抑えられるか、または排除される（ブタＤＰは存在しない）。分子レベル、細胞表面発現、及びヒトＰＢＭＣとのインビトロでの反応性について分析が実施される。得られる細胞株に対する反応性には顕著な下方調節が見られる。
細胞反応性を試験するには、すべての細胞は、ブタＩＦＮ－γとともに７２時間インキュベートされた後、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞がブタ細胞株に添加され、７日間培養される。読み取り値は、利用可能なリソースに応じた活性化／増殖の形態である。
ＤＱに特異的な応答を観察するには、細胞応答が、ヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されるブタ抗原の結果とならないように、ＡＰＣが培養物に存在しないようにされる。
ブタドナーからヒトへの異種移植との関連では、各ヒトレシピエントは、その個人に特有の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（クラスＩ、クラスＩＩ、及び／またはクラスＩＩＩ）を有し、このＭＨＣは、ブタドナーのＭＨＣとは適合となる可能が非常に低いことが理解されよう。したがって、ブタドナー移植片がレシピエントに導入されると、ブタドナーＭＨＣ分子自体がｎｏｎ－Ｇａｌの異種抗原として働き、レシピエント由来の免疫応答を誘発することで、移植拒絶反応を引き起こすことが理解されよう。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子がヒト集団において示す配列多様性は途方もないものである。例えば、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子だけも４，０００を超える対立遺伝子の存在が知られている。ＨＬＡ遺伝子の遺伝的多様性においては、異なる抗原の提示効率が異なる様々な対立遺伝子が存在し、この遺伝的多様性は、ヒトが曝露される広範な異なる病原体に対する集団レベルの抵抗性が向上するように進化が生じた結果であると考えられる。この遺伝的多様性は、レシピエントの免疫応答が移植後の生着及び生存の結果を左右する最も重要な因子である異種移植の中においては問題になるものでもある。
本発明の一態様によれば、特定の一連の既知ヒトＨＬＡ分子を発現するように生物学的に操作されたゲノムを有するブタドナーが提供される。そのようなＨＬＡ配列は利用可能であり、例えば、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／にて利用可能）及びｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｉｍｇｔ．ｏｒｇにて利用可能）において利用可能である。例えば、ＨＬＡ－Ａ１，Ｂ８，ＤＲ１７は、コーカサス人種の中で最も一般に見られるＨＬＡハプロタイプであり、その頻度は５％である。したがって、開示の方法は、本明細書で提供される本開示と組み合わせて既知のＭＨＣ／ＨＬＡ配列情報を使用して実施され得る。
いくつかの態様では、レシピエントのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子ならびにＭＨＣ（クラスＩ、クラスＩＩ、及び／またはクラスＩＩＩ）が同定され、マッピングされる。ヒトレシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ配列を把握することは、当該技術分野で知られる任意の数の方法を用いることによって可能であることが理解されよう。例えば、ＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子は、通常、標的配列決定法（ロングリードシークエンシングまたはロングインサートショートリードシークエンシング）によって型が決定される。慣例的には、ＨＬＡ型は、２桁分解能（例えば、Ａ＊０１）で決定されており、この分解能は、血清学的抗原分類とほぼ同じである。より最近では、４桁分解能（例えば、Ａ＊０１：０１）でのＨＬＡの型決定に配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）法が使用されており、この分解能によれば、アミノ酸差異を区別可能である。現在のところ、ＨＬＡの型を決定するための標的ＤＮＡ配列決定は、他の従来法と比較して最も一般的なＨＬＡ型決定手法である。配列ベースの手法では、コード領域及び非コード領域の両方が直接的に決定されるため、それぞれ６桁分解能（例えば、Ａ＊０１：０１：０１）及び８桁分解能（例えば、Ａ＊０１：０１：０１：０１）でのＨＬＡ型決定が達成され得る。現存するＨＬＡ対立遺伝子を新たな対立遺伝子またはヌル対立遺伝子と区別する上では、臨床的観点から、最高分解能でＨＬＡの型を決定することが望ましい。かかる配列決定技術は、例えば、Ｅｌｓｎｅｒ ＨＡ，Ｂｌａｓｃｚｙｋ Ｒ：（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＨＬＡ ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．６４（６）：６８７－６９５、Ｅｒｌｉｃｈ ＲＬ，ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｏｃｉ．ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１２：４２－１０．１１８６／１４７１－２１６４－１２－４２、Ｓｚｏｌｅｋ Ａ、ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＯｐｔｉＴｙｐｅ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：３３１０－３３１６、Ｎａｒｉａｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＨＬＡ－ＶＢＳｅｑ：Ａｃｃｕｒａｔｅ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ａｔ ｆｕｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：Ｓ７、Ｄｉｌｔｈｅｙ ＡＴ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｉｇｈ－ａｃｃｕｒａｃｙ ＨＬＡ ｔｙｐｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｒａｐｈｓ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １２：ｅ１００５１５１、Ｘｉｅ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｓｈｏｒｔ－ｒｅａｄ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｘＨＬＡ １１４（３０）８０５９－８０６４に記載されており、これらの各々は参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣまたは個々のレシピエントの配列決定されたＨＬＡ／ＭＨＣ配列（複数可）をテンプレートとして利用することで、既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣ配列またはヒトレシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ配列と配列相同性が一致するようにブタドナー白血球抗原（ＳＬＡ）／ＭＨＣ配列を修飾することができる。使用される既知のヒトレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣ配列が同定されるか、またはヒトレシピエントの遺伝子配列決定を行って、ＨＬＡ／ＭＨＣ配列が得られると、所望のＨＬＡ／ＭＨＣ配列に基づいてブタドナーの細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ配列に対して生物学的再プログラムを行うことができる。例えば、標的を定めるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を、本開示のブタドナーにいくつか投与することで、ブタドナーの細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ配列がヒトレシピエントのテンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列によって再プログラムされる。
ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９を使用して、ブタドナー細胞中の特定の天然遺伝子座に位置するＭＨＣ対立遺伝子全体の迅速かつ無痕跡の交換を媒介する。２つのｇＲＮＡを用いてＣａｓ９によるマルチプレックス標的化を行うことで、ＭＨＣ対立遺伝子の隣に一本鎖切断または二本鎖切断が導入され、テンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列（一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖ＤＮＡテンプレートとして提供される）での置き換えが可能になる。ある特定の態様では、養母に移される前に、ブタドナーの卵母細胞、卵子、接合体、または未分化胚芽細胞にＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素が注入される。
ある特定の態様では、本開示は、ＳＬＡが存在せず、ＨＬＡを発現する生物学的に再プログラムされたブタドナーの胚形成及び生児出生を含む。ある特定の態様では、本開示は、ＳＬＡが存在せず、ＨＬＡを発現する生物学的に再プログラムされたブタドナーを交配繁殖させて、ＳＬＡが存在せず、ＨＬＡを発現する後代を創出することを含む。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素が、ブタ接合体の細胞質内マイクロインジェクションによってブタドナー接合体に注入される。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素がブタドナーに注入された後、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９遺伝的に操作されたブタドナーの選択的繁殖が行われる。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素は、ブタドナーからの細胞、組織、接合体、及び／または臓器を採取する前にブタドナーに注入される。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素は、遺伝子編集の制御に必要な要素をすべて含み、こうした要素には、米国特許第９，８３４，７９１号（Ｚｈａｎｇ）に記載の自己不活化に利用される制御性ｇＲＮＡ分子が含まれ、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
遺伝的修飾は、既知のゲノム編集手法を利用して行うことができ、こうした手法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性遺伝子編集、及び規則的な間隔でクラスター化した反復回文配列Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９）などである。こうしたプログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を標的位置に生成させることが可能であり、このＤＳＢによって細胞の修復機構の上方制御が促進され、これによって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のエラープローンプロセスまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）のいずれかが生じ、これらのうち、ＨＤＲを外因性のドナーＤＮＡテンプレートの組み込みに使用することができる。ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来の多重精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９は、細胞中のウイルス感染を除去するためにも使用され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９を介する遺伝的修飾は、Ｋｅｌｔｏｎ，Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，“Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ＭＨＣ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ ｏｒ ａｎｙ ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｃａｓ９－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ，”Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７：４５７７５（２０１７）（「Ｋｅｌｔｏｎ」）に記載の様式で実施することができ、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本開示は、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９を使用して、対立遺伝子全体（例えば、ＭＨＣ、ＨＬＡ、ＳＬＡなど）の迅速かつ無痕跡の交換を媒介して再プログラムを行うことを含む。
一態様では、レシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子が配列決定され、レシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子に基づいてテンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列が調製される。別の態様では、本開示のブタドナーを遺伝的に再プログラムするために、ＷＨＯデータベースから得られる既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子型が使用され得る。ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９プラスミドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製され、レシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ配列が、テンプレートとしてプラスミドにクローニングされる。ブタドナー細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子座でのＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術切断部位が同定され、切断部位を標的とするｇＲＮＡ配列が１つ以上のＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９プラスミドにクローニングされる。次に、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術－Ｃａｓ９プラスミドがブタドナー細胞に投与され、ブタドナー細胞のＭＨＣ遺伝子座においてＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９切断が行われる。
既知のヒトＨＬＡ／ＭＨＣ配列またはレシピエントの配列決定されたＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子と一致する１つ以上のテンプレートＨＬＡ／ＭＨＣ配列を用いてブタドナー細胞中のＳＬＡ／ＭＨＣ遺伝子座が置き換えられる。ブタドナー細胞中のＨＬＡ／ＭＨＣ配列の再プログラムが成功しているかどうかを決定するために、ＳＬＡ／ＭＨＣ再プログラムステップの実施後にブタドナーの細胞が配列決定される。ＨＬＡ／ＭＨＣ配列が再プログラムされたブタドナーから得られる１つ以上の細胞、組織、及び／または臓器がヒトレシピエントに移植される。
ある特定の態様では、ＨＬＡ／ＭＨＣ配列が再プログラムされたブタドナーは、少なくとも一世代または少なくとも二世代にわたって、交配繁殖されてから、異種移植において使用される生存組織、生存臓器、及び／または生存細胞の供給源として使用される。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素は、ＰＥＲＶ活性を担う遺伝子（例えば、ｐｏｌ遺伝子）を不活化するためにも利用され、それによって、ブタドナーからＰＥＲＶが同時に完全除去され得る。
ドナーＳＬＡ／ＭＨＣを修飾してレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣと一致させる目的については、ヒト組織適合遺伝子複合体及びブタドナー組織適合遺伝子複合体のゲノム構成を比較してマッピングすることが行われている。例えば、かかるＳＬＡからＨＬＡへのマッピングは、Ｌｕｎｎｅｙ，Ｊ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｏｎｏｒ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｔｈｅ ＳＬＡ ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３：３６２－３７４（２００９）（“Ｌｕｎｎｅｙ”）に見出されることができ、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、当業者であれば、本開示を考慮して、Ｌｕｎｎｅｙらのマッピングを参照ツールとして使用して効果的かつ効率的にブタドナー細胞を遺伝的に再プログラムする。
ドナーＳＬＡ／ＭＨＣをレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣと一致するように修飾すると、既知のヒト遺伝子型または特定のヒトレシピエントのＭＨＣ分子と同一または実質的に同一の特定のＭＨＣ分子がブタドナー細胞から発現するようになる。一態様では、本開示は、ブタドナーのゲノムの特定ＳＬＡ領域の特定部分のみに限って修飾を施すことで、ブタドナーの効果的な免疫プロファイルを保つ一方で、免疫抑制剤の使用が低減または回避され得るようにヒトレシピエントに移植されたときに生物学的製品は低免疫原性である。本開示の態様とは対照的に、先行技術分野の異種移植研究では、免疫抑制剤を使用して拒絶反応に抵抗する必要があった。一態様では、ブタドナーゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＤＲに対応するノックアウトブタドナー遺伝子、ならびにノックインＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇに対応するノックアウトブタ遺伝子に再プログラムされる。いくつかの態様では、ブタドナーゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｆ、ＤＱ、及びＤＲに対応するノックアウトブタ遺伝子、ならびにノックインＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇに対応するノックアウトブタドナー遺伝子に再プログラムされる。いくつかの態様では、ブタドナーゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｆ、ＤＱ、及びＤＲに対応するノックアウトブタドナー遺伝子、ならびにノックインＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＤＱに対応するノックアウトブタ遺伝子に再プログラムされる。一態様では、ブタドナーゲノムは、ＳＬＡ－１１；ＳＬＡ－６，７，８；ＳＬＡ－ＭＩＣ２、及びＳＬＡ－ＤＱＡ；ＳＬＡ－ＤＱＢ；ＳＬＡ－ＤＱＢ２をノックアウトし、ＨＬＡ－Ｃ；ＨＬＡ－Ｅ；ＨＬＡ－Ｇ；及びＨＬＡ－ＤＱをノックインするように再プログラムされる。ある特定の態様では、再プログラムされたブタドナーゲノムではＨＬＡ－Ｃ発現が低減される。ある特定の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱまたはＤＲをコードする遺伝子のノックアウトを含む。ある特定の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱまたはＤＲのノックアウト、及びヒトＤＱまたはＤＲ遺伝子配列での置き換えを含む。ヒトの免疫系にとって不可視となるようにブタドナー細胞を再プログラムすることによって、再プログラムが未実施であればブタドナー細胞から発現するブタドナーＭＨＣ分子に基づいて再プログラム未実施時には生じたであろう免疫応答が、この再プログラムによって最少化または除去されさえする。
一態様では、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む、保存的アミノ酸置換を利用して、正確な部位特異的変異原性遺伝子置換または修飾を促進し、その設計は、動物の免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときにドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する、付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、ゲノム組織破壊を回避する。２０個のアミノ酸の化学的特性は、当該技術分野で十分に理解されている。例えば、類似の化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸の基としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン等の脂肪族側鎖、セリン及びトレオニン等の脂肪族－ヒドロキシル側鎖、アスパラギン及びグルタミン等のアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン等の芳香族側鎖、リジン、アルギニン、及びヒスチジン等の塩基性側鎖、アスパラギン酸及びグルタミン酸等の酸性側鎖、ならびにシステイン及びメチオニン等の含硫側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基として、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸塩／アスパラギン酸塩、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。
一態様では、既知のヒト遺伝子型または特定のヒトレシピエントのＭＨＣ分子と、ブタドナー細胞からの特定のＭＨＣ分子の発現が実質的に同一になるようにするために、ドナーＳＬＡ／ＭＨＣをレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣと一致するように修飾することは、保存的アミノ酸置換に限定され、ミスマッチ配列は、それらが同じ保存的アミノ酸置換基内にある場合にのみ修飾される。別の態様では、既知のヒト遺伝子型または特定のヒトレシピエントのＭＨＣ分子と、ブタドナー細胞からの特定のＭＨＣ分子の発現が実質的に同一になるようにするために、ドナーＳＬＡ／ＭＨＣをレシピエントＨＬＡ／ＭＨＣと一致するように修飾することは、保存的アミノ酸置換に限定され、ブタアミノ酸は、ヒトアミノ酸の置換によるＳＬＡタンパク質の３Ｄ構造の著しい変化がある場合に保持される。これは、ヒトアミノ酸側鎖Ｒが極性であり、ブタアミノ酸が非極性である場合であり得る。次いで、ミスマッチ配列を、それらがペプチド結合領域内にあるか、もしくは重要とみなされるペプチド結合領域付近の残基であるか、またはＳＬＡ－ＤＱＡとの相互作用の構造立体配座における役割について評価する。ペプチド結合領域内のアミノ酸は、ＴＣＲ相互作用にとって重要であり、ヒトであるが、分子の構造的完全性にとって重要なブタアミノ酸は保持される。次いで、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を共有するミスマッチ配列をレシピエントのものに修飾して、ハイブリッド個別化テンプレートを達成し、テンプレートは、ドナー動物のＳＬＡ－ＤＱＡを修飾するために使用され得る。例えば、図５８に示すように、ドナーのＳＬＡ－ＤＱＢのエクソン２とレシピエントのＨＬＡ－ＤＱＢとの間のミスマッチ配列は、最初に識別される。次いで、ミスマッチ配列を、それらがペプチド結合領域内にあるか、もしくは重要とみなされるペプチド結合領域付近の残基であるか、またはＳＬＡ－ＤＱＢとの相互作用の構造立体配座における役割について評価する。ペプチド結合領域内のアミノ酸は、ＴＣＲ相互作用にとって重要であり、ヒトであるが、分子の構造的完全性にとって重要なブタアミノ酸は保持される。次いで、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を共有するミスマッチ配列をレシピエントのものに修飾して、ハイブリッド個別化テンプレートを達成し、テンプレートは、ドナー動物のＳＬＡ－ＤＱＢを修飾するために使用され得る。上に記載の保存的アミノ酸置換は、正確な部位特異的変異原性遺伝子置換または修飾を適用することによって、ドナー動物の細胞、組織、及び臓器がヒトに移植されたときに免疫寛容性であることを可能にし、その設計は、動物の免疫機能を犠牲にすることなく、付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、ゲノム組織破壊を回避する。
したがって、この態様（すなわち、厳密に選択したヒトＭＨＣ対立遺伝子を発現するようにＳＬＡ／ＭＨＣを再プログラムすること）は、異種移植を目的とするブタドナーの細胞、組織、及び臓器に適用されると、野生型ブタドナーから得られるか、あるいはこの再プログラムが行われておらず、その他の方法で遺伝的に操作されたブタドナー（例えば、トランスジェニックブタドナー、または非特異的な遺伝的修飾もしくは異なる遺伝的修飾が行われたブタドナー）に由来する細胞、組織、及び臓器と比較して拒絶反応を低減することが理解されるであろう。
既知のヒトＭＨＣ遺伝子型または本明細書に具体的に記載されるレシピエントのＭＨＣをブタドナーの細胞、組織、及び臓器が発現するようにすることを、アルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）（例えば、「シングルノックアウト」、「ダブルノックアウト」、または「トリプルノックアウト」）と組み合わせると、本開示の厳密なＳＬＡ／ＭＨＣ再プログラムが行われていないトリプルノックアウトブタドナーと比較して免疫学的拒絶反応が低減された細胞を有するブタドナーが得られることがさらに理解されよう。加えて、アルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をコードする遺伝子に対する新規の遺伝子再プログラムを行うことによって、本開示（トリプルノックアウトブタドナー）によれば、免疫原性は、さらに低減され得、拒絶反応に対する耐性は、さらに増加され得る。
再プログラムされたパイロットブタ細胞の特徴付け
遺伝的に操作された細胞、例えば、遺伝的に操作された動物由来の細胞、またはエクスビボで作製された細胞を分析し、選別することができる。ある場合には、遺伝的に操作された細胞は、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別によって分析及び選別され得る。例えば、目的の遺伝子を発現する遺伝的に操作された細胞は、その遺伝子によってコードされるポリペプチドを認識する標識（例えば、蛍光標識）に基づくフローサイトメトリーを使用して、他の細胞から検出及び精製することができる。本出願では、未修飾ＰＡＭ細胞上のＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲ、及びＳＬＡ－ＤＱの表面発現を、それらの糖タンパク質上のエピトープを対象とする標識抗体を使用して確立する。特定の遺伝子ノックアウト（例えば、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－ＤＲ）の場合、フローサイトメトリーによる分析を使用して、インターフェロンガンマで細胞をインキュベートした後でも、これらの糖タンパク質の発現の欠如を実証する。ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８及びＳＬＡ－ＤＱの遺伝子は、細胞表面上に発現される糖タンパク質がそれぞれＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ及びＨＬＡ－ＤＱ糖タンパク質を反映するように修飾される。したがって、ＨＬＡエピトープに特異的な抗体の異なるセットを使用して、修飾遺伝子によってコードされる糖タンパク質の発現を検出し、ＳＬＡ関連糖タンパク質を対象とする抗体は、修飾ＰＡＭ細胞の細胞表面に結合しない。
表面糖鎖エピトープをノックアウトすると、糖部分を発現しない細胞株が得られるため、ヒト血清中に見られる天然の事前生成抗体による結合が生じない。このことは、フローサイトメトリー、ならびにヒト血清及び標識型のヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体もしくはヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体、または糖に対して特異的な抗体、または標識された糖特異的アイソレクチンを使用して検出される。こうした抗体（アイソレクチン）が最終的な細胞株に結合しないという結果が得られる。遺伝的修飾を含まない元の細胞株（ＷＴ）が陽性対照とされる。さらに、分子解析によって、そうした遺伝子の変化が実証される。
細胞のノックインについては、ゲノム物質を挿入することで所望の配列が細胞ゲノムにノックインされ、この挿入は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して行われる。クラスＩＩ分子の発現を最適化するために、細胞がブタインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）中で最大７２時間インキュベートされ、このＩＦＮ－γによって発現が刺激される。次に、標的特異的抗体を使用してフローサイトメトリーによって発現が測定される。フローサイトメトリーでは、抗ＨＬＡ－Ｃ抗体、抗ＨＬＡ－Ｅ抗体、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体、もしくは他の抗ＨＬＡ抗体、またはパン抗ＨＬＡクラスＩ抗体もしくはパン抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体が使用され得る。本開示によれば、ノックイン後に細胞表面ＨＬＡ発現が確認される。
修飾されたブタドナー細胞の免疫応答は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）研究を通じて評価される。レスポンダー細胞は、ＰＢＭＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＴ細胞の他の亜集団のいずれかであり得る。ＰＢＭＣは、レシピエント内に存在するすべての免疫細胞を表し、測定された応答は、刺激細胞、例えば、未修飾ＰＡＭ細胞と修飾ＰＡＭ細胞の比較、への免疫応答をマウントするレスポンダーの能力を反映する。あるいは、ＰＡＥＣまたは線維芽細胞が使用され得る。測定された増殖は、それぞれＭＨＣクラスＩＩ及びＩと相互作用するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方からなる。ＣＤ４＋Ｔ細胞のみを非修飾または修飾ＰＡＭ細胞に対して使用して、ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質、ＤＲ及びＤＱに対する応答を測定する。例えば、ＰＡＭ細胞においてＳＬＡ ＤＲがノックアウトされるＭＬＲにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答が減少する；またはＳＬＡ－ＤＱ遺伝子が、「レシピエント」［レスポンダー］からの配列を使用することによって修飾されるとき、増殖応答が減少するが、これは、この場合、レスポンダーがＤＱ糖タンパク質を自己として認識するのに対し、ＤＲノックアウトにおいては、ＤＲが存在しなかったため、シグナルを生成することができなかったためである。
レスポンダーＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して、ＭＨＣクラスＩ糖タンパク質、ＳＬＡ－１、及びＳＬＡ－２に対する免疫応答を評価した。１×１０５の精製したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）またはヒトＰＢＭＣ（Ｂ）を、４倍ノックアウトブタ１０２６１または野生型ブタに由来する増加した数の照射（３０Ｇｙ）ブタＰＢＭＣで刺激したグラフを示す。増殖を、５日＋１６時間後に、３Ｈ－チミジン組み込みにより測定した。データは、単一の実験において１つのヒト血液ドナーからの細胞で得られた三連培養物の平均ＣＰＭ±ＳＥＭを表す。同様の応答パターンは、第２の血液ドナーからのレスポンダー細胞及び４倍ノックアウトピッグ１０２６２からの刺激用細胞を使用して観察された。４倍ノックアウトブタＰＢＭＣで刺激した後、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が減少した。（Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉａｂｌｅ ｐｉｇｓ ａｆｔｅｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｘｅｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅｓ ＧＧＴＡ１，ＣＭＡＨ ａｎｄ Ｂ４ＧＡＬＮＴ２，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０１９）。ＳＬＡ－１及びＳＬＡ－２を発現しない修飾ノックアウトＰＡＭ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成しない。これは、ＰＢＭＣをレスポンダーとして用いた応答とは対照的である。図３４を参照されたい。
本開示の生物学的製品から得られる細胞を抗ＨＬＡ抗体が認識するかどうかを決定するためには、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイが実施され得る。事前に特徴付けられた抗ＨＬＡを含む特異的ヒト血漿（または対照血漿）を添加することによって調製されたアッセイプレートが使用され得る。血漿を、カルシウム及びマグネシウムを含むＨＢＳＳ培地中で１：５０から開始して１：３６４５０まで連続的に希釈し、４℃で３０分間修飾または非修飾ＰＡＭ細胞とともにインキュベートし、続いて３７℃で１時間、新たに再構築されたベビーウサギ補体とともにインキュベートする。次に、細胞をフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で１５分間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各アッセイについて適切な補正対照を行った。細胞を取得し、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。ＰＡＭ細胞をインターフェロンガンマで処理して、ＭＨＣ分子の表面発現を増加させることもできる。
細胞集団を、以下の条件について決定した：
ａ．死んだ細胞： ＰＩ＋、ＦＤＡ－
ｂ．損傷細胞： ＰＩ＋、ＦＤＡ＋
ｃ．生細胞： ＰＩ－、ＦＤＡ＋
おおよその計算を行って、血漿の各濃度（希釈）についての細胞毒性％を決定し、その結果をＰｒｉｓｍにプロットした。細胞傷害性曲線に基づいて、５０％殺傷に必要な希釈（ＩＣ５０）を決定した。これは、図３６Ａ及び図３６ＢにおけるＷＴまたはＧａｌＴ－ＫＯブタＰＢＭＣに対するヒト血漿を使用して例示され、ここでは、ガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）を欠く細胞に対して細胞傷害性の低減が同定された。
非修飾及び修飾ＰＡＭ細胞に対するＮＫ細胞傷害性であって、修飾ＰＡＭ細胞では、ＳＬＡ３、ＳＬＡ６、ＳＬＡ７、及びＳＬＡ８についての遺伝子が、細胞表面上で発現される糖タンパク質が、それぞれＨＬＡ Ｃ、ＨＬＡ Ｅ、ＨＬＡ Ｆ、及びＨＬＡ Ｇ糖タンパク質を反映するように修飾される。新たに単離したＩＬ－２活性化ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を、無血清ＡＩＭ－Ｖ培地中の４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。標識した非修飾及び修飾ＰＡＭ細胞を、４０：１～５：１の範囲の４つのＥ：Ｔ比のＮＫ細胞の連続２倍希釈で３重で培養する。３７℃で４時間インキュベーションした後、アッセイを停止し、５１Ｃｒ放出をガンマカウンターで分析し、特異的溶解のパーセンテージを計算した。特定の遺伝子マッチした「レシピエント」由来のＮＫ細胞は、未修飾ＰＡＭ細胞と比較して、修飾ＰＡＭ細胞の死滅が減少するであろう。ＮＫ細胞に対するトランスフェクトＰＡＥＣ細胞におけるＨＬＡ Ｅによる保護を図３４に示す。
ブタリンパ芽球様細胞上でのＨＬＡ Ｅ発現は、異種ヒトＮＫ細胞傷害性を阻害する。ＨＬＡ Ｅ／Ａ２またはＨＬＡ Ｅ／Ｂ７でそれぞれトランスフェクトされた１３２７１－Ｅ／Ａ２または１３２７１－Ｅ／Ｂ７（塗りつぶしダイヤモンド）、または未トランスフェクト１３２７１細胞（中抜き三角形）に対する、２つのドナー、ＫＨ及びＭＳのＮＫ細胞傷害性。クラスＩＩ分子の発現を最適化するために、細胞がブタインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）中で７２時間インキュベートされ、このＩＦＮ－γによって発現が刺激される。次に、標的特異的抗体を使用してフローサイトメトリーによって発現が測定される。フローサイトメトリーでは、抗ＨＬＡ－Ｃ抗体、抗ＨＬＡ－Ｅ抗体、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体、もしくは他の抗ＨＬＡ抗体、またはパン抗ＨＬＡクラスＩ抗体もしくはパン抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体が使用され得る。本開示によれば、ノックイン後に細胞表面ＨＬＡ発現が確認される。
非ヒト動物ドナーの生成
他の研究者らは、ホモ接合性トランスジェニックブタを開発しようと試みたが、これは、遅いプロセスであり、胎児線維芽細胞における相同組換え、続いて体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、次いでヘテロ接合性トランスジェニック動物の繁殖を使用してホモ接合性トランスジェニックブタを得るという伝統的な方法を使用して、３年は必要となる。異種移植のためのそれらのトランスジェニックブタの開発の試みは、多能性幹細胞の欠如によって妨げられており、代わりに、遺伝子操作が行われた細胞として胎児の線維芽細胞に依存する。例えば、ガラクトースの任意の機能的発現を欠く最初の生きたブタの産生は、２０００年に初めて報告された。そのような先行の試みとは対照的に、本開示は、本明細書に開示されるような非トランスジェニックな再プログラムされたブタドナーを作製するためのより速くかつ根本的に異なるプロセスを提供する。いくつかの態様では、ブタ胎児線維芽細胞は、遺伝子編集を使用して、例えば、正確な再プログラムのためにＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓを使用し、遺伝的に操作されたブタ胎児線維芽細胞の核をブタ脱核卵母細胞に移入して、胚を生成し、ｄ）その胚を代理ブタに移入し、移入された胚を、代理ブタ内で遺伝的に操作されたブタに成長させることによって、再プログラムされる。
試験結果が確認されると、遺伝的に再プログラムされたブタの交配繁殖が行われ、その結果、上記のアッセイから決定される望ましいヒト細胞修飾のうちの１つを各集団が有するいくつかのブタ集団の交配繁殖が行われる。完全に発育後にブタの細胞活性が試験されることで、異種移植後にブタの細胞及び組織の拒絶反応を回避するように所望の形質をブタが発現するかどうかが決定される。その後、望ましいヒト細胞修飾のうちの複数を有するようにさらに遺伝的に再プログラムされたブタの交配繁殖が行われることで、異種移植後にヒト患者の体によって拒絶されることのない細胞及び組織を発現するブタが得られる。
ブタからの多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の可能性は、胎児線維芽細胞からの初代細胞の使用を超える機会を提供する。ＭＳＣが様々な細胞亜集団に分化する能力は、一次体細胞が老化する前に受けることができる細胞分裂の数が限定的であることと対照的であり、恐らく、ＭＳＣは、核移入の前に、いくつかの遺伝子、特に遺伝子ノックアウト及びノックインの指向性の変化に対応するために必要な複数の選択ステップに耐え得ることを意味する。体細胞にまさるＭＳＣの別の利点は、クローニング効率が分化状態及び関連するエピジェネティック状態と逆相関するべきであることが予測されていることである。本開示において提示されるＰＡＭ細胞は、形質転換細胞株であるが、遺伝子工学的スキーマは、ブタＭＳＣに移入することができる。次いで、特異的に遺伝的に操作されたＭＳＣ株は、体細胞核移動（ＳＣＮＴ）のために利用され、遺伝的に操作されたブタ胎児線維芽細胞の核をブタ脱核卵母細胞に移入して、胚を生成し、その胚を代理ブタに移入し、移入された胚を、代理ブタ内で遺伝的に操作されたブタに成長させることによって、再プログラムされる。これは、移入された核が特定のゲノムを含有するため、子ブタはホモ接合の子孫を得るために繁殖を経る必要がないという利点がある。ブタの遺伝子型及び表現型は、ＭＳＣと同一である。
遺伝子修飾されたＭＳＣの特定の集団は、特定の細胞株として凍結保存され、その遺伝的背景に必要なブタの開発のために必要に応じて使用され得る。解凍されたＭＳＣを培養し、核を脱核卵母細胞に移し、代理ブタへの移植のための胚盤胞／胚を生成する。これにより、患者特有の組織、臓器、または細胞移植に必要なブタを産生するための遺伝的に操作されたＭＳＣの生存可能なバンクが作成される。
換言すれば、このアンメット臨床ニーズに対するかつて／以前の手法は、「万人に有効な（ｏｎｅ－ｓｉｚｅ ｆｉｔｓ ａｌｌ）」古典的な医学的定説に明確に従っている。この限られたアプローチに従う代わりに、本発明者らは、この狭窄した視野を積極的に打ち砕き、現在の技術的進歩及び基本原理を原動力として利用して、臨床転帰尺度が劇的に改善する「患者特異的」解決策を達成する能力を実利的に実証する。前者のことを、本発明者らは「下流」手法と称し、この手法では、次々に生じる自然免疫プロセスのすべてに対処することに取り組まなくてはならない。後者（本発明者らの手法）のことを、本発明者らは、「上流」手法と楽観的に命名し、この手法は、満たされない科学的労力の集大成が調和のとれた橋渡し的成果となったものである。
別の態様では、本出願に記載の遺伝的に操作された動物を作製する方法であって、ａ）ＭＨＣ Ｉ特異的エンハンセオソームの構成要素、ＭＨＣ Ｉ結合ペプチドのトランスポーター、及び／またはＣ３のうちの１つ以上の発現が低下した細胞を得ることと、ｂ）細胞から胚を生成することと、ｃ）胚を遺伝的に操作された動物内で増殖させることと、を含む方法が本明細書で開示される。ある場合には、細胞は、接合体である。
ある特定の態様では、ＨＬＡ／ＭＨＣ配列が再プログラムされたブタドナーは、少なくとも一世代または少なくとも二世代にわたって、交配繁殖されてから、異種移植において使用される生存組織、生存臓器、及び／または生存細胞の供給源として使用される。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素は、ＰＥＲＶ活性を担う遺伝子（例えば、ｐｏｌ遺伝子）を不活化するためにも利用され、それによって、ブタドナーからＰＥＲＶが同時に完全除去され得る。
ある特定の態様では、本開示は、ＳＬＡが存在せず、ＨＬＡを発現する生物学的に再プログラムされたブタドナーの胚形成及び生児出生を含む。ある特定の態様では、本開示は、ＳＬＡが存在せず、ＨＬＡを発現する生物学的に再プログラムされたブタドナーを交配繁殖させて、ＳＬＡが存在せず、ＨＬＡを発現する後代を創出することを含む。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素が、ブタ接合体の細胞質内マイクロインジェクションによってブタドナー接合体に注入される。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素がブタドナーに注入された後、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９遺伝的に操作されたブタドナーの選択的繁殖が行われる。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素は、ブタドナーからの細胞、組織、接合体、及び／または臓器を採取する前にブタドナーに注入される。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素は、遺伝子編集の制御に必要な要素をすべて含み、こうした要素には、米国特許第９，８３４，７９１号（Ｚｈａｎｇ）に記載の自己不活化に利用される制御性ｇＲＮＡ分子が含まれ、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ある特定の態様では、本開示は、ＳＣＮＴを使用してブタを作製することを含む。ある特定の態様では、本開示は、操作されたヌクレアーゼを胚に直接マイクロインジェクションすることによってブタを作製することを含む。
