CN116615233A - 用于使生物分子在受试者中表达的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于使至少一种治疗性蛋白或生物活性核酸分子在受试者中表达的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，所述受试者首先被施用包含不合或基本上不合核酸分子的聚阳离子结构的组合物，然后(例如，在1‑30分钟后)被施用包含编码至少一种治疗性蛋白(例如，至少一种抗SARS‑CoV‑2抗体、多种不同的抗体、ACE2蛋白或人生长激素)或生物活性核酸分子的多个一种或多种非病毒表达载体的组合物。
Description
本申请要求2020年9月25日提交的美国临时申请序列号63/083,625的优先权，所述临时申请通过引用整体并入本文。
序列表
与此一起提交的标题为“38655-601_SEQUENCE_LISTING_ST25”、创建于2021年9月24日、文件大小为2，893，042字节的计算机可读序列表的文本特此通过引用整体并入。
技术领域
本发明提供了用于使至少一种治疗性蛋白或生物活性核酸分子在受试者中表达的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，所述受试者首先被施用包含不含或基本上不含核酸分子的聚阳离子结构的组合物，然后(例如，在1-30分钟后)被施用包含编码至少一种治疗性蛋白(例如，至少一种抗SARS-CoV-2抗体、多种不同的抗体、一种抗SARS-CoV-2重组ACE2蛋白、至少一种细胞因子或人生长激素)或生物活性核酸分子的多个一种或多种非病毒表达载体的组合物。
背景技术
最简单的非病毒基因传递系统使用裸表达载体DNA。已经证实将游离DNA直接注射到某些组织，特别是肌肉中，会产生高水平的基因表达，并且这种方法的简单性使其在许多临床方案中得到采用。具体而言，这种方法已应用于癌症的基因疗法，其中DNA可以直接注射到肿瘤中，或者可以注射到肌肉细胞中，以便使可能起到癌症疫苗作用的肿瘤抗原表达。
尽管已证实直接注射质粒DNA会导致基因表达，但总体表达水平远低于病毒或脂质体载体。由于血清核酸酶的存在，裸DNA一般也被认为不适合于全身施用。因而，直接注射质粒DNA似乎仅限于几个牵涉易于进行直接注射的组织(诸如皮肤和肌肉细胞)的应用。
发明内容
本发明提供了用于使至少一种治疗性蛋白或生物活性核酸分子在受试者中表达的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，所述受试者首先被施用包含不含或基本上不含核酸分子的聚阳离子结构的组合物，然后(例如，在1-30分钟后)被施用包含编码至少一种治疗性蛋白(例如，至少一种抗SARS-CoV-2抗体、多种不同的抗体或人生长激素)或生物活性核酸分子的多个一种或多种非病毒表达载体的组合物。在一些实施方案中，进一步施用增加在受试者中的表达水平和/或表达长度的剂(例如，EPA或DHA)。在特定实施方案中，第一和/或第二组合物经由受试者的气道施用。
在一些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用第一组合物后向受试者施用第二组合物，其中第二组合物包含编码至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分和/或重组ACE2的多个一种或多种非病毒表达载体，并且其中，作为施用第一和第二组合物的结果，所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分和/或所述重组ACE2在受试者中表达。
在某些实施方案中，本文提供了系统，其包括：a)第一容器；
b)处于第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；c)第二容器；和
d)处于第二容器内部并且包含编码至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或ACE2蛋白的多个一种或多种非病毒表达载体的第二组合物。
在一些实施方案中，所述系统还包含这样的剂，与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)当施用于受试者时，增加所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或ACE2蛋白的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。在进一步的实施方案中，所述剂存在于第一组合物和/或第二组合物中。在其他实施方案中，所述系统还包括：第三容器，并且其中所述剂存在于所述第三容器中。
在某些实施方案中，所述系统还包括抗病毒剂(例如，瑞德西韦(Remdesivir)或包含ACE2受体的至少一部分的蛋白)和/或抗炎剂和/或抗凝血剂。
在特定的实施方案中，其中：A)受试者感染SARS-CoV-2病毒，并且其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或重组ACE2在受试者中以足以降低以下的表达水平表达：i)所述受试者中的SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)所述受试者中由所述SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状；或者B)所述受试者未感染SARS-CoV-2病毒，并且其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分，或重组ACE2在所述受试者中以足以防止所述受试者感染所述SARS-CoV-2病毒的表达水平表达。
在某些实施方案中，所述表达水平在所述受试者中维持至少两周而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次、两次或三次进一步重复，及ii)编码所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的载体的任何进一步施用。在其他实施方案中，所述表达水平在所述受试者中维持至少一个月而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次、两次或三次进一步重复，及ii)编码所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的载体的任何进一步施用。在进一步的实施方案中，所述表达水平在所述受试者中维持至少一年或两年或受试者终生而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次、两次或三次进一步重复，及ii)编码所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的载体的任何进一步施用。在一些实施方案中，所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分在所述受试者中以以下的水平和持续时间表达：i)介于500ng/ml与50ug/ml之间，或10-20ug/ml，持续至少25天，或ii)至少250ng/ml，持续至少25天。
在一些实施方案中，本文提供了使至少三种不同的抗体或其抗原结合部分在受试者中同时表达的方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用第一组合物后向受试者施用第二组合物，其中第二组合物包含编码至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的多个一种或多种非病毒表达载体，并且其中，作为施用第一和第二组合物的结果，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分同时在受试者中表达。在某些实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分对SARS-CoV-2和/或甲型流感和/或乙型流感具有特异性。在一些实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自对SARS-CoV-2是完全或大体上中和的。在其他实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自对选自由以下组成的组的病毒是完全或大体上中和的：HIV、甲型流感、乙型流感和疟疾。
在某些实施方案中，本文提供了系统，其包括：a)第一容器；b)处于第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；c)第二容器；和d)处于第二容器内部并且包含编码至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的多个一种或多种非病毒表达载体的第二组合物。在某些实施方案中，所述系统还包含这样的剂，与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)当施用于受试者时，增加所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。在其他实施方案中，所述剂存在于第一组合物和/或第二组合物中。在另外的实施方案中，所述系统还包括第三容器，并且其中所述剂存在于所述第三容器中。
在某些实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自在受试者中以至少100ng/ml(例如，至少100...500...900ng/ml)的水平表达。在其他实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自在所述受试者中以至少100ng/ml的水平表达至少25天。在其他实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分在所述受试者中以至少200ng/ml的水平表达。