試験結果が確認されると、遺伝的に再プログラムされたブタの交配繁殖が行われ、その結果、上記のアッセイから決定される望ましいヒト細胞修飾のうちの１つを各集団が有するいくつかのブタ集団の交配繁殖が行われる。完全に発育後にブタの細胞活性が試験されることで、異種移植後にブタの細胞及び組織の拒絶反応を回避するように所望の形質をブタが発現するかどうかが決定される。その後、望ましいヒト細胞修飾のうちの複数を有するようにさらに遺伝的に再プログラムされたブタの交配繁殖が行われることで、異種移植後にヒト患者の体によって拒絶されることのない細胞及び組織を発現するブタが得られる。
上記のプロトコールまたはその同様のバリアントはいずれも、医薬製品と関連する様々な文書に記載され得る。こうした文書には、限定されないが、プロトコール、統計解析計画書、治験薬概要書、臨床指針、メディケーションガイド、リスク評価及びメディケーションプログラム、処方情報、ならびに医薬製品と関連し得る他の文書が含まれ得る。そのような文書は、有益となり得るか、または規制当局によって示されるように、細胞、組織、試薬、デバイス、及び／または遺伝物質とともにキットとして物理的に包装され得ることが明確に企図される。
別の態様では、本出願に記載の遺伝的に操作された動物を作製する方法であって、ａ）ＭＨＣ Ｉ特異的エンハンセオソームの構成要素、ＭＨＣ Ｉ結合ペプチドのトランスポーター、及び／またはＣ３のうちの１つ以上の発現が低下した細胞を得ることと、ｂ）細胞から胚を生成することと、ｃ）胚を遺伝的に操作された動物内で増殖させることと、を含む方法が本明細書で開示される。ある場合には、細胞は、接合体である。
これらのブタの各々から採取した筋肉及び皮膚組織試料を解剖し、線維芽細胞に成長させるために培養した。次に、細胞を採取し、体細胞核移動（ＳＣＮＴ）に使用して、クローンを作製した。３０日目に複数の胎児（最大８）を採取した。胎児を別々に解剖し、１５０ｍｍの皿にプレートして、胎児線維芽細胞に成長させた。培養全体を通して、胎児細胞株を別々に維持し、各チューブまたは培養容器上に胎児番号で標識した。コンフルエントな場合、細胞を採取し、液体窒素凍結保存のために１０％のＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で約１００万細胞／ｍＬで凍結した。
別の実施例から追加された：ある特定の態様では、養母に移される前に、ブタドナーの卵母細胞、卵子、接合体、または未分化胚芽細胞にＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術／Ｃａｓ９要素が注入される。
したがって、早産ブタドナー胎児及び新生子ブタは、成体ブタドナーとの比較時のその特徴に基づいて本発明に従って組織、細胞、及び臓器の供給源として利用され得る。
指定の病原体には、任意の数の病原体が含まれ得る。こうした病原体には、限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生生物、及び／またはプリオン（及び／または伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）と関連する他の病原体）が含まれる。指定の病原体には、限定されないが、いずれか及びすべての人畜共通感染症ウイルス、ならびに下記の科に由来するウイルスが含まれ得る：ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、ｃａｌｉｃｉｖｉｒｄａｅ、ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、及びｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ。
指定の病原体には、これらに限定されないが、アデノウイルス、アルボウイルス、アルテリウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、カリシウイルス、カルジオウイルス、サーコウイルス２、サーコウイルス１、コロナウイルス、脳心筋炎ウイルス、エペリスロゾーン、ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｕｉｓ、ヘルペスウイルス及びヘルペス関連ウイルス、イリドウイルス、コブウイルス、レプトスピリウム（ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、リステリア、マイコバクテリアＴＢ、マイコプラズマ、オルソミクソウイルス、パポウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス３、パラミクソウイルス、パルボウイルス、パサウイルス－１、ペスチウイルス、ピコビルナウイルス（ＰＢＶ）、ピコルナウイルス、ブタサーコウイルス様（ｐｏ－ｃｉｒｃｏ様）ウイルス、ブタアストロウイルス、ブタバコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｂａｃｏｖｉｒｕｓ）、ブタボカウイルス－２、ブタボカウイルス－４、ブタエンテロウイルス－９、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタポリオウイルス、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス（ＰＬＨＶ）、ブタ糞便関連環状ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｔｏｏｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｖｉｒｕｓ）（ＰｏＳＣＶ）、ポサウイルス－１、ポックスウイルス、狂犬病関連ウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、リケッチア、サペロウイルス、サポウイルス、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スイポックスウイルス、ブタドナーインフルエンザ、テッシェン（ｔｅｓｃｈｅｎ）、トロウイルス、トルクテノサスウイルス－２（ＴＴＳｕＶ－２）、伝染性胃腸炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及び／またはいずれか及び／またはすべての他のウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生生物、及び／またはプリオン（及び／またはＴＳＥと関連する他の病原体）が含まれ得る。いくつかの態様では、具体的にはブタドナー群では、ブタドナーの自然条件ではＴＳＥは報告されていないため、ＴＳＥの検査は実施されない。他の態様では、本開示の方法の一部としてＴＳＥの検査が実施される。
動物群に対する検査が行われ得る可能性のある病原体は膨大な数に上ることから、異種移植の安全性及び有効性を確保するためにドナー動物に対してどの特定の病原体群を検査すべきか、及びドナー動物集団からどの特定の病原体群を除去すべきかに関する分野における規制指針もしくは基準または理解は存在しない。換言すれば、本開示以前には、検査及び排除すべき有限数の予測可能な病原体が同定されていなかった。
重要なことには、本開示は、異種移植の安全性及び有効性を得る上では排除することが非常に重要であることを本発明者らが同定した特定の病原体群を提供する。この特定の病原体群は、以下の表１に示される。
Figure 2023538663000002
ある特定の態様では、本開示の製品は、本開示で論じられる病原体の複数またはすべてについて抗体力価レベルが検出レベルを下回る動物が供給源となる。ある特定の態様では、本開示の製品が移植される対象は、本開示で論じられる病原体の複数またはすべてについて抗体力価レベルが検出レベルを下回ることが試験され、明らかにされる。
いくつかの態様では、本開示は、１８～３５（例えば、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８）種類以下の病原体からなる特定の病原体群について検査する方法を含み、この特定の病原体群には、表１に記載の病原体のそれぞれが含まれる。いくつかの態様では、本開示は、１８～３５（例えば、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８）種類の病原体を含まないドナー動物を創出すること、維持すること、及び使用することを含み、この特定の病原体群には、表１に記載の病原体のそれぞれが含まれる。
それに由来する生物学的製品
本明細書に記載のように、異種移植のための生物学的製品は、本発明に従って生産及び維持された供給源動物から得られる。そのような生物学的製品には、これらに限定されないが、肝臓、腎臓、皮膚、肺、心臓、膵臓、腸、神経、ならびに他の臓器、細胞、及び／または組織が含まれる。
例として、そのような細胞を利用することで、異種移植のための当該技術分野で知られる再生細胞治療法によって（例えば、生物学的足場を利用することによって）多くの臓器及び／または組織を生成させることができ、こうして生成させることができる臓器及び／または組織には、限定されないが、皮膚、腎臓、肝臓、脳、副腎、肛門、膀胱、血液、血管、骨、脳、脳、軟骨、耳、食道、眼、腺、歯ぐき、毛、心臓、視床下部、腸、大腸、靱帯、唇、肺、リンパ、リンパ節及びリンパ管、乳腺、口、爪、鼻、卵巣、卵管、膵臓、陰茎、咽頭、下垂体、幽門、直腸、唾液腺、精嚢、骨格筋、皮膚、小腸、平滑筋、脊髄、脾臓、胃、腎上体、歯、腱、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、尿管、尿道、子宮、子宮、及び腟、乳輪組織、血液、咽頭扁桃組織、骨組織、褐色脂肪組織、網状組織、軟骨組織、軟骨、海綿組織、軟骨様組織、クロム親和性組織、結合組織、大動脈組織、弾性組織、上皮組織、表面被覆組織、脂肪組織、線維硝子組織、線維組織、ギャンジー包帯、ゼラチン様組織、肉芽組織、腸管関連リンパ系組織、ハラー脈管組織、硬性の造血組織、未分化組織、間質組織、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ系組織、間葉組織、中腎組織、膠様組織、多房性脂肪、筋組織、骨髄組織、軟組織鼻点、腎発生組織、神経組織、結節組織、骨組織、造骨組織、類骨組織、根尖周囲組織、細網組織、網状組織、ゴム状組織、骨格筋組織、平滑筋組織、ならびに皮下組織が含まれる。
本開示は、免疫原性が低減され、抗原性が低減され、生存度が上昇し、ミトコンドリア活性が上昇し、具体的に必要な病原体プロファイルを有し、凍結保存に供された異種移植組織の有効期間が予想外に長い異種移植製品の連続製造プロセスを提供する。連続製造プロセスは、超急性拒絶反応、遅延性異種移植拒絶反応、急性細胞性拒絶反応、慢性拒絶反応、疾患の異種間伝染、寄生生物の異種間伝染、細菌の異種間伝染、真菌の異種間伝染、ウイルスの異種間伝染を回避する上で驚くほどかつ予想外に有効である。連続製造プロセスは、検出可能な病理学的変化を伴わずにドナー動物が正常に生存する閉鎖群を創出する上で驚くほどかつ予想外に有効である。
生物学的製品には、限定されないが、本明細書に開示のもの（例えば、具体例に開示もの）、ならびに供給源動物から採取されたいずれか及びすべての他の組織、臓器、及び／または精製されたか、もしくは実質的に純粋な細胞及び細胞株も含まれ得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の異種移植に利用される組織には、限定されないが、乳輪組織、血液、咽頭扁桃組織、骨組織、褐色脂肪組織、網状組織、軟骨組織、軟骨、海綿組織、軟骨様組織、クロム親和性組織、結合組織、大動脈組織、弾性組織、上皮組織、表面被覆組織、脂肪組織、線維硝子組織、線維組織、ギャンジー包帯、ゼラチン様組織、肉芽組織、腸管関連リンパ系組織、ハラー脈管組織、硬性の造血組織、未分化組織、間質組織、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ系組織、間葉組織、中腎組織、膠様組織、多房性脂肪、筋組織、骨髄組織、軟組織鼻点、腎発生組織、神経組織、結節組織、骨組織、造骨組織、類骨組織、根尖周囲組織、細網組織、網状組織、ゴム状組織、骨格筋組織、平滑筋組織、及び皮下組織が含まれる。いくつかの態様では、本明細書に記載の異種移植に利用される臓器には、限定されないが、皮膚、腎臓、肝臓、脳、副腎、肛門、膀胱、血液、血管、骨、軟骨、角膜、耳、食道、眼、腺、歯ぐき、毛、心臓、視床下部、腸、大腸、靱帯、唇、肺、リンパ、リンパ節及びリンパ管、乳腺、口、爪、鼻、卵巣、卵管、膵臓、陰茎、咽頭、下垂体、幽門、直腸、唾液腺、精嚢、骨格筋、皮膚、小腸、平滑筋、脊髄、脾臓、胃、腎上体、歯、腱、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、尿管、尿道、子宮、ならびに腟が含まれる。
いくつかの態様では、本明細書に記載の異種移植に利用される精製されたか、または実質的に純粋な細胞及び細胞株には、限定されないが、血液細胞、血液前駆細胞、心筋細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、顆粒膜細胞、造血細胞、ランゲルハンス島細胞、ケラチノサイト、リンパ球（Ｂ及びＴ）、マクロファージ、メラノサイト、単球、単核細胞、神経系細胞、他の筋細胞、膵臓アルファ－１細胞、膵臓アルファ－２細胞、膵臓ベータ細胞、膵臓インスリン分泌細胞、脂肪細胞、上皮細胞、大動脈内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、アストロサイト、好塩基球、骨細胞、骨前駆細胞、心筋細胞、軟骨細胞、好酸球、赤血球、線維芽細胞、グリア細胞、肝細胞、ケラチノサイト、クッパー細胞、肝臓星状細胞、リンパ球、微小血管内皮細胞、単球、神経幹細胞、ニューロン、好中球、膵島細胞、上皮小体細胞、耳下腺細胞、血小板、始原幹細胞、シュワン細胞、平滑筋細胞、甲状腺細胞、腫瘍細胞、臍帯静脈内皮細胞、副腎細胞、抗原提示細胞、Ｂ細胞、膀胱細胞、頸部細胞、錐体細胞、卵細胞、上皮細胞、生殖細胞、有毛細胞、心臓細胞、腎細胞、ライディッヒ細胞、黄体細胞、マクロファージ、メモリー細胞、筋細胞、卵巣細胞、ペースメーカー細胞、管周細胞、下垂体細胞、形質細胞、前立腺細胞、赤血球、網膜細胞、桿体細胞、セルトリ細胞、体細胞、精子細胞、脾細胞、Ｔ細胞、精巣細胞、子宮細胞、腟上皮細胞、白血球、線毛細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、ドーパミン作動性細胞、胚性幹細胞、子宮内膜細胞、線維芽細胞、胎児線維芽細胞、濾胞細胞、杯細胞、角質化上皮細胞、肺細胞、乳腺細胞、粘液細胞、非角質化上皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞及び胎児線維芽細胞、ならびに扁平上皮細胞が含まれる。特定の実施形態では、これらに限定されないが、ランゲルハンス細胞の島、インスリン分泌細胞、アルファ－２細胞、ベータ細胞、機能的アルファ－１，３－ＧＴの発現を欠くブタ由来のアルファ－１細胞を含む膵臓細胞が提供される。生存不可能な誘導体としては、酵素処理または化学処理によって生存細胞を除去した組織が挙げられ、これらの組織誘導体は、移植で使用する前に架橋または他の化学処理を介してさらに処理することができる。いくつかの実施形態では、誘導体は、皮膚、尿、膀胱、または臓器粘膜下組織を含む様々な組織に由来する細胞外マトリックスを含む。また、医療機器として心臓弁を含む生存組織及び他の非生存組織を除去した腱、関節、及び骨が提供される。
いくつかの実施形態によれば、細胞は、多種多様な方法で順番に宿主に投与され得る。好ましい投与様式は、非経口、腹腔内、静脈内、皮内、硬膜外、髄腔内、胸骨内、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、皮下、眼窩内、嚢内、局所、経皮パッチであり、坐剤を含む直腸、膣、または尿道投与を介して、経皮、鼻スプレー、手術による移植、内科用塗料、注入ポンプ、またはカテーテルを介する。一実施形態では、薬剤及び担体は、直接組織注射またはボーラス、移植、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、またはナノスフィアなどの徐放製剤で投与される。
開示された細胞の注入によって治療され得る障害には、これらに限定されないが、正常な血液細胞産生及び成熟の機能不全の障害に起因する疾患（すなわち、再生不良性貧血及び低増殖性幹細胞障害）、造血器官における新生物性悪性疾患（例えば、白血病及びリンパ腫）、非造血起源の広範なスペクトルの悪性固形腫瘍、自己免疫状態、ならびに遺伝性障害が含まれる。このような障害には、これらに限定されないが、特発性の、薬物、放射線、または感染症に起因する、再生不良性貧血、汎血球減少症、無顆粒球症、血小板減少症、赤芽球癆、ブラックファン－ダイヤモンド症候群を含む、正常な血球産生の失敗または機能不全及び成熟過増殖性幹細胞障害から生じる疾患；急性リンパ芽球性（リンパ性）白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血、急性悪性骨髄硬化症、多発性骨髄腫、真性多血症、原発性骨髄線維症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含む、造血器悪性腫瘍；悪性黒色腫、胃癌、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、精巣癌、膠芽腫、横紋筋肉腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、リンパ腫を含む、悪性の固体腫瘍を有する患者における免疫抑制；関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、慢性肝炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスを含む、自己免疫疾患；家族性再生不良性貧血、ファンコニ症候群、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損、ホルムアミノトランスフェラーゼ欠損、レッシュ・ナイハン症候群、先天性赤血球形成異常性症候群Ｉ～ＩＶ、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損、ホルムアミノトランスフェラーゼ欠損、レッシュ・ナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天性楕円赤血球症、先天性有口赤血球症、先天性Ｒｈ ｎｕｌｌ疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｇ６ＰＤ（グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）バリアント１、２、３、ピルビン酸キナーゼ欠損、先天性エリスロポエチン感受性、欠損、鎌状赤血球症及び鎌状赤血球形質、サラセミアアルファ、ベータ、ガンマ、メト－ヘモグロビン血症、先天性免疫障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、不全リンパ球症候群、イオノフォア応答性複合型免疫不全症、キャッピング異常性を伴う複合型免疫不全症、ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損、顆粒球アクチン欠損、乳児無顆粒球症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ欠損、コストマン症候群、細網異形成症、先天性白血球機能障害症候群を含む、遺伝性（先天性）疾患；ならびにその他、例えば、骨粗鬆症、骨髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全症、原発性または続発性免疫不全症を引き起こす感染性障害、細菌感染症（例えば、ブルセラ症、リステリア症、結核、ハンセン病）、寄生虫感染症（例えば、マラリア、リーシュマニア症）、真菌感染症、リンパ球細胞セットの不均衡及び加齢による免疫機能低下を含む障害、食細胞障害、コストマン無顆粒球症、慢性肉芽腫症、チェディアック－東症候群、好中球アクチン欠損、好中球膜ＧＰ－１８０欠損、代謝性蓄積症、ムコ多糖症、ムコ脂質症、免疫機序を含む種々雑多な障害、ウィスコット・アルドリッチ症候群、アルファ１－アンチトリプシン欠乏症などが挙げられる。疾患または病理は、神経変性疾患、肝変性疾患、腎変性疾患、脊髄損傷、頭部外傷または手術、組織、臓器、または腺変性をもたらすウイルス感染などを含み得る。このような神経変性疾患には、これらに限定されないが、エイズ認知症症候群；脱髄疾患、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎；錐体外路障害及び小脳障害、例えば、エコルティコスピナル（ｅｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ）系の病変；大脳基底核の障害または小脳障害；多動性運動障害、例えば、ハンチントン舞踏病及び老人性舞踏病；薬物誘発性運動障害、例えば、ＣＮＳドーパミン受容体をブロックする薬物によって誘発されるもの；運動低下性運動障害、例えば、パーキンソン病；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；脊髄性運動失調症、例えば、フリードライヒ運動失調症、皮質性小脳変性症、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ－Ｄｒａｇｅｒ、及びＭａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性障害（ｓｙｓｔｅｒｍｉｏｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、例えば、レフサム病、無βリポタンパク質血症（ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｍｉａ）、運動失調症、毛細血管拡張症；及び多系統のミトコンドリア病；脱髄コア疾患、例えば、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；及び運動単位の障害、例えば、神経原性筋萎縮症（前角細胞変性症、例えば、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、及び若年性脊髄性筋萎縮症）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型老人性認知症；パーキンソン病、ウェルニッケ－コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト－ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎ハレルフォルデン－スパッツ病；ならびに拳闘家認知症が挙げられる。
２０２０年２月１２日に出願された米国仮特許出願第１６／８３０２１３号、第６２／９７５６１１号、２０２０年１月２２日に出願された第６２／９６４３９７号、２０１９年５月１５日に出願された第６２／８４８２７２号、２０１９年３月２５日に出願された第６２／８２３４５５号、及び２０１９年１０月４日に出願された米国非仮特許出願第１６／５９３７８５号（それは、２０１８年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／７４２，１８８号、２０１８年１１月７日に出願された第６２／７５６，９２５号、２０１８年１１月７日に出願されたＵＳ６２／７５６９５５、２０１８年１１月７日に出願されたＵＳ６２／７５６９７７、２０１８年１１月７日に出願されたＵＳ６２／７５６９９３、２０１９年１月１４日に出願されたＵＳ６２／７９２２８２、２０１９年１月２２日に出願されたＵＳ６２／７９５５２７、２０１９年３月２５日に出願されたＵＳ６２／８２３４５５、及び２０１９年５月１５日に出願されたＵＳ６２／８４８２７２の優先権の利益を主張するものである）（これらの文献は、あらゆる目的のために、参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる）により完全に記載されるように、ドナー動物細胞は、ドナー動物における完全な免疫機能が保持されるように再プログラムされ得るが、細胞表面発現タンパク質及び糖鎖は、それらがヒトレシピエントの免疫系によって外来物として認識されないように再プログラムされる。したがって、動物のゲノムの別々かつ少ない部分のみが、動物が機能的免疫系を保持するように再プログラムする必要があり得るが、動物の再プログラムされた細胞は、ヒトレシピエントの免疫系による攻撃を誘発する細胞表面発現タンパク質及び糖鎖を発現しない。
ブタドナーからの生物学的製品の採取に関して、非ヒト動物ドナーは、非トランスジェニックな遺伝的に再プログラムされたブタドナーから単離された細胞、組織、及び／または臓器の異種移植のための非トランスジェニックな遺伝的に再プログラムされたブタドナーであり、非トランスジェニックな遺伝的に再プログラムされたブタドナーは、野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の複数のエクソン領域中の複数のヌクレオチドを、ヒト捕捉配列からの既知のヒト主要組織適合性複合体のオルソロガスなエクソン領域からのヌクレオチドで置き換えるように再プログラムされているゲノムを含み、当該再プログラムは、いかなるフレームシフトまたはフレーム破壊も導入しない。さらなる特定の態様、詳細及び実施例は、以下の開示及び特許請求の範囲において提供され、それらの態様、詳細及び実施例の任意の及びすべての組み合わせは、本開示の態様を構成する。
他の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品は、生存可能な生存細胞（例えば、活力を有し、生物学的に活性である）製品であり、血管新生プロセスを完了させる能力を有さない最終滅菌された非生存細胞から構成される合成または他の組織ベースの製品とは異なる。さらに、いくつかの態様では、本開示の製品は、失活処理が行われないか、またはグルタルアルデヒドもしくは照射処理で「固定化」されない。
さらに他の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品は、正確な部位特異的変異原性置換または修飾を介して作成され、その設計は、かかる製品が実質的にそれらの自然状態になるように、副次的ゲノム破壊を最小限に抑え、付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、ゲノム組織破壊を回避する（例えば、関連する細胞、臓器、または組織の物理的改変なしで）。本開示は、その設計が、再プログラムされた遺伝子から発現されるタンパク質への翻訳後修飾の変化を最小限に抑えるか、または回避する部位特異的変異原性置換または修飾を含む。
ある特定の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品は、非ヒト動物ドナー、例えば、非トランスジェニックな遺伝的に再プログラムされたブタドナーから単離された細胞、組織、及び／または臓器を含む非トランスジェニックな遺伝的に再プログラムされたブタドナーから得られ、非トランスジェニックな遺伝的に再プログラムされたブタドナーは、野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の複数のエクソン領域中の複数のヌクレオチドを、ヒト捕捉配列からの既知のヒト主要組織適合性複合体配列のオルソロガスなエクソン領域からのヌクレオチドで置き換えるように再プログラムされたゲノムを含み、当該遺伝的に再プログラムされたブタドナーの細胞は、１つ以上の表面糖鎖エピトープを提示せず、当該再プログラムは、いかなるフレームシフトまたはフレーム破壊も導入しない。例えば、アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をコードする遺伝子は、当該遺伝子によってコードされる表面糖鎖エピトープが発現されないように破壊される。さらなる特定の態様、詳細及び実施例は、以下の開示及び特許請求の範囲において提供され、それらの態様、詳細及び実施例の任意の及びすべての組み合わせは、本開示の態様を構成する。
さらに他の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品は、ヒトレシピエントとの有機的な調和をもたらす能力を有し、こうした有機的な調和には、限定されないが、血管新生、コラーゲン増殖（例えば、皮膚に関するもの）、及び／または移植片接着、有機的な調和、もしくはレシピエントによる他の一次的もしくは永続的な許容を誘導する移植レシピエント由来の他の相互作用、との親和性が生じることが含まれる。
さらに他の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品は、免疫抑制剤または他の免疫抑制治療を使用することを必要とせずに、またはそれらの使用を少なくとも軽減して、異種移植において利用されて所望の治療結果が達成される。
他の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品のいくつか（例えば、皮膚）は、本発明に沿って、凍結保存によって保管されるか、新鮮なまま（凍結を伴うことなく）保管されるか、またはそのような製品を保存する他の方法を介して保管される。保管は、細胞及び組織の生存度を保つ条件及びプロセスを使用することを含む。
いくつかの態様では、保管は、氷上で滅菌等張液（例えば、抗生物質を含むか、または含まない滅菌生理食塩水）を使用するもの、－４０℃付近または－８０℃付近の温度で、凍結保存用液体中で凍結保存するもの、及び当該分野で知られる他の方法、の任意の組み合わせで臓器、組織、または細胞を保管することを含み得る。そのような保管は、一次封じ込め系及び二次封じ込め系において行われ得る。
さらに他の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品は、相同的使用のためのものとすることであり、こうした相同的使用は、すなわち、レシピエントの臓器、細胞、及び／または組織を、ドナーのものと同じ基本機能を果たす対応臓器、対応細胞、及び／または対応組織を用いて修復、再構築、置き換え、または補充を行うことである（例えば、ヒト腎臓用移植物としてブタドナー腎臓を使用すること、ヒト肝臓用移植物としてブタドナー肝臓を使用すること、ヒト皮膚用移植物としてブタドナー皮膚を使用すること、ヒト神経用移植物としてブタドナー神経を使用することなど）。
さらに他の態様では、本明細書に記載及び開示される異種移植製品は、バイオバーデンが少ないことで、製品のバイオバーデン及び異種移植時の製品に対するヒトの体の免疫学的拒絶反応の増加に働き得る病原体、抗体、遺伝子マーカー、及び他の特徴が最小化されている。こうした免疫学的拒絶反応には、自然免疫系がＰＲＲ及びＴＬＲを介してＰＡＭＰを検出し、対象異種移植製品を拒絶するものが含まれ得る。
本明細書に開示及び記載される態様は、本発明が包含する態様の特徴及び／または態様のうちの１つ以上を含む一連の態様または異なる態様を創出するために、任意の数の組み合わせにおいて適用可能であることが理解されよう。
本発明に従ってＤＰＦ閉鎖コロニーから得られる製品には多数の治療用途が存在することが理解されよう。例えば、そのような製品は、臓器、細胞、または組織の急性及び／または慢性の疾患、障害、または損傷、ならびに本明細書に開示の製品が利用され得るいずれか及びすべての他の病気を治療するために利用され得る。そのような治療及び／または療法には、そのような製品を（いくつかの態様では応急的に、他の態様では永続的に）利用して、ドナーのものと同じ基本機能（複数可）を果たすヒトレシピエントの対応臓器、対応細胞、及び／または対応組織を修復、再構築、置き換え、または補充することが含まれ得る。
特定の治療用途には、限定されないが、肺移植、肝臓移植、腎臓移植、膵臓移植、心臓移植、神経移植、及び他の完全移植または部分移植が含まれる。皮膚に関して、治療用途には、限定されないが、熱傷、糖尿病性潰瘍、静脈性潰瘍、慢性皮膚状態、ならびに他の皮膚病、皮膚損傷、及び／または皮膚状態（限定されないが、重度かつ広範な深達性の部分層及び全層の損傷、病気、及び／または状態を含む）の治療（例えば、本明細書の実施例１を参照のこと）、総体表面積の３０％以上を構成する真皮深層熱傷または全層熱傷を有する成人患者及び小児患者における使用（この使用は、任意選択で、分層自家移植片を併用して行われるか、または患者の創傷／熱傷の重症度及び程度が理由で分層自家移植片が選択肢となり得ない患者については単独で行われる）、本発明に従って得られる肝臓製品を用いる肝不全、創傷、病気、損傷、及び／または状態の治療、末梢神経損傷ならびに他の神経病、神経損傷、及び／または神経状態の治療、ならびにＤＰＦ閉鎖コロニーから採取される材料を利用する細胞治療及び他の治療も含まれ、こうした治療には、米国特許第７，７９５，４９３号（「Ｐｈｅｌｐｓ」）に開示の治療的使用が含まれ、こうした治療的使用には、ある特定の障害に対する細胞治療及び／または細胞注入（３０列目１行目～３１列名９行目に開示のもの）ならびにある特定の障害または病状の治療（３１列目１０～４２行目に開示のもの）が含まれ、当該文献の開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書には治療が具体的に記載されるが、こうした具体的な記載は、本明細書に開示及び記載される製品の治療用途の型をいかなる様式においても限定しないことが理解されよう。こうした治療用途の対象となるものには、下記の臓器、組織、及び／または細胞の急性及び／または慢性の疾患、障害、損傷が含まれる：皮膚、腎臓、肝臓、脳、副腎、肛門、膀胱、血液、血管、骨、脳、脳、軟骨、耳、食道、眼、腺、歯ぐき、毛、心臓、視床下部、腸、大腸、靱帯、唇、肺、リンパ、リンパ節及びリンパ管、乳腺、口、爪、鼻、卵巣、卵管、膵臓、陰茎、咽頭、下垂体、幽門、直腸、唾液腺、精嚢、骨格筋、皮膚、小腸、平滑筋、脊髄、脾臓、胃、腎上体、歯、腱、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、尿管、尿道、子宮、子宮、腟、乳輪組織、血液、咽頭扁桃組織、骨組織、褐色脂肪組織、網状組織、軟骨組織、軟骨、海綿組織、軟骨様組織、クロム親和性組織、結合組織、大動脈組織、弾性組織、上皮組織、表面被覆組織、脂肪組織、線維硝子組織、線維組織、ギャンジー包帯、ゼラチン様組織、肉芽組織、腸管関連リンパ系組織、ハラー脈管組織、硬性の造血組織、未分化組織、間質組織、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ系組織、間葉組織、中腎組織、膠様組織、多房性脂肪、筋組織、骨髄組織、軟組織鼻点、腎発生組織、神経組織、結節組織、骨組織、造骨組織、類骨組織、根尖周囲組織、細網組織、網状組織、ゴム状組織、骨格筋組織、平滑筋組織、及び皮下組織；血液細胞、血液前駆細胞、心筋細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、顆粒膜細胞、造血細胞、ランゲルハンス島細胞、ケラチノサイト、リンパ球（Ｂ及びＴ）、マクロファージ、メラノサイト、単球、単核細胞、神経系細胞、他の筋細胞、膵臓アルファ－１細胞、膵臓アルファ－２細胞、膵臓ベータ細胞、膵臓インスリン分泌細胞、脂肪細胞、上皮細胞、大動脈内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、アストロサイト、好塩基球、骨細胞、骨前駆細胞、心筋細胞、軟骨細胞、好酸球、赤血球、線維芽細胞、グリア細胞、肝細胞、ケラチノサイト、クッパー細胞、肝臓星状細胞、リンパ球、微小血管内皮細胞、単球、神経幹細胞、ニューロン、好中球、膵島細胞、上皮小体細胞、耳下腺細胞、血小板、始原幹細胞、シュワン細胞、平滑筋細胞、甲状腺細胞、腫瘍細胞、臍帯静脈内皮細胞、副腎細胞、抗原提示細胞、Ｂ細胞、膀胱細胞、頸部細胞、錐体細胞、卵細胞、上皮細胞、生殖細胞、有毛細胞、心臓細胞、腎細胞、ライディッヒ細胞、黄体細胞、マクロファージ、メモリー細胞、筋細胞、卵巣細胞、ペースメーカー細胞、管周細胞、下垂体細胞、形質細胞、前立腺細胞、赤血球、網膜細胞、桿体細胞、セルトリ細胞、体細胞、精子細胞、脾細胞、Ｔ細胞、精巣細胞、子宮細胞、腟上皮細胞、白血球、線毛細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、ドーパミン作動性細胞、胚性幹細胞、子宮内膜細胞、線維芽細胞、胎児線維芽細胞、濾胞細胞、杯細胞、角質化上皮細胞、肺細胞、乳腺細胞、粘液細胞、非角質化上皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、ならびに扁平上皮細胞。このリストは、急性及び／または慢性の疾患、障害、損傷、臓器不全または組織不全、ならびに本明細書に開示の製品が利用され得るいずれか及びすべての他の病気を治療するための一連の治療的使用を限定することを、いかなる様式においても意図するものではない。
熱傷（限定されないが、例えば、第ＩＩ度熱傷及び第ＩＩＩ度熱傷を含む）の治療に関して、いくつかの態様では、本発明に従って得られる皮膚製品は、重度かつ広範な深達性の部分層熱傷及び／または全層熱傷を有するヒト患者を治療するために使用される。そのような製品は、使用前にエクスビボで増殖しない最終分化した細胞型を含み、所期の治療期間中に適用部位から遊走することはない。したがって、腫瘍原性が生じる可能性は無視できる。
そのような製品は、創傷床に接着し、熱傷直後期間中に障壁機能を与える。そのような製品は、最終滅菌されていない生存細胞を有することから、レシピエントにおいて移植組織の血管新生を生じさせることが可能である。いくつかの態様では、表皮は、完全にインタクトなままであり、真皮成分は、様々な細胞及び組織の構造的な形態及び秩序が変化することなく維持される。この生理学的構造は、移植材料の生存長期化を支援し、同種移植片と同等以上の顕著な臨床効果を伴って少なくとも応急的な障壁機能を与える。いくつかの態様では、感染の臨床徴候（例えば、疼痛、浮腫、紅斑、温感、体液排出、臭気、または原因不明の発熱）が存在するか、または発生している場合、そうした感染の臨床徴候が、所定の期間（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間）減少もしくは消失するか、または対象が検査で感染陰性となるまでは、本開示の製品は適用されない。いくつかの態様では、創傷は、きれいにされ、うまく血管新生化されること、及び滲出がないことが確認される。真皮代用物（死体同種移植片など）も使用される場合、生着同種移植片から表皮層が除去された後に、生着真皮を除去することなく製品が適用される。表皮層は、施設の標準的作業手順に従って採皮機器または他の器具を用いて除去され得る。
臨床診療において通常使用される移植片は、脱細胞化及び／または再構成された均質化真皮シートからなり、この均質化真皮シートは、表在性創傷の応急的な被覆の達成に使用される。そのような従来の移植片は、元の組織構造も保持せず、代謝的な活性も有さず（これらは、通常なら細胞に自然に存在する）、それ故に、血管新生が誘導されず、内部への毛細血管成長または血管間の結合が生じない。対照的に、本明細書に記載の皮膚製品は、そのような移植片とは基本的に区別されるものであり、これは、本開示の製品が、患者の元の皮膚と同じ機能を発揮する生存細胞を含むためであり、すなわち、当該製品は、臓器移植物として働く。皮膚は、ホメオスタシス、温度制御、体液交流、及び感染阻止と関連する非常に重要な役割を追加で果たす。十分な量の皮膚が存在しないと、こうした機能を発揮する能力が損なわれることで、感染及び体液喪失に起因して死亡及び病的状態の発生率が高まり得る。皮膚移植物は、著しい創傷を有する患者にこうした転帰が生じることを阻止するために、注目すべき臨床的利点を伴って確実に使用されており、そうした移植片が応急的または永続的なものであるかは無関係である。したがって、他の提唱移植物とは異なり、免疫抑制剤の使用は軽減されるか、不要となることが想定される。実際、損傷によってあるレベルの免疫機能不全が既に生じている熱傷患者では、そのようなレジメンは禁忌となるであろう。したがって、成型されてシートまたはメッシュ状になった構成された均質化野生型ブタ真皮からなる従来の「異種移植」製品（ＥＺ－Ｄｅｒｍ（商標）またはＭｅｄｉ－Ｓｋｉｎ（商標）など）と本開示の異種移植製品を混同すべきではない。そのようなブタ異種移植は、血管新生を誘導せず、主に浅達性熱傷の応急的な被覆にのみに有用である。全く対照的に、本開示の異種移植製品は、供給源組織と同一の立体配座及び不変の形態の、代謝的に活性な細胞を含む。
いくつかの態様では、本開示は、ドナー皮膚を異種移植して、同じ動物ドナーから得られる他の臓器の拒絶反応を予測するための検査とすることを含む。ヒトドナー皮膚を使用してそのような予測試験を実施するための技術は、以前に、例えば、Ｍｏｒａｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９８９；４８（６）：９５１－２、Ｓｔａｒｚｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４０２９８０，１－９、Ｒｏｂｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．１９７５；２（７９３４）：５２１－４に記載されている。これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｍｏｒａｅｓの報告によれば、この交差適合手順は、早期の腎臓移植拒絶反応を予測する上で高度な正確性を有していた。Ｓｈａｃｋｍａｎの報告によれば、有望な生存ヒト腎臓ドナーから取り出した皮膚移植片の運命は、同じドナーから得られた腎臓移植の結果とよく相関するものである。本開示によれば、一態様では、本開示は、ヒト患者に皮膚試料を異種移植することで、同じ動物ドナーから異種移植する他の臓器がヒト患者において拒絶されるリスクが存在するかどうかを決定する方法を含む。
本明細書に記載の皮膚移植方法は、皮膚移植片が有用である任意の傷害を治療するために使用することができ、例えば、熱傷、例えば、部分的な厚さまたは切除された完全な厚さの熱傷、例えば、四肢上の分離した皮膚、糖尿病による傷、例えば、治癒していない糖尿病性の足の傷、静脈うっ血性潰瘍を含むが、これらに限定されない、部分的な厚さ及び完全な厚さの傷害を被覆するために使用することができる。
いくつかの態様では、本開示の異種移植製品は、規制上の要件を満たす薬物動態特性及び薬力学特性を有する。そのような特性を特徴付けるには、薬物の吸収、分布、代謝、及び排泄の古典的意義に関する特有の手法が必要である。薬物動態を考慮する目的のための異種移植製品の「吸収」は、異種移植製品に生じる血管新生プロセスによって説明され得る。例えば、術後間もなく、皮膚異種移植製品は、温かくて、柔らかい、及びピンク色として存在し得るが、一方、野生型または伝統的な異種移植は、非血管化した「白色の移植片」として現れる。いくつかの態様では、移植の分布は、移植部位を超える末梢血中のブタ細胞の存在または不在を実証するためのＤＮＡ ＰＣＲ試験によって確認されるように、移植部位に限定される。
他の態様では、本発明に従って生産される生物学的製品の細胞は、異種移植後に遊走してレシピエントに入り込むこと（レシピエントの循環に入り込むことを含む）はない。このことには、ＰＥＲＶまたはＰＥＲＶに感染したブタ細胞が遊走してレシピエントに入り込まないことが含まれる。そのような細胞が遊走してレシピエントに入り込まないことの確認は、多くの方法によって実施され得る。こうした方法には、移植部位ならびに灌流が高度に生じる臓器（例えば、肝臓、肺、腎臓、及び脾臓）から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び試料をＤＮＡ－ＰＣＲ分析することで、末梢血へのブタ細胞（ＤＮＡ）またはブタレトロウイルス（ＲＮＡ）成分の遊走がレシピエントにおいて生じなかったことを決定するか、またはその他の様式で実証するものが含まれる。
さらに、異種移植製品の生物学的利用率及び作用機構は、サイズの影響を受けない。異種移植製品の分布は、適用部位に限られる。例えば、皮膚移植物の場合、外傷または熱傷によって初期に創出される創傷床が清拭されたものが適用部位となる。本開示は、適用部位を超えて末梢血、創傷床、脾臓、及び／または腎臓に異種移植製品由来の細胞が分布していないかを検査して検出することを含む。ある特定の態様では、そのような検査では、適用部位を超えて末梢血、創傷床、脾臓、及び／または腎臓に異種移植製品由来の細胞が存在しないことが実証されることになる。そのような検査は、製品の取得元である型の動物に存在する様々な細胞マーカー（例えば、ＰＥＲＶ、ブタドナーＭＨＣ、及び他のブタドナーＤＮＡ配列）を検査するＤＮＡ ＰＣＲを含み得る。ある特定の態様では、異種移植製品由来の細胞及び核酸は、適用部位に限局して留まる。
異種移植製品の代謝は、生体によってそうした薬物が代謝分解されること（典型的には、特殊な酵素または酵素系を介して生じる）として伝統的には定義されるものであり、前述の自然宿主拒絶現象と一致し得、この自然宿主拒絶現象は、外因性の免疫抑制剤の非存在下で生じるものである。ヒトでの将来の使用が意図されるものと同じ製剤及び同一の適用経路を介して、臨床的に有用な期間中にそのような異種移植製品がたどる免疫拒絶過程は、同種移植片比較物と同様の遅延型のものである。
同様の様式で、異種移植製品の排泄は、抗体媒介性の血管損傷に起因してそうした移植物に壊死性の虚血が生じて、組織が最終的に死に至る結果として生じる臨床的な「脱落」現象によってモデル化され、実験的に監視され得る。
本開示の異種移植製品の有効性は、安全性、利用可能性、保管、有効期間、及び分布と併せて実証されており、これによって、現在の標準治療を上回る大きな利点が得られる。
いくつかの態様では、本開示の異種移植製品の「用量」は、単位移植面積当たりの製品中の生存細胞のパーセントとして表される。したがって、いくつかの態様では、本開示の異種移植製品は、医薬品中の活性医薬成分に類似するものとみなすことができる。
本開示の異種細胞、組織、または臓器の生存度は、以下のことを回避することによって上昇する：（ａ）異種移植製品への免疫細胞もしくは炎症性細胞の浸潤、または他の関連コンパートメント（血液及び脳脊髄液など）におけるそのような細胞の変化、（ｂ）異種移植製品の線維性被包（例えば、結果的に、機能が損なわれるもの、または異種移植製品が損失するもの）、（ｃ）異種移植製品の壊死、（ｄ）移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ならびに（ｅ）拒絶応答または炎症応答を弱めることを意図する封入または障壁をインビボで機能させ永続させること。
子ブタから血液試料が採取され、ＦＩＴＣ－ＩＢ４標識化及びフローサイトメトリーを使用して表現型（血液細胞の細胞表面上でのアルファガラクトースの発現を欠くこと）の検査が行われる。この発育段階において、すべての後代が、出生時に遺伝子型判定を受けることになる。ブタが野生型アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）遺伝子を有するかどうか、またはＧａｌ－Ｔノックアウト（Ｇａｌ－Ｔ－ＫＯ）についてブタがヘテロ接合型もしくはホモ接合型であるかどうかを、耳切時試料またはＰＢＭＣから単離されるＤＮＡを使用して決定するためのＰＣＲアッセイは確立されている。ゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットの指示に従ってＤＮｅａｓｙキットを使用してＰＢＭＣ（または皮膚組織）から単離される。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡならびに対照テンプレートＤＮＡ（野生型Ｇａｌ－Ｔ（＋／＋）、ヘテロ接合型Ｇａｌ－Ｔ－ＫＯ（＋／－）、及びホモ接合型Ｇａｌ－Ｔ－ＫＯ（－／－））で実施される。
７５－ｃｍ２フラスコに入れた培養培地（１０％ウシ胎児血清、ならびにグルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンが添加されたダルベッコ改変イーグル培地）中で維持されたサブコンフルエントの標的細胞（ヒト２９３（腎臓被覆組織）細胞株及びブタＳＴ－ＩＯＷＡ細胞株）とともに皮膚移植片のパンチ生検検体が共培養される。この生検検体は、標的細胞と接触させながら５日間保持された後、培養培地及び残存組織が除去され、必要に応じて継代培養によって標的細胞共培養物が維持される。培養上清中の逆転写酵素（ＲＴ）活性の存在によって標的細胞のＰＥＲＶ感染が決定される。伝染アッセイは、陰性とみなされる前に最低でも６０日間維持される。
安全性、同一性、純粋性、及び有効性を測定するための製品の特徴付けが実施される。安全性検査には、細菌及び真菌の無菌性、マイコプラズマ、ならびにウイルス物質が含まれる。本開示は、すべての最終異種移植製品の試料（すなわち、細胞もしくは組織、または臓器の生検検体）を、新鮮なものか、またはエクスビボでの培養から得られるものかにかかわらず、必要に応じてさらに検査するために凍結保存すること及び収集保管すること含む。場合によっては、例えば、異種移植製品がインタクトな全臓器である場合、関連代用試料（例えば、隣接組織または対側臓器）が収集保管される。
皮膚に関して、ブタ皮膚の保管及び凍結保存の特徴付けは完全には行われておらず、特に生存度に関しての特徴付けが不完全である。これは、ほとんどのブタ異種移植が意図的に失活されるか、またはグルタルアルデヒドもしくは照射処理を用いて「固定化」されるためである。そのような情報は、活力のあるブタ皮膚移植片またはブタ皮膚移植物を、応急的及び臨床的に有利な選択肢として使用することを支援する上で必要なものである。
異種移植製品を供給源動物から取り出した直後に移植する手順（全臓器の異種移植など）では、異種移植製品を臨床的に使用する前にその検査結果が利用不可能な場合があり得る。そのような場合、実施可能な検査は、そうした手順の前に行う供給源動物自体の検査がすべてとなり得る。そのような異種移植製品から採取される試料または適切な関連生物学的代用物（例えば、隣接組織もしくは対側臓器）の検査は、本開示に従って実施され得る。微生物学的検査方法は、以下の表２に示される態様を含み得る：
Figure 2023538663000003
Figure 2023538663000004
本開示は、塩化ナトリウム－ペプトン緩衝溶液（ｐＨ７．０）またはリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を使用して検査懸濁液を調製し、Ａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ｓｐｏｒｅｓを懸濁することを含み、０．０５％のポリソルベート８０が緩衝液に添加されてもよい。本開示は、２時間以内、または２℃～８℃で保存される場合、２４時間以内に懸濁液を使用することを含む。Ａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの新鮮な栄養細胞懸濁液を調製し、その後に希釈することの代替法としては、安定胞子懸濁液が調製され、その後にこの胞子懸濁液が適切な量で検査播種に使用される。安定胞子懸濁液は、検証期間中は２°～８°で維持され得る。検査条件を検証するために、検査調製物の代わりに選択希釈液を使用して陰性対照が実施される。微生物の増殖が生じてはならない。製品の検査時には、「製品の検査」に記載されるように陰性対照も実施される。陰性対照が失敗した場合は調査が必要である。微生物学的検査は、ＵＳＰ６１、ＵＳＰ６３、ＵＳＰ７１、ＵＳＰ８５ ＥＰセクション２．６．１３ 非滅菌製品の微生物検査（特定微生物の検査）に従って実施することができ、これらはそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ブタサイトメガロウイルス（ＰＣＭＶ）の検査に関して、供給源動物は、３ヶ月ごとにＰＣＭＶについてスクリーニングされる。しかしながら、帝王切開で得られた子ブタが、その後に閉鎖コロニーで一貫して育てられる場合、こうした子ブタはＰＣＭＶに感染しない。ＰＣＭＶの分析は、本明細書のＵＳ２０２０／０１０８１７５Ａ１に記載の試験中に実施し、下記のＰＣＲ法を使用してパンチ生検試料中にＰＣＭＶが検出されることはなかった。こうした結果は、鼻腔スワブから得られたＰＣＲ結果と一致していた。ＰＣＭＶの検査には定量的リアルタイムＰＣＲが利用される。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５Ｐを使用してリアルタイムＰＣＲによって標的ＤＮＡ配列を定量化した。各遺伝子標的に対して配列特異的プライマー及びＴａｑＭａｎプローブを生成させた。標的ＤＮＡ、８００ｎＭのプライマー、２００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ、２０ｎＭのＲｏｘ参照色素、及び１×Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ Ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを各２５ｕＬのＰＣＲ反応液に含めた。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りであった：９５℃５分のサイクルを１回実施後、９５℃１０秒の変性及び６０℃３０秒のアニーリング－伸長反応のサイクルを５０回実施し、各伸長反応の後にデータを収集。ゲル抽出増幅産物をクローニングしたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯプラスミドを段階希釈したものを定量化用標準物質として使用した。標的ＤＮＡの検出は、コピー数が１０～１０６となる直線ダイナミックレンジで行われる。ＰＣＭＶ ＤＮＡの定量化については、３００ｎｇの異種移植ブタ腎臓ＤＮＡをＴａｑＭａｎ ＰＣＲにおいて３連で分析した。ＰＣＭＶ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に特異的なプライマー及びプローブは、ＰＬＨＶ－１との交差反応性が存在しないことが示されている。帝王切開で得られたブタドナーを供給源動物として利用し、得られる閉鎖コロニーでの動物飼育を併せて行い、障壁隔離条件を維持することによって、動物がＰＣＭＶを含まないものとみなされる。皮膚に関して、（トリプルノックアウトとは対照的に、またはさらに遺伝的に操作されたブタドナーとさえ異なって）シングルノックアウトブタドナーを使用することでＵＳ２０２０／０１０８１７５Ａ１に記載の安全性及び有効性の結果が達成されたことは、同種移植片と同等の性能が得られたことを鑑みると、非常に驚くべきことであることに本発明らは気付いた。加えて、アルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジンモノリン酸－Ｎ－アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をコードする遺伝子に対する新規の遺伝子再プログラムを行うことによって、本開示（トリプルノックアウトブタドナー）によれば、免疫原性は、さらに低減され得、拒絶反応に対する耐性は、安全性及び有効性を増加させるためにさらに増加され得る。
いくつかの態様では、本開示は、図５２Ａ及び／または図５２Ｂに示される配列を有する遺伝子を有するブタドナー、細胞、組織、または臓器を含む。いくつかの態様では、本開示は、野生型ブタドナー遺伝子を再プログラムして、ＴＡＧＴＧＡＴＡＡを用いてブタドナー遺伝子の開始コドンの後の最初の９つのヌクレオチドを再プログラムする方法を含む。いくつかの態様では、再プログラムされたブタドナー遺伝子は、ＳＬＡ遺伝子、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２である。いくつかの態様では、再プログラムされたブタドナーゲノムは、ブタドナー遺伝子の開始コドン後の最初の９つのヌクレオチドをＴＡＧＴＧＡＴＡＡで置き換えることによって、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－ＤＲをコードする遺伝子を再プログラムすることによって、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上の機能的発現を欠く。いくつかの態様では、ＳＬＡ－ＤＲをコードする再プログラムされた遺伝子は、ＳＬＡ－ＤＲＡ、ＳＬＡ－ＤＲＢ、またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子である。
いくつかの態様では、異種移植製品の検査に使用される分析手順には、下記のものも含まれ得る：
ａ．ＵＳＰ＜７１＞無菌性。適切なようにトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）または液状チオグリコール酸培地（ＦＴＭ）に試料を移す。静菌作用及び静真菌作用については、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの２４時間培養物及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの２４時間培養物の１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満の種菌、ならびに胞子数１００未満のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓをＴＳＢ試料に添加する。ＦＴＭ試料に対しては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの２４時間培養物、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２４時間培養物、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓの２４時間培養物の１００ＣＦＵ未満の種菌を添加する。増殖が観察されない場合、その製品は静菌性または静真菌性であることが明らかとなり、ＵＳＰ＜７１＞無菌性検査に不合格である。
ｂ．好気性及び嫌気性細菌培養物。適切なようにトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）または液状チオグリコール酸培地（ＦＴＭ）に試料を移す。潜在的な増殖が可能になるように容器をインキュベートする。微生物が増殖したという証拠が見つからない場合、その製品は、ＵＳＰ＜７１＞に記載の無菌性検査に適合すると判断されることになる。
ｃ．マイコプラズマアッセイＵＳＰ＜６３＞。１００ｍＬのマイコプラズマＨａｙｆｌｉｃｋブロスに新鮮な試料を添加し、３７℃で最大２１日間インキュベートする。２～４日後、７～１０日後、１４日後、及び２１日後に試料を継代培養する。次に、プレートを３７℃で最大１４日間インキュベートし、マイコプラズマコロニーの存在について調べる。非検出の場合、その製品は、ＵＳＰ＜６３＞に適合することが明らかとなり、マイコプラズマを含まない。
ｄ．エンドトキシンＵＳＰ＜８５＞。カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）検査の阻害／促進について同じロット由来の３つの試料を検査する。試料当たり４０ｍＬのＷＦＩを用いて試料を３７℃で１時間抽出する。次に、５～５０ＥＵ／ｍＬの範囲の標準曲線を用いてＬＡＬカイネティック比色法において検証済希釈率で試料を検査する。ＵＳＰ＜８５＞に従ってアッセイを実施する。
ｅ．細胞生存率のためのＭＴＴアッセイ。［３－４，５ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）代謝についての生化学的アッセイを使用して医薬品の代謝活性を対照組織試料と比較して試験する。新鮮な異種移植製品組織（陽性対照）もしくは異種移植製品組織の熱不活化ディスク（陰性対照）である陽性対照試料及び陰性対照試料、または異種移植製品の検査品を、ＭＴＴ溶液（０．５ｍＬのＤＭＥＭ中０．３ｍｇ／ｍＬ）を含む黄褐色の微量遠心チューブに入れる。これらのディスクをＭＴＴホルマザンで処理し、空気中５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１８０±１５分間インキュベートする。それらのディスクを取り出すことによって反応を停止し、環境温度で≦２４時間のインキュベートを行うか、または４℃で≦７２時間の冷蔵を行うことによってホルマザンを抽出する。この間、試料の遮光を行う。抽出完了後に一定分量を取り、５５０ｎｍでの吸光度を測定し（６３０ｎｍを参照波長とする）、標準曲線と比較する。
ｆ．細胞外糖鎖エピトープのＩＢ４アッセイ。細胞上にガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）エピトープが存在しないことを、蛍光活性化フローサイトメトリーを使用して決定する。蛍光色素標識型イソレクチン－Ｂ４（ＦＩＴＣ－Ｉ－Ｂ４）を用いて全血中の白血球を染色し、野生型陽性対照から得た血液及びＧａｌ－Ｔ－ＫＯ供給源動物から得た血液に対する比較を２回行う。第１に、出生時にすべての供給源動物に検査を行う。第２に、供給源動物の屠殺時に採取した全血を用いて同じ検査を実施し、遺伝子ノックアウトの安定性及びガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）の陰性表現型について検査する。イソレクチンは、野生型ブタ由来の細胞上のエピトープに結合するが、Ｇａｌ－Ｔ－ＫＯブタ由来の細胞に結合は生じない。このアッセイは、遺伝的に操作された供給源動物中にガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）エピトープが存在しないことの確認となる。遺伝子が自発的に再び活性化し、屠殺後にガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）部分が再び発現していることはまずあり得ず、予期することは非合理的であるが、仮にアルファ－Ｇａｌ部分が含まれることになれば、異種移植製品の有効性に悪影響を及ぼし、異種移植製品が野生型ブタ組織と似たものとなり、以前に実証されたように超急性拒絶反応が生じることになる。
ｇ．ＰＥＲＶウイルスアッセイ。ＰＥＲＶ ｐｏｌの定量化 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ３００Ｐリアルタイムサーモサイクラー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５０サイクルのＰＥＲＶポリメラーゼ定量的ＴａｑＭａｎ ＰＣＲにおいてＲＴ反応液の１：６２５希釈液１０ｕＬを３連で増幅した。「ＲＴ酵素なし」の対照ＲＴ反応液の１：２５希釈液１０ｕＬを同様に処理した。ＰＣＲ条件では、ＰＥＲＶ ｐｏｌのフォワードプライマー及びリバースプライマー（最終濃度８００ｎＭ）及びＰＥＲＶ ｐｏｌのプローブ（最終濃度２００ｎＭ）を使用した。２０ｎＭのＲＯＸレポーター色素（６００８８０ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．０４ユニット／μＬのＵＮＧヌクレアーゼ（Ｎ８０８００９６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が添加されたＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ Ｆａｓｔマスターミックス（６００８８０ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。サイクル条件では、５０℃１０分のサイクルを１回実施後、９５℃１０分のサイクルを１回、９５℃１０秒の後６０℃３０秒のサイクルを５０回実施し、各サイクルの終了時にデータを収集した。ＰＥＲＶ ｐｏｌの絶対コピー数、ならびにブタＭＨＣ－Ｉ核酸及びブタＧＡＰＤＨ核酸の絶対コピー数をインプットｃＤＮＡのナノグラム当たりとして測定した。ＰＥＲＶ ＤＮＡ及びＰＥＲＶ ＲＮＡの存在について検査は、本明細書に記載のように解凍したパンチ生検試料、及び洗浄した異種移植製品で行う。
ｈ．組織学及び形態学。異種移植製品の試料を、記載の製造プロセス後に、細胞の形態及び秩序を検査するために採取する。視認検査による顕微鏡下での検証を行って異種移植製品組織の細胞の形態及び秩序が正しく、異常細胞浸潤集団が存在しないことを確かめる。
ｉ．出荷アッセイ試料採取方法論。すべての最終異種移植製品ロット単位が創出された時点で、必要な合否判定基準を得るための製造出荷アッセイにおいて使用するために独立かつ無作為に単位を選択する。こうした単位を、様々な研究業者へのロット出荷用として印を付け、必要なｃＧＭＰ条件に従って様々な分析検査を実施する。
同様に、ヒトでの臨床使用のための検証に先立って、最終異種移植製品はすべて、材料用のドナーブタを選択するための合否判定基準を満たさなくてはならず、こうした合否判定基準には、（ｉ）規定の系統についての医療記録の審査、（ｉｉ）フローサイトメトリーでの評価基準によるガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）の検査結果についての医療記録の審査、（ｉｉｉ）すべてのワクチン接種の実施歴についての医療記録の審査、（ｉｖ）ブタの生存期間にわたって実施される監視検査についての医療記録の審査、（ｖ）供給源動物の外来性病因物質スクリーニング、（ｖｉ）ブタの生存期間にわたる感染についての医療記録の審査、及び（ｖｉ）動物の生存期間中に認められた任意の皮膚異常についての医療記録の審査、が含まれる。
最終異種移植製品の管理方針及び分析検査が製造プロセスの終局時に実施された後で、臨床使用に向けての出荷が行われる。必要な分析検査の結果は、異種移植製品医薬品の各ロットに関するマスターバッチ記録とともに維持される異種移植製品医薬品分析証明書（ＣＯＡ）を介して文書化されることになる。
以下の表３は、異種移植製品材料に関して実施される一連の検査のアッセイ及び結果のリストである。
Figure 2023538663000005
Figure 2023538663000006
別の態様では、種、系統、地理的起源、組織型、及び生じる徴候を含めて、供給源動物に基づいて開発される外来性病因物質管理方針が含められることが理解されよう。細菌、真菌、マイコプラズマ、及びウイルス微生物を含むように、外来性病因物質についての分析検査が実施され、こうした分析検査には、下記のものが含まれる：
ｊ．細菌を含まない状態－細菌学的なスクリーニングを実施することで、ヒトで懸念が生じる可能性がある生物学的病因物質を医薬品が含まないことを確認する。好気性スクリーニング及び嫌気性スクリーニングの両方を実施して無菌性を確かめる。本明細書に記載のように試料を解凍し、適切なようにトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）または液状チオグリコール酸培地（ＦＴＭ）に移す。潜在的な増殖が可能になるように容器をインキュベートする。微生物が増殖したという証拠が見つからない場合、その製品は、無菌性検査に適合すると判断されることになる。
ｋ．菌類（真菌）を含まない状態－菌類のスクリーニングを実施することで、懸念が生じる可能性がある真菌物質を医薬品が含まないことを確認する。本明細書に記載のように試料を解凍する。解凍後、試料を大豆－カゼイン消化物寒天に移す。潜在的な増殖が可能になるように容器をインキュベートする。真菌が増殖したという証拠が見つからない場合、その製品は、ＵＳＰ＜７１＞に従う無菌性検査に適合すると判断されることになる。
ｌ．マイコプラズマを含まない状態－マイコプラズマのスクリーニングを実施することで、医薬品がマイコプラズマを含まないことを確認する。本明細書に記載のように試料を解凍し、１００ｍＬのマイコプラズマブロスに添加し、３７℃で最大２１日間インキュベートする。２～４日後、７～１０日後、１４日後、及び２１日後に試料を継代培養する。次に、プレートを３７℃で最大１４日間インキュベートし、マイコプラズマコロニーの存在について調べる。非検出の場合、その製品は、ＵＳＰ＜６３＞に適合することが明らかとなり、マイコプラズマを含まない。
ｍ．エンドトキシンを含まない状態－エンドトキシンのスクリーニングを実施することで、エンドトキシン及び関連懸念物質を医薬品が含まないことを確認する。カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）検査の阻害／促進について同じロット由来の３つの試料を検査する。本明細書に記載のように試料を解凍し、試料当たり４０ｍＬのＷＦＩを用いて３７℃で１時間抽出する。次に、５～５０ＥＵ／ｍＬの範囲の標準曲線を用いてＬＡＬカイネティック比色法において検証済希釈率で試料を検査する。ＵＳＰ＜８５＞に従ってアッセイを実施する。
ｎ．実施ウイルスアッセイ－ウイルスアッセイを実施することで、懸念が生じる可能性のあるウイルス物質を供給源動物が含まないことを確認する（内因性ウイルスの確認）（以下を参照されたい）。これは、共培養、及び特定の潜在性の内因性ウイルス（ＰＥＲＶを含む）のＲＴ－ＰＣＲ検査を含む。供給源動物に対してインビボアッセイも実施することで、ロット出荷判定基準の重要側面として動物の健康及びウイルス感染の不在を監視する。ＰＥＲＶはブタ組織に固有のものであるという性質を有するため、これによって、結果が陽性であっても、そのような組織を使用することが可能であるとみなされる。しかしながら、このウイルスをロット出荷に際して同定し、特徴付けることで、異種移植製品のレシピエントを監視するための情報を提供する。
ｏ．細胞生存度アッセイ－ＭＴＴアッセイを実施することで、異種移植製品中の細胞が生物学的に活性な状態であることを確認する。ミトコンドリア活性のサロゲートマーカーを陽性（新鮮であり、凍結保存されていない）対照及び陰性（熱変性）対照と比較することで生存度の証拠を得る。異種移植製品が所期の臨床機能を与えるには細胞の活性が必要である。このことは、ロット出荷判定基準として必要であり、組織生存度が、新鮮な組織対照比較物が示す代謝活性の５０％を下回るべきでないということが現在確立されている。
ｐ．組織学及び形態学。表皮層及び真皮層をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）切片染色による視認検査によって顕微鏡下での検証を行って異種移植製品組織及び細胞浸潤集団の細胞の形態及び秩序が正しいことが確かめられる。これを実施することで、異種移植製品に存在する細胞の生理学的な外見及び同一性が適切であることを確認する。異種移植製品は、ブタの真皮組織層及び表皮組織層から構成される。このことは、ロット出荷判定基準として必要である。表皮層中の下記の細胞層（最表層から最深層への順に記載される）の証拠を検証する：
ｉ．角質層
ｉｉ．顆粒層
ｉｉｉ．有棘層
ｉｖ．基底層
真皮層中の下記の細胞構造の証拠を検証する：
ｖ．血管（脈管構造の証拠）
ｖｉ．神経
ｖｉｉ．各種腺
ｖｉｉｉ．毛包
ｉｘ．コラーゲン
遺伝的に操作された供給源動物は、任意の外来性ＤＮＡもゲノムに導入されておらず、用いられる遺伝子修飾は、細胞表面抗原を遍在性に発現させる酵素のコードを担う単一の遺伝子のノックアウトのみである。１つ以上の態様における異種移植製品には、導入遺伝子技術（ＣＤ－４６トランスジェニックコンストラクトまたはＣＤ－５５トランスジェニックコンストラクトなど）が組み込まれていないことが理解されよう。
エンドトキシンのスクリーニングを実施することで、エンドトキシン及び関連懸念物質を医薬品が含まないことが確認される。エンドトキシン非含有状態を保証するためのプロトコールは以下の通りである：カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）検査の阻害／促進について同じロット由来の３つの試料を検査する。試料を解凍し、抽出し、ＵＳＰ＜８５＞に従って、５～５０ＥＵ／ｍＬの範囲の標準曲線を用いてＬＡＬカイネティック比色法において検証済希釈率で検査する。
ＭＴＴアッセイを実施することで、製品中の細胞が生物学的に活性な状態であることが確認される。ミトコンドリア活性のサロゲートマーカーを陽性（新鮮であり、凍結保存されていない）対照及び陰性（熱変性）対照と比較することで生存度の証拠が得られる。製品が所期の臨床機能及び生存度パラメーター（一態様については、５０％～１００％の範囲のミトコンドリア活性）を与えるには細胞の活性が必要である。
表皮層及び真皮層をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）切片染色による視認検査によって顕微鏡下での検証を行って異種移植製品組織及び細胞浸潤集団の細胞の形態及び秩序が正しいことが確かめられる。これを実施することで、製品に存在する細胞の生理学的な外見及び同一性が適切であることが確認される。
皮膚異種移植製品については、表皮層中の下記の細胞層（最表層から最深層への順に記載される）の証拠を検証する：角質層、顆粒層、有棘層、基底層。真皮層中の下記の細胞構造の証拠を検証する：血管、神経、腺、毛包、コラーゲン。
異種移植製品は、好気性細菌及び嫌気性細菌、真菌、ウイルス、ならびにマイコプラズマを含まない状態が確実に保持されるようにさらに加工され得る。異種移植製品は、採取直後、採取から１秒以内、２秒以内、３秒以内、４秒以内、５秒以内、６秒以内、７秒以内、８秒以内、９秒以内、１０秒以内、１０秒～１分以内、１分～１時間以内、１時間～１５時間以内、または１５時間～２４時間以内に、適用可能な無菌手法を使用して医薬品加工特別室の層流フード内の滅菌条件の下で滅菌され、この滅菌は、例えば、ＵＶ照射または抗微生物剤／抗真菌剤を１つ以上使用して行われる。一態様では、製品は、抗微生物／抗真菌槽（「抗病原体槽」）に入れられ得る。抗病原体槽は、１つ以上の抗細菌剤（例えば、アンピシリン、セフタジジム、ネオマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、ペニシリン、テトラサイクリン、バンコマイシン、及び同様のもの）、１つ以上の抗真菌剤（例えば、アムホテリシン－Ｂ、アゾール、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、カンジシジン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、リモシジン、アリルアミン、エキノキャンディン、及び同様のもの）、及び／または１つ以上の抗ウイルス剤を含み得る。抗病原体槽は、希釈剤として担体または媒体（例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地）を含み得る。いくつかの態様では、抗病原体槽は、少なくとも２つの抗細菌剤を含み得る。いくつかの態様では、抗病原体槽は、少なくとも２つの抗細菌剤及び少なくとも１つの抗真菌剤を含み得る。いくつかの態様では、抗病原体槽は、少なくとも４つの薬剤を含み得る。いくつかの態様では、抗病原体槽は、４つ以下、５つ以下、６つ以下、７つ以下、８つ以下、９つ以下、または１０個以下の薬剤を含み得る。いくつかの態様では、抗病原体槽は、前述のものを任意の組み合わせで含み得る。
一態様では、皮膚に関して、本発明に従ってブタドナーに由来する真皮組織からなる全層皮膚移植片創傷被覆材は、培養された表皮自家移植片と併せて使用されるか、または培養された表皮自家移植片と組み合わせて使用されることで、本開示による製品となり、この製品は、本開示の方法において使用することができるものである。適切な基質を確保するには、表皮自家移植片の適用に先立って、創傷床をしっかりと清拭することが必要である。創傷床が表皮自家移植片を受け入れる準備が整ったかを確認するために、本明細書に記載の皮膚製品（例えば、本開示の動物に由来する生物学的皮膚製品）が適用されて接着が確認される。接着が確認されると、この応急的創傷被覆製品が除去され、いくつかの態様では、メッシュ状自家移植を用いて創傷床が被覆され、この自家移植片メッシュ中のギャップを埋めるために１つ以上の培養表皮自家移植片製品が上に被せられる。
いくつかの態様では、創傷床は、慢性創傷もしくは急性創傷を含むか、または慢性創傷もしくは急性創傷であり得る。慢性創傷には、限定されないが、静脈性下腿潰瘍、褥瘡、及び糖尿病性足部潰瘍が含まれる。急性創傷には、限定されないが、熱傷、外傷、切断創傷、皮膚移植片提供部位、咬創、凍傷、皮膚剥離、及び外科的創傷が含まれる。
真皮が存在しない場合、本発明に従って製造された生物学的製品が利用される。そのような製品からは表皮が除去され（この除去は、例えば、ＶＥＲＳＡＪＥＴ（商標）Ｈｙｄｒｏｓｕｒｇｅｒｙシステムを用いてブタの真皮を採取する前に行われる）、その結果、真皮のみが残される。次に、対象生物学的製品が患者の皮下組織の上に配置され、本明細書に記載の培養表皮自家移植片プロセスの基質となる。
一態様では、本開示に従って得られる肝臓は、ヒト移植物が患者に移植されるまで、ヒト患者のための応急的フィルターとして体外灌流に利用される。ＤＰＦ隔離区域内の手術区域において、供給源動物が、全身麻酔（ケタミン、キシラジン、エンフルラン）下に置かれるか、または家畜銃によって安楽死される。次に、指定の病原体を含まない条件の下で供給源動物の肝切除が実施される。供給源動物から得られる肝臓製品は、包装され、ヒトドナー肝臓での現行方式に従う手順が行われる場所に輸送され得る。肝臓ろ過製品を利用するための手順は、例えば、静脈流入用にヒト患者の内頸静脈に動脈カニューレを経皮的に挿入し、静脈流出用に患者の大腿静脈に動脈カニューレを経皮的に挿入することによって実施され得る。これらのカニューレは、バイパス回路に連結され、このバイパス回路には、遠心ポンプ、熱交換器、人工肺、及びローラーポンプが組み込まれている。この回路は、晶質液を用いて開始準備が整えられ、本開示による動物に由来する肝臓が安定流速（例えば、６００～１０００ｍｌ／分）で組み込まれるまでの一定時間（例えば、１０～３０分）回され、当該肝臓は、晶質液槽において維持され、この晶質液槽には、温かい溶液（例えば、３０～４０℃）が時折補充される。
一態様では、本開示は、ドーパミン放出を回復させ、ヒト脳を神経再支配し、それによって神経変性疾患を治療及び逆転させる、最適化されたブタドナーからの免疫適合性ドーパミン作動性ニューロンを含む。
一態様では、本開示は、運動制御の進行性喪失を治療する、阻害する、及び逆転させるための方法を含む。ＰＤは、振戦、動作緩徐、硬直、及び姿勢の不安定によって特徴付けられる進行性変性疾患である。
一態様では、本開示は、α－シヌクレインの産生、輸送、及び処理に関与する遺伝子をサイレンシングすることによって、ミスフォールドα－シヌクレインタンパク質の凝集体の蓄積に耐性であるようにさらに修飾されるブタ免疫適合性ドーパミン作動性ニューロンを含む。
一態様では、本開示は、パーキンソン病患者において移植されたときに免疫寛容性であり、かつミスフォールドα－シヌクレインタンパク質の凝集体の蓄積に耐性である、免疫適合性ドーパミン作動性ニューロンを生成及び保存するための方法、生物学的システム、細胞、遺伝的に修飾された非ヒト動物、細胞、製品、ベクター、キット、及び／または遺伝物質を含む。
一態様では、本開示は、インビボでｍＤＡニューロンまたは前駆細胞にさらに分化される、臨床グレードのブタドナーから得られる間葉系幹細胞を含む。
一態様では、本開示は、パーキンソン病患者において移植されたときに免疫寛容性である免疫適合性ドーパミン作動性ニューロンを生成及び保存するための方法、生物学的システム、細胞、遺伝的に修飾された非ヒト動物、細胞、製品、ベクター、キット、及び／または遺伝物質を含む。
一態様では、本開示は、インビボでｍＤＡニューロンまたは前駆細胞にさらに分化される、臨床グレードのブタドナーから得られる免疫適合性間葉系幹細胞を生成及び保存するための方法、生物学的システム、細胞、遺伝的に修飾された非ヒト動物、細胞、製品、ベクター、キット、及び／または遺伝物質を含む。
一態様では、本開示は、ブタ由来細胞を脳の片側の線条体に注射することを含む手術を伴う方法を含む。いくつかの態様では、手術は段階的であり得る。例えば、細胞は、最初に、第１の段階で、脳のより症状がある側に投与されてもよく、次いで、細胞は、第２の段階で、脳のより症状のない側に投与されてもよい。
本開示による凍結保存及び保管は、本開示に従って生物学的製品を調製し、容器に入れ、凍結媒体を容器に添加し、密封することを含む。例えば、１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）凍結保護媒体がブタ胎児血清（ＦＰＳ）またはドナー血清（ＦＰＳが利用不可能な場合）と１：１の比で混合され、ろ過（０．４５ミクロン）され、使用するまで４℃に冷却される。その後、容器は、速度段階制御型フリーザー中で、毎分１℃の速度で－４０℃に凍結された後、－８０℃の温度に急速冷却さされる。ＤＭＳＯは、凍結プロセス中に細胞内液を取り換える。凍結保護媒体（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ）は、凍結保存用バイアルの最大内容量（１０ｍｌ）から異種移植製品の体積を差し引いた値に基づいて、約４０～８０％または約５０～７０％の量で使用される。外科的な使用のために凍結保存された生物学的製品を解凍するには、密封バイアルを約３７℃の水槽に約０．５～２分間置いてから容器を空け、滅菌手法を使用して製品を取り出した。その後、周囲の残留ＤＭＳＯを希釈し、全体的に除去し、細胞生存度が失われないようにするために、（例えば、生理食塩水中で）穏やかに撹拌しながら行う１分間の洗浄を３回実施する段階洗浄によって製品が洗浄される。次に、製品は、外科的に使用され得る。
異種移植製品は、無菌性の保持及びそれに対する損傷阻止を確保するための材料、容器、及びプロセスを使用して加工され、保管され、輸送され、及び／またはその他の様式で取り扱われ得ることが理解されよう。いくつかの態様では、異種移植製品を保護するために、滅菌された非接着材料を使用することができ、これによって、例えば、処理操作、保管、または輸送の間に、異種移植製品が支持され、表面への製品の接着が阻止され、及び／または異種移植製品の自己接着が阻止される。異種移植製品が意図せず接着すると、異種移植製品の完全性が破壊され、その治療的生存度が低下する可能性があり得る。滅菌された非接着材料を含めることで、保護及び／または物理的支持が得られ、接着が阻止される。いくつかの態様では、滅菌された非接着材料は、生物学的または化学的に不活性であり、異種移植製品自体の代謝活性または有効性に直接的に影響を与えない。
説明的で非限定的な項目リスト
本開示の態様は、下記の非限定的な項目リストによってさらに説明される。
項目１．移植のための個別化された、ヒト化された、移植可能な細胞、組織、及び臓器のリポジトリを生成及び保存するための生物学的システムであって、前記生物学的システムが、生物学的に活性及び代謝的に活性であり、前記生物学的システムが、ヒトレシピエントへの移植のために非ヒト動物ドナーにおいて遺伝的に再プログラムされた細胞、組織、及び臓器を含み、
前記非ヒト動物ドナーが、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーから単離された細胞、組織、及び／または臓器の異種移植のための遺伝的に再プログラムされたブタドナーであり、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の複数のエクソン領域中の複数のヌクレオチドを、ヒト捕捉参照配列からの複数の合成ヌクレオチドで置き換えるように再プログラムされているゲノムを含み、
前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーの細胞が、ガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及び／またはＳｄａから選択される１つ以上の表面糖鎖エピトープを提示せず、
アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をコードする遺伝子が、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、前記遺伝子によってコードされる表面糖鎖エピトープの機能的発現を欠くように破壊され、
前記再プログラムされたゲノムが、ｉ）ヒトレシピエントのＨＬＡ－Ｃのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－３、ならびにｉｉ）ヒト捕捉参照配列のそれぞれＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８、ならびにｉｉｉ）ヒトレシピエントのＨＬＡ－ＤＲ及びＨＬＡ－ＤＱのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱの、領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含み、
前記野生型ブタドナーのゲノムの内因性エクソン及び／またはイントロン領域が、再プログラムされておらず、
前記再プログラムされたゲノムが、以下のＡ～Ｄ：
Ａ）前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトβ２－のオルソロガスなエクソンからのヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーの２つのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの第１の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むこと；
Ｂ）
Ｃ）前記再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、前記野生型ブタドナーの２つの内因性ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドの第２の機能的発現を欠くように再プログラムされていること；
Ｄ）前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２のオルソロガスなエクソンからのヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むこと；を含み、
前記再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、前記野生型ブタドナーの内因性ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドの機能的発現を欠くように再プログラムされており、
前記再プログラムが、いかなるフレームシフトまたはフレーム破壊も導入しない、前記生物学的システム。
項目２．前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、非トランスジェニックである、項目１に記載の生物学的システム。
項目３．前記野生型ブタドナーのゲノムの内因性エクソン及び／またはイントロン領域が再プログラムされない、項目１または項目２に記載の生物学的システム。