在进一步的实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分在受试者中以至少200ng/ml的水平表达至少25天。在其他实施方案中，其中：A)所述三种不同的抗体或其抗原结合部分中的每一种的表达水平在所述受试者中维持至少两周，或至少3周，无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的载体的任何进一步施用；并且/或者B)重复步骤a)和b)至少一次或至少两次。在特定实施方案中，所述表达水平在所述受试者中维持至少两周，或至少3周，无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次或两次进一步重复，及ii)编码所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的载体的任何进一步施用。
在其他实施方案中，所述一种或多种非病毒表达载体包括三种非病毒表达载体。在进一步的实施方案中，所述三种非病毒表达载体中的每一种编码不同的抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方案中，所述一种或多种非病毒表达载体包括六种非病毒表达载体。在另外的实施方案中，所述六种非病毒表达载体中的每一种编码不同的抗体轻链可变区或重链可变区。在进一步的实施方案中，所述一种或多种非病毒表达载体包含各自编码抗体轻链可变区的第一、第二和第三核酸序列，及各自编码抗体重链可变区的第四、第五和第六核酸序列。在其他实施方案中，所述的其抗原结合部分选自由以下组成的组：Fab′、F(ab)2、Fab和微型抗体。
在一些实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种是抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分。在其他实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的所述至少一种是选自表4和/或表7的抗体或其抗原结合部分。在进一步的实施方案中，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分包括至少四种、五种、六种、七种或八种不同的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述施用包括静脉内施用。
在一些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用第一组合物之后向受试者施用第二组合物，其中第二组合物包含编码人生长激素(hGH)和/或与半衰期延长肽连接的hGH(hGH-ext)的多个非病毒表达载体，并且
其中，作为施用所述第一和第二组合物的结果，所述hGH在所述受试者中表达。
在特定实施方案中，hGH和/或hGH-ext在受试者中以至少1ng/ml(例如，至少1...10...100...500ng/ml)的血清表达水平表达。在其他实施方案中，所述表达水平在受试者中维持至少两周而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码hGH或hGH-ext的载体的任何进一步施用。在其他实施方案中，所述表达水平在受试者中维持至少一个月而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码hGH或hGH-ext的载体的任何进一步施用。在另外的实施方案中，所述表达水平在受试者中维持至少一年而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码hGH或hGH-ext的载体的任何进一步施用。在进一步的实施方案中，所述多个非病毒表达载体编码hGH-ext，并且其中所述半衰期延长肽选自由以下组成的组：Fc区肽、血清白蛋白、人绒毛膜促性腺激素b-亚基的羧基端肽(CTP)和XTEN(参见，Schellenberger等人，NatBiotechnol.2009年12月；27(12)：1186-90)。在另外的实施方案中，所述方法还包括：c)施用处于所述第一和/或第二组合物中，或存在于第三组合物中的剂，其中与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)增加hGH和/或hGH-ext的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。
在一些实施方案中，本文提供了系统，其包括：a)第一容器；b)处于第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；c)第二容器；和d)处于第二容器内部并且包含编码人生长激素(hGH)和/或与半衰期延长肽连接的hGH(hGH-ext)的多个非病毒表达载体的第二组合物。在某些实施方案中，系统还包含这样的剂，与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)当施用于受试者时，增加hGH和/或hGH-ext的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。在其他实施方案中，所述剂存在于第一组合物和/或第二组合物中。在特定实施方案中，所述系统还包括第三容器，并且其中所述剂存在于所述第三容器中。
在一些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括：a)向受试者施用第一组合物，其中第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；b)在施用第一组合物之后向所述受试者施用第二组合物，其中第二组合物包含多个表达载体，所述多个表达载体各自包含编码第一蛋白和/或第一生物活性核酸分子的第一核酸序列；以及c)施用处于第一和/或第二组合物中或存在于第三组合物中的剂，其中所述剂：i)增加第一蛋白或第一生物活性核酸分子的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度；并且/或者iii)降低如通过丙氨酸转氨酶(ALT)水平度量的毒性；全部是与未向受试者施用所述剂时相比；其中所述剂选自由以下组成的组：二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、α-亚麻酸(ALA)、脂氧素A4(LA4)、15-脱氧-12，14-前列腺素J2(15d)、花生四烯酸(AA)、二十二碳五稀酸(DPA)、视黄酸(RA)、二烯丙基二硫化物(DADS)、油酸(OA)、α-生育酚(AT)、1-磷酸鞘氨醇(S-1-P)、棕榈酰鞘磷脂(SPH)、抗TNFa抗体或其抗原结合片段、类肝素和N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素；并且其中，作为向受试者施用第一和第二组合物和所述剂的结果，第一蛋白或第一生物活性核酸分子在受试者中表达。
在其他实施方案中，第一蛋白或第一生物活性核酸分子在受试者中以至少10ng/ml或至少100ng/ml的血清表达水平表达。在另外的实施方案中，所述表达水平在受试者中维持至少两周而无需：i)步骤a)、b)和c)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码第一蛋白或第一生物活性核酸分子的载体的任何进一步施用。在进一步的实施方案中，所述表达水平在受试者中维持至少一个月而无需：i)步骤a)、b)和c)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码第一蛋白或第一生物活性核酸分子的载体的任何进一步施用。在另外的实施方案中，所述表达水平在受试者中维持至少一年而无需：i)步骤a)、b)和c)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码第一蛋白或第一生物活性核酸分子的载体的任何进一步施用。在其他实施方案中，第一核酸序列提供第一蛋白或第一生物活性核酸分子，其中第一生物活性核酸分子包含选自以下的序列：siRNA或shRNA序列、miRNA序列、反义序列、CRISPR多聚化单向导和CRISPR单向导RNA序列(sgRNA)。在其他实施方案中，所述表达载体中的每一个还包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码：i)第二治疗性蛋白，和/或ii)第二生物活性核酸分子。
在一些实施方案中，所述剂存在于第一组合物中。在特定实施方案中，所述剂存在于第三组合物中，并且在第一组合物之前至少一小时施用。在另外的实施方案中，所述剂包含二十二碳六烯酸(DHA)。在进一步的实施方案中，所述剂包含二十碳五烯酸(EPA)。
在另外的实施方案中，本文提供了系统，其包括：a)第一容器；
b)处于第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；c)第二容器；和
d)处于第二容器内部并且包含多个表达载体的第二组合物，所述多个表达载体各自包含编码第一蛋白和/或第一生物活性核酸分子的第一核酸序列；和e)处于第一和/或第二组合物中，或存在于第三容器中的第三组合物中的剂，其中所述剂选自由以下组成的组：二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、α-亚麻酸(ALA)、脂氧素A4(LA4)、15-脱氧-12，14-前列腺素J2(15d)、花生四烯酸(AA)、二十二碳五烯酸(DPA)、视黄酸(RA)、二烯丙基二硫化物(DADS)、油酸(OA)、α-生育酚(AT)、1-磷酸鞘氨醇(S-1-P)、棕榈酰鞘磷脂(SPH)、抗TNFa抗体或其抗原结合片段、类肝素和N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素。
在进一步的实施方案中，所述剂在与第一和第二组合物一起被施用给受试者时：i)增加第一蛋白或第一生物活性核酸分子的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度；并且/或者iii)降低如通过丙氨酸转氨酶(ALT)水平度量的毒性；全部是与未向受试者施用所述剂时相比。在其他实施方案中，所述剂存在于第一组合物和/或第二组合物中。在进一步的实施方案中，所述系统还包括所述第三容器，并且其中所述剂存在于所述第三容器中。