項目４．前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、少なくとも以下：Ａｓｃａｒｉｓ種、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｓ ｓｔｅｒｏｃｏｌｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ブタ生殖器呼吸器症候群、仮性狂犬病、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｉｃｒｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、ブタインフルエンザ、ブタサイトメガロウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、及び家畜関連メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの病原体を含まない、項目１～３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目５．前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、バイオバーデン低減手順に従って維持され、前記手順が、隔離された閉鎖群中で前記ブタドナーを維持することを含み、前記隔離された閉鎖群中のすべての他の動物が、前記病原体を含まないことが確認され、前記ブタドナーが、前記隔離された閉鎖群の外部の任意の非ヒト動物ドナー及び動物収容施設との接触から隔離される、項目１～４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目６．前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、及びＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－ＤＲの機能的発現を欠く、項目１～４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目７．前記野生型ブタドナーゲノムが、ＣＴＬＡ－４プロモーター及びＰＤ－Ｌ１プロモーターのうちの１つ以上において再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ＣＴＬＡ－４プロモーター及び前記ＰＤ－Ｌ１プロモーターのうちの１つ以上が、前記野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１の内因性発現と比較して、再プログラムされたＣＴＬＡ－４及び再プログラムされたＰＤ－Ｌ１のうちの１つまたは両方の発現を増加させるように再プログラムされる、項目１～５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目８．前記合成ヌクレオチドの総数が、前記合成ヌクレオチドで前記野生型ブタドナーのゲノムを再プログラムした後に、ヌクレオチドの数に正味の損失または正味の利得がないように、前記置き換えられたヌクレオチドの総数に等しい、項目１～６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目９．前記複数の合成ヌクレオチドによる前記再プログラムが、前記野生型ブタドナーＭＨＣ配列と前記ヒト捕捉参照配列との間で保存されるアミノ酸をコードするコドン領域におけるヌクレオチドの置き換えを含まない、項目１～７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１０．前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列由来のオルソロガスなヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーの前記主要組織適合性複合体におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１１．部位特異的変異原性置換が、前記非ヒト動物ドナーを産生するために使用される生殖細胞において作製される、項目１～９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１２．前記ヒト捕捉参照配列が、ヒト患者捕捉配列、ヒト集団特異的ヒト捕捉配列、または対立遺伝子群特異的ヒト捕捉配列である、項目１～１０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１３．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ａ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－１の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～１１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１４．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｂ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～１２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１４．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｃ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－３の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～１３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１５．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｅ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－６の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～１４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１６．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｆ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－７の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～１５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１７．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｇ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－８の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～１６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１８．前記再プログラムされたゲノムが、前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩ鎖関連２（ＭＩＣ－２）の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～１７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目１９．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲ、ＳＬＡ－ＤＱ、またはそれらの組み合わせの機能的発現を欠く、項目１～１８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２０．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－ＤＱＡ捕捉参照配列のオルソロガスな領域に由来する前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱＡの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～１９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２１．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－ＤＱＢ捕捉参照配列のオルソロガスな領域に由来する前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱＢの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～２０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２２．前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のＨＬＡ－ＤＲＡ及びＨＬＡ－ＤＲＢのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＲＡ及びＳＬＡ－ＤＲＢの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むか、または前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＲＡ及びＳＬＡ－ＤＲＢの機能的発現を欠く、項目１～２１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２３．前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のＨＬＡ－ＤＱＡ及びＨＬＡ－ＤＱＢのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～２２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２４．前記ヌクレオチドの部位特異的変異原性置換が、前記野生型ブタドナーのゲノムと既知のヒト配列との間で保存されないコドンにある、項目１～２３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２５．前記再プログラムされたゲノムが、既知のヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のオルソロガスなエクソンに由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～２４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２６．前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のアミノ酸配列とオルソロガスであるヒト化ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチド配列であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、項目１～２５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２７．前記核ゲノムが、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが前記野生型ブタドナーの内因性ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドの機能的発現を欠くように再プログラムされている、項目１～２６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２８．前記核ゲノムが、前記ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座において、前記核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のβ２－ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように再プログラムされているように、再プログラムされている、項目１～２７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目２９．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、及びＭＩＣ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～２８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３０．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＱ及びＭＩＣ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～２９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３１．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱ、及びＭＩＣ－２におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～３０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３２．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＲ、ＳＬＡ－１、及び／またはＳＬＡ－２の機能的発現を欠く、項目１～３１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３３．前記核ゲノムが、フレームシフト、挿入変異、欠失変異、ミスセンス変異、及びナンセンス変異が存在しない、前記エクソン領域のスカーレス交換を使用して再プログラムされる、項目１～３２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３４．前記核ゲノムが、フレームシフト、ナンセンス、またはミスセンス変異を介してタンパク質発現の破壊を引き起こし得る、いかなる正味の挿入、欠失、切断、または他の遺伝子改変も導入せずに再プログラムされる、項目１～３３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３５．前記核ゲノムの内因性エクソン及び／またはイントロン領域におけるヌクレオチドが破壊されない、項目１～３４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３６．前記核ゲノムが、前記再プログラムされたエクソン領域においてホモ接合であるように再プログラムされる、項目１～３５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３７．前記核ゲノムが、ポリペプチドの細胞外、表現型表面発現がヒトレシピエントにおいて免疫寛容性であるように再プログラムされる、項目１～３６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３８．前記核ゲノムが、ＣＴＬＡ－４プロモーター配列を再プログラムすることによって、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の発現が増加するように再プログラムされる、項目１～３７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目３９．前記再プログラムされたゲノムが、ヒト捕捉参照配列ＣＴＬＡ－４のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ＣＴＬＡ－４の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～３８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目４０．前記再プログラムされた核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるＣＴＬＡ－４とオルソロガスであるヒト化ＣＴＬＡ－４ポリペプチド配列であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、項目１～３９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目４１．前記核ゲノムが、ＰＤ－Ｌ１プロモーター配列を再プログラムすることによって、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現が増加するように再プログラムされる、項目１～４０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目４２．前記再プログラムされたゲノムが、既知のヒトＰＤ－Ｌ１のオルソロガスなエクソンに由来するヌクレオチドでの、前記野生型ＰＤ－Ｌ１の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目１～４１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目４３．前記再プログラムされた核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるＰＤ－Ｌ１とオルソロガスであるヒト化ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド配列であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、項目１～４２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目４４．項目１～４３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた、遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な、非ヒト細胞、組織、または臓器。
項目４５．前記遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト細胞が、幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、または分化幹細胞である、項目４４に記載の、遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト細胞、組織、または臓器。
項目４６．前記幹細胞が、造血幹細胞である、項目４５に記載の、遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト細胞、組織、または臓器。
項目４７．前記遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト組織が、神経、骨、または皮膚である、項目４４に記載の、遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト細胞、組織、または臓器。
項目４８．前記遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト臓器が、固形臓器である、項目４４に記載の、遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト細胞、組織、または臓器。
項目４９．ガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及びＳｄａから選択される表面糖鎖エピトープの機能的発現を欠き、かつヒト捕捉参照配列のヒト化表現型を発現するように遺伝的に再プログラムされる核ゲノムを含む、遺伝的に再プログラムされたブタドナーを調製する方法であって、方法が、
ａ．ブタ胎児線維芽細胞、ブタ接合体、ブタ間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはブタ生殖細胞を得ることと、
ｂ．ａ）中の前記細胞を、機能的アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を欠くように遺伝的に改変することと、
ｃ．ｉ）ヒトレシピエントのゲノムのＨＬＡ－Ｃのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－３、ならびにｉｉ）ヒトレシピエントのゲノムのそれぞれＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、少なくとも１つの野生型ブタドナーのＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８、ならびにｉｉｉ）前記ヒトレシピエントのＨＬＡ－ＤＱのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱの、領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換のために、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲまたは任意の現在もしくは将来のマルチプレックス、精密遺伝子編集技術）／Ｃａｓを用いて、ｂ）中の前記細胞を遺伝的に再プログラムすることであって、
前記野生型ブタドナーのゲノムの内因性エクソン及び／またはイントロン領域が、再プログラムされておらず、
前記再プログラムされたゲノムが、以下のＡ～Ｄ：
Ａ）前記再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のオルソロガスなエクソンからのヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーの２つのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの第１の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むこと；
Ｂ）前記再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とオルソロガスであるヒト化ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチド配列であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むこと；
Ｃ）前記再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、前記野生型ブタドナーの２つの内因性ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドの第２の機能的発現を欠くように再プログラムされていること；
Ｄ）前記再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２のオルソロガスなエクソンからのヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むこと；のうちの少なくとも１つを含み、
前記再プログラムが、いかなるフレームシフトまたはフレーム破壊も導入しない、前記遺伝的に再プログラムすることと、
ｄ．ｃ）中の前記遺伝的に再プログラムされた細胞から胚を生成することと、
ｅ．前記胚を代用ブタに移植し、前記移植された胚を前記代用ブタ内で成長させることと、を含む、方法。
項目５０．ステップ（ａ）が、前記ヒト捕捉参照配列からの主要組織適合性複合体配列のオルソロガスなエクソン領域からのヌクレオチドでの、野生型ブタドナーの主要な組織適合性複合体の複数のエクソン領域における複数のヌクレオチドの置き換えをさらに含み、前記置き換えが、いかなるフレームシフトまたはフレーム破壊も導入しない、項目４９に記載の方法。
項目５１．前記置き換えが、前記既知のヒト主要組織適合性複合体配列に由来するオルソロガスなヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーの前記主要組織適合性複合体におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９もしくは５０またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５２．前記ヒト捕捉参照配列が、ヒト患者捕捉配列、ヒト集団特異的ヒト捕捉配列、または対立遺伝子群特異的ヒト捕捉配列である、項目４９～５１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５３．前記オルソロガスなエクソン領域が、前記野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の１つ以上の多型糖タンパク質である、項目４９～５２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５４．
前記代理ブタに前記胚を埋め込み、前記胚を妊娠させ、帝王切開によって前記代理ブタから子ブタを出産させることと、
少なくとも以下：
（ｉ）糞便物質中のＡｓｃａｒｉｓ種、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｓ ｓｔｅｒｏｃｏｌｉｓ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、
（ｉｉ）抗体力価を決定することによる、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、仮性狂犬病、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）／ブタ呼吸器コロナウイルス、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ Ｇｏｎｄｉｉ、
（ｉｉｉ）ブタインフルエンザ、
（ｉｖ）細菌培養によって決定される以下の細菌病原体：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、家畜関連メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＡ ＭＲＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｐｈｙｔｏｎ、及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．、
（ｖ）ブタサイトメガロウイルス、ならびに
（ｖｉ）Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、の人畜共通感染症病原体を前記子ブタが含まないことを確認することと、
バイオバーデン低減手順に従って前記子ブタを維持することであって、前記手順が、隔離された閉鎖群中で前記子ブタを維持することを含み、前記隔離された閉鎖群中のすべての他の動物が、前記人畜共通感染症病原体を含まないことが確認され、前記子ブタが、前記隔離された閉鎖群の外部の任意の非ヒト動物ドナー及び動物収容施設との接触から隔離される、前記維持することと、をさらに含む、項目４９～５３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５５．前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、及びＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＳＬＡ－ＤＲ、ＳＬＡ－１、及びＳＬＡ－２の機能的発現を欠く、項目４９～５４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５６．前記野生型ブタドナーゲノムが、ＣＴＬＡ－４プロモーター及びＰＤ－Ｌ１プロモーターのうちの１つ以上において再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ＣＴＬＡ－４プロモーター及び前記ＰＤ－Ｌ１プロモーターのうちの１つ以上が、前記野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１の内因性発現と比較して、再プログラムされたＣＴＬＡ－４及び再プログラムされたＰＤ－Ｌ１のうちの１つまたは両方の発現を増加させるように再プログラムされる、項目４９～５５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５７．前記合成ヌクレオチドの総数が、前記合成ヌクレオチドで前記野生型ブタドナーのゲノムを再プログラムした後に、ヌクレオチドの数に正味の損失または正味の利得がないように、前記置き換えられたヌクレオチドの総数に等しい、項目４９～５６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５８．前記複数の合成ヌクレオチドによる前記再プログラムが、前記野生型ブタドナーＭＨＣ配列と前記ヒト捕捉参照配列との間で保存されるアミノ酸をコードするコドン領域におけるヌクレオチドの置き換えを含まない、項目４９～５７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目５９．前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列由来のオルソロガスなヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーの前記主要組織適合性複合体におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～５８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６０．部位特異的変異原性置換が、前記非ヒト動物ドナーを産生するために使用される生殖細胞において作製される、項目４９～５９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６１．前記ヒト捕捉参照配列が、ヒト患者捕捉配列、ヒト集団特異的ヒト捕捉配列、または対立遺伝子群特異的ヒト捕捉配列である、項目４９～６０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６２．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ａ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－１の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～６１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６３．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｂ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～６２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６４．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｃ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－３の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～６３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６５．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｅ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－６の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～６４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６６．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｆ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－７の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～６５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６７．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｇ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－８の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～６６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６８．前記再プログラムされたゲノムが、前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩ鎖関連２（ＭＩＣ－２）の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項４９～６７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目６９．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－ＤＲ、またはそれらの組み合わせの機能的発現を欠く、項目４９～６８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７０．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－ＤＱＡ捕捉参照配列のオルソロガスな領域に由来する前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱＡの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～６９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７１．前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－ＤＱＢ捕捉参照配列のオルソロガスな領域に由来する前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱＢの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～７０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７２．前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のＨＬＡ－ＤＲＡ及びＨＬＡ－ＤＲＢのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＲＡ及びＳＬＡ－ＤＲＢの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～７１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７３．前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のＨＬＡ－ＤＱＡ及びＨＬＡ－ＤＱＢのオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢの領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～７２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７４．前記ヌクレオチドの部位特異的変異原性置換が、前記野生型ブタドナーの核ゲノムと既知のヒト配列との間で保存されないコドンにある、項目４９～７３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７５．前記再プログラムされたゲノムが、既知のヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のオルソロガスなエクソンに由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～７４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７６．前記再プログラムされたブタドナー核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のアミノ酸配列とオルソロガスであるヒト化ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチド配列であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、項目４９～７５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７７．前記核ゲノムが、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが前記野生型ブタドナーの内因性ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドの機能的発現を欠くように再プログラムされている、項目４９～７６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目７８．前記核ゲノムが、前記ブタドナーの内因性ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座において、前記核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように再プログラムされているように、再プログラムされている、項目４９～７７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システム。
項目７９．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、及びＭＩＣ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～７８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８０．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＱ及びＭＩＣ－２の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～７９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８１．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱ、及びＭＩＣ－２におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～８０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８２．前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＲ、ＳＬＡ－１、及び／またはＳＬＡ－２の機能的発現を欠く、項目４９～８１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８３．前記核ゲノムが、フレームシフト、挿入変異、欠失変異、ミスセンス変異、及びナンセンス変異が存在しない、前記エクソン領域のスカーレス交換を使用して再プログラムされる、項目４９～８２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８４．前記核ゲノムが、フレームシフト、ナンセンス、またはミスセンス変異を介してタンパク質発現の破壊を引き起こし得る、いかなる正味の挿入、欠失、切断、または他の遺伝子改変も導入せずに再プログラムされる、項目４９～８３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８５．前記核ゲノムの内因性エクソン及び／またはイントロン領域におけるヌクレオチドが破壊されない、項目４９～８４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８６．前記核ゲノムが、前記再プログラムされたエクソン領域においてホモ接合であるように再プログラムされる、項目４９～８５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８７．前記核ゲノムが、ポリペプチドの細胞外、表現型表面発現がヒトレシピエントにおいて免疫寛容性であるように再プログラムされる、項目４９～８６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８８．前記核ゲノムが、ＣＴＬＡ－４プロモーター配列を再プログラムすることによって、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の発現が増加するように再プログラムされる、項目４９～８７のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目８９．前記再プログラムされたゲノムが、ヒト捕捉参照配列ＣＴＬＡ－４のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ＣＴＬＡ－４の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～８８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目９０．前記再プログラムされた核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるＣＴＬＡ－４とオルソロガスであるヒト化ＣＴＬＡ－４ポリペプチド配列であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、項目４９～８９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目９１．前記核ゲノムが、ＰＤ－Ｌ１プロモーター配列を再プログラムすることによって、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現が増加するように再プログラムされる、項目４９～９０のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目９２．前記再プログラムされたゲノムが、既知のヒトＰＤ－Ｌ１のオルソロガスなエクソンに由来するヌクレオチドでの、前記野生型ＰＤ－Ｌ１の領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、項目４９～９１のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目９３．前記再プログラムされた核ゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるＰＤ－Ｌ１とオルソロガスであるヒト化ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド配列であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、項目４９～９２のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目９４．レシピエントヒトにおける、異種移植細胞、組織、または臓器に対する少なくとも部分的な免疫寛容を誘導する方法であって、
項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする１つ以上の領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
項目９５．異種移植のナチュラルキラー細胞媒介性拒絶反応を低減する方法であって、項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠き、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含む、前記産生するかまたは得ることと、前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
項目９６．異種移植の細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠き、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含む、前記産生するかまたは得ることと、
前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記ヒトレシピエントに移植することと、を含む、前記方法。
項目９７．レシピエントヒトにおける、異種移植細胞、組織、または臓器に対する凝固性及び／または血栓性虚血を予防または低減する方法であって、
項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠き、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記野生型ブタドナーの内皮タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）、トロンボモジュリン（ＴＢＭ）、及び組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含む、前記産生するかまたは得ることと、
前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記ヒトレシピエントに移植することと、を含む、前記方法。
項目９８．異種移植のＭＨＣクラスＩａ媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつＳＬＡ－３、ならびに前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＳＬＡ－１、及びＳＬＡ－２の機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記ヒトレシピエントに移植することと、を含む、前記方法。
項目９９．異種移植のＭＨＣクラスＩｂ媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８、ならびに前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記ヒトレシピエントに移植することと、を含む、前記方法。
項目１００．異種移植のＭＨＣクラスＩＩ媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつＳＬＡ－ＤＲ及びＳＬＡ－ＤＱのうちの少なくとも１つと前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの１つ以上とコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
項目１０１．異種移植のアポトーシス細胞媒介性拒絶反応を阻害する方法であって、
項目１～４８のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の機能的発現を欠き、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含む、前記産生するかまたは得ることと、
前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記ヒトレシピエントに移植することと、を含む、前記方法。
項目１０２．異種移植のためのブタドナー組織または臓器を産生する方法であって、前記ブタドナー組織または臓器の細胞が、レシピエント固有の表面表現型によって特徴付けられるように遺伝的に再プログラムされ、方法が、
有望なヒト移植レシピエントからＤＮＡを含有する生体試料を得ることと、
前記生体試料の全ゲノム配列決定を行い、ヒト捕捉参照配列を得ることと、
ヒト捕捉参照配列を、遺伝子座（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）ＳＬＡ－３をコードするエクソン領域、
（ｉｉ）ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８をコードするエクソン領域、
（ｉｉｉ）ＳＬＡ－ＤＱをコードするエクソン領域、
（ｉｖ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする１つ以上のエクソン、
（ｖ）ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子ならびにＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、及びＴＦＰＩをコードする遺伝子のエクソン領域で前記ブタドナーの前記野生型ゲノムと比較することと、前記遺伝子座（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上について１０～３５０塩基対の長さの前記ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された合成ヌクレオチド配列を作成することであって、前記ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された前記合成ヌクレオチド配列が、ブタドナー遺伝子座（ｉ）～（ｖｉ）に対応するオルソロガスな遺伝子座（ｖｉ）～（ｘ）で前記ヒト捕捉参照配列と少なくとも９５％同一である、前記作成することと、
（ｖｉ）ＨＬＡ－Ｃをコードするエクソン領域、
（ｖｉｉ）ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇをコードするエクソン領域、
（ｖｉｉｉ）ＨＬＡ－ＤＱをコードするエクソン領域、
（ｉｘ）ヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする１つ以上のエクソン、
（ｘ）前記ヒト捕捉参照配列からＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、及びＴＦＰＩをコードするエクソン領域；（ｉ）～（ｖ）のヌクレオチド配列を、前記ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された、当該合成ヌクレオチド配列で置き換えることと、前記ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された、前記合成ヌクレオチド配列を有する遺伝的に再プログラムされたブタドナーから、異種移植のための前記ブタドナー組織または臓器を得ることと、を含む、方法。
項目１０３．前記合成ヌクレオチド配列を有する前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、少なくとも以下：
（ｉ）糞便物質中のＡｓｃａｒｉｓ種、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｓ ｓｔｅｒｏｃｏｌｉｓ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、
（ｉｉ）抗体力価を決定することによる、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、仮性狂犬病、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）／ブタ呼吸器コロナウイルス、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ Ｇｏｎｄｉｉ、
（ｉｉｉ）ブタインフルエンザ、
（ｉｖ）細菌培養によって決定される以下の細菌病原体：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、家畜関連メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＡ ＭＲＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｐｈｙｔｏｎ、及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．、
（ｖ）ブタサイトメガロウイルス、ならびに
（ｖｉ）Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、の人獣共通病原体を含まないことを確認することをさらに含む、項目１０２に記載の方法。
項目１０４．バイオバーデン低減手順に従って前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーを維持することをさらに含み、前記手順が、隔離された閉鎖群中で前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーを維持することを含み、前記隔離された閉鎖群中のすべての他の動物が、前記人獣共通病原体を含まないことが確認され、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、前記隔離された閉鎖群の外部の任意の非ヒト動物ドナー及び動物収容施設との接触から隔離される、項目１０２～１０３のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目１０５．前記ブタから生物学的製品を採取することをさらに含み、前記採取することが、前記ブタを安楽死させること、及び前記ブタから前記生物学的製品を無菌的に取り出すことをさらに含む、項目１０２～１０４のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目１０６．３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイによって決定される５０％未満の細胞生存度に細胞生存度を低下させない滅菌プロセスを使用する採取後の滅菌を含む前記生物学的製品を加工することをさらに含む、項目１０２～１０５のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目１０７．細胞生存度を保存する貯蔵条件下で、滅菌容器中で前記生物学的製品を貯蔵することをさらに含む、項目１０２～１０６のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の方法。
項目１０８．項目１～４９のいずれか１項またはそれらの組み合わせに記載の核ゲノムを含む遺伝的に再プログラムされたブタドナーにおけるオフターゲット編集またはゲノム改変についてスクリーニングする方法であって、前記ブタドナー核ゲノムの遺伝的な再プログラムを行う前に、ブタドナーからのＤＮＡを含有する生体試料について全ゲノム配列決定を行い、それによって、第１の全ゲノム配列を取得することと、前記ブタドナー核ゲノムの再プログラム後に、全ゲノム配列決定を行って、第２の全ゲノム配列を取得することと、前記第１の全ゲノム配列及び前記第２の全ゲノム配列を整列させて、配列アラインメントを取得することと、前記配列アラインメントを分析して、オフターゲット部位における前記ブタドナーのゲノムに対する任意のミスマッチを識別することと、を含む、前記方法。
項目１０９．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＨＣクラスＩａ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記ＳＬＡ－３と前記ヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｃとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｃのコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－３をコードする領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１０．ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、野生型ブタドナーのＳＬＡ－１及びＳＬＡ－２がそれぞれ、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらの１、２、及び／または３つの連続した組み合わせを含み、いくつかの場合では、所望のサイレンシング（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得る、項目１０９に記載の合成ヌクレオチド配列。
項目１１１．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＨＣクラスＩｂ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／または内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつそれぞれＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８と前記ヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のそれぞれＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇのコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８をコードする領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１２．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、項目１０９及び１１１の両方、または項目１１０及び１１１の両方に記載の合成ヌクレオチド配列を有する、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１３．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＨＣクラスＩＩ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／または内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつそれぞれＳＬＡ－ＤＱと前記ヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－ＤＱとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のそれぞれＨＬＡ－ＤＱのコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＱをコードする領域で再プログラムされており、前記野生型ブタドナーのＳＬＡ－ＤＲが、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）、またはこれらのうちの１つ、２つ、及び／または３つの連続した組み合わせを含み、いくつかの場合では、所望のサイレンシングされた（ＫＯ）遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流で置換され得る、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１４．合成ヌクレオチド配列であって、項目１０９及び１１３の両方、項目１１０及び１１３の両方、または項目１１２及び１１３の両方に記載の合成ヌクレオチド配列を有し、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１５．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／または内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のコドンを用いて前記野生型ブタドナーのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする領域で再プログラムされており、前記ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された前記合成ヌクレオチド配列が、前記合成ヌクレオチド配列が前記野生型ブタドナーのβ２－ポリペプチドの機能的発現を欠くように、エクソン領域において少なくとも１つの終止コドンを含む、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１６．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＭＩＣ－２由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記ＭＩＣ－２と前記ヒト捕捉参照配列由来のＭＩＣ－ＡまたはＭＩＣ－Ｂとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来の前記ＭＩＣ－Ａまたは前記ＭＩＣ－Ｂのコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＭＩＣ－２の領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１７．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＣＴＬＡ－４由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４と前記ヒト捕捉参照配列由来のＣＴＬＡ－４との間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＣＴＬＡ－４のコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＣＴＬＡ－４をコードする領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１８．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＰＤ－Ｌ１由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記野生型ブタドナーのＰＤ－Ｌ１と前記ヒト捕捉参照配列由来のＰＤ－Ｌ１との間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＰＤ－Ｌ１のコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＰＤ－Ｌ１をコードする領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１１９．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＥＰＣＲ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記野生型ブタドナーのＥＰＣＲと前記ヒト捕捉参照配列由来のＥＰＣＲとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＥＰＣＲのコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＥＰＣＲをコードする領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１２０．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＴＢＭ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記野生型ブタドナーのＴＢＭと前記ヒト捕捉参照配列由来のＴＢＭとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＴＢＭのコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＴＢＭをコードする領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１２１．合成ヌクレオチド配列であって、ヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計され、かつ野生型ブタドナーＴＦＰＩ由来の野生型ブタドナー内因性エクソン及び／またはイントロン領域を有し、かつ前記野生型ブタドナーのＴＦＰＩと前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＴＦＰＩとの間で保存されていないアミノ酸をコードするヒト捕捉参照配列由来のＴＦＰＩのコドンを用いて前記野生型ブタドナーのＴＦＰＩをコードする領域で再プログラムされた、前記合成ヌクレオチド配列。
項目１２２．任意の項目の生物学的システム（動物）は、Ｏ陰性の血液型を有し得る。
項目１２３．タンパク質、細胞、組織、及び臓器の調達が、コーシャ方法論で行われる、いずれかの項目に記載の生成物の方法。
本発明は、下記の実施例においてさらに詳細に説明されるが、こうした実施例は例示のために提供されるものにすぎず、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
実施例１
ヒト臨床異種移植の成功
ヒト患者における重度かつ広範囲の部分的及び完全な厚さの火傷の治療のための本開示の異種移植製品のヒト評価において、以下の結果を得た：
患者は、混合した深度の、炎により誘発された火傷を呈し、図５１Ａに示すように、具体的には右側外側腋窩（上縁）から第６右側外側肋骨（下縁）までの、（解剖学的な）右側上部胴体に１４％の全身表面積（ＴＢＳＡ）欠損をもたらした。
外科医は、ヒト死亡ドナー（ＨＤＤ）同種移植片及び本開示の異種移植産物を用いて、患部の創傷領域の一部を一時的に移植した。創傷領域の残りの領域は、陰圧創傷療法（ＮＰＷＴ）で被覆した。図５１Ｂに具体的に示されるように、患者は、１：１．５の比率で網目状にした約１５０ｃｍ２のＨＤＤ同種移植片と、１：１の比率で網目状にした２５ｃｍ２の本開示の異種移植製品とを手術中に受けた。
両方の一時的な創傷閉鎖包帯は隣接して配置されたが、直接接触しておらず、組織（複数可）の周囲にホッチキスで固定され、ＮＰＷＴで覆われた。
５日目での第１の創傷包帯交換時の臨床的な目視検査では、図５１Ｃに示されるようにＨＤＤ同種移植片及び本開示の異種移植産物はともに、下層の創傷床に完全に付着しており、区別できないことが観察された。
患者は有害事象を発現せず、異種移植製品に関連する重篤な有害事象は観察または報告されなかった。
通常の臨床標準の治療に従って、ＨＤＤ同種移植片及び本開示の異種移植製品の両方を、第１の創傷包帯交換時に除去した。機械的除去後、下層の創傷床は等しく灌流され（目に見える点状出血を伴う）、それ以外は図５１Ｄに示すように等価であるように見えた。
ＨＤＤ同種移植片のための創傷床に隣接する本開示の異種移植製品の創傷床の５日目のクローズアップ画像を図５１Ｅに示す。
除去後５日目において、治療の臨床基準に従って、図５１Ｆに示すように、患者から得られた自己（自家）移植片（自己分層皮膚移植片）による生着を介して、患部全体が確定的な創傷閉鎖を受けた。
プロトコールに従って、感染症、免疫応答、及び長期評価のための血液試料、ならびに術前、術中、及び術後の写真を得た。
（最初の手術からの）１４日目において、創傷包帯交換時の臨床観察は、図５１Ｇに示されるように、任意の位置において創傷治癒速度または質において識別可能な差異を示さなかった。
プロトコールに従って、感染症、免疫応答、及び長期評価のための血液試料、ならびに術前、術中、及び術後の写真を得た。
定量的ＲＴ－ＰＣＲによるＰＥＲＶの検出のための試験を、ベースライン血液試料（２５ｍＬ）、第１の包帯変更（２１ｍＬ）、及び２週間血液試料（２３ｍＬ）に対して行った。結果は以下の通りであった。
ＰＥＲＶは、ＰＢＭＣから単離されたＲＮＡまたはＤＮＡ、及び血漿から単離されたＲＮＡのいずれにおいてもｑＰＣＲによって検出されなかった。ＰＢＭＣから単離したＲＮＡには、ブタｍｔＣＯＩＩ遺伝子に指向したｑＰＣＲによって決定されるようなブタ細胞の証拠は見出されなかった。
Figure 2023538663000007
さらに、マイトマイシンＣで処理したブタ刺激細胞（ＧａｌＴ－ＫＯブタＢ１７３）の存在下でのヒトリンパ球応答性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖応答を経時的に評価するための研究を実施する。ＰＢＭＣ試料は、ブタ皮膚移植片の移植前及び移植後の両方で、治験委託者試験ＸＴ－００１に登録した患者から得た。ブタ皮膚移植片は、遺伝的に操作されたＧａｌＴ－ＫＯブタから得た。
患者のＰＢＭＣ試料は、予めフィコール勾配遠心分離により調製され、凍結保存された。皮膚ドナーブタ（Ｂ１７３）からの全血は、診断検査施設に出荷され、ＰＢＭＣは、フィコール勾配遠心分離により単離され、凍結保存された。ＭＬＲを設定する前日、試料を３７℃で解凍し、洗浄し、１０％のＦＢＳ／ＲＰＭＩ中で一晩保管した。ブタＰＢＭＣをマイトマイシンＣで処理し（刺激剤）、等数の試験ヒトＰＢＭＣ（レスポンダー）と混合した。ＭＬＲを、６日目にＢｒｄＵを添加して７日間インキュベートした。７日目にＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡを実行し、増殖を測定した。
さらに、ＧａｌＴ－ＫＯブタから得られたブタ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へのヒト血漿抗ブタＩｇＭ及びＩｇＧ結合のレベルを経時的に測定する研究を実施する。血漿試料は、ブタ皮膚移植片の移植前及び移植後の両方で、治験委託者試験ＸＴ－００１に登録した患者から採取した。ブタ皮膚移植片は、遺伝的に操作されたＧａｌＴ－ＫＯブタから得た。
この研究では、血漿試料を５６℃の乾燥熱浴中で３０分間解離させた。試料を冷却し、ＦＡＣＳ結合／洗浄媒体中で連続希釈した。次いで、希釈した血漿試料をＫＯブタＰＢＭＣとともにインキュベートし、続いて二次抗体（ＰＥ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ及びＦＩＴＣ－ヤギ抗ヒトＩｇＭ）とともにインキュベートした。適切な補正、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）、及びブランク限界（ＬＯＢ）対照を同じアッセイにおいて実行した。細胞を取得し、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。抗ブタＩｇＭ及びＩｇＧの結合を、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及び以下のように得られた相対的ＭＦＩを使用して評価した：相対的ＭＦＩ＝実際のＭＦＩ値／ＬＯＢ（血漿の不在下でのみ二次抗体を使用して得られるＭＦＩ）。
ヒト血漿ＩｇＭ及びＩｇＧ結合は、移植前及び移植後を含む４つの時点（７日目、１６日目、３０日目）において測定された。１：２及び１：１０希釈での、すべての実際の試験試料は、ＬＯＢ値よりも高いＭＦＩ値が示された。図５３に示されるように、抗異種ＩｇＭ及びＩｇＧレベルの増加は、相対的に中央値の蛍光強度の増加によって示されるように、１６日目及び３０日目に既存のレベルを上回って得られた。７ＡＡＤによって決定されたアッセイ後の細胞生存率の平均値は、９２．８２％であった。細胞を生細胞上でのみゲート化して、ブタＰＢＭＣに対するＩｇＭ及びＩｇＧ結合を決定した。
この実施例では、ＧａｌＴ－ＫＯブタから得られたブタ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へのヒト血漿抗ブタＩｇＭ及びＩｇＧ結合のレベルを経時的に測定した。血漿試料は、ブタ皮膚移植片の移植前及び移植後の両方で、治験委託者試験ＸＴ－００１に登録した患者から得た。ブタ皮膚移植片は、遺伝的に操作されたＧａｌＴ－ＫＯブタから得た。
血漿試料を５６℃の乾燥熱浴中で３０分間解離させた。試料を冷却し、ＦＡＣＳ結合／洗浄媒体中で連続希釈した。次いで、希釈した血漿試料をＧａｌＴ－ＫＯブタＰＢＭＣとともにインキュベートし、続いて二次抗体（ＰＥ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ及びＦＩＴＣ－ヤギ抗ヒトＩｇＭ）とともにインキュベートした。適切な補正、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）、及びブランク限界（ＬＯＢ）対照を同じアッセイにおいて実行した。細胞を取得し、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。抗ブタＩｇＭ及びＩｇＧの結合を、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及び以下のように得られた相対的ＭＦＩを使用して評価した：相対的ＭＦＩ＝実際のＭＦＩ値／ＬＯＢ（血漿の不在下でのみ二次抗体を使用して得られるＭＦＩ）。
ヒト血漿ＩｇＭ及びＩｇＧ結合は、移植前及び移植後を含む４つの時点（７日目、１６日目、３０日目）において測定された。１：２及び１：１０希釈での、すべての実際の試験試料は、ＬＯＢ値よりも高いＭＦＩ値が示された。７ＡＡＤによって決定されたアッセイ後の細胞生存率の平均値は、９２．８２％であった。細胞を生細胞上でのみゲート化して、ブタＰＢＭＣに対するＩｇＭ及びＩｇＧ結合を決定した。
抗異種ＩｇＭ及びＩｇＧレベルの増加は、相対的に中央値の蛍光強度の増加によって示されるように、１６日目及び３０日目に既存のレベルを上回って得られた（図１、２、３、４、及び５）。
ＩｇＭの６．８倍の増加及びＩｇＧ結合の２５３．４倍の増加を、１６日目に得た。３０日目に、ＩｇＭ及びＩｇＧ結合においてそれぞれ４．６倍及び１７９．９倍に増加が減少した。
すべての試験の複製に対して平均ＣＶ％＜１０を複製する。
実際の実験では、ＦＳＣ－Ｈ及びＳＳＣ－Ｈ密度プロット（ゲートＥ５－ＭＡＩＮ）のゲートは、５０，０００イベントに設定され、イベントは各ウェルで＞５，０００であった。
その後、５人のさらなる患者が治療され、同様の成功した結果であった。
実施例２
ＭＨＣクラスＩＩ実験シリーズのサイレンシング及び個別化
本開示は、以下の遺伝子修飾の実施形態を含む。
Figure 2023538663000008
Figure 2023538663000009
この実施例では、ＰＡＭ細胞を、ヒトＰＢＭＣドナーとのＭＬＲ様形式でヒトＰＢＭＣ増殖を刺激する能力について調査した。第１の実験では、保管したＰＢＭＣを、２００μＬのＡＩＭ－Ｖ培地中２×１０５細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート中の１×１０４、２．５×１０４、及び５×１０４細胞／ウェルのマイトマイシンＣで処理したＰＡＭ細胞と共培養する。結果は、ＰＡＭ細胞が、７日間の培養において増殖性であったため、ＰＡＭ細胞に対するＰＢＭＣ応答を識別するには、マイトマイシンＣ処理が必要であることを示す。マイトマイシンＣは、ＤＮＡに架橋し、かつ細胞複製を停止させることによってＤＮＡ合成を阻害する抗腫瘍抗生物質である。マイトマイシンＣで処理した細胞は、０．００４～０．０２４のＡＢＳ４５０値をもたらすが、未処理の細胞は、１．１１７～１．１５８のＡＢＳ４５０値をもたらした（図５８Ａ）。
ＰＢＭＣ＃２９＋＃５７Ｘ及びＰＢＭＣ＃５７＋＃１９Ｘの７日間の共培養実験における一方向ＭＬＲ応答は、２３．８及び２６．２であり、ＡＢＳ４５０値は、０．５７２及び０．３６７であった。ＩＦＮ－ｙ及びＩＬ－２レベルは、一方向同種異系ドナー＃２９＋５７Ｘ及びドナー＃５７＋ドナー＃１９Ｘについて、それぞれ７０８．０１、１２１．２２ｐｇ／ｍＬ及び７９．５５、２２．８４ｐｇ／ｍＬであった。
ヒトＰＢＭＣと共培養した新鮮に解凍したＰＡＭ細胞は、陽性対照ヒト同種異系ＭＬＲ様応答と比較して、有意により低いＡＢＳ４５０及びＳＩ値を示した（図５８Ｂ及び図５９Ａ）。ドナー＃５７のＰＢＭＣは、ドナー＃１９及び＃２９と比較して、１０ＫのＰＡＭ細胞に対して最も高い増殖応答及びＩＦＮ－ガンマレベルを示し（ＳＩＰＡＭ１０Ｋ＋ＰＢＭＣ＃５７＝４．６及びＩＦＮ－ｙ １８．５５ｐｇ／ｍＬ）、５０ＫのＰＡＭ細胞に対して最も高いＩＬ－２レベルが観察された（ＩＬ－２＝８．６８ｐｇ／ｍＬ）。ヒトＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ＃１９＋ＰＨＡ、＃２９＋ＰＨＡ、及び＃５７＋ＰＨＡ）の有糸分裂ＰＨＡ対照は陽性であった（ＳＩ＝１５．８、２９．０、３３．４、及びＡＢＳ４５０＝０．７９９、０．７０５、０．４５７）。
Figure 2023538663000010
３つの異なるＰＡＭ細胞濃度でのマイトマイシンＣで処理したＰＡＭ「Ｘ」、ＰＡＭ、及び１０μｇ／ｍＬのＬＰＳを有するＰＡＭは、いかなるＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現ももたらさなかった
Figure 2023538663000011
共培養実験前の２日間培養ＰＡＭ細胞と一貫して、ＰＡＭ細胞に対するＰＢＭＣドナー応答をもたらさなかった。マイトマイシンＣで処理したＰＡＭ細胞は、０．２２～０．５２のＡＢＳ４５０値をもたらしが、共培養実験でも、同様のＡＢＳ４５０値（０．２９～０．５７）がもたらされた。
Figure 2023538663000012
この実施例では、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）及びＣＤ４＋Ｔ細胞をブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞と共培養したときの、それらの免疫増殖応答性を評価した。この研究では、３人のヒトＰＢＭＣドナー（ドナー＃１１、＃５０、＃５７）を使用した。ヒトドナーＰＢＭＣまたはそれらのＣＤ４＋Ｔ細胞を、未処理、ＩＦＮ－γ活性化及びＫＬＨ負荷ＰＡＭ細胞と７日間共培養した。ドナー＃１１、＃５０、及び＃５７から単離した細胞をそれぞれ陽性及び陰性対照として使用して、一元同種及び自己ＭＬＲ実験を行った。バックグラウンド対照を、マイトマイシンＣ（Ｘ）処理及び未処理のＰＡＭ細胞、ならびに各ヒトドナー細胞について行った。増殖応答は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ＥＬＩＳＡアッセイを利用して決定しる。６日目に、ＢｒｄＵ追加が完了した。７日目に、サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２）分析のために培地を収集し、増殖応答を決定した。
結果：
ＩＦＮ－γの存在下でのＰＡＭ細胞の７２時間の培養は、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＱ分子発現を２．５５％から９５．８２％に増加させた。ＫＬＨ負荷ＰＡＭ細胞は、未処理細胞と同様のレベルのＳＬＡクラスＩＩ ＤＱ分子の発現をもたらした。
ＭＬＲ様共培養実験では、未処理及びＩＦＮ－γ処理の両方のＰＡＭ細胞は、異種反応において同様のレベルのＡＢＳ４５０値をもたらした。さらに、ドナー＃５０を未処理及びＩＦＮ－γ処理ＰＡＭ細胞と共培養したときに、同様のレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現が得られた。ドナー＃１１及びドナー＃５７は、ＩＦＮ－γ処理細胞で比較的より高いＩＬ－２発現を示したが、濃度レベルが低いため、意味のある結論を下すことは困難である。
すべての同種異系対照は、ベースライン値に対して陽性の増殖応答を有し、マイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣ及びＰＡＭ細胞は、ベースライン値と比較して減少した増殖応答を有した。
ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＰＡＭ細胞による異種応答よりも高い同種異系応答をもたらしたが、同種異系対照は、異種応答に対する応答を比較するのに好適な対照ではない場合がある。好適な対照は、関連するヒトドナーからマクロファージを単離または生成することによって確立され得る。
同種異系反応において、図６０に示すように、高いＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現は、高いＡＢＳ－４５０値と相関していた。しかしながら、異種反応ではそうではなかった。ヒトＰＢＭＣまたはＣＤ４＋Ｔ細胞を有するすべての異種培養物は、同様のレベルのＡＢＳ４５０値をもたらした。しかしながら、ＰＡＭ細胞をＣＤ４＃５０（９３．８２ｐｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ及び１４６．４４ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）及びＰＢＭＣ＃５０（２１０．４４ｐｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ及び７２．５８ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）と共培養した場合、高いＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現レベルが観察された。実際、ドナー＃５０の異種培養物中のＩＬ－２レベルは、その同種異系培養物と比較して高かった。
ＰＡＭ細胞は、マイトマイシン－Ｃの非存在下で増殖しており、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の発現なしで３の最も高いＡＢＳ４５０値（１５Ｋ ＰＡＭ細胞）をもたらし、マイトマイシンＣで処理した細胞は、０．０２９～０．０６に減少したＡＢＳ４５０値を有した。
すべての同種異系対照は、ベースライン値に対して陽性の増殖応答を有し、マイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣ及びＰＡＭ細胞は、ベースライン値と比較して減少した増殖応答を有した。すべての自己増殖応答は、予想されるベースライン値に近く、それらの同種異系応答よりも少なかった（図６１Ａ～６１Ｂ及び６２Ａ～６２Ｂ）。
未処理及びＩＦＮ－γ処理の両方のＰＡＭ細胞は、異種反応において同様のレベルのＡＢＳ４５０値をもたらした（図６１Ａ～６１Ｂ）。さらに、ドナー＃５０を未処理及びＩＦＮ－γ処理ＰＡＭ細胞と共培養したときに、同様のレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現が得られた（表４）。ドナー＃１１及びドナー＃５７は、ＩＦＮ－γ処理細胞で比較的より高いＩＬ－２発現を示したが、濃度レベルが低いため、意味のある結論を下すことは困難である。
自己ＰＢＭＣ＃５０及びＰＢＭＣ＃１１、またはＰＢＭＣ＃５０もしくはＰＢＭＣ＃１１のみの試験試料中のＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現は、検出限界に近かったか、またはそれよりも低かった（０．９９ｐｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ及び１．７２ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）。
しかしながら、これらの細胞は、ＢｒｄＵ組み込みのための高いバックグラウンドＡＢＳ４５０レベルを示した（表４及び図６１Ｂ）。この結果は、Ｔ細胞活性化に頼らずこれらの特異的ＰＢＭＣ細胞集団における増殖細胞の存在を示し得る。
異種共培養物は、陽性対照ヒト同種異系ＭＬＲ反応と比較して、より低いＡＢＳ４５０及びＳＩ値を示した（表４及び図６１Ａ～６１Ｂ）が、同種異系対照は、異種異系反応に対するそれらの応答を比較するのに好適な対照ではない場合がある。好適な対照は、関連するヒトドナーからマクロファージを単離または生成することによって確立され得る。
同種異系反応において、高いＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現は、高いＡＢＳ－４５０値と相関していた。
ヒトＰＢＭＣまたはＣＤ４＋Ｔ細胞を有するすべての異種培養物は、低いレベルのＡＢＳ４５０値をもたらした。
しかしながら、ＰＡＭ細胞をＣＤ４＃５０（９３．８２ｐｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ及び１４６．４４ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）及びＰＢＭＣ＃５０（２１０．４４ｐｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ及び７２．５８ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）と共培養した場合、高いＩＦＮ－γ及びＩＬ－２発現レベルが観察された。実際、ドナー＃５０の異種培養物中のＩＬ－２レベルは、その同種異系培養物と比較して高かった。
比較的高いサイトカイン分泌を伴うより低いＡＢＳ４５０値は、ＢｒｄＵの組み込みが何が起こるかの片鱗を伝えるため、より早い時点で起こるイベントが異種反応において見逃されている場合があることを示し得る。
ドナー＃５７のＰＢＭＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＫＬＨ負荷、マイトマイシン処理ＰＡＭ細胞と共培養し、未処理細胞と比較して同様のレベルのＡＢＳ４５０値を示した。
フローサイトメトリー７ＡＡＤ染色を使用して、共培養の７日目に、ＰＢＭＣ－ＰＡＭ及びＣＤ４＋－ＰＡＭ共培養試験ウェルにおけるＣＤ３＋Ｔ細胞の生存率をそれぞれ５４％及び６４％として測定した。ＰＡＭ細胞を含まないＰＢＭＣ細胞は、７日目で７１％生存であった。
これらのデータは、フロー研究によってさらに支持され得る。ＰＡＭ細胞は、ＣＦＳＥ標識レスポンダー細胞と共培養され得る。ＣＦＳＥは、細胞内分子を共有結合的に標識する。ＣＦＳＥ標識細胞が分裂するとき、その子孫は、細胞分裂を評価することを可能にする蛍光強度の半分を有する。さらに、レスポンダー細胞は、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９＋、ＣＤ２５＋）について分析され得、疲弊したエフェクターＴ細胞マーカーは、研究され得る。
この実施例では、マイトマイシンＣで処理したブタ刺激リンパ球（非増殖刺激細胞）の存在下でのヒトリンパ球（レスポンダー細胞）の増殖応答を評価した。増殖応答は、ＥＬＩＳＡ手順によって測定されるように、ＢｒｄＵを増殖リンパ球ＤＮＡに組み込むことによって測定した。評価した組織を、遺伝的に操作されたＧａｌＴ－ＫＯブタから得た。
ブタリンパ球を、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ）を介して末梢全血から単離する。単離されたリンパ球を、１）未処理及び２）マイトマイシンＣ処理の２つの群に分ける。マイトマイシンＣ処理は、ＤＮＡと共有結合性架橋を形成し、したがって増殖を防止する。未処理の細胞は増殖が可能であり、レスポンダー細胞として機能するが、一方で、マイトマイシンＣで処理した細胞は非増殖性であるため、刺激細胞として作用する。非増殖性細胞は、ＢｒｄＵを積極的に組み込まないため、抗ＢｒｄＵ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用することにより、増殖性リンパ球と非増殖性リンパ球との差異的な測定が可能になる。
患者のリンパ球は、自身の細胞（自己応答）、同じ種の他の個体の細胞（同種異系応答）、ブタ種由来の細胞（α－Ｇａｌノックアウト遺伝子のありまたはなし－異種応答）、またはフィトヘマグルチニン（有糸分裂応答）による増殖応答について評価される。アッセイの対照の尺度として、各個体は、刺激指数デルタを計算することによってそれら独自の対照として作用し、それによって、陰性（マイトマイシンＣで処理した細胞応答）をより少ない陽性（有糸分裂応答）対照は陽性数をもたらす。
増殖応答を評価するために、等数のマイトマイシンＣで処理した細胞及び未処理の細胞を使用する。自己評価のために、細胞の１つの群をマイトマイシンＣで処理し、同じ個々の動物由来の等数の未処理細胞を添加する。このアッセイで使用される同種異系刺激細胞は、無関係の個体由来である。ブタ刺激細胞は、同じブタまたは遺伝的に関連するブタ異種移植ドナー由来である。すべての細胞は、無菌的にヘパリンナトリウムに収集された末梢血から単離され、ＳＯＰ Ａ－０３１またはクライアントから凍結保存されて受けた細胞に従って処理される。
読み取り値：刺激指数の計算
刺激指数は、試験吸光度（ＡＢＳ４５０－５７０）値をベースラインＡＢＳ４５０－５７０で割ることによって計算される。
例えば、平均試験ＡＢＳ４５０－５７０＝１．３２１及びベースライン平均ＡＢＳ４５０－５７０＝０．１２４の場合、刺激指数（ＳＩ）は、１．３２１／０．１２４＝１０．７である。
以下の表は、代表的なテンプレートマップを示す。
Figure 2023538663000013
Figure 2023538663000014
刺激指数は、試験吸光度（ＡＢＳ４５０－５７０）値をベースラインＡＢＳ４５０－５７０で割ることによって計算される。
例えば、平均試験ＡＢＳ４５０－５７０＝１．３２１及びベースライン平均ＡＢＳ４５０－５７０＝０．１２４の場合、刺激指数（ＳＩ）は、１．３２１／０．１２４＝１０．７である。
合格基準は以下の通りである。
ＱＣ試験試料が、以下の範囲の結果をもたらす場合、アッセイは許容可能であるとみなされる。
●陽性対照は１．０以上となる
●陰性対照は１．０以下となる
●同種異系対照ＳＩは、自己対照ＳＩよりも大きくなる
●自己対照は２．５以下となる
●異種対照は、２．０以上となる
この研究には、ブタ肺胞マクロファージ（ＡＴＣＣ－２６３Ｄ４２１）由来の７つの異なるＷＴ由来修飾細胞株上の８５個の一方向、ＰＢＭＣ、ＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋混合リンパ球反応（ＭＬＲ）が含まれる。
３人の非特定化、ＩＲＢ承認、ヒト対象を使用した：
患者１１（ＨＬＡ－Ｃ、ＤＱＡ、ＤＱＢ対立遺伝子分野）：対立遺伝子：０５：０１、０５：０５、０３：０１
患者５０（ＨＬＡ－Ｃ、ＤＱＡ、ＤＱＢ対立遺伝子分野）：対立遺伝子：０５：０１、０１：０２、０６：０２
患者５７（ＨＬＡ－Ｃ、ＤＱＡ、ＤＱＢ対立遺伝子分野）：対立遺伝子：０７：０２、０３：０３、０３：０１
これらのヒト患者の遺伝情報に基づいて、７つの固有の遺伝的に操作された細胞株を使用した。
Ａ－１１ ＤＱＡ、Ｂヒト化
Ａ－５０ ＤＱＡ、Ｂヒト化
Ａ－５７ ＤＱＡ、Ｂヒト化
Ｂ－サイレンシングＤＲ
Ｃ－Ｂ２Ｍヒト化（患者１１、５０、及び５７は相同である）
Ｄ－サイレンシングＳＬＡ－Ａ
Ｅ－サイレンシングＳＬＡ－Ｂ
一方向ＭＬＲ（ベースライン）試験を実施した：［レシピエント］：［ドナー］ｘ
Figure 2023538663000015
表現型検査（ＦＡＣＳ）を行った。
Figure 2023538663000016
Figure 2023538663000017
この実施例での、フローサイトメトリーによる、ＡＴＣＣ（登録商標）から購入したブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）（３Ｄ４／２１細胞、カタログ番号ＣＲＬ－２８４３（商標））の表現型に対するＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－γ＋ＬＰＳによる刺激の影響。ＰＡＭ細胞（３Ｄ４／２１）の表面特徴付けを図５４に示す。
ＰＡＭ細胞をＲＰＭＩ－１６４０／１０％ ＦＢＳ中で解凍し、３つの異なる培養プレート中で２日間培養した。３日目に、マクロファージ活性化培養培地について、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（プレート１）及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ＋１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（プレート２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０／２０％のＦＢＳ培地で置き換えた。ＲＰＭＩ－１６４０／２０％ ＦＢＳ中の未処理細胞を対照として使用した（プレート３）。２４時間インキュベーション後、ＴｒｙｐＬＥ処理を使用して接着細胞をプレートから切り離した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ ｐＨ＝７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＳＡ）中に再懸濁した。細胞数及び生存率を、トリパンブルー排除法によって決定した。合計１×１０５個の細胞を、マウス抗ブタＳＬＡクラスＩ、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＲ、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＱ抗体で３０分間、及びＡＰＣコンジュゲートＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）－ｍｕｌｇ融合タンパク質（ブタＣＤ８０／ＣＤ８６に結合する）で４５分間、４℃で染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗体染色細胞を、抗マウスＡＰＣコンジュゲートポリクローナルＩｇＧ二次抗体を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。続いて４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を使用して細胞を２回洗浄した。すべての細胞を、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。試料をＮｏｖａｃｙｔｅフローサイトメトリーで取得し、データをＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓを使用して解析した。凝集を示す培養細胞の顕微鏡写真を図５５Ａ～５５Ｂに示す。
未処理のＰＡＭ細胞は、それぞれ９９．９８％、２９．６８％、及び２．２８％のＳＬＡクラスＩ、ＳＬＡクラスＩＩ ＤＲ、及びＤＱ分子発現をもたらす。これらの細胞は、４．８１％のＣＤ８０／８６＋であった。ＩＦＮ－γの存在下で２４時間細胞を培養したところ、すべてのＳＬＡ分子発現が増加した（９９．９９％ ＳＬＡクラスＩ＋蛍光強度中央値の増加、ＤＲ＋４２．２７％、ＤＱ＋５７．３６％）及びＣＤ８０／８６レベルが増加した（４７．３８％）。ＬＰＳを有するＩＦＮ－γ含有細胞は、ＩＦＮ－γのみで処理した細胞と比較して、類似レベルのＳＬＡ分子及びＣＤ８０／８６発現をもたらした。
ＰＡＭ細胞をブタＩＦＮ－γで２４時間処理し、共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７－１）及びＣＤ８６（Ｂ７－２）に対して高い親和性を有する一次ＭＡｂ及びフルオレセインコンジュゲート二次抗体及びＡＰＣコンジュゲートＣＤ１５２で染色した。ＩＦＮ－γで処理すると、細胞は、非刺激ＰＡＭ細胞と比較してＳＬＡ及びＣＤ８０／８６共刺激分子発現を増加させた。非刺激細胞は、９９．９８％のＳＬＡクラスＩ＋、２９．６８％のＤＲ＋２．２８ＤＱ＋及び４．８１％のＣＤ８０／８６＋であったが、ＩＦＮ－γ刺激細胞は、９９．９９％のＳＬＡクラスＩ＋、４２．２７％のＤＲ＋、５７．３６％のＤＱ＋、４７．３８％のＣＤ８０／８６＋であった。ＬＰＳを有するＩＦＮ－γ含有細胞は、ＩＦＮ－γのみで処理した細胞と比較して、類似レベルのＳＬＡ分子及びＣＤ８０／８６発現をもたらした。
基底状態において、マクロファージは、低レベルのＳＬＡクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６共刺激分子を発現する。２４時間のＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－γ－ＬＰＳ処置は、ＳＬＡクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６共刺激分子ならびにＳＬＡクラスＩ分子の発現を誘導する。延長したインキュベーションは、恐らくこれらの分子の発現をさらに増加させるであろう。
Figure 2023538663000018