在一些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括：a)经由受试者的气道向受试者施用第一组合物，其中第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及b)在施用第一组合物之后向受试者施用第二组合物，其中所述施用是经由受试者的气道来进行，并且其中第二组合物包含多个表达载体，所述多个表达载体各自包含编码第一蛋白和/或第一生物活性核酸分子的第一核酸序列；并且
其中，作为向受试者施用第一和第二组合物的结果，第一蛋白或第一生物活性核酸分子在受试者中表达。
在某些实施方案中，第一蛋白或第一生物活性核酸分子在受试者的肺部中表达。在进一步的实施方案中，第一组合物是水性组合物或冻干组合物。在其他实施方案中，第二组合物是水性组合物或冻干组合物。在另外的实施方案中，聚阳离子结构包含选自由以下组成的组的脂质：1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；和1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸。在其他实施方案中，受试者患有肺部炎症。在进一步的实施方案中，受试者佩戴着呼吸机。
在另外的实施方案中，本文提供了系统，其包括：a)第一容器；b)处于第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子，并且其中聚阳离子结构包含选自由以下组成的组的脂质：1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；和1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸；c)第二容器；和d)处于第二容器内部并且包含多个表达载体的第二组合物，所述多个表达载体各自包含编码第一蛋白和/或第一生物活性核酸分子的第一核酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了系统，其包括：a)第一容器；b)处于第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子；c)第二容器；和d)处于第二容器内部并且包含多个表达载体的第二组合物，所述多个表达载体各自包含编码第一蛋白和/或第一生物活性核酸分子的第一核酸序列，其中第一和/或第二组合物是冻干组合物。
在一些实施方案中，本文提供了治疗受试者的方法，其包括：向受试者施用组合物，其中所述组合物包含：i)乳剂和/或多种脂质体，和ii)剂，其中所述受试者患有：炎症、自身免疫性疾病、免疫缺陷疾病、SARS-CoV-2感染，和/或正在接受检查点抑制剂，并且其中所述剂选自由以下组成的组：地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、地塞米松脂肪酸酯、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、α-亚麻酸(ALA)、脂氧素A4(LA4)、15-脱氧-12，14-前列腺素J2(15d)、花生四烯酸(AA)、二十二碳五烯酸(DPA)、视黄酸(RA)、二烯丙基二硫化物(DADS)、油酸(OA)、α-生育酚(AT)、1-磷酸鞘氨醇(S-1-P)、棕榈酰鞘磷脂(SPH)、抗TNFa抗体或抗原结合其片段、类肝素和N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素。在进一步的实施方案中，所述施用包括气道施用。在其他实施方案中，所述施用包括全身施用。在其他实施方案中，所述组合物包含脂质体，并且其中剂被掺入到脂质体中。在其他实施方案中，所述组合物还包含不位于脂质体中的剂中的一种或多种。在另外的实施方案中，所述组合物不含或基本上不含核酸分子。在其他实施方案中，所述受试者感染SARS-CoV-2，并且所述方法还包括向所述受试者施用抗病毒剂。在进一步的实施方案中，所述抗病毒剂包括瑞德西韦或包含ACE2受体的至少一部分的蛋白。在其他实施方案中，所述方法还包括：向受试者施用抗炎剂和/或抗凝血剂。在一些实施方案中，所述组合物是水性组合物或冻干组合物。在另外的实施方案中，所述脂质体包含选自由以下组成的组的脂质：1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；和1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸。
在某些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括：a)向动物模型施用第一组合物，其中第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中第一组合物不含或基本上不含核酸分子，并且其中动物模型感染SARS-CoV-2；以及b)在施用第一组合物后向动物模型施用第二组合物，其中第二组合物包含编码第一和第二抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的多个一种或多种非病毒表达载体，并且其中，作为施用第一和第二组合物的结果，第一和第二候选抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分在动物模型中表达；以及c)确定第一和第二候选抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的表达使以下发生的程度：i)降低动物模型中的SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)降低动物模型中由SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状。在特定实施方案中，所述多个一种或多种非病毒表达载体还编码第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一候选抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述动物模型选自：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、灵长类动物、猴子、黑猩猩或兔。在进一步的实施方案中，第一和抗SARS-CoV2抗体或其抗原结合部分来自表7或表5。在另外的实施方案中，第一和第二抗SARS-CoV2抗体或其抗原结合部分选自由以下组成的组：REGN10933、REGN10987；VIR-7831；LY-CoV1404；LY3853113；Zost2355K；CV07-209K；C121L；Zost2504L；CV38-183L；COVA215K；RBD215；CV07-250L；C144L；COVA118L；C135K；和B38。在某些实施方案中，第一和第二抗SARS-CoV2抗体或其抗原结合部分是REGN10933和REGN10987。
在进一步的实施方案中，聚阳离子结构包含阳离子脂质。在一些实施方案中，第一组合物包含多种脂质体，其中所述脂质体中的至少一些脂质体包含所述阳离子脂质。在其他实施方案中，所述脂质体中的至少一些脂质体包含中性脂质。在进一步的实施方案中，所述脂质体中所述阳离子脂质与所述中性脂质的比率为95：05-80：20或约1：1。在其他实施方案中，阳离子脂质和中性脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰磷酯酰胆碱(DSPC)；氢化或非氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；蛋磷脂酰胆碱(EPC)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油(DSPG)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)；1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐(DPPA)；三甲基铵丙烷脂质；DOTIM(1-[2-9(2)-十八碳烯酰基氧基)乙基]-2-(8(2)-十七碳烯)-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物)脂质；及它们中两种或更多种的混合物。
在一些实施方案中，所述一种或多种非病毒表达载体包含质粒，其中所述质粒不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。在另外的实施方案中，所述一种或多种非病毒表达载体包含编码抗体轻链可变区的第一核酸序列，和编码抗体重链可变区的第二核酸序列，及任选地，编码抗体轻链可变区的第三核酸序列，和编码抗体重链可变区的第四核酸序列。在某些实施方案中，其中：A)所述其抗原结合部分选自由以下组成的组：Fab′、F(ab)2、Fab和微型抗体，并且/或者B)其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分对不同的SARS-CoV-2抗原具有双特异性。在其他实施方案中，抗SARS-CoV-2抗体是选自由以下组成的组的单克隆抗体：REGN10933、REGN10987；VIR-7831；LY-CoV1404；LY3853113；Zost2355K；CV07-209K；C121L；Zost2504L；CV38-183L；COVA215K；RBD215；CV07-250L；C144L；COVA118L；C135K；和B38。这些抗体在通过引用并入本文的以下参考文献中有描述：Zost等人，NatureMedicine第26卷，第1422-1427页(2020)；Robbiani等人，Nature第584卷，第437-442页(2020)；和Wu等人，Science，2020年6月12日；368(6496)：1274-1278；并且参见表7中的参考文献。这些抗体或其抗原结合片段中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16种或所有17种的任何组合可用于本文所述的实施方案中的任一实施方案中。在一些实施方案中，抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包括以下的任何组合中的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种：REGN10933、REGN10987；VIR-7831；LY-CoV1404；LY3853113；Zost2355K；CV07-209K；C121L；Zost2504L；CV38-183L；COVA215K；RBD215；CV07-250L；C144L；COVA118L；C135K；和B38(或表7或表5中所示那些中的任一种)。在另外的实施方案中，抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分如表7中所述。
在一些实施方案中，所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包括至少两种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分，所述至少两种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分在所述受试者中以足以降低以下的表达水平表达：i)受试者中的SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)受试者中由SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状。在其他实施方案中，所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包括至少四种或至少八种或至少十一种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分。在另外的实施方案中，所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包括至少四种或至少八种或至少11种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分，并且所述至少四种或至少八种或至少11种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分在受试者中以足以降低以下的表达水平表达：i)受试者中的SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)受试者中由SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状。
在一些实施方案中，所述施用包括静脉内施用。在其他实施方案中，第二组合物在以下时间施用：i)在第一组合物之后0.5分钟与80分钟之间，或在第一组合物之后约1分钟与20分钟之间。在特定实施方案中，所述方法还包括：c)施用处于第一和/或第二组合物中，或存在于第三组合物中的剂，其中与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)增加所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。在其他实施方案中，所述剂存在于第一组合物中。在特定实施方案中，所述剂存在于第三组合物中，并且在第一组合物之前至少一小时施用。在一些实施方案中，所述剂选自由以下组成的组：地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、地塞米松脂肪酸酯、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、α-亚麻酸(ALA)、脂氧素A4(LA4)、15-脱氧-12,14-前列腺素J2(15d)、花生四烯酸(AA)、二十二碳五烯酸(DPA)、视黄酸(RA)、二烯丙基二硫化物(DADS)、油酸(OA)、α-生育酚(AT)、1-磷酸鞘氨醇(S-1-P)、棕榈酰鞘磷脂(SPH)、抗TNFa抗体或其抗原结合片段、类肝素和N-乙酰-脱-O-硫酸化肝素。在某些实施方案中，地塞米松脂肪酸酯具有下式：
其中R1为C5-C23烷基或C5-C23烯基。
在某些实施方案中，所述剂(例如，水溶性地塞米松，又名地塞米松环糊精包合物(inc1usioncomplex)；参见Sigma SkuD2915)以0.1-35mg/ml或0.001-1.0mg/ml(例如，0.001...0.005...0.01...0.05...0.1...0.5...1.0mg/ml)的浓度存在于第一、第二或第三组合物中。在其他实施方案中，受试者患有肺部、心血管和/或多器官炎症。在特定实施方案中，受试者佩戴着呼吸机。
在一些实施方案中，第一和/或第二组合物还包含生理上可耐受的缓冲液或静脉内溶液。在其他实施方案中，第一和/或第二组合物还包含乳酸盐林格氏溶液或盐水溶液。
在另外的实施方案中，第一组合物包含含有聚阳离子结构的脂质体，其中脂质体还包含选自由以下组成的组的一种或多种巨噬细胞靶向部分：甘露糖部分、马来酰亚胺部分、叶酸受体(folate receptor)配体、叶酸(folate)、叶酸受体抗体或其片段、甲酰肽受体配体、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、四肽Thr-Lys-Pro-Arg、半乳糖和乳糖酸。在其他实施方案中，所述多个一种或多种非病毒表达载体不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。
在某些实施方案中，受试者是人。在特定实施方案中，其中0.05-60mg/mL的表达载体存在于第二组合物中。在其他实施方案中，聚阳离子结构包含阳离子脂质体，所述阳离子脂质体在第一组合物中以0.5-100mM的浓度存在。在进一步的实施方案中，受试者是人，其中：i)施用一定量的第一组合物，使得人接受2-50mg/kg剂量的聚阳离子结构；和/或ii)施用一定量的第二组合物，使得人接受0.05-60mg/kg剂量的表达载体。
在一些实施方案中，聚阳离子结构包含阳离子脂质体，其中阳离子脂质体还包含脂质双层整合肽和/或靶肽。在某些实施方案中，脂质双层整合肽选自由以下组成的组：表面活性蛋白D(SPD)、表面活性蛋白C(SPC)、表面活性蛋白B(SPB)和表面活性蛋白A(SPA)，并且ii)靶肽选自由以下组成的组：微管相关序列(MTAS)、核定位信号(NLS)、ER分泌肽、ER保留肽和过氧物酶体肽。
在其他实施方案中，在初始步骤b)之后1与60天之间重复步骤a)和b)。在一些实施方案中，非病毒表达载体中的每一种均包含5,500个与30,000个之间的核酸碱基对。在某些实施方案中，所述方法还包括：向受试者施用抗病毒剂。在一些实施方案中，所述抗病毒剂包括瑞德西韦或包含ACE2受体的至少一部分的蛋白。在另外的实施方案中，所述方法还包括：向受试者施用抗炎剂和/或抗凝血剂。在一些实施方案中，所述一种或多种非病毒表达载体是不含CPG的或CPG减少的。
在一些实施方案中，本文的剂包括地塞米松脂肪酸酯(例如，如式I所示)。例如，地塞米松棕榈酸酯具有下式(式I)：
也可以使用地塞米松的其他脂肪酸酯，用另一种脂肪酸酯代替棕榈酸酯基团。在一些实施方案中，所述脂肪酸酯是C6-C24脂肪酸酯，诸如己酸酯(hexanoate)(羊油酸酯(caproate))、庚酸酯(heptanoate)(葡萄花酸酯(enanthate))、辛酸酯(octanoate)(羊脂酸酯(caprylate))、壬酸酯(nonanoate)(天竺葵酸酯(pelargonate))、癸酸酯(decanoate)(羊蜡酸酯(caprate))、十一酸酯、十二酸酯(月桂酸酯)、十四烷酸酯(肉豆蔻酸酯)、十八碳烯酸酯(硬脂酸酯)、二十烷酸酯(花生酸酯)、二十二烷酸酯(山萮酸酯)和二十四烷酸酯(木蜡酸酯)。因此，在一些实施方案中，所述化合物选自地塞米松羊油酸酯、地塞米松葡萄花酸酯、地塞米松羊脂酸酯、地塞米松天竺葵酸酯、地塞米松羊蜡酸酯、地塞米松十一酸酯、地塞米松月桂酸酯、地塞米松肉豆蔻酸酯、地塞米松棕榈酸酯、地塞米松硬脂酸酯、地塞米松花生酸酯、地塞米松山嵛酸酯和地塞米松木蜡酸酯。
在某些实施方案中，所述剂是式I的所述地塞米松脂肪酸酯，并且其中R1为C5-C23烷基。在其他实施方案中，所述剂是式I的所述地塞米松脂肪酸酯，并且其中R1为C5-C23直链烷基。在其他实施方案中，所述剂是式I的所述地塞米松脂肪酸酯，并且其中R1为C15烷基。
附图说明
专利或申请文件含有至少一张用彩色绘制的附图。在提出要求并支付必要费用后，专利局将提供含有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。
图1示出了实施例1的结果，示出了四种不同的抗体或抗体片段(抗IL5；5J8抗流感；抗SARS-CoV-2；和抗CD20)在36天内的表达水平。
图2示出了实施例2的结果，示出了抗SARS-CoV-2抗体在43天内的表达水平，以及抗IL5、5J8抗流感和抗Sars-Cov2的表达数据。
图3A示出了实施例3的结果，该实施例示出了多种独特单克隆抗体的表达水平。图3B示出了实施例3的结果，该实施例示出了在初始注射后29天内的不同时间点的抗体表达水平。
图4示出了实施例4的结果，该实施例示出了注射后某些天的抗体表达水平。
图5A示出了实施例5的结果，该实施例示出了15天内各种蛋白的表达水平。图5B示出了实施例5的结果，该实施例示出了22天内各种蛋白的表达水平。
图6示出了实施例6的结果，该实施例示出了22天内各种抗体的表达水平。
图7示出了实施例7的结果，该实施例示出了各种蛋白的表达水平。
图8A和图8B示出了实施例8的结果，该实施例示出了9天内cDNA编码的重组ACE2蛋白的表达水平。
图9示出了实施例9的结果，该实施例示出了人ACE2及其变体的表达水平。
图10示出了质粒070120#1：B38-λ-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：10)。
图11示出了质粒070120#11：B38H-B38L-BV3：双的核酸序列(SEQ ID NO：11)。
图12示出了质粒070320#4：B38-κ-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：12)。
图13示出了质粒071320#3：H4-κ-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：13)。
图14示出了质粒080920#6：H4-H4-κ-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：14)。
图15示出了质粒072620#5A：4A8-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：15)。