この実施例では、フローサイトメトリーを使用して、未処理及びＩＦＮ－γ処理親ブタマクロファージ（ＰＡＭ）細胞の存在下でのドナー＃５０ ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖及び活性化マーカー発現を評価した。
この研究では、ＸｅｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣによるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）プログラムを通じて調達した１つのヒトＰＢＭＣドナー＃５０を使用した。使用前に、凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、インキュベーター中で一晩保管した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（非接触／陰性選択）を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して単離した。高精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（９８．５８％）を、レスポンダー細胞としてアッセイで使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）細胞増殖キットを使用して標識し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激で活性化した。これらの刺激された細胞を、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ））対照に使用して、陽性集団及び陰性集団（５色、ＣＴＶ－４０５、ＣＤ４－ＰＥ、７ＡＡＤ、ＣＤ６９－ＡＰＣ、ＣＤ２５－ＡＰＣ／Ｃｙ７）を決定した。残りのＣＤ４＋ＣＴＶ標識Ｔ細胞（抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激細胞及び非刺激細胞の両方）を、未処理及びＩＦＮ－γ処理ＰＡＭまたはＰＡＭＸ（マイトマイシンＣ処理）細胞と共培養した。６日間の培養後、細胞を、ＣＤ４－ＰＥ、７ＡＡＤ（生存率）、ＣＤ６９－ＡＰＣ、及びＣＤ２５－ＡＰＣ／Ｃｙ７マーカーを使用して染色した。補正対照が含まれた。追加の対照は、（１）非標識ＣＤ４＋Ｔ細胞、（２）ＣＴＶ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞、（３）ＰＡＭ細胞、及び（４）抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＴＶ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでいた。細胞をＮｏｖｏｃｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。すべての培養物をＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡張培地（ＣＴＳ－ＯＰＴ）で試験した。６日目に、サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２）産生のために培地を収集し、付随する研究（ＸＤ０７６－ＸＬＢ３６６）で分析した。
生細胞は、７ＡＡＤで染色することによって区別し、蛍光抗体パネルで染色することによって免疫表現型を決定して、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４－ＰＡＭ細胞を分離した。このパネルには、２つの異なるＴ細胞活性化マーカーも含まれる：ＣＤ６９（早期）、ＣＤ２５（後期）。
非刺激ＣＴＶ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＰＡＭ細胞単独は、いかなる増殖またはＣＤ２５及びＣＤ６９発現も示さなかった。
抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激細胞は、ＣＴＶ試薬を使用して８世代を示した。ヒストグラム中の離散的なピークは、連続的な世代の生ＣＤ４＋Ｔ細胞を表すことが観察された。ＣＤ４＋Ｔ細胞の９９．８２％及び５６．０８％は、それぞれＣＤ２５＋及びＣＤ６９＋であった。
マイトマイシンＣで処理したＰＡＭ細胞（ＰＡＭＸ）及びＩＦＮγ＋マイトマイシンＣで処理したＰＡＭ細胞（ＰＡＭＸ－ＩＦＮ－γ）の存在下での抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＴＶを使用して６世代を示した。これらの共培養物中のＣＤ４＋Ｔ細胞の約９９％は、ＣＤ２５＋及びＣＤ６９＋であった。
マイトマイシンＣで処理したＰＡＭ細胞（ＰＡＭＸ）またはＩＦＮ－γで処理したＰＡＭ細胞（ＰＡＭＸ－ＩＦＮ－γ）と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞は、それぞれ２５．０３％及び３２．４６％のＣＤ２５発現、ならびに５．８２％及び１２．３７％のＣＤ６９発現を示した。
ＰＡＭ細胞またはＩＦＮ－γで処理したＰＡＭ細胞で共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞は、それぞれ１４．４５％及び５１．３０％のＣＤ２５発現、ならびに２．９２％及び２９．９８％のＣＤ６９発現を示した。ＣＤ６９マーカーは、陽性集団及び陰性集団を別々に示さない。しかしながら、ＣＤ６９＋染色細胞により、右に蛍光強度の明確な変化（増加）が得られた。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート結合した抗ＣＤ３、４ ｇ／ｍＬのＣＤ２８（溶液中）、ＰＡＭ／ＰＡＭＸ細胞、またはＩＦＮ－γで処理したＰＡＭ／ＰＡＭＸ細胞で６日間刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、培養前に５μＭのＣＴＶで標識した。死んだＣＤ４＋Ｔ細胞を、７ＡＡＤで染色することによって生細胞と区別した。生細胞は、蛍光抗体パネルで染色することによって免疫表現型を決定して、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４－ＰＡＭ細胞を分離した。このパネルには、２つの異なるＴ細胞活性化マーカーも含まれる：ＣＤ６９（早期）、ＣＤ２５（後期）。補正ビーズを用いて補正対照を行った。ＦＭＯ対照を行って、陽性集団と陰性集団とを区別した。データ分析は、ＮｏＶｏＥｘｐｒｅｓｓを使用して行う。
抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ試薬を使用して８世代を示した。ヒストグラム中の離散的なピークは、連続的な世代の生ＣＤ４＋細胞を表す。ＣＤ４＋Ｔ細胞の９９．８２％及び５６．０８％は、それぞれＣＤ２５＋及びＣＤ６９＋であった。
Figure 2023538663000019
データは、ＰＡＭ細胞がＴ細胞増殖及び活性化マーカーの発現を刺激することを示唆している。未処理のＰＡＭ細胞に対して、ＩＦＮ－γで処理したＰＡＭ細胞は、増殖、ＣＤ２５及びＣＤ６９発現マーカーを増強した。より高い増殖は、より高いレベルのＣＤ２５＋及びＣＤ６９＋Ｔ細胞と相関しているように思われる。
この実施例では、目的は、（１）ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）及びヒトドナー＃５０ ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物中のＩＬ－２及びＩＦＮ－γ産生を測定することと、（２）マイトマイシンｃ処理及び未処理のＰＡＭ細胞の応答をヒトドナー＃５０ ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較することと、（３）ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡大培地及びＡＩＭＶ中でＰＡＭ細胞と共培養した場合のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫増殖応答性を比較することであった。この研究では、ＰＡＭ細胞は、ＩＦＮ－γを用いて予めインキュベートされなかったことに留意されたい。
この研究では、Ｘｅｎｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣによるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）プログラムを通じて調達したヒトＰＢＭＣドナー＃５０を使用した。使用前に、凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、インキュベーター中で一晩保管した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（非接触／陰性選択）を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して単離し、レスポンダー細胞として使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＷＴ ＰＡＭまたはマイトマイシンＣで処理したＰＡＭ細胞（ＰＡＭＸ）と共培養した。細胞を８日間培養した。培養上清を、２日目、４日目、及び７日目にウェルから収集し、摂氏－８０で保管した。対照ウェルは、陰性対照としてＣＤ４＋Ｔ細胞及びマイトマイシン－Ｃで処理したＰＡＭ細胞ならびに未処理のＰＡＭ細胞を含んでいた。ＸＬＢ－３６４研究から４日目に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激細胞から収集した上清を陽性対照として使用した。すべての培養物をＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡張培地で試験した。ＰＡＭＸ細胞をまた、７日目にのみＡＩＭ－Ｖ培地中でその異種刺激能力について試験し、７日目にＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡大培地中で試験した細胞を比較した。上清を８日目に解凍し、ＭａｇＰｉｘ（商標）Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）技術）を使用して、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２産生について分析した。加えて、８日目に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ＥＬＩＳＡアッセイを利用して、増殖応答を決定した。
ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ産生を、ＰＡＭ及びヒトドナー＃５０ ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物からの上清中で測定した。加えて、ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡアッセイを介してヒトＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激するＰＡＭ細胞の能力を調査した。
抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激細胞は、４日目に、最も高いＩＬ－２及びＩＦＮ－γ発現を示した。サイトカインレベルは、すべてのベースライン細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＰＡＭ及びＰＡＭＸ細胞）について検出レベルを下回った。
異種培養物中で４日目に収集した上清は、２日目に収集した培養上清よりも高いＩＬ－２及びＩＦＮ－γ発現を示した。ＩＬ－２レベルは、１６３．４８ｐｇ／ｍＬ（４日目）から７日目に８．３７ｐｇ／ｍＬに減少したが、ＩＦＮ－γレベルは、４０８．６４ｐｇ／ｍＬから１００８ｐｇ／ｍＬに増加した。
ＰＡＭ－ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養から収集した培養上清は、７日目に、ＰＡＭＸ－ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養から収集した上清（８．３７ｐｇ／ｍＬ、１００８ｐｇ／ｍＬ）と比較して、７日目により高いレベルのＩＬ－２（１７３．９８ｐｇ／ｍＬ）及びＩＦＮ－γ（７４０６ｐｇ／ｍＬ）レベルを示した。
以前に実施したＸＬＢ３２８研究は、７日目に、ＡＩＭ－Ｖ培地中のＣＤ４＋Ｔ細胞（ドナー＃５０）を有するＰＡＭＸ細胞の培養物中で、１４６．４４ｐｇ／ｍＬのＩＬ－２及び９３．８２ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γをもたらした。現在の研究では、同じ条件下で、１３４．３１ｐｇ／ｍＬのＩＬ－２及び１３２．２９ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γレベルが得られた。
ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡張培養培地中の異種培養物は、ＡＩＭ－Ｖ培地中の培養物（ＳＩ＝５．２５）と比較して、ＢｒｄＵ組み込みＥＬＩＳＡアッセイにおいて有意に高い刺激指数（ＳＩ＝８６．９２）を示し、図６９に示されるような強い陽性免疫原性反応を示す。
全体として、これらの結果は、サイトカイン産生及び増殖の両方（ＢｒｄＵ組み込みＥＬＩＳＡ）が、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する能力についてＰＡＭ細胞を調査するために使用され得ることを示した。
抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激細胞は、４日目に、最も高いＩＬ－２及びＩＦＮ－γ発現を示した。サイトカイン発現は、任意の日に収集された上清中のすべてのベースライン細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＰＡＭ及びＰＡＭＸ細胞）（表４、５、及び付録１）の検出レベルを下回った。異種培養物中で４日目に収集した上清は、２日目に収集した培養上清よりも高いＩＬ－２及びＩＦＮ－γ発現を示した（表４及び付録１）。ＩＬ－２レベルは、１６３．４８ｐｇ／ｍＬ（４日目）から７日目に８．３７ｐｇ／ｍＬに減少したが、ＩＦＮ－γレベルは、４０８．６４ｐｇ／ｍＬから７日目に１００８ｐｇ／ｍＬに増加した（表４及び付録１）。
ＰＡＭ－ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養から収集した培養上清は、以下の表に示されるように、７日目に、ＰＡＭＸ－ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養から収集した上清（８．３７ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２、１００８ｐｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ）と比較して、７日目により高いレベルのＩＬ－２（１７３．９８ｐｇ／ｍＬ）及びＩＦＮ－γ（７４０６ｐｇ／ｍＬ）を示した。
Figure 2023538663000020
以前に実施したＸＬＢ３２８研究は、７日目に、ＡＩＭ－Ｖ培地中のＣＤ４＋Ｔ細胞（ドナー＃５０）を有するＰＡＭＸ細胞の培養物中で、１４６．４４ｐｇ／ｍＬのＩＬ－２及び９３．８２ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γをもたらした。現在の研究では、以下の表に示されるように、同じ条件下で、１３４．３１ｐｇ／ｍＬのＩＬ－２及び１３２．２９ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γレベルが得られた。
Figure 2023538663000021
ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡張培養培地中の異種培養物は、ＡＩＭ－Ｖ培地中の培養物（ＳＩ＝５．２５）と比較して、ＢｒｄＵ組み込みＥＬＩＳＡアッセイにおいて有意に高い刺激指数（ＳＩ＝８６．９２）を示し、強い陽性免疫原性反応を示す。
ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡ実験から計算した刺激指数。ＣＴＳ－ＯＰＴ及びＡＩＭ－Ｖ培地中のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（ドナー＃５０）のＰＡＭＸ（ｍｉｔＣ処理）に対する増殖応答を示す。結論として、研究ＸＬＢ－３６６及びＸＬＢ－３６４は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した場合のＷＴ ＰＡＭ細胞の免疫原性を特徴付けるための最適な培養条件を確立した。
前述の開示によれば、本発明者らは、本明細書に記載の特定の遺伝子領域で細胞をサイレンシング、ヒト化、及び個別化するために、記載の領域で以下の配列を有するブタドナー細胞を産生した。
一実施例では、図７０及び図５６に示されるように、単一の塩基対の挿入を使用してＳＬＡ－ＤＲＢ１の遺伝子をノックアウトして、エクソン１において終止コドンを作製した。ＣＲＩＳＰＲ技術を使用し、ガイドＲＮＡ配列を組み込んだ。ＧＵＧＵＣＣＣＵＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡ；ガイドＲＮＡ切断位置：ｃｈｒ７：２９，１２５，３４５；ドナー配列：ＧＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＣＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＣＧＴＡＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＧ．
Figure 2023538663000022
結果は以下を生成した、２つのクローンＩＤ：Ｆ３、修飾：ＤＲＢ１－Ｌ２６Ｘ（ＴＴＧ＞ＴＡＧ）、説明：ホモ接合性ＫＩクローン、及びクローンＩＤ：Ｍ２１、修飾：ＤＲＢ１－Ｌ２６Ｘ（ＴＴＧ＞ＴＡＧ）、説明：ホモ接合性ＫＩクローン。
Figure 2023538663000023
ＰＡＭ細胞クローンＦ３及びＭ２１を、ｐ ＩＦＮ γで４８時間処理し、細胞をＳＬＡ－ＤＲの発現のために表現型を決定した。結果は、ＳＬＡ－ＤＲの表面発現を示さない以下の表に要約する。
Figure 2023538663000024
この実施例では、図５７に示すように、大きなＦｒａｇｄｅｌを使用して、ＳＬＡ－ＤＱＢ１の遺伝子をエクソン２でノックアウトした。クローンＭ２１、ＳＬＡ ＤＲＢ１ノックアウトを開始細胞株として使用した：３Ｄ４／２１ ＤＲＢ１－Ｌ２６Ｘ クローンＭ２１。ＣＲＩＳＰＲをガイドＲＮＡ配列１とともに使用した：ＧＧＣＡＣＧＡＣＣＣＵＧＣＡＧＣＧＧＣＧ、ガイドＲＮＡ１切断位置：ｃｈｒ７：２９，１８６，９６６、ガイドＲＮＡ配列２：ＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＡＡＡＵＣＣＵＣＵＧ、ガイドＲＮＡ２切断位置：ｃｈｒ７：２９，１８７，２３１。
トランスフェクション後、２つのクローンを生成した。遺伝子型／ＩＣＥ分析Ｂ１０：ＤＱＢ１－欠失（－２６３）、Ｄ１０：ＤＱＢ１－欠失（－２６４）Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＳＯ ４９９３０８５。図７１は、クローンＤ１０のＦｒａｇＤｅｌを示す。ＳＬＡクラスＩＩ分子、ＤＲ及びＤＱの図７２に示される発現のフローサイトメトリー分析は、クローンＢ１０及びＤ１０におけるＤＲ及びＤＱの発現の不在を示すが、開始クローンＭ２１は、ＳＬＡ－ＤＱの発現を有する。
得られたクラスＩＩ陰性クローン、Ｍ２１及びＤ１０を、図７３Ａ～７３Ｃに示すように、ヒトドナーＣＤ４＋Ｔ細胞に対して異種ＭＬＲでチャレンジした。クローンをＩＦＮγの存在下で４８時間培養し、次いで、ヒトＴ細胞で培養した。
別の例では、ドナー１１ゲノムからのＨＬＡ－ＤＱＢのエクソン２を、クローンＢ１０で作成されたＦｒａｇＤｅｌに挿入した。この挿入にはＣＲＩＳＰＲ技術を使用した。
細胞株：３Ｄ４／２１ ＤＲＢ１－Ｌ２６Ｘ ＤＱＢ１－ＫＯクローンＢ１０（ＳＯ－４９９３０８５－１）、ガイドＲＮＡ配列：ＧＣＡＣＵＣＡＣＣＵＣＧＣＣＵＣＵＧＣＧ
ドナー配列：ＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧ
ＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ
ＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＧ
ＣＡＣＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣ
ＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣ
ＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣ
ＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴ
ＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡ
ＴＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡ
ＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴ
ＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡ
ＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣ
ＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧ
ＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧ
ＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＧ
ＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡ
ＡＡＧＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣ
ＡＡＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴ
ＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣ
以下のクローンを単離した。
クローンＩＤ：Ａ１１
修飾：ＳＬＡ－ＤＱＢ１－ヒト患者１１
説明：ホモ接合性ＫＩクローン
クローンＩＤ：Ｆ３
修飾：ＳＬＡ－ＤＱＢ１－ヒト患者１１
説明：ホモ接合性ＫＩクローン
得られたクローンの細胞表現型分析を以下の表に要約する。
Figure 2023538663000025
クローンＡ１１及びＦ３上に既知のＤＱ分子の細胞表面発現はなかった。さらに、細胞クローンＦ３上で質量分析を行って、サイトゾル中に残るが細胞表面上で発現されないＤＱＢ１タンパク質の産生をスクリーニングした。ＸＬＢ ４８５。以下の表に示されるように、この探索的分析は、ＳＬＡ－ＤＱＢ／ＨＬＡ－ＤＱＢタンパク質がサイトゾル中に存在したことを示唆した。
Figure 2023538663000026
Figure 2023538663000027
別の例では、クローン、細胞株：３Ｄ４／２１ ＤＲＢ１－Ｌ２６Ｘ、ＤＱＢ１－ＫＯ（４９９３０８５－１からのクローンＢ１０）を使用して、遺伝子：ＳＬＡ－ＤＱＡのエクソン２に大きなＦｒａｇｄｅｌを作成した。ＣＲＳＰＲ技術を使用して、この欠失を実行し、以下を使用した：ガイドＲＮＡ配列１：ＵＵＡＡＧＣＣＡＵＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡ、ガイドＲＮＡ１切断位置：ｃｈｒ７：２９，１６８，７９０、ガイドＲＮＡ配列２：ＵＧＡＵＧＵＧＡＡＣＧＧＧＵＡＡＡＧＡＡ、ガイドＲＮＡ２切断位置：ｃｈｒ７：２９，１６９，０５４、欠失サイズの期待値：－２６４ｂｐ。２６４ｂｐの欠失を有する得られたクローンを図７４に示す。ＰＣＲ産物をゲル上で実行し、図７５に示すように欠失を示す（レーン１：３Ｄ４／２１野生型（予想サイズ＝６９８ｂｐ）、レーン２：３Ｄ４／２１ ＤＲＢ１－Ｌ２６Ｘ、ＤＱＢ１－ＫＯ、ＤＱＡ－ＫＯクローンＢ１（予想サイズ＝４３４ｂｐ）、レーン３：３Ｄ４／２１ ＤＲＢ１－Ｌ２６Ｘ、ＤＱＢ１－ＫＯ、ＤＱＡ－ＫＯクローンＥ４（予想サイズ＝４３４ｂｐ））。
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ＳＬＡ－ＤＲＢ－ＫＯ、ＳＬＡ－ＤＱＡ－ＫＯ、ＳＬＡ－ＤＱＢ－ＫＯクローン中のトリプル終止コドンを使用してＳＬＡ ＤＲＡをノックアウトした。ＣＴＴＣＡＧＡＡＡは、図７６に示すように、エクソン１においてＴＡＧＴＧＡＴＡＡに変化した。染色体座標：ｃｈｒ７：２４８２５１８３－２４８２５１９１。ガイド標的：ＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡ、ＰＡＭ配列：ＴＧＧ、トランスフェクション後のノックインスコア３８％。参照元：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｃｅ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ／＃／ａｎａｌｙｚｅ／ｒｅｓｕｌｔｓ／ｅｑ１３４ｆｄ２ｍｐ３６ｚｈｋ４／ＣＥ＿６９５３２９－１００５＿８０１８５５４－１－ｇ１－Ｍ３８１４＿８０１－Ｆ１＿Ｅ０１
別の例では、ＰＡＭ細胞中のブタＢ２Ｍの２つの遺伝子をオフにした。ブタＢ２Ｍノックアウトには、１番染色体上のほぼ同一の２つの遺伝子のノックが必要であった。ＣＲＩＳＰＲを使用して、両方の遺伝子においてエクソン２で大きなＦｒａｇｄｅｌを作成した（ガイドＲＮＡ切断位置：Ｃｈｒ１：１４１，５３４，７５０及びｃｈｒ１：１２６，８３９，８９１、ガイドＲＮＡ配列：ＣＧＡＧＡＧＵＣＡＣＧＵＧＣＵＵＣＡＣＧ）。Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＳＯ ５３８３３１８－１。２つの遺伝子を、同じ染色体上で２０～２３ｋｂｐだけ分離された。この処理から９６個のクローンが生成され、その後評価した。さらに、図７７に示すように、ドナーのＢ２Ｍを、配列アライメントのためのＰＡＭのＢ２Ｍと比較した。Ｓｙｎｔｈｅｇｏによって生成された９６の３６個のＰＡＭ細胞クローンを、ブタＩＦＮγで４８時間処理し、次いで、ＳＬＡクラスＩ及びｐＢ２Ｍの発現についてスクリーニングした。目的は、これらの分子の両方の発現を欠くクローンを識別することであった。クローンＡ１ ＰＡＭ細胞におけるＳＬＡ－Ｉ及びｐＢ２Ｍの発現の欠如を、図７８に示す。さらに、ＳＬＡ１及びｐＢ２Ｍ発現の要約データを以下の表に開示する。
Figure 2023538663000028
実施例３
ブタ細胞のヒト化実験シリーズ
３人の非特定化、ＩＲＢ承認、ヒト対象を使用した：
患者１１（ＨＬＡ－Ｃ、ＤＱＡ、ＤＱＢ対立遺伝子分野）：対立遺伝子：０５：０１、０５：０５、０３：０１
患者５０（ＨＬＡ－Ｃ、ＤＱＡ、ＤＱＢ対立遺伝子分野）：対立遺伝子：０５：０１、０１：０２、０６：０２
患者５７（ＨＬＡ－Ｃ、ＤＱＡ、ＤＱＢ対立遺伝子分野）：対立遺伝子：０７：０２、０３：０３、０３：０１
ＨＬＡ－ＤＱＡ ＳＬＡ－ＤＱＡ個別化
試料ＩＤ：１１、１９、２９
０５：０５：０１
ＥＸ２
ＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＧＣＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＧ
試料ＩＤ：１９、５７
０１：０１：０１
ＥＸ２
ＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＧ
試料ＩＤ：５７
０３：０３：０１
ＥＸ２
ＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＡＣＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＣＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＧ
試料ＩＤ：５０
０１：０２：０１
ＥＸ２
ＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＧ
ＨＬＡ－ＤＱＢ－ＳＬＡ－ＤＱＢ
試料ＩＤ：１１、５７
０３：０１：０１
ＥＸ２
ＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧ
試料ＩＤ：１９、２９
０２：０１：０１
ＥＸ２
ＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧ
試料ＩＤ：１９、５７
０５：０１：０１
ＥＸ２
ＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧ
試料ＩＤ：５０
０６：０２：０１
ＥＸ２
ＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＴＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＴＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧ
Ａ－１１ ＤＱＡ、Ｂヒト化
患者１１ ＤＱＡ－アルファ１
試料ＩＤ：１１
対立遺伝子：０５：０５：０１
ドメイン：アルファ１
－－－－－－
キー：
セクションＡ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流
セクションＢ＝＝ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム
セクションＣ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流
セクションＤ＝＝ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム
セクションＡ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流；２３９塩基対
ＧＡＡＧＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＧＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＡＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＴＡＧＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣ
セクションＢ）ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム；２３４塩基対；７８アミノ酸
ＴＣＣＴＡＴＧＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＣＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴ
セクションＣ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流；２５１塩基対
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＧＴＣＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＴＣＣＣＡＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＣＣ
セクションＤ）ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム；２３１塩基対；７７アミノ酸
ＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴ
＊＊ＨＬＡ ０５：０５：０１は、残基５４のＴＴＴの間に３塩基対の自然発生インデルを有する．．．ＡＧＡＣＡＡＴＴＴ ＸＸＸ ＡＧＡＴＴＴＧＡＣ
患者１１ ＤＱＢ
試料ＩＤ：１１
対立遺伝子：０３：０１：０１
ドメイン：ベータ１
キー：
セクションＡ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流
セクションＢ＝＝ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム
セクションＣ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流
セクションＤ＝＝ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム
セクションＡ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流；３１０塩基対
ＡＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＴＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴ
セクションＢ）ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム；２４０塩基対；８０アミノ酸
ＡＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＧＡＣＣＣＴＧ
セクションＣ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流；２６０塩基対
ＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣ
セクションＤ）ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム；２４０塩基対；８０アミノ酸
ＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧ
Ａ－５０ ＤＱＡ、Ｂヒト化
患者５０ ＤＱＡ－アルファ１
試料ＩＤ：５０
対立遺伝子：０１：０２：０１
ドメイン：アルファ１
キー：
セクションＡ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流
セクションＢ＝＝ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム
セクションＣ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流
セクションＤ＝＝ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム
セクションＡ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流；２３９塩基対
ＧＡＡＧＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＧＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＡＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＴＡＧＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣ
セクションＢ）ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム；２３４塩基対；７８アミノ酸
ＴＣＣＴＡＴＧＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＣＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴ
セクションＣ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流；２５１塩基対
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＧＴＣＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＴＣＣＣＡＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＣＣ
セクションＤ）ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム；２３４塩基対；７８アミノ酸
ＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴ
患者５０ ＤＱＢ
試料ＩＤ：５０
対立遺伝子：０６：０２：０１
ドメイン：ベータ１
キー：
セクションＡ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流
セクションＢ＝＝ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム
セクションＣ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流
セクションＤ＝＝ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム
セクションＡ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流；３１０塩基対
ＡＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＴＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴ
セクションＢ）ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム；２４０塩基対；８０アミノ酸
ＡＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＧＡＣＣＣＴＧ
セクションＣ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流；２６０塩基対
ＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣ
セクションＤ）ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム；２４０塩基対；８０アミノ酸
ＡＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＴＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＴＴＧ
Ａ－５７ ＤＱＡ、Ｂヒト化
患者５７ ＤＱ－Ａアルファ１
試料ＩＤ：５７
対立遺伝子：０３：０３：０１
ドメイン：アルファ１
キー：
セクションＡ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流
セクションＢ＝＝ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム
セクションＣ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流
セクションＤ＝＝ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム
セクションＡ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流；２３９塩基対
ＧＡＡＧＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＧＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＡＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＴＡＧＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣ
セクションＢ）ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム；２３４塩基対；７８アミノ酸
ＴＣＣＴＡＴＧＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＣＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＧＴＣＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴ
セクションＣ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流；２５１塩基対
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＧＴＣＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＴＣＣＣＡＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＣＣ
セクションＤ）ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム；２３４塩基対；７８アミノ酸
ＴＣＴＴＡＣＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＣＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴ
患者５７ ＤＱＢ
試料ＩＤ：５７
対立遺伝子：０５：０１：０１
ドメイン：ベータ１
キー：
セクションＡ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流
セクションＢ＝＝ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム
セクションＣ＝＝ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流
セクションＤ＝＝ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム
セクションＡ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの上流；３１０塩基対
ＡＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＴＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴ
セクションＢ）ＳＬＡ：ＳＬＡノックアウトのための正確なフレーム；２４０塩基対；８０アミノ酸
ＡＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＧＡＣＣＣＴＧ
セクションＣ）ＳＬＡ：５’から３’、ノックアウトの下流；２６０塩基対
ＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣ
セクションＤ）ＨＬＡ：５’から３’、ノックインのための正確なフレーム；２４０塩基対；８０アミノ酸
ＡＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧ
Ｂ－サイレンシングＤＲ
ＤＲＡ ３ＸＥノックアウト
編集の２００塩基対（ｂｐ）５’上流：
ＣＴＧＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＴＧＴＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧ
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
編集済み部位（９ｂｐ）：
ＴＡＧＴＧＡＴＡＡ
２００ｂｐ ３’下流の編集：
ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＧＴＡＧＧＴＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＡＴＣＴＡＡＧＣＧＡＧＧＧＧＴＡＧＴＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＣＴＡＡＡＣＣＴＡ
この実施例では、３Ｄ４／２１細胞株において、本開示に従ってＤＲＢをサイレンシングした。
ＳＬＡ－ＤＲＢ野生型配列
ＥＸ１
ＡＴＧＴＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＣＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＣ
ＳＬＡ－ＤＲＢ ＫＯ配列
ＥＸ１
Figure 2023538663000029
Figure 2023538663000030
ブタ細胞のヒト化を参照されたい：ＤＲ－Ｂ ＫＯ／ＫＩは、図７０をもたらす。
ＨＬＡ－Ａ－ＳＬＡ－１
試料ＩＤ：１１
０３：０１：０１、１９
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１１
３２：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１９、２９、５０
０１：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧ
試料ＩＤ：５７
１１：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧ
試料ＩＤ：５７
０２：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＧＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