图16示出了质粒081820#2：4A8-4A8-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：16)。
图17示出了质粒081820#3：4A8-B38κ-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：17)。
图18示出了质粒081820#4：4A8-H4-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：18)。
图19示出了质粒081820#5：4A8-shACE2-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：19)。
图20示出了质粒080420#3：shACE2-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：20)。
图21示出了质粒082020#1：shACE2 TYLTNY-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：21)。
图22示出了质粒081320#2A：shACE2-1xL-Fc-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：22)。
图23示出了质粒081320#4A：shACE2-1xL-FcLALA-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：23)。
图24示出了质粒082620#5A：shACE2 TYLTNY-1xL-FcLALA-BV3的核酸序列(SEQ IDNO：24)。
图25示出了质粒080420#4：shACE2-shACE2-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：25)。
图26示出了质粒081120#1：B38κ-shACE2-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：26)。
图27示出了质粒081120#4：shACE2-B38κ-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：27)。
图28示出了质粒081120#2：H4-shACE2-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：28)。
图29示出了质粒081120#5：shACE2-H4-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：29)。
图30示出了质粒072320#2：H4-aCD20-aIL5-5J8-BV2的核酸序列(SEQ ID NO：30)。
图31示出了质粒070620#2：B38λ-aCD20(Cys)-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：31)。
图32示出了质粒120717#1：aCD20-aIL5-5J8-BV2的核酸序列(SEQ ID NO：32)。
图33示出了质粒122019#2A：GLA-1xL-hyFc的核酸序列(SEQ ID NO：33)。
图34示出了质粒011215#7：hGCSF-BV3的核酸序列(SEQ ID NO：34)。
图35示出了质粒071816#1：的核酸序列(SEQ ID NO：35)。
图36示出了质粒072520#4：aCD20-aCD20的核酸序列(SEQ ID NO：36)。
图37示出了质粒111517#1：5J8-5J8：两个2A的核酸序列(SEQ ID NO：37)。
图38示出了质粒111517#3：aIL5-aIL5：两个2A的核酸序列(SEQ ID NO：38)。
图39示出了质粒111517#19A：5J8-aIL5：双2A的核酸序列(SEQ ID NO：39)。
图40示出了以下的核酸序列：A)密码子优化的人生长激素(hGH1)cDNA(SEQ IDNO：40)；B)hGH1-Fc(SEQ ID NO：41)；C)接头GGGGS(SEQ ID NO：42)，1x接头：GGTGGAGGAGGTAGT(SEQ ID NO：43)，2x接头：GGTGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGAGGTTCA(SEQ IDNO：44)，和3x接头：GGAGGAGGTGGArCAGGTGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGAGGTTCA(SEQ ID NO：45)；D)Fc(SEQ ID NO：46)；E)FcA链(SEQ ID NO：47)；和F)FcB链(SEQ ID NO：48)。
图41示出了以下的核酸序列：A)FcAB链(SEQ ID NO：49)；B)Fc-IgG4(SEQ ID NO：50)；C)hyFc(SEQ ID NO：51)；D)mFc(SEQ ID NO：52)；E)GAALIE(SEQ ID NO：53)；和F)GAALIE-LS(SEQ ID NO：54)。
图42示出了以下的核酸序列：A)hGH1-HSA(SEQ ID NO：55)；和B)HSA-K753P-接头-GH1：(SEQ ID NO：56)。
图43示出了以下的核酸序列：A)hGH1-CTP(SEQ ID NO：57)；B)CTP-hGH1-CTP(SEQID NO：58)；C)CTP-hGH1(SEQ ID NO：59)；和D)XTEN1-hGH1(SEQ ID NO：60)。
图44示出了以下的核酸序列：A)XTEN1-hGH1-XTEN2(SEQ ID NO：61)；和B)hGH1-XTEN2(SEQ ID NO：62)。
图45A显示与蛋白半衰期延长DNA序列(包括Fc、血清白蛋白或Xten)融合的野生型hGH cDNA的表达可随时间显著增加具有免疫能力的小鼠中的血清hGH水平。图45B显示产生的cDNA编码的hGH蛋白具有完全生物活性，因为它适当地增加hGH调控的内源性小鼠IGF-1蛋白的水平。图45C显示在实施例10的程序中DNA载体的一次注射驱动野生型hGH cDNA，但缺少任何蛋白半衰期延长DNA序列可在具有免疫能力的小鼠中引起治疗性hGH血清水平的持久产生。
图46显示实施例11的程序可被用于使与蛋白半衰期延长DNA序列(包括Fc、血清白蛋白或Xten)融合的野生型hGH cDNA表达以随时间显著增加具有免疫能力的小鼠中的血清hGH水平。
图47显示，使用实施例12的程序，将驱动野生型hGH cDNA的DNA载体再次注射到完全具有免疫能力的小鼠中一次可显著且持久地进一步增加由初始HEDGES hGH DNA载体注射产生的血清hGH水平。
图48显示与Fc区蛋白融合的hGH的表达水平将hGH的半衰期延长到至少225天，并且是在小鼠中单次DNA注射之后。
图49示出了从治疗起64天内与Fc区蛋白融合的hGH的表达水平。
图50A显示驱动与Fc蛋白半衰期延长DNA序列融合的野生型hGH cDNA的DNA载体的Fc区的选择性定点诱变可以选择性地增加或降低具有免疫能力的小鼠中产生的血清hGH水平。图50B显示驱动与Fc蛋白半衰期延长DNA序列融合的野生型hGH cDNA的DNA载体的Fc区的选择性定点诱变可以选择性地增加具有免疫能力的小鼠中随时间产生的血清hGH水平。
图51显示将优化摩尔百分比的地塞米松棕榈酸酯(DexPalm)掺入到阳离子脂质体中可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性。
图52显示将优化摩尔百分比的地塞米松棕榈酸酯掺入到阳离子脂质体中可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性。
图53显示在注射阳离子脂质体之前，预先注射优化摩尔百分比的在脂质体中的地塞米松棕榈酸酯可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性。
图54显示注射一些掺入到阳离子脂质体中的AIL可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性(ALT水平)。
图55显示注射掺入到阳离子脂质体中的某些AIL可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性(ALT水平)。
图56显示在原本无效的hG-CSF-DNA剂量后，将优化摩尔百分比的地塞米松棕榈酸酯掺入到阳离子脂质体中可以进一步增加基因表达的峰值水平。
图57显示通过选择性地改变鼻内施用的脂质体的脂质组成，可以使这些脂质体不同程度地选择性地靶向至肺内单核细胞和巨噬细胞，从而对肺部进行选择性地免疫调节。
图58显示通过选择性地改变肠胃外水溶性前给剂(pre-dose)和/或掺入到随后施用的脂质体中的地塞米松棕榈酸酯的摩尔百分比，可以选择性地免疫调节肺部和血液中的T淋巴细胞活化水平。
图59显示通过选择性地改变肠胃外水溶性前给剂和/或掺入到随后施用的脂质体中的地塞米松棕榈酸酯的摩尔百分比，可以选择性地免疫调节肺部和血液中的T淋巴细胞活化水平。
图60显示预先施用抗TNF单克隆抗体可以进一步增加基因表达，同时进一步降低它的毒性。
图61显示NSH的预先施用或在后施用都可降低毒性。
图62显示NSH的预先施用或在后施用都可降低毒性。
图63显示NSH的预先施用可以进一步增加基因表达，同时进一步降低它的毒性。
图64显示与单独地塞米松的全身施用相比，含有地塞米松棕榈酸酯的脂质体的各种制剂的施用减少了血液中的淋巴细胞计数。
图65显示与单独地塞米松的全身施用相比，含有地塞米松棕榈酸酯的脂质体的各种制剂的施用减少了血液中的单核细胞计数。
图66示出了实施例22的结果，该实施例显示各自编码五种不同的SARS-CoV2特异性mAb(C135、C215、COV2-2355、CV07-209和C121)之一的不同的单个DNA表达质粒的一次注射在施用后至少134天的整个实验过程中产生完全中和性血清水平的每种SARS-CoV2特异性mAb，并且这些持续的血清mAb水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合至少120天。
图67示出了实施例23的结果，该实施例显示单次注射导致在这种程序后的至少134天的过程内两种SARS-CoV2特异性mAb从单个质粒表达，并且这些血清表达的mAb血清在功能上能够阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2相互作用至少134天。
图68示出了实施例24的结果，其中三种不同的方法被成功地用于通过所尝试的该三种方法使两种抗SARS-CoV2 mAb同时表达。三种方法全部成功地允许两种mAb以允许中和SARS-CoV2/ACE2相互作用(图68b示出中和能力)的水平(图68B示出表达水平)在动物血清中表达。
图69示出了实施例25的结果，该实施例显示每周注射两次编码总共三种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb的一种或两种DNA表达质粒在施用后至少70天的过程中产生完全中和性血清水平的三种不同的SARS-CoV2特异性mAb，并且这些持续的血清mAb水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2至少70天。
图70示出了实施例26的结果，该实施例示出了小鼠中表达的四种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图71示出了实施例27的结果，该实施例示出了小鼠中表达的四种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图72示出了实施例28的结果，该实施例示出了小鼠中表达的四种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图73示出了实施例29的结果，该实施例示出了小鼠中表达的四种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图74示出了实施例30的结果，该实施例示出了小鼠中表达的四种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图75示出了实施例31的结果，该实施例示出了小鼠中表达的五种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图76示出了实施例32的结果，该实施例示出了小鼠中表达的六种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图77示出了实施例33的结果，该实施例示出了小鼠中表达的六种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图78示出了实施例34的结果，该实施例示出了小鼠中表达的六种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图79示出了实施例35的结果，该实施例示出了小鼠中表达的八种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图80示出了实施例36的结果，该实施例示出了小鼠中表达的八种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图81示出了实施例37的结果，该实施例示出了小鼠中表达的八种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图82示出了实施例38的结果，该实施例示出了小鼠中表达的八种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力。
图83示出了实施例39的结果，该实施例示出了小鼠中表达的10种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力，以及小鼠中表达的其他非Sars-CoV-2抗体和各种治疗性蛋白的表达水平。
图84示出了实施例40的结果，该实施例示出了小鼠中表达的11种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力，以及小鼠中表达的其他非Sars-CoV-2抗体和各种治疗性蛋白的表达水平。
图85示出了实施例41的结果，该实施例示出了小鼠中表达的10种抗SARS-CoV-2抗体的表达水平和中和能力，以及小鼠中表达的其他非Sars-CoV-2抗体的表达水平。
图86A示出了实施例42的结果，该实施例示出了在1-48小时内标示的mAb的表达水平。图86B示出了在1-48小时的时段内标示的mAb的中和能力。
图87示出了实施例43的结果，该实施例描述了使用单次注射使六种不同的mAb和基因同时表达。
图88示出了实施例44的结果，该实施例描述了在120天内使用各种真核启动子来使靶基因(人生长激素)表达。
图89示出了实施例45的结果，该实施例描述了对11种不同的hGLA DNA载体的同时测试，结果显示它们随时间产生一系列血清水平。
图90示出了实施例46的结果，该实施例显示Fc修饰的GLA可以在载体注射后104天在心脏组织中以治疗水平表达。
图91示出了实施例47的结果，该实施例比较了各种突变的Fc区的GLA-Fc表达。
图92示出了实施例48的结果，该实施例描述了低剂量地塞米松预先治疗剂的使用不干扰蛋白表达的持久性(并且急性表达可能会增强)。
定义
如本文所用，短语“CpG减少的”是指这样的核酸序列或表达载体，该核酸序列或表达载体具有比该序列或载体的野生型型式中存在的CpG二核苷酸更少的CpG二核苷酸。“无CpG”意指主题核酸序列或载体不具有任何CpG二核苷酸。可以通过改变核酸序列来修饰含有CpG二核苷酸的初始序列(例如，抗SARS-CoV-2抗体的野生型型式)以去除CpG二核苷酸。此类CpG二核苷酸不仅可以在编码序列中被适当地减少或消除，而且可以在非编码序列中被适当地减少或消除，该非编码序列包括例如5′和3′非翻译区(UTR)、启动子、增强子、聚A(polyA)、ITR、内含子，以及核酸分子或载体中存在的任何其他序列。在某些实施方案中，本文采用的核酸序列是CpG减少的或不含CpG的。
如本文所用，“空脂质体”是指不含核酸分子但可含有其他生物活性分子的脂质体(例如，仅由脂质分子本身组成，或仅由脂质分子和小分子药物组成的脂质体)。在某些实施方案中，空脂质体与本文公开的任何方法或组合物一起使用。
如本文所用，“空阳离子胶束”是指不含核酸分子但可含有其他生物活性分子的阳离子胶束(例如，仅由脂质和表面活性剂分子本身组成，或仅由脂质和表面活性剂分子和小分子药物组成的胶束)。在某些实施方案中，空阳离子胶束与本文公开的任何方法或组合物一起使用。
如本文所用，“空阳离子乳剂”是指不含核酸分子但可含有其他生物活性分子的阳离子乳剂或微乳剂。在某些实施方案中，空阳离子乳剂与本文公开的任何方法或组合物一起使用。
如本文所用，术语“烷基”意指含有1至30个碳原子的直链或支化的饱和烃链，例如1至16个碳原子(C1-C16烷基)、1至14个碳原子(C1-C14烷基)、1至12个碳原子(C1-C12烷基)、1至10个碳原子(C1-C10烷基)、l至8个碳原子(C1-C8烷基)、1至6个碳原子(C1-C6烷基)、1至4个碳原子(C1-C4烷基)或5至23个碳原子(C5-C23烷基)。烷基的代表性示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。
如本文所用，术语“烯基”是指含有2至30个碳原子并且含有至少一个碳-碳双键的直链或支化的烃链，例如2至16个碳原子(C2-C16烷基)、2至14个碳原子(C2-C14烷基)、2至12个碳原子(C2-C12烷基)、2至10个碳原子(C2-C10烷基)、2至8个碳原子(C2-C8烷基)、2至6个碳原子(C2-C6烷基)、2至4个碳原子(C2-C4烷基)或5至23个碳原子(C5-C23烷基)。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、2-庚烯基、2-甲基-1-庚烯基和3-癸烯基。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指任何动物，诸如哺乳动物如狗、猫、鸟、家畜，并且优选人。
如本文所用，术语“施用”是指将如本文所述的组合物给予受试者的动作。向人体施用的示例性途径可以是通过口(经口)、皮肤(经皮、外用)、鼻(鼻腔)、肺(吸入剂)、口腔粘膜(颊部)、通过注射(例如，静脉内、皮下、肿瘤内、眼内、腹膜内等)，等等。
具体实施方式
本发明提供了用于使至少一种治疗性蛋白或生物活性核酸分子在受试者中表达的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，所述受试者首先被施用包含不含或基本上不含核酸分子的聚阳离子结构的组合物，然后(例如，在1-30分钟后)被施用包含编码至少一种治疗性蛋白(例如，至少一种抗SARS-CoV-2抗体、多种不同的抗体、至少一种重组ACE2或人生长激素)或生物活性核酸分子的多个一种或多种非病毒表达载体的组合物。在一些实施方案中，进一步施用增加在受试者中的表达水平和/或表达长度的剂(例如，EPA或DHA)。在特定实施方案中，第一和/或第二组合物经由受试者的气道施用。
本公开提供了方法、系统和组合物，所述方法、系统和组合物允许通过单次注射(例如，静脉内注射)阳离子脂质体并且随后不久注射(例如，静脉内注射)编码至少一种蛋白或生物活性核酸分子的载体来产生是利用其他方法实现的循环蛋白水平的多倍(例如，2-20倍)的循环蛋白水平(例如，允许表达持续延长的时段，诸如190天或超过500天)。