ＨＬＡ－Ｂ－ＳＬＡ－２
試料ＩＤ：１１，５０
４４：０２：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１１
４０：０２：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１９、２９
０８：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１９
３５：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：２９
５７：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＧＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：５０
５７：０３：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＧＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：５７
１５：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：５７
０７：０２：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
Ｂ２Ｍ－ヒト化
ＥＸ１
ＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣ
ＥＸ２
ＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＡＡＧＴＧＧＧ
ＥＸ３
ＡＴＣＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＡ
Ｂ２ｍクローン
Figure 2023538663000031
ＨＬＡ－Ｃ ＳＬＡ－３個別化
試料ＩＤ：１１
０２：０２：０２
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１１，５０
０５：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１９、２９、５０
０７：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧ
試料ＩＤ：１９、５７
０４：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧ
試料ＩＤ：２９
０６：０２：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧ
試料ＩＤ：５７
０７：０２：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧ
ＨＬＡ－Ｅ－ＳＬＡ－６個別化
試料ＩＤ：１１、１９、２９、５０、５７
０１：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：１９
０１：０６
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
試料ＩＤ：５０
０１：０３：０５
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧ
ＨＬＡ－Ｆ－ＳＬＡ－７個別化
試料ＩＤ：１１、１９、２９、５０、５７
０１：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＧ
試料ＩＤ：１１，１９
０１：０３：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＧ
試料ＩＤ：５７
０１：０１：０２
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＧ
試料ＩＤ：５０
０１：０３：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＧ
ＨＬＡ－Ｇ ＳＬＡ－８個別化
試料ＩＤ：１１、１９
０１：０１：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡ
試料ＩＤ：１１
０１：０３：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡ
試料ＩＤ：１９
０１：０１：１９
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡ
試料ＩＤ：５７
０１：０１：０３
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡ
試料ＩＤ：５７
０１：０１：０６
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡ
試料ＩＤ：２９、５０
０１：０１：０２
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣ
試料ＩＤ：２９
０１：０６
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡ
試料ＩＤ：５０
０１：０４：０１
ＥＸ２
ＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡ
実施例４
生存可能な異種神経移植は、非ヒト霊長類における長ギャップ末梢神経損傷にわたる再生及び機能回復を示す
２０００万人のアメリカ人が末梢神経損傷（ＰＮＩ）に苦しんでおり、その結果、ＰＮＩを修復するために毎年約５万件の手術が行われていると推定される。四肢の重度の外傷は、しばしば末梢神経の切断をもたらし、これらの損傷は、患者の生活の質に壊滅的な影響を及ぼす。これらの神経の再生は、外科的修復後でさえ遅く、しばしば不完全である。損傷後に神経修復を受ける患者の半数未満が、適切な運動または感覚機能を回復し、そのような欠陥は、完全な四肢麻痺または難治性神経障害性疼痛をもたらし得る。
末梢神経再生の成功には、神経再生の速度、及び複合筋の神経再支配を改善することが伴われ、機能の改善につながる。既存の治療選択肢には、同じ患者由来のドナー部位から調達された自己神経移植または非細胞化ヒト死体神経同種異系移植の使用が含まれる。両方の治療選択肢には深刻な欠点があり、したがって、長ギャップ（≧４ｃｍ）の分節末梢神経欠損に対する高品質の神経移植の必要性が存在する。代替手段は、理想的には、シュワン細胞とヒトの神経と同様のマトリックスリッチ足場を含み、潜在的には、自己神経移植を現在の標準ケアにする同じ基本的な作用機序を介して重要な軸索再生プロセスを促進するべきである。
ブタの神経は、サイズ、長さ、細胞外マトリックス、及びアーキテクチャを含む、ヒトの運動及び感覚神経に多くの生理学的特徴を共有する。生存可能な異種神経移植には、生シュワン細胞及びマトリックスリッチ足場が含まれ、臨床的利用可能性を高める可能性を提供し、それによって、追加の外科的調達手順に関連する必要性及び併存疾患を排除する。遺伝的に操作された指定病原体を含まない（ＤＰＦ）ブタドナーに由来する皮膚異種移植は、前臨床的有効性を示しており、現在、ヒト臨床試験で評価されている。したがって、ＧａｌＴ－ＫＯブタドナーに由来する生存可能な異種神経移植が、長ギャップ（≧４ｃｍ）の分節ＰＮＩの再構築及び治療の成功のために使用され得ると仮定した。
倫理
本研究の外科的処置、プロトコール、及び動物のケアに関するガイドラインは独立して、ＩＡＣＵＣにより審査及びモニタリングされ、ＵＳ－ＦＤＡ ２１ ＣＦＲ Ｐａｒｔ ５８．３５１及びＧＦＩ １９７、ＵＳＤＡ動物福祉法（９ ＣＦＲ Ｐａｒｔｓ １、２、及び３）、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施した。
動物
この研究で使用したすべての異種神経移植は、指定の病原体を含まない（ＤＰＦ）ブタドナーである１つの遺伝的に操作されたアルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト（ＧａｌＴ－ＫＯ）から供給した。５匹の雄及び５匹の雌のナイーブアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）は、異種移植神経産物レシピエントとして役立った。
外科的処置
ブタドナーを安楽死させ、前述のように手術のために準備した。採取前に坐骨神経を単離するために、仙骨と坐骨の中間に、大腿骨の後側に沿って腹部に延びる、直線切開を行い、中臀筋、大臀筋、梨状筋、及び大腿二頭筋を近位脛腓関節に長手方向に切開した。坐骨神経を視覚化し、脛骨及び総腓骨神経への神経起源の遠位及び分岐の近位の放射状切断によって採取した。
このプロセスは両側で繰り返した。一方の未修飾の坐骨神経分節をＲＰＭＩ培地に保存し、４８時間後に外科的に使用するまで４℃で維持した。他方を凍結保存し、－８０℃で１週間の期間保存した。移植の前に、異種神経を欠損サイズに合わせて４ｃｍにトリミングした。
長ギャップ（≧４ｃｍ）の分節末梢神経欠損は、１０個すべての非ヒト霊長類対象において両側に外科的に導入された。対象は、麻酔１０下で、肩を９０°屈曲させ、完全な内旋、及びニュートラルな外転とともに、側臥位に配置した。皮下組織及び深部筋膜を、近位腕の後外側縁に沿って肘前窩に向かって６～８ｃｍの皮膚切開で切開し、解剖学的オリエンテーションのために、上腕三頭筋腱膜を形成するために収束した上腕三頭筋の長頭部及び外側頭部を露出させた。上腕三頭筋の長頭部と外側頭部の間の筋肉内平面は、腱膜の頂点に近接して約２．５ｃｍ発達した。橈骨神経及びそれに付随する血管が、橈骨神経溝の上腕骨に対して観察された。意図しない損傷を最小限に抑えるために、外科用平面を近位及び遠位に延長した。橈骨神経を、深枝の原点の近位の約１ｃｍ遠位に切断した。４ｃｍのセグメントを除去して欠損を作成し、再取り付けまたはその後の分析のために保存した。
神経移植は、各神経縫合部位で４～８個の等距離８－０ナイロンモノフィラメント縫合糸で近位及び遠位に取り付けた。次いで、皮下の吸収性縫合糸を使用して切開部を層に閉じた。
このプロセスは、１０匹の対象の各々につき両側で行い、異種及び自己神経の両方を同じ外科的処置で移植した。異種移植または自己移植のための四肢の指定（右／左）は、無作為に割り当てられ、分析のために観察者から盲検化された。１０匹の対象は、１週間の差で、２つの外科的一連に無作為に均等に分けられた。最初の一連では５つの新鮮な異種移植が使用され、２番目では以前に凍結保存されていた５つの解凍された生存可能なブタ異種移植が使用された。術後、すべての対象は少なくとも６ヶ月間１４タクロリムスを投与され、トラフレベルは３０ｎｇ／ｍＬ未満になるはずであった。
機能的評価
以前に報告された橈骨神経損傷モデルを、異種及び自己神経移植レシピエントの機能回復を評価するために適合させた。肘の近位の橈骨神経損傷は、手関節伸展機能の喪失、すなわち「手関節の低下」をもたらし、これは、長橈側手根伸筋及び短橈側手根伸筋の運動神経変性によるものである。手関節伸展機能評価は、各対象について毎月行い、対象が手関節の角度を伸展して取得する必要のある物体を回収する間に、自動及び他動手関節角度屈曲の椅子側及びケージ側の観察を含めた。すべての機能評価はビデオ録画され、２人の独立した観察者によって分析され、最大手関節角度伸展を正確に測定した。
この測定は精度が限られているが、連続的な度の値の代わりに順序的なカテゴリー値を使用することで強化される。角度データは、ニュートラル（前腕と一直線、０°）から手関節伸展の３０°毎に１～３の数値を割り当てることにより、関節可動域（ＲＯＭ）スコアに変換した。したがって、ＲＯＭスコアは、それぞれ、角度＜３１°（スコア１）、３１°～６０°（スコア２）、及び６１°～９０°（スコア３）として定義した。
電気生理学
評価及び分析は、独立した専門家（Ｎａｔｕｓ ＵｌｔｒａＰｒｏとＳｙｎｅｒｇｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃソフトウェア）によって、放射状運動及び感覚分岐について、ベースラインならびに術後の５、８．５、及び１２ヶ月で、神経伝導速度（ＮＣＶ）、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）振幅、ＣＭＡＰ持続時間について１７で、両群の１０匹の対象すべてに対して行った。
組織形態計測分析
剖検では、神経縫合部位を超える近位及び遠位のネイティブ神経外科手術を含む神経移植の連続切除が調達され、ミクロトームを介して５μｍの厚さに長手方向に切片化され、組織学的分析のために１０％ＮＢＦで固定化された。試料をヘマトキシリン及びエオシン、Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ、及びＮＦ２００で染色した。
統計分析
別段の記載がない限り、自己神経移植部位と異種神経移植部位との間のデータ比較は、群当たりの平均±ＳＤとして表される。統計比較は、スチューデント＝ニューマン＝コイルス多重比較法を用いた一元配置分散分析として行った。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ Ｐａｄバージョン９．１．０ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ＵＳＡ）で行った。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると考えられた。
外科的及び臨床的転帰
１０匹の対象すべてが、処置に関連する有害イベントなしに回復した。タクロリムスレベルを、３０ｎｇ／ｍＬ未満に維持したが、しかしながら、トラフレベルは個々の対象間で大きく変化した（４．９～１４．２ｎｇ／ｍＬ）。術後６ヶ月で、無作為に選択された５匹の対象についてタクロリムスレジメンを中止し、残りの５匹については維持した。８ヶ月までに、タクロリムスレジメンの対象は、膝関節の可動性の制限、筋固縮、剛性、萎縮、及び著しい体重減少など、タクロリムス毒性１９に関連する進行中の症状を呈した。その結果、これら５匹の対象を安楽死させ８、残りの５匹の対象は、事故なしに研究終了まで生存した。
機能回復
手術後、用いられた神経移植の種類にかかわらず、１０匹すべての対象で約３ヶ月間、機能的手関節伸展の完全な喪失が観察された。近位の神経縫合部位から長橈側手根伸筋及び短橈側手根伸筋の神経支配部位までの距離は、１６．０ｃｍ±０．５６と測定された。１ｍｍ／日の軸索再生速度で、２１の機能回復がＰＯＤ－１６０で予想された。
術後４ヶ月までに、１０件の異種移植のうち６件とすべての自家移植は、様々な程度の機能回復を示し始めた。観察期間（それぞれ８ヶ月及び１２ヶ月）の終了までに、自家神経移植で修復した１０本の四肢すべてがベースライン値と同等の機能回復値を示したが、異種神経移植で処置した７本の四肢は術前レベルに回復していた。３匹の非レスポンダーでは、２つの異種神経が新鮮であり、１つは凍結保存されていた。
１７の成功例では、対象全体の平均回復率は、２つの神経の種類間で同等であるように思われたが、回復の大きさは自家神経移植で処置された四肢で最も大きかった。
神経伝導速度（ＮＣＶ）
１２ヶ月の観察期間の終了までに、自家または異種の再構築された四肢間の運動または感覚伝導速度に統計学的または生理学的に有意な差はなかった。
術後５ヶ月の最初の評価では、１０匹すべての対象において、術前値からの運動及び感覚伝導速度の全体的な低下（それぞれ－３６％及び－５３％）が認められた：運動（６４．２８ｍ／ｓ±２．３２～４１．１６ｍ／ｓ±１１．６３）及び感覚（５３．５５ｍ／ｓ±２．６３～２５．００ｍ／ｓ±８．１８）。
術後８ヶ月の２回目の評価では、運動伝導は４８％及び２３％増加し（自家神経については５４．０７ｍ／ｓ±６．２９、異種神経については５６．３３ｍ／ｓ±５．８２）、高速伝導性繊維の部分的な再ミエリン化が示された。
術後１２ヶ月の３回目及び最終の評価では、残りの５匹の対象は、同種異系及び異種の両方の群で運動速度が平均ベースライン値の少なくとも９６％まで回復したことを示した。すべての時点ですべての動物についてＦ波を誘発し、近位脊髄セグメント及び神経根を含む長い神経経路にわたる運動伝導の存在を示した。しかしながら、感覚神経の速度はすべての評価で有意に低下し、いずれの種類の移植でも回復を示すことはなかった。
複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）振幅
２０本の四肢すべての術前活動電位振幅は、１９．５５ｍＶ±５．０３であった。術後５ヶ月で、すべての対象の両肢にほぼ完全な喪失が観察された。８ヶ月までに、自家神経移植の振幅は、１０．１４ｍＶ±２．３３に回復したが、異種神経で処置された四肢は、６．９４ｍＶ±３．６２にのみ回復した。研究終了までに、自家移植及び異種移植の振幅は、残りの５匹の対象で同等であったが、しかしながら、両方ともベースライン値に完全に回復することはできなかった。
複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）持続時間
３つの時点のうちのいずれにおいても、異種移植と自家移植との間のＣＭＡＰ持続期間に統計的または生理学的に有意な差はなかった。ベースラインのＣＭＡＰ持続時間は、同種異系神経については３．９ｍｓ±０．６８、異種神経については３．９ｍｓ±０．５５であった。術後５ヶ月では、複合筋活動電位の持続時間は両群で延長され（時間分散）、術後８ヶ月でピークに達した（１０．１４ｍＶ±２．３３、自家及び６．９４ｍＶ±３．６２、異種）。術後１２ヶ月の残りの５匹の対象では、持続期間は部分的に回復した（－２３％、自家及び－４１％、異種）が、ベースライン値を超えて延長したままであった。
組織形態計測分析
剖検では、両方の種類の神経移植について、近位及び遠位の吻合部位に様々な程度の神経腫が観察された。Ｈ＆Ｅ染色を伴うこれらの部位での顕微鏡検査により、繊維組織の増殖が可変炎症を伴うことが明らかになり、一般に、縫合糸の周りの異物反応、ならびに神経腫形成と一貫する小径神経枝の多方向増殖からなる。吻合部位にフィブリン沈着を伴う元の欠損部位にわたって、軽度の線維症が観察され、埋め込まれた神経線維及び神経原繊維が一般的に長手方向に進行している。
８ヶ月のエンドポイントでは、５匹の対象すべての欠損部位にわたる神経線維のサイズは、両方の神経移植で１００～３００μｍの範囲となり同等であったが、周術期に測定した場合、自家神経半径は３００μｍを超えていた。１０匹の対象すべてについて、研究終了時では、異種軸索直径［２．５０μｍ±０．４０］は、自家対照［３．４０μｍ±０．５５］よりも小さかったが、いずれもネイティブ橈骨神経の周術期軸索直径［４．００μｍ±０．００］まで完全に回復しなかった。
Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ染色は、移植された神経の様々な程度のミエリン化を明らかにした。全体的に、両方の群について、神経移植領域に近位の領域は、最小限から軽度の脱髄を示し、遠位の領域でより重度であった。剖検では、ミエリン化の証拠は自家移植でより顕著であったが、脱髄は異種神経移植で処置された部位でより重度であった。新鮮な移植と凍結保存された移植の間には、組織学的に識別可能な差異はなかった。
ヒトの運動及び感覚神経との生理学的特徴の類似性、ならびに異種皮膚移植の前臨床的及び初期臨床的成功９を考えると、ＧａｌＴ－ＫＯブタドナー由来の生存可能な異種神経移植は、長ギャップ（≧４ｃｍ）の分節ＰＮＩの再構築及び処置の成功において、自家神経に代わる妥当な高品質の代替物であると思われた。
本研究では、両方の神経の種類で、術後４ヶ月で機能回復の開始が観察されたが、異種移植の回復の大きさは自家対照よりも少なかった。７本の成功した異種処置四肢のうち、６本は、自家神経移植対照と同等の回復度及び回復速度を示し、７本目は電気生理学及び組織学的転帰で同等の転帰を伴う遅延回復を示した。
機能的な手関節の活動を回復できなかった３匹の非レスポンダーのうちの２匹は、顕著な一側上肢筋萎縮を有し、剖検では、反対側の腕の相同領域と比較して、マクロスコピックな検査により、この領域における生存可能な組織が明らかになった。顕微鏡検査では、神経線維は検出されず、移植の継続性を確認することができなかった。これが技術的な失敗であったのか、または神経筋接合部が神経再支配が生じ得ない程度に完全に変性していたのかどうかは不明である。
手関節伸展の測定は、主観性及び単一度の精度を達成することができないことによって本質的に制限されているが、カテゴリーランキングでさえ、これらのデータは、異種移植における機能の回復が自家対照よりも全体的に堅牢ではなかったことを示唆している。
以前に報告されたように、タクロリムスの治療量以下の用量を、神経再生を刺激するためにすべての対象に投与したが、しかしながら、５匹の対象によって呈された毒性は、研究の潜在的な分析及び検出力を制限した。別の制限は、レジメンの相対的利益を解明するために必要な非タクロリムス処置対照群の欠如であった。
運動伝導速度の減少は、軸索断裂と一過性神経伝導障害の両方に起因すると想定されているが、増加は、対応する組織学的観察と一致して、高速伝導繊維及び再ミエリン化の回復を示唆している。しかしながら、神経伝導の存在は、完全な機能的筋肉神経支配を示すものではなく、不均一な伝導は、脱髄、未熟なミエリンによる再ミエリン化、繊維の喪失、または結合組織閉塞の局在化領域を示し得る。
活動電位の大きさは、運動ニューロン、神経筋接合部、ならびに刺激に応答する運動ユニットの強度及び数の完全性を反映する。振幅の減少は、軸索断裂、局所脱髄、ワーラー変性、及び部分的な伝導ブロックまたは運動ユニット障害の組み合わせを反映しており、これらはすべて弱点として表され得る。振幅の戻りは、不完全であるにもかかわらず、２つの群の間の運動ユニットが再神経支配され、高速伝導軸索が戻ったことを示唆している。
ＣＭＡＰ持続時間（時間的分散）の増加は、分節脱髄または不均一脱髄を示し得る。そのような場合、活動電位持続時間はより低い振幅でより長くなり、各時点で両方の徴候が観察される。
これらのデータは、運動神経の回復への傾向を示す。対照的に、橈骨感覚神経伝導はそのような傾向を示さなかった。いくつかの場合、感覚活動電位が弱く誘発され、側副感覚神経からの感覚再神経支配の可能性が示されたが、術後のすべての観察で感覚欠損がすべての対象にあった可能性が高い。
全体として、自家神経を伴う再構築では、機能回復、より大きな神経線維、及びより大きな程度の再ミエリン化において概してより好ましい転帰が観察されたが、それ以外の場合、電気生理学及び組織学的評価によって統計的に有意なまたは意味のある差は観察されなかった。可能な寄与因子には、特に橈骨神経を修復するための移植源として坐骨神経を使用することを考えると、非ヒト霊長類及びブタ神経の間の可変軸索直径及び束量、ならびに観察された浮腫、細胞浸潤、及び三次リンパ小節に寄与する可能性が高い固有の免疫学的差異、したがって全体的な軸索再生に対する微妙な影響が含まれる。最後に、失敗した新鮮な異種移植と凍結保存された異種移植との間で観察された２：１の比率は、統計的に有意ではなく、保存方法に基づく臨床転帰への負の影響の組織学的証拠はなかった。
この研究では、遺伝的に操作されたＤＰＦブタドナー異種神経移植を使用して、有害イベントまたは異種移植に起因する安全性への影響なしに、末梢神経欠損を再構築することに成功した。これらのデータは、遺伝的に操作されたＤＰＦブタドナーに由来する生存可能な異種神経移植の移植が、長ギャップ（≧４ｃｍ）の分節末梢神経損傷にわたる移植のための生存可能なドナー神経の有望な供給源であり、有望な所見はさらなる評価を保証することを示す。
データの追加分析と結論
１つの１２ヶ月間の研究では、非ヒト霊長類における長ギャップ（≧４ｃｍ）の末梢神経神経断裂を再構築する可能性のある方法として、遺伝的に操作された、指定された病原体を含まないブタドナーに由来する生存可能な大口径混合型異種神経移植の安全性及び有効性が評価された。２０００万人のアメリカ人が末梢神経損傷（ＰＮＩ）に苦しんでおり、その結果、毎年約５万件の手術が行われている。早期介入が成功すると、神経再生と再神経支配の速度が改善されるが、既存の治療は深刻な欠点を有する。質の高い外科的治療法が緊急に必要とされている。候補の療法は、理想的には生存可能なシュワン細胞及びマトリックスリッチ足場を含むべきである。ブタの神経は、ヒトの運動及び感覚神経と多くの生理学的特徴を共有し、より高い臨床的有用性の可能性を提供する。したがって、生存可能なブタ神経移植は、既存の外科的治療法に対する効果的な代替手段であり得ると仮定した。研究の臨床転帰（例えば、機能の回復、電気生理学）を公開した。ここでは、異種移植に対する組織学的及び免疫学的応答を具体的に評価する。
軸索及び結合組織の完全な生理学的及び解剖学的切断である両側の４ｃｍの放射状神経断裂を、１０匹のアカゲザルに外科的に導入した。各対象について、盲検化様式で、１本の四肢を自家神経移植で修復し、反対側の四肢を異種で修復した。１２ヶ月の観察期間にわたって、神経、脾臓、肝臓、腎臓、肺、及び心臓の試料を、様々なマクロスコピック及び顕微鏡的な組織形態学的特徴について評価した。対象を、ｑＰＣＲによって、抗ＧａｌＴ－ＫＯブタＩｇＧ及びＩｇＭ抗体ならびにブタ細胞の存在について反復的に評価した。
以前に報告された機能回復は、自家及び異種で処置された四肢の両方で観察された。炎症は、リンパ球、マクロファージ、及び組織球の浸潤集団を含む異種移植部位でより大きく、外側髄鞘に沿って三次リンパ小節が顕著に存在した。抗ＧａｌＴ－ＫＯブタＩｇＧ及びＩｇＭのレベル及び傾向は、以前の経験及び進行中の臨床試験と一致していた。マイクロキメリズムは、試料採取されたいかなる組織においても検出されず、異種移植に起因するいかなる全身的影響の証拠もなかった。
これらの長期的なインビボデータは、生存可能なブタ神経移植による再建後の有望な安全性及び忍容性を示唆している。鍵となる所見には、対象における１２ヶ月にわたる全身性ブタ細胞遊走の欠如、及び移植されたブタ組織の完全な除去が含まれる。組み合わせたこれらのデータは、神経異種移植療法を奨励し、異種移植の臨床的実現可能性をより広く支持している。
同じ１２ヶ月間の研究では、標準化された実験モデルを適用して、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における長ギャップ（≧４ｃｍ）の末梢神経神経断裂を再構築する可能性のある方法として、遺伝的に操作された、指定された病原体を含まないブタドナーに由来する生存可能な大口径混合型異種神経移植の安全性及び有効性を評価した。以前に報告された１機能回復が観察された。運動もしくは感覚神経の伝導速度、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）振幅、またはＣＭＡＰ持続時間において、自家または異種で処置された四肢の間に統計的に有意な差はなかった。全身性作用または有害イベントの証拠は、１０匹の対象のいずれにおいても異種移植に起因するものではなかった。この前臨床研究で示された異種神経移植の有望性を考慮して、ここでは、ＮＨＰにおける長ギャップ（≧４ｃｍ）の末梢神経損傷のための現在利用可能な外科的治療薬に対する安全な代替手段としての、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）に特に重点を置いた、生存可能なブタ神経移植の微生物学的安全性の分析を提示する。
ＰＥＲＶコピー数及び発現をマイクロキメリズムとともに分析して、ｑＰＣＲによってブタ細胞の存在を評価した。分析した試料には、処置後８ヶ月及び１２ヶ月で採取した異種（ｎ＝５）及び自家（ｎ＝５）神経組織、１２ヶ月の研究にわたる様々な時点で得られた対象（ｎ＝１０）からの血清及びＰＢＭＣ、ならびに剖検で得られた脾臓、腎臓、肝臓、及び肺切片が含まれた。
遺伝的に操作された、指定された病原体を含まないブタ神経移植ドナーは、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、レプトスピラ症、インフルエンザＡ、ＰＣＭＶ、ＰＲＶ、ＰＲＣＶ、及びＰＲＲＳＶに対して陰性であり、臨床異種移植ドナーの微生物学的プロファイルと一致していた。ブタ異種またはＮＨＰ自家神経試料において、ＰＥＲＶまたはマイクロキメリズム増幅は観察されなかった。レシピエントＰＢＭＣ、血清、及び組織は、ＰＥＲＶ ＲＮＡ及び／またはＤＮＡ増幅に対して試験で陰性であった。分析されたどの組織においても循環ブタ細胞の証拠は存在しなかった。すべての試料は分析のための品質基準を満たしていた。
これらの長期的なインビボデータは、生存可能なブタ神経移植による再建後の有望な微生物学的安全性を示唆している。分析されたいかなる組織または試料において、いずれの時点においても、いずれの対象においても、ＰＥＲＶの伝染またはＰＥＲＶ感染の証拠は存在しなかった。この研究の１つの限界は、アカゲザルの使用であり、これは以前に非効率的なＰＥＲＶ感染性を呈することが見出されている。興味深いことに、いずれの異種処置された四肢からも剖検で得られた任意の神経試料において、ブタ細胞は検出されなかった。これは、インビボでの異種神経移植の完全なリモデリングの組織学的証拠と一致する。これらの所見は、神経異種移植療法の安全性及び忍容性を奨励し、異種移植の有望な臨床的実現可能性をより広く支持している。
本開示の主題は、特徴の様々な組み合わせ及び部分的組み合わせを含めて、ある特定の例示の態様を参照してかなり詳細に記載及び提示されているが、当業者なら他の態様ならびにその変形及び修飾を容易に理解するであろうし、そうしたものは本開示の範囲に含まれる。さらに、そのような態様、組み合わせ、及び部分的組み合わせの説明は、特許請求の範囲に明示的に記載されるもの以外にも特徴または特徴の組み合わせが請求主題に必要となると伝えることを意図するものではない。したがって、本開示の範囲は、下記の添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲に含まれるすべての修飾及び変形を含むものとする。

Claims (95)

  1. 移植のための個別化された、ヒト化された、移植可能な細胞、組織、及び臓器のリポジトリを生成及び保存するための生物学的システムであって、前記生物学的システムが、生物学的及び代謝的に活性（生存）であり、前記生物学的システムが、ヒトレシピエントへの移植のために非ヒト動物ドナーにおいて遺伝的に再プログラムされたタンパク質、細胞、組織、及び／または臓器を含み、
    前記非ヒト動物ドナーが、遺伝的に再プログラムされたブタドナーから単離された細胞、組織、及び／または臓器の異種移植のための前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーであり、
    前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、複数の内因性エクソン及び／またはイントロン領域内の複数の野生型ヌクレオチドを、３～３５０塩基対の長さのヒト捕捉参照配列の免疫原性及び／または物理化学的特性に基づいて設計された複数の合成ヌクレオチド配列で置き換えるように再プログラムされたゲノムを含み、
    前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーの細胞が、ガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトース（アルファ－Ｇａｌ）、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及び／またはＳｄａから選択される１つ以上の表面糖鎖エピトープを提示せず、アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）をコードする遺伝子が、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、前記遺伝子によってコードされる表面糖鎖エピトープの機能的発現を欠くように破壊され、
    前記ブタドナーのゲノムが、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせを通じて再プログラムされ、その設計は、付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、ヌクレオチドの総数の５％以下の正味の利得または正味の損失を有し、ゲノム組織破壊を回避し、非トランスジェニックであり、かつそれは前記動物の免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときに前記ドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与し、
    前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲＡ、ＳＬＡ－ＤＲＢ、ＳＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＳＬＡ－ＤＱＢのエクソン領域に対応する前記野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の内因性エクソン及び／またはイントロン領域、ならびにそれらの任意の組み合わせを含み、それらは、破壊され、サイレンシングされ、またはそれ以外の場合、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせによって達成される細胞外表面の（９５％）において機能的に発現されず、
    前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列から設計され、かつ付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、かつゲノム組織破壊を回避する、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトＢ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２のオルソロガスなエクソンに由来する合成ヌクレオチドでの、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせを通じて再プログラムすることを介してヒト化され、かつ前記Ｂ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びＭＩＣ－２のタンパク質の自然免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときに前記ドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する、前記野生型ブタドナーのＢ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及び／またはＭＩＣ－２、ならびにそれらの任意の組み合わせの内因性エクソン及び／またはイントロン領域を含み、
    前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列から設計され、かつ付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の利得または損失をもたらさず、かつゲノム組織破壊を回避する、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＨＬＡ－ＤＱＢのオルソロガスなエクソンに由来する合成ヌクレオチドでの、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせを通じて再プログラムされ、かつ前記ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲＡ、ＳＬＡ－ＤＲＢ、ＳＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＳＬＡ－ＤＱＢのタンパク質の自然免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときに前記ドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲＡ、ＳＬＡ－ＤＲＢ、ＳＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＳＬＡ－ＤＱＢ、またはそれらの任意の組み合わせのエクソン領域に対応する前記野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の内因性エクソン及び／またはイントロン領域を含む、前記生物学的システム。
  2. 前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーが、少なくとも以下：Ａｓｃａｒｉｓ種、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ブタ生殖器呼吸器症候群、仮性狂犬病、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｉｃｒｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、ブタインフルエンザ、ブタサイトメガロウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、及び家畜関連メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの病原体を含まない、請求項１に記載の生物学的システム。
  3. 前記ブタドナーのゲノムが、前記合成ヌクレオチドで前記野生型ブタドナーの前記ゲノムを再プログラムした後に、ヌクレオチドの数に正味の損失または正味の利得なしに再プログラムされる、請求項１または請求項２に記載の生物学的システム。
  4. 部位特異的変異原性置換が、前記非ヒト動物ドナーを産生するために使用される生殖細胞において作製される、請求項１～３のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  5. 前記ヒト捕捉参照配列が、ヒト患者捕捉配列、ヒト集団特異的ヒト捕捉配列、または対立遺伝子群特異的ヒト捕捉配列である、請求項１～４のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  6. 前記ゲノムが、フレームシフト、挿入変異、欠失変異、ミスセンス変異、及びナンセンス変異が存在しない、いかなる正味の挿入、欠失、切断、または他の遺伝子改変も導入せずに、前記エクソン領域のスカーレス交換を使用して再プログラムされる、請求項１～５のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  7. 前記再プログラムされたゲノムが、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡから選択される少なくとも１つの終止コドン、または前記終止コドンのうちの２つもしくは３つの連続した組み合わせを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  8. 前記再プログラムされたゲノムが、前記野生型ブタドナー遺伝子が、前記遺伝子の機能的発現を欠くように、サイレンシングされる遺伝子のプロモーターから７０超の塩基対下流に前記少なくとも１つの終止コドンまたは前記終止コドンのうちの２つもしくは３つの前記組み合わせを含む、請求項７に記載の生物学的システム。