在某些实施方案中，本公开采用不含载体DNA的聚阳离子结构(例如，空阳离子脂质体、空阳离子胶束或空阳离子乳剂)，该聚阳离子结构在载体施用之前被施用给受试者。在某些实施方案中，聚阳离子结构是阳离子脂质并且/或者作为乳剂提供。本公开不限于所采用的阳离子脂质，所述阳离子脂质在一些实施方案中可由以下的一种或多种组成：DDAB，二甲基双十八烷基溴化铵；DPTAP(1，2-二棕榈酰基3-三甲基铵丙烷)；DHA；前列腺素，N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵；1，2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷，(包括但不限于二油酰基(DOTAP)、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基)；1，2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷，(包括但不限于二油酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基)DOTMA，N-[1-[2，3-双(油酰氧基)]丙基]-N,N，N-三甲基氯化铵；DOGS，双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺；DC-胆固醇，3.β.-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇；DOSPA，2,3-二油酰氧基-N-(2(精胺羧酰胺)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐；1，2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(包括但不限于二油酰基(DOEPC)、二月桂酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基、棕榈酰基-油酰基)；β-丙氨酰胆固醇；CTAB，十六烷基三甲基溴化铵；二C14-脒，N-叔丁基-N′-十四烷基-3-十四烷基氨基丙脒；14Dea2，O，O′-双十四烷酰基-N-(三甲基铵乙酰基)二乙醇胺氯化物；DOSPER，1，3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰胺；N，N，N′，N′-四甲基-N，N′-双(2-羟乙基)-2，3-二油酰氧基-1，4-丁烷碘化二铵；1-[2-酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基-)氯化咪唑啉鎓衍生物，诸如1-[2-(9(Z)-十八碳烯酰氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七碳烯基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉鎓(DOTIM)，1-[2-(十六酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉鎓(DPTIM)；1-[2-十四酰氧基)乙基]-2-十三烷基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑鎓(DMTIM)(例如，如Solodin等人(1995)Biochem.43：13537-13544中所述，其通过引用并入本文)；在季胺上含有羟烷基部分的2，3-二烷氧基丙基季铵化合物衍生物，诸如1，2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)；1，2-二油烯氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)；1，2-二油烯氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)，1，2-二油烯氧基丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵(DORIE-HB)；1，2-二油烯氧基丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵(DORIE-HPe)；1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)；1，2-二棕榈氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)；1，2-二硬脂氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)(例如，如Felgner等人(1994)J.Biol.Chem.269：2550-2561中所述，该文献通过引用整体并入本文)。上面提到的脂质中的许多脂质可从例如AvantiPolar Lipids，Inc.；Sigma Chemical Co.；Molecular Probes，Inc.；Northern Lipids，Inc.；Roche Molecular Biochemicals；和Promega Corp.商购获得。
在某些实施方案中，与方法、组合物、系统和试剂盒一起使用的中性脂质包括二酰基甘油磷酸胆碱，其中酰基链的长度一般为至少12个碳(例如，长度为12...14...20...24...或更多个碳)，并且酰基链可以含有一个或多个顺式或反式双键。所述化合物的实例包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、氢化或非氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或向日葵磷脂酰胆碱。
在某些实施方案中，中性脂质包括例如至多70mol二酰基甘油磷酰基乙醇胺/100mol磷脂(例如，10/100mol...25/100mol...50/100...70/100mol)。在一些实施方案中，二酰基甘油磷酰基乙醇胺具有一般长度为至少12个碳(例如，长度为12...14...20...24...或更多个碳)，并且可含有一个或多个顺式或反式双键的酰基链。此类化合物的实例包括但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、蛋磷脂酰乙醇胺(EPE)和转磷脂酰化磷脂酰乙醇胺(t-EPE)，这些化合物可以使用磷脂酶D从各种天然或半合成的磷脂酰胆碱生成。
在某些实施方案中，本公开采用CpG减少的或不含CpG的表达载体。可以通过改变核酸序列来修饰含有CpG二核苷酸的初始序列(例如，抗SARS-CoV-2抗体的野生型型式)以去除CpG二核苷酸。此类CpG二核苷酸不仅可以在编码序列中被适当地减少或消除，而且可以在非编码序列中被适当地减少或消除，该非编码序列包括例如5′和3′非翻译区(UTR)、启动子、增强子、聚A(polyA)、ITR、内含子，以及核酸分子或载体中存在的任何其他序列。CpG二核苷酸可位于选定氨基酸的密码子三联体内。有五种氨基酸(丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和精氨酸)具有一个或多个含有CpG二核苷酸的密码子三联体。这些氨基酸的全部五种都具有可以被改变为避免CpG但仍编码相同氨基酸的不含CpG二核苷酸的替代密码子，如下表1所示。因此，在选定氨基酸的密码子三联体内分配的CpG二核苷酸可以被改变为缺少CpG二核苷酸的相同氨基酸的密码子三联体。
表1
| DNA密码子 | DNA密码子 | |
| 氨基酸 | 含有CpG | 缺少CpG |
| 丝氨酸(Ser或S) | TCG | TCT、TCC、TCA、 |
| AGT、AGC | ||
| 脯氨酸(Pro或P) | CCG | CCT、CCC、CCA、 |
| 苏氨酸(Thr或T) | ACG | ACA、ACT、ACC |
| 丙氨酸(Ala或A) | GCG | GCT、GCC、GCA |
| 精氨酸(Arg或R) | CGT、CGC、 | AGA、AGG |
| CGA、CGG |
另外，在编码区内，应考虑三联体之间的界面。例如，如果氨基酸三联体以C-核苷酸结束，接着是只能以G-核苷酸开始的氨基酸三联体(例如，缬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸)，则第一个氨基酸三联体的三联体被改变为不以C-核苷酸结束的三联体。用于制备不含CpG的序列的方法示于例如美国专利7，244，609中，其通过引用并入本文。INVIVOGEN提供的商业服务也可用于产生不含CpG(或CpG减少的)核酸序列/载体(质粒)。ThermoScientific提供的商业服务产生不含CpG的核苷酸。
下面表2提供了可用于本文所述的载体中的示例性启动子和增强子。此类启动子和本领域已知的其他启动子可以单独使用或者与所述增强子中的任一种或本领域已知的增强子一起使用。另外，当从相同载体表达多种蛋白或生物活性核酸分子(例如，两种、三种、四种或更多种)时，可以将相同或不同的启动子与主题核酸序列联合使用。在一些实施方案中，采用选自以下列表的启动子来控制蛋白或核酸的表达水平：FerL、FerH、Grp78、hREG1B和cBOX1。此类启动子可被例如用于在很宽的时间范围内(例如，在不使用包括基因开关在内的任何其他修饰的情况下)控制蛋白(例如，HGH蛋白)的产生。
表2
在一些实施方案中，本文的组合物和系统以被选定为在适当的受试者(例如，小鼠、人等)中引发治疗和/或预防效果的剂量提供和/或施用。在一些实施方案中，提供治疗性剂量。在一些实施方案中，提供预防剂量。给药和施用方案由临床医生或药理学领域的其他技术人员根据众所周知的药理学和治疗/预防考虑因素定制，这些考虑因素包括但不限于期望的药理学作用水平、可获得的药理学作用的实际水平、毒性。一般来说，建议遵循众所周知的药理学原则来施用药剂(例如，一般建议一次改变剂量不超过50％，并且不超过每3-4个剂半衰期)。对于具有相对少的剂量相关毒性考虑因素或没有剂量相关毒性考虑因素的组合物，在期望最大功效的情况下，超过平均所需剂量的剂量并不少见。这种给药方法通常被称为“最大剂量”策略。在某些实施方案中，剂量(例如，治疗性或预防性)为约0.01mg/kg至约200mg/kg(例如，0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg或介于之间的任何范围(例如，5.0mg/kg至100mg/kg))。在一些实施方案中，受试者为0.1kg(例如，小鼠)与150kg(例如，人)之间，例如0.1kg、0.2kg、0.5kg、1.0kg、2.0kg、5.0kg、10kg、20kg、50kg、100kg、200kg或介于之间的任何范围(例如，40-125kg)。在一些实施方案中，剂量包括0.001mg与40，000mg之间(例如，0.001mg、0.002mg、0.005mg、0.01mg、0.02mg、0.05mg、0.1kg、0.2mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、5.0mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1,000mg、2,000mg、5,000mg、10,000mg、20,000mg、40,000mg，或介于之间的范围)。