  9. 前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及びベータ－２－ミクログロブリンをコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ－２－ミクログロブリン、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－ＤＲの機能的発現を欠く、請求項１～８のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  10. 前記野生型ブタゲノムが、ＣＴＬＡ－４プロモーター及びＰＤ－Ｌ１プロモーターのうちの１つ以上において再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ＣＴＬＡ－４プロモーター及び前記ＰＤ－Ｌ１プロモーターのうちの１つ以上が、前記野生型ブタのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１の内因性発現と比較して、再プログラムされたＣＴＬＡ－４及び再プログラムされたＰＤ－Ｌ１のうちの１つまたは両方の発現を増加させるように再プログラムされる、請求項１～９のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  11. 前記合成ヌクレオチドの総数が、前記合成ヌクレオチドで前記野生型ブタの前記ゲノムを再プログラムした後に、ヌクレオチドの数に正味の損失または正味の利得がないように、前記置き換えられたヌクレオチドの総数に等しい、請求項１～１０のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  12. 前記複数の合成ヌクレオチドによる前記再プログラムが、前記野生型ブタＭＨＣ配列と前記ヒト捕捉参照配列との間で保存されるアミノ酸をコードするコドン領域におけるヌクレオチドの置き換えを含まない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  13. 前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列由来のオルソロガスなヌクレオチドでの、前記野生型ブタの前記主要組織適合性複合体におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  14. 部位特異的変異原性置換が、前記非ヒト動物を産生するために使用される生殖細胞において作製される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  15. 前記ヒト捕捉参照配列が、ヒト患者捕捉配列、ヒト集団特異的ヒト捕捉配列、または対立遺伝子群特異的ヒト捕捉配列である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  16. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ａ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－１のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  17. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｂ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－２のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  18. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｃ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－３のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  19. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｅ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－６のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  20. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｆ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－７のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  21. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｇ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－８のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  22. 前記再プログラムされたゲノムが、前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩ鎖関連２（ＭＩＣ－２）のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  23. 前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－ＤＲ、またはそれらの組み合わせの機能的発現を欠く、請求項１～２２のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  24. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－ＤＱＡ１捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来する、前記野生型ブタのＳＬＡ－ＤＱＡのエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  25. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－ＤＱＢ１捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来する、前記野生型ブタのＳＬＡ－ＤＱＢのエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  26. 前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のＨＬＡ－ＤＲＡ１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－ＤＲＡ及びＳＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含むか、または前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＲＡ及びＳＬＡ－ＤＲＢ１の機能的発現を欠く、請求項１～２５のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  27. 前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のＨＬＡ－ＤＱＡ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢ１のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  28. 前記ヌクレオチドの部位特異的変異原性置換が、前記野生型ブタのゲノムと既知のヒト配列との間で保存されないコドンにある、請求項１～２７のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  29. 前記再プログラムされたゲノムが、既知のヒトＢ２－ミクログロブリンのオルソロガスなエクソンに由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＢ２－ミクログロブリンのエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  30. 前記再プログラムされたブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるベータ２ミクログロブリン糖タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるヒト化ベータ２ミクログロブリン（ｈＢ２Ｍ）ポリペプチド配列であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  31. 前記ゲノムが、前記遺伝的に再プログラムされたブタが前記野生型ブタの内因性β２－ミクログロブリンポリペプチドの機能的発現を欠くように再プログラムされている、請求項１～３０のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  32. 前記ゲノムが、前記ブタの内因性β２－ミクログロブリン遺伝子座において、前記ゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のβ２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように再プログラムされているように、再プログラムされている、請求項１～３１のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  33. 前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、及びＳＬＡ－ＤＱのエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  34. 前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＱ及びＭＩＣ－２のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  35. 前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＱ、及びＢ２Ｍにおけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  36. 前記再プログラムされたゲノムが、ＳＬＡ－ＤＲ、ＳＬＡ－１、及び／またはＳＬＡ－２の機能的発現を欠く、請求項１～３５のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  37. フレームシフト、挿入変異、欠失変異、ミスセンス変異、及びナンセンス変異が存在しない、請求項１～３６のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  38. 前記ゲノムのイントロン領域におけるヌクレオチドが破壊されない、請求項１～３７のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  39. 前記ゲノムが、前記再プログラムされたエクソン領域においてホモ接合であるように再プログラムされる、請求項１～３８のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  40. 前記ゲノムが、ポリペプチドの細胞外、表現型表面発現がヒトレシピエントにおいて免疫寛容性であるように再プログラムされる、請求項１～３９のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  41. 前記ゲノムが、ＣＴＬＡ－４プロモーター配列を再プログラムすることによって、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の発現が増加するように再プログラムされる、請求項１～４０のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  42. 前記再プログラムされたゲノムが、ヒト捕捉参照配列ＣＴＬＡ－４のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ＣＴＬＡ－４のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  43. 前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるＣＴＬＡ－４と少なくとも９５％同一であるヒト化ＣＴＬＡ－４ポリペプチド配列であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  44. 前記ゲノムが、ＰＤ－Ｌ１プロモーター配列を再プログラムすることによって、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現が増加するように再プログラムされる、請求項１～４３のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  45. 前記再プログラムされたゲノムが、既知のヒトＰＤ－Ｌ１のオルソロガスなエクソンに由来するヌクレオチドでの、前記野生型ＰＤ－Ｌ１のエクソン領域におけるヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  46. 前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照ゲノムによって発現されるＰＤ－Ｌ１と少なくとも９５％同一であるヒト化ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド配列であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  47. 前記再プログラムされたゲノムが、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇ捕捉参照配列のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８のエクソン領域におけるヌクレオチドの保存的アミノ酸置換を含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  48. 前記再プログラムされたゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列のＨＬＡ－ＤＱＡ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１のオルソロガスなエクソン領域に由来するヌクレオチドでの、前記野生型ブタのＳＬＡ－ＤＱＡ及びＳＬＡ－ＤＱＢ１のエクソン領域におけるヌクレオチドの保存的アミノ酸置換を含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の生物学的システム。
  49. 請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた、遺伝的に再プログラムされた、生物学的及び代謝的に活性な、非ヒト細胞、組織、または臓器であって、任意選択で、前記生物学的システムが、Ｏ陰性の血液型を有し、任意選択で、タンパク質、細胞、組織、及び臓器の調達が、コーシャ方法論で行われる、前記遺伝的に再プログラムされた、生物学的及び代謝的に活性な、非ヒト細胞、組織、または臓器。
  50. 前記遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト細胞が、幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、または分化幹細胞である、請求項４９に記載の、遺伝的に再プログラムされた、生物学的に活性及び代謝的に活性な非ヒト細胞、組織、または臓器。
  51. 請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた、遺伝的に再プログラムされた、非ヒト機能性タンパク質。
  52. 再プログラムされたゲノムを含む遺伝的に再プログラムされたブタドナーから、異種移植のためのブタドナータンパク質、細胞、組織、または臓器を産生する方法であって、前記ブタドナー組織または臓器の細胞が、レシピエント固有の表面表現型によって特徴付けられるように遺伝的に再プログラムされ、
    ａ）有望なヒト移植レシピエントからＤＮＡを含有する生体試料を得ることと、
    ｂ）前記生体試料の全ゲノム配列決定を行って、ヒト捕捉参照配列を得ることと、
    ｃ）前記ヒト捕捉参照配列を、遺伝子座（ｉ）～（ｖ）：
    （ｉ）ＳＬＡ－３をコードするエクソン領域、
    （ｉｉ）ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８をコードするエクソン領域、
    （ｉｉｉ）ＳＬＡ－ＤＱをコードするエクソン領域、
    （ｉｖ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする１つ以上のエクソン、
    （ｖ）ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、及びＴＦＰＩのエクソン領域で前記ブタドナーの野生型ゲノムと比較することと、
    ｄ）前記遺伝子座（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上について３～３５０塩基対の長さの合成ヌクレオチド配列を作成することであって、前記合成ヌクレオチド配列が、ブタドナー遺伝子座（ｉ）～（ｖｉ）に対応する遺伝子座で前記ヒト捕捉参照配列にオルソロガスである、前記作成することと、
    ｅ）ブタ胎児線維芽細胞、ブタ接合体、ブタ間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはブタ生殖細胞を得ることと、
    ｆ）ｅ）の前記細胞を、機能的アルファ－１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、及びベータ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を欠くように遺伝的に再プログラムすることと、
    ｇ）（ｉ）～（ｖ）のヌクレオチド配列を前記合成ヌクレオチド配列で置き換えることによって、ヌクレオチドの部位特異的変異原性置換を行うために、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）またはマルチプレックス遺伝子編集を使用して、ｅ）またはｆ）の前記細胞を遺伝的に再プログラムすることであって、
    前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲＡ、ＳＬＡ－ＤＲＢ、ＳＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＳＬＡ－ＤＱＢのエクソン領域に対応する前記野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の内因性エクソン及び／またはイントロン領域、ならびにそれらの任意の組み合わせを含み、それらは、破壊され、サイレンシングされ、またはそれ以外の場合、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせによって達成される細胞外表面の（９５％）において機能的に発現されず、
    前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列から設計され、かつ付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつヌクレオチドの総数の５％以下の正味の利得または正味の損失を有し、かつゲノム組織破壊を回避する、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトＢ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及び／またはＭＩＣ－２のオルソロガスなエクソンに由来する合成ヌクレオチドでの、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせを通じて再プログラムされ、かつ前記Ｂ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及び／またはＭＩＣ－２のタンパク質の自然免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときに前記ドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する、前記野生型ブタドナーのＢ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及び／またはＭＩＣ－２、ならびにそれらの任意の組み合わせの内因性エクソン及び／またはイントロン領域を含み、
    前記再プログラムされたブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列から設計され、かつ付帯ゲノム破壊を最小限に抑え、かつ理想的には、ヌクレオチドの総数の正味の利得または損失をもたらさず、かつゲノム組織破壊を回避する、前記ヒト捕捉参照配列からの既知のヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＨＬＡ－ＤＱＢのオルソロガスなエクソンに由来する合成ヌクレオチドでの、正確な部位特異的変異原性置換または修飾の特定の組み合わせを通じて再プログラムされ、かつ前記ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲＡ、ＳＬＡ－ＤＲＢ、ＳＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＳＬＡ－ＤＱＢのタンパク質の自然免疫機能を犠牲にすることなく、ヒトに移植されたときに前記ドナー動物の細胞、組織、及び臓器に免疫寛容性を付与する、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、ＳＬＡ－８、ＳＬＡ－ＤＲＡ、ＳＬＡ－ＤＲＢ、ＳＬＡ－ＤＱＡ、及び／またはＳＬＡ－ＤＱＢ、またはそれらの任意の組み合わせのエクソン領域に対応する前記野生型ブタドナーの主要組織適合性複合体の内因性エクソン及び／またはイントロン領域を含む、前記遺伝的に再プログラムすることと、
    ｈ）ｇ）中の前記遺伝的に再プログラムされた細胞から胚を生成することと、
    ｉ）前記胚を代用ブタに移植し、前記移植された胚を前記代用ブタ内で成長させることであって、前記代用ブタが、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーを出産する、前記成長させることと、
    ｊ）前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーから、前記ブタドナータンパク質、細胞、組織、または臓器を採取することと、を含む、前記方法。
  53. 前記合成ドナーブタヌクレオチド配列を有する前記遺伝的に再プログラムされたブタが、少なくとも以下：
    （ｉ）糞便物質中のＡｓｃａｒｉｓ種、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、
    （ｉｉ）抗体力価を決定することによる、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、仮性狂犬病、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）／ブタ呼吸器コロナウイルス、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ Ｇｏｎｄｉｉ、
    （ｉｉｉ）ブタインフルエンザ、
    （ｉｖ）細菌培養によって決定される以下の細菌病原体：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、家畜関連メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＡ ＭＲＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｐｙｔｈｏｎ、及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．、
    （ｖ）ブタサイトメガロウイルス、ならびに
    （ｖｉ）Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、の人獣共通病原体を含まないことを確認することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
  54. バイオバーデン低減手順に従って前記遺伝的に再プログラムされたブタを維持することをさらに含み、前記手順が、隔離された閉鎖群中で前記遺伝的に再プログラムされたブタを維持することを含み、前記隔離された閉鎖群中のすべての他の動物が、前記人獣共通病原体を含まないことが確認され、前記遺伝的に再プログラムされたブタが、前記隔離された閉鎖群の外部の任意の非ヒト動物及び動物収容施設との接触から隔離される、請求項１０８～１０９のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記ブタから生物学的製品を採取することをさらに含み、前記採取することが、前記ブタを安楽死させること、及び前記ブタから前記生物学的製品を無菌的に取り出すことをさらに含む、請求項１０２～１０４のいずれか１項に記載の方法。
  56. ３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイによって決定される５０％未満の細胞生存度に細胞生存度を低下させない滅菌プロセスを使用する採取後の滅菌を含む前記生物学的製品を加工することをさらに含む、請求項１０２～１０５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 細胞生存度を保存する貯蔵条件下で、滅菌容器中で前記生物学的製品を貯蔵することをさらに含む、請求項１０８～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  58. 異種移植の細胞媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びＢ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及び／またはＭＩＣ－２タンパク質のうちの１つ以上、あるいはそれらの任意の組み合わせをコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタオルソログの機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  59. レシピエントヒトにおける、異種移植に対する凝固性及び／または血栓性虚血を予防または低減する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタドナーゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、前記野生型ブタドナーのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びＢ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＰＣＲ、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、及び／またはＭＩＣ－２タンパク質のうちの１つ以上、あるいはそれらの任意の組み合わせをコードする領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタオルソログの機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  60. レシピエントヒトにおける、異種移植細胞、組織、または臓器に対する少なくとも部分的な免疫寛容を誘導する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリンをコードする１つ以上のエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ－２－ミクログロブリンの機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  61. 異種移植片のナチュラルキラー細胞媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリンのうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ２－ミクログロブリンの機能的発現を欠き、前記野生型ブタゲノムが、前記野生型ブタのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含む、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  62. 異種移植片の細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリンのうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ２－ミクログロブリンの機能的発現を欠き、前記野生型ブタゲノムが、前記野生型ブタのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含む、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  63. 異種移植片のＭＨＣクラスＩａ媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつＳＬＡ－３及び前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリンのうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ－２－ミクログロブリン、ＳＬＡ－１、及びＳＬＡ－２の機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  64. 異種移植片のＭＨＣクラスＩｂ媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８、ならびに前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリンのうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ－２－ミクログロブリンの機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  65. 異種移植片のＭＨＣクラスＩＩ媒介性拒絶反応を低減する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつＳＬＡ－ＤＲ及びＳＬＡ－ＤＱの少なくとも１つ、ならびに前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、及びベータ－２－ミクログロブリンのうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ－２－ミクログロブリンの機能的発現を欠く、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  66. 異種移植片のアポトーシス細胞媒介性拒絶反応を阻害する方法であって、
    ａ）請求項１～４８のいずれか１項に記載の生物学的システムから得られた非ヒト細胞、組織、または臓器を産生するかまたは得ることであって、前記野生型ブタゲノムが、前記ヒト捕捉参照配列を使用して、ＳＬＡ－ＭＩＣ－２遺伝子において、かつ前記野生型ブタのＭＨＣクラスＩａ、ＭＨＣクラスＩｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びベータ－２－ミクログロブリンのうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含み、前記ヒト細胞、組織、または臓器が、ブタベータ２－ミクログロブリンの機能的発現を欠き、前記野生型ブタゲノムが、前記野生型ブタのＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１のうちの１つ以上をコードするエクソン領域において、再プログラムされたヌクレオチドを含む、前記産生するかまたは得ることと、
    ｂ）前記非ヒト細胞、組織、または臓器を前記レシピエントヒトに移植することと、を含む、前記方法。
  67. 前記移植ステップの後、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）Ａ、Ｂ、及び／またはＣが、前記レシピエントヒトに伝染されない、請求項５８～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 請求項１に記載のゲノムを含む、前記遺伝的に再プログラムされたブタドナーにおけるオフターゲット編集またはゲノム改変についてスクリーニングする方法であって、
    ａ）ブタドナーからのＤＮＡを含有する生体試料について全ゲノム配列決定を行って、第１の全ゲノム配列を取得することと、
    ｂ）前記ブタドナーゲノムの遺伝的な再プログラムを行って、前記再プログラムされたブタドナーゲノムを取得することと、
    ｃ）ステップｂ）の後に、全ゲノム配列決定を行って、第２の全ゲノム配列を取得することと、
    ｄ）前記第１の全ゲノム配列及び前記第２の全ゲノム配列を整列させて、配列アラインメントを取得すること、
    ｅ）前記配列アラインメントを分析して、オフターゲット部位における前記ブタドナーのゲノムに対する任意のミスマッチを識別することと、を含み、前記オフターゲット部位が、ステップｂ）において遺伝子再プログラムのために選択されなかったゲノム位置である、前記方法。
  69. 野生型ブタＭＨＣクラスＩａ由来の野生型ブタイントロン領域を有し、ＳＬＡ－３と、ヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｃとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｃのコドンを用いて前記野生型ブタのＳＬＡ－３をコードするエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  70. 前記野生型ブタのＳＬＡ－１及びＳＬＡ－２がそれぞれ、終止コドンを含む、請求項６９に記載の合成ヌクレオチド配列。
  71. 野生型ブタＭＨＣクラスＩｂ由来の野生型ブタイントロン領域を有し、ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８と、ヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇそれぞれとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇそれぞれのコドンを用いて前記野生型ブタの前記ＳＬＡ－６、ＳＬＡ－７、及びＳＬＡ－８をコードするエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  72. 請求項６９及び７１の両方、または請求項７０及び７１の両方に記載の合成ヌクレオチド配列を有する、合成ヌクレオチド配列。
  73. 合成ヌクレオチド配列であって、野生型ブタＭＨＣクラスＩＩ由来の野生型ブタイントロン領域を有し、ＳＬＡ－ＤＱと、ヒト捕捉参照配列由来のＨＬＡ－ＤＱそれぞれとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＨＬＡ－ＤＱのコドンをそれぞれ用いて前記野生型ブタの前記ＳＬＡ－ＤＱをコードするエクソン領域で再プログラムされ、前記野生型ブタのＳＬＡ－ＤＲが終止コドンを含む、前記合成ヌクレオチド配列。
  74. 請求項７０～７３のいずれかの組み合わせに記載の合成ヌクレオチド配列を有する、合成ヌクレオチド配列。
  75. 合成ヌクレオチド配列であって、野生型ブタベータ２－ミクログロブリン由来の野生型ブタイントロン領域を有し、野生型ブタのベータ２－ミクログロブリンと、ヒト捕捉参照配列由来のベータ２－ミクログロブリンとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来のベータ２－ミクログロブリンのコドンを用いて前記野生型ブタのベータ２－ミクログロブリンをコードするエクソン領域で再プログラムされ、前記合成ヌクレオチド配列が、前記野生型ブタのβ２－ミクログロブリンポリペプチドの機能的発現を欠くように、エクソン領域内に少なくとも１つの終止コドンを含む、前記合成ヌクレオチド配列。
  76. 野生型ブタＭＩＣ－２由来の野生型ブタイントロン領域を有し、ＭＩＣ－２と、ヒト捕捉参照配列由来のＭＩＣ－ＡまたはＭＩＣ－Ｂとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＭＩＣ－ＡまたはＭＩＣ－Ｂのコドンを用いて前記野生型ブタのＭＩＣ－２のエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  77. 野生型ブタＣＴＬＡ－４由来の野生型ブタイントロン領域を有し、前記野生型ブタのＣＴＬＡ－４と、ヒト捕捉参照配列由来のＣＴＬＡ－４との間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＣＴＬＡ－４のコドンを用いて前記野生型ブタのＣＴＬＡ－４をコードするエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  78. 野生型ブタＰＤ－Ｌ１由来の野生型ブタイントロン領域を有し、前記野生型ブタのＰＤ－Ｌ１と、ヒト捕捉参照配列由来のＰＤ－Ｌ１との間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＰＤ－Ｌ１のコドンを用いて前記野生型ブタのＰＤ－Ｌ１をコードするエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  79. 野生型ブタＥＰＣＲ由来の野生型ブタイントロン領域を有し、前記野生型ブタのＥＰＣＲと、ヒト捕捉参照配列由来のＥＰＣＲとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＥＰＣＲのコドンを用いて前記野生型ブタのＥＰＣＲをコードするエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  80. 野生型ブタＴＢＭ由来の野生型ブタイントロン領域を有し、前記野生型ブタのＴＢＭと、ヒト捕捉参照配列由来のＴＢＭとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＴＢＭのコドンを用いて前記野生型ブタのＴＢＭをコードするエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  81. 野生型ブタＴＦＰＩ由来の野生型ブタイントロン領域を有し、前記野生型ブタのＴＦＰＩと、ヒト捕捉参照配列由来のＴＦＰＩとの間で保存されていないアミノ酸をコードする前記ヒト捕捉参照配列由来の前記ＴＦＰＩのコドンを用いて前記野生型ブタのＴＦＰＩをコードするエクソン領域で再プログラムされた、合成ヌクレオチド配列。
  82. 前記再プログラムされたゲノムが、野生型ブタ遺伝子が機能的発現を欠くように、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡから選択される少なくとも１つの終止コドン、または前記終止コドンのうちの２つもしくは３つの連続した組み合わせでの、前記野生型ブタ遺伝子の開始コドンの後の最初の９つのヌクレオチドの置き換えを含む、請求項５２～８１のいずれか１項に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  83. 図５２Ａ～Ｂに示される配列を有する、ブタ、細胞、組織、または臓器。
  84. 図５２Ａ及び／または図２２Ｂに示されるように再プログラムされた野生型ブタ遺伝子を有する、ブタ、細胞、組織、または臓器。
  85. ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡから選択される少なくとも１つの終止コドン、または前記終止コドンのうちの２つもしくは３つの連続した組み合わせを用いて、野生型ブタ遺伝子を再プログラムして、前記ブタ遺伝子の開始コドンの後の最初の９つのヌクレオチドを再プログラムする方法。
  86. 図５２Ａ及び／または図５２Ｂに示されるように、前記野生型ブタ遺伝子を再プログラムすることを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ヌクレオチドの置換が、保存的アミノ酸置換に基づく、本開示のいずれかの請求項に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  88. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、類似の化学的特性を有する側鎖Ｒ基を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８７に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  89. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８８に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  90. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８８に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  91. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、アミド含有側鎖を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８８に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  92. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、芳香族側鎖を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８８に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  93. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８８に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  94. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、酸性側鎖を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８８に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
  95. 別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸残基に限定される、請求項８８に記載の方法または合成ヌクレオチド配列。
JP2023513097A 2020-08-24 2021-08-24 付帯ゲノム破壊を最小限に抑えたサイレンシング、ヒト化、及び個別化のための、移植のための免疫学的に適合性のある細胞、組織、臓器、及び方法 Pending JP2023538663A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063069569P 2020-08-24 2020-08-24
US63/069,569 2020-08-24
PCT/US2021/047424 WO2022046824A1 (en) 2020-08-24 2021-08-24 Immunologically compatible cells, tissues, organs, and methods for transplantation for silencing, humanization, and personalization with minimized collateral genomic disruptions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023538663A true JP2023538663A (ja) 2023-09-08

Family

ID=77897721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023513097A Pending JP2023538663A (ja) 2020-08-24 2021-08-24 付帯ゲノム破壊を最小限に抑えたサイレンシング、ヒト化、及び個別化のための、移植のための免疫学的に適合性のある細胞、組織、臓器、及び方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20220053739A1 (ja)
EP (1) EP4199711A1 (ja)
JP (1) JP2023538663A (ja)
CN (1) CN116615448A (ja)
AU (1) AU2021333671A1 (ja)
CA (1) CA3189986A1 (ja)
WO (1) WO2022046824A1 (ja)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2496761C (en) 2002-08-21 2015-06-02 Revivicor, Inc. Porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US11284607B2 (en) 2015-03-24 2022-03-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genetic modification of pigs for xenotransplantation
US20190001180A1 (en) 2017-06-29 2019-01-03 Victory Grips Llc Rowing handle
WO2020072982A1 (en) * 2018-10-05 2020-04-09 Xenotherapeutics, Inc. Xenotransplantation products and methods
EP3945799A1 (en) * 2019-03-25 2022-02-09 Xenotherapeutics, Inc. Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non- human) donor and methods and products relating to same

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021333671A9 (en) 2023-07-13
CN116615448A (zh) 2023-08-18
US20230323400A1 (en) 2023-10-12
US20220053739A1 (en) 2022-02-24
AU2021333671A1 (en) 2023-05-04
WO2022046824A1 (en) 2022-03-03
CA3189986A1 (en) 2022-03-03
EP4199711A1 (en) 2023-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wolf et al. Novel approaches to exploiting invariant NKT cells in cancer immunotherapy
Parham et al. Alloreactive killer cells: hindrance and help for haematopoietic transplants
de Almeida et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives
Cantor et al. Loss of T cell CD98 H chain specifically ablates T cell clonal expansion and protects from autoimmunity
JP2019517803A (ja) 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織、および臓器
CN110191898A (zh) Cd33特异性嵌合抗原受体
KR20220004029A (ko) 인간화된, 맞춤형, 지정된-병원체 유리, (비-인간) 공여체로부터 이식을 위한 개인화된 세포, 조직 및 장기 및 이와 관련된 방법 및 생성물
US11424007B2 (en) Selection and monitoring methods for xenotransplantation
JP2008505080A (ja) ＲＯＲγｔ機能の調節のための組成物および方法
Salisbury et al. Transplantation tolerance
US20150139994A1 (en) Compositions and methods for preventing allogeneic immune rejection
IL281867B1 (en) Products and methods of cell transplantation
James et al. HY peptides modulate transplantation responses to skin allografts
Meissner et al. Immune editing: overcoming immune barriers in stem cell transplantation
Socié et al. Immune biology of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: models in discovery and translation
US20230078894A1 (en) Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non-human) donor and methods and products relating to same
US20220053739A1 (en) Immunologically compatible cells, tissues, organs, and methods for transplantation for silencing, humanization, and personalization with minimized collateral genomic disruptions
Shizuru The experimental basis for hematopoietic cell transplantation for autoimmune diseases
WO2022133155A1 (en) Humanization of beta2-microglobulin in porcine genome resulting in functional expression of human βeta2-microglobulin within donor cells, tissues, or organs
Nagy Acceptance of allogeneic cell transplants without systemic immune suppression
Brandmaier TRP-1 as a Model Tumor Antigen for Immunotherapy and Immune Tolerance in the Thymus