在某些实施方案中，靶肽与本文组合物中的阳离子或中性脂质体一起使用。下面表3中示出了示例性的靶肽。在表3中，“[n]”前缀指示N端，“[c]”后缀指示C端；在蛋白质的中间发现缺少任一端的序列。
表3
在某些实施方案中，用本文的系统和方法表达了一种或多种(例如，至少3种或至少8种抗体)。在一些实施方案中，这包括下面表4中所示的治疗性单克隆抗体(mAb)、Fab、F(ab)2和scFv，以及表5和表7处提供的抗SARS-CoV2抗体和抗原结合，所述表通过引用并入本文。
表4
表5
在某些实施方案中，使用诸如抗炎剂或生物活性脂质的剂来增加在本文的方法中从非病毒载体表达的任何治疗性蛋白(或生物活性核酸分子)的表达水平和/或持续时间。在实施方案开发期间进行的工作中，在本文中对下表6中的抗炎剂(AIL)和生物活性脂质进行了测试，并且发现黑色的是成功的剂。
表6
测试的AIL和生物活性脂质
红色＝培养不成功
实施例
在以下实施例中，地塞米松是水溶性地塞米松，该水溶性地塞米松含有这样的地塞米松，该地塞米松与环糊精络合以使该地塞米松可溶。地塞米松棕榈酸酯是地塞米松21-棕榈酸酯。
实施例1
多种MAb的表达
本实施例描述了在4周治疗过程中在小鼠中进行连续治疗后多种独特的单克隆抗体的体内表达。
实验方法：在第0天，给予每组三只小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmolDOTAPSUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱)中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，两小时后注射75mg含有5J8和抗IL5 cDNA(“5J8-IL5”)的单一质粒DNA(pDNA)。这些小鼠在第7天、第14天和第21天再次用IP地塞米松和IV脂质及依序施用的pDNA如以前那样再次治疗，但是使用含有标示剂量的以下cDNA的pDNA：第7天：88mg B38-λ抗CoV2“B38λ”，第14天：44mgB38-λ抗-CoV2，和44mg含有抗IL5 cDNA的两个拷贝(IL5-IL5)的单一pDNA，第21天：44mg利妥昔单抗(aCD20双)和44mg H4抗CoV2(“H4”)。每次治疗后24小时和此后每2-3周通过ELISA测量mAb蛋白的血清水平。图中示出了靶蛋白的组平均值+/-SEM血清水平。显示的“注射后天数”时间点全部是相对于第0天含有5J8和抗IL5 cDNA的pDNA的初始注射。
结果示于图1中，并且证明在每周的基础上不同的DNAmAb载体的连续注射可以在单个小鼠中产生持续治疗水平的四种不同的完整单克隆抗体。
实施例2
多种MAb的表达
本实施例描述了在6周治疗过程中在小鼠中进行连续治疗后多种独特的单克隆抗体的体内表达。
实验方法：在第0天，给予每组三只小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱)中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，两小时后注射各44mg含抗IL5和5J8cDNA(“aIL5+5J8”)的pDNA。这些相同的小鼠在第7天、第14天类似地用IP地塞米松和IV脂质及依序施用的pDNA如以前那样再次治疗，但是使用含有标示剂量的以下cDNA的pDNA：第7天：75mg抗Sars-Cov-2单克隆抗体B38κ cDNA(“B38-κ”)，第14天：44mg含有利妥昔单抗cDNA的两个拷贝(“aCD20-aCD20”)的单一pDNA，以及44mg含有5J8的两个拷贝(“5J8-5J8”)的单一pDNA。在第二次治疗后一天(第8天)的24小时和此后每1-2周通过ELISA测量mAb蛋白的血清水平。图中示出了靶蛋白的组平均值+/-SEM血清水平。标示的时间点全部是相对于第0天含有抗IL5和5J8 cDNA的pDNA的初始注射。
结果示于图2中，并且证明在每周的基础上注射的不同的DNAmAb载体的连续注射可以在单个小鼠中产生持续治疗水平的四种不同的完整单克隆抗体。
实施例3
多种MAb的表达
本实施例描述了在3周治疗过程中在小鼠中进行连续治疗后多种独特的单克隆抗体的体内表达。
实验方法：
关于图3A：在第0天，给予4组每组3只小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱)中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，两小时后注射75mg如下四种含有抗Sars-Cov-2单克隆抗体B38 cDNA的单独pDNA之一：第1组：B38-λ-BV3，第2组：modSE3-2-mCMV-B38-BV3，第3组：modSE3-2-hCMV-B38-BV3，和第4组：B38-κ-BV3。在初始治疗后24小时通过ELISA测量抗CoV2 mAb蛋白的血清水平，并且将该血清水平以组平均值+/-SEM的形式显示。
关于图3B：这些相同的小鼠在第7天和第14天类似地用IP地塞米松和IV脂质及依序施用的pDNA如以前那样治疗，但是使用含有标示剂量的以下cDNA的pDNA：第7天：44mg抗IL5(“aIL5”)和44mg 5J8(“5J8”)。第14天：88mg利妥昔单抗(“aCD20双”)。
在初始治疗后24小时及此后每周通过ELISA测量抗CoV2 mAb蛋白的血清水平。在第22天和第29天确定抗IL5、5J8和利妥昔单抗的血清水平，并且将该血清水平以组平均值+/-SEM的形式显示。图3A和图3B中标示的时间点全部是相对于第0天含有抗IL5和5J8 cDNA的pDNA的初始注射。
图3A和图3B中所示的这些结果表明：A)pDNA表达载体的各种构造导致靶蛋白的不同的表达水平，和B)连续注射编码不同mAb克隆物的pDNA mAb载体可以在单个小鼠中产生显著持续血清水平的四种不同的完整单克隆抗体。
实施例4
多种MAb的表达
本实施例描述了在3周治疗过程中在小鼠中进行连续治疗后多种独特的单克隆抗体的体内表达。
实验方法：在第0天，类似地给予每组各含三只小鼠的三组小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmolDOTAPSUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱)中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射标示剂量的以下含有以下cDNA的pDNA：44mg含有5J8 cDNA的两个拷贝(“5J8-5J8”)的单一pDNA，和44mg含有抗IL5 cDNA的两个拷贝(“aIL5-aIL5”)的单一pDNA。这些相同组的小鼠在第7天、第14天用IP地塞米松和IV脂质及依序施用的pDNA如以前那样治疗，但是使用含有标示剂量的以下cDNA的pDNA：
第1组：第7天-44mg利妥昔单抗cDNA(“aCD20-双”)和44mg的B38抗SARS CoV2 cDNA(“B38-标签”)，第14天-88mg抗Sars-Cov-2单克隆抗体(“H4”)。
第2组：第7天-44mg含有利妥昔单抗cDNA的两个拷贝(“aCD20-aCD20”)的单一pDNA和44mg抗Sars-Cov-2单克隆抗体B38κ cDNA(“B38-κ”)cDNA(“B38-标签”)，第14天-88mg抗Sars-Cov-2单克隆抗体H4 cDNA(“H4”)。第3组：第7天-44mg利妥昔单抗cDNA(“aCD20-双”)和44mg的B38抗SARS CoV2cDNA(“B38-标签”)，第14天-无治疗。
在第1天、第8天和第15天通过ELISA测量mAb蛋白的血清水平。标示的时间点全部是相对于含有5J8和aIL5 cDNA的pDNA的初始注射。结果示于图4中，结果证明在每周的基础上不同的DNAmAb载体的连续注射可以在单个小鼠中产生显著持续血清水平的四种不同的完整单克隆抗体。
实施例5
多种蛋白质的表达
本实施例描述了在3周治疗中在小鼠中进行连续治疗后多种独特的单克隆抗体的体内表达。
实验方法：
关于图5A：在第0天，给予每组各含三只小鼠的八组小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射标示剂量的以下含有以下cDNA的pDNA：第1组：88mg编码利妥昔单抗、抗IL5和5J8 cDNA(“maCD20-haIL5-m5J8”)的单一pDNA；第2组：88mg编码抗SARS-Cov-2单克隆抗体B38λcDNA(“B38-κ”)、利妥昔单抗、抗IL5和5J8 cDNA(“mB38Ld-maCD20-haIL5-m5J8”)的单一pDNA；第3组：88mg编码抗Sars-Cov-2单克隆抗体H4 cDNA(“mH4”)、利妥昔单抗、抗IL5和5J8 cDNA(“mH4-maCD20-haIL5-m5J8”)的单一pDNA；第4组：88mg编码抗Sars-Cov-2单克隆抗体B38κ cDNA(“B38-κ”)和抗IL5 cDNA(“mB38Kp-haIL5”)的单一pDNA；第5组：88mg编码抗Sars-Cov-2单克隆抗体B38κ cDNA(“B38-κ”)和5J8 cDNA(“mB38Kp-m5J8”)的单一pDNA；第6组：88mg编码抗Sars-Cov-2单克隆抗体B38λcDNA(“B38-λ”)和抗IL5 cDNA(“mB38Ld-maIL5”)的单一pDNA；第7组：88mg编码抗Sars-Cov-2单克隆抗体B38λcDNA和5J8cDNA(“mB38Ld-m5J8”)的单一pDNA；第8组：88mg编码抗IL5和B38λcDNA(“maIL5-mB38Ld”)的单一pDNA。这些相同组的小鼠中的一些小鼠在第7天和/或第14天用IP地塞米松和IV脂质及依序施用的pDNA如以前那样再次治疗，但是使用含有标示剂量的以下cDNA的pDNA：
第1组：第7天-44mg利妥昔单抗(“aCD20-双”)和44mg含有抗SARS-CoV2mAb H4的单一pDNA，第14天-无治疗。第2组：第7天-无治疗，第14天-无治疗。第3组、第4组：第7天-44mg利妥昔单抗(“aCD20-双”)和44mg含有5J8 cDNA的两个拷贝(“5J8-5J8”)的单一pDNA，第14天-44mg人G-CSF(“GCSF”)和44mg人α-乳糖苷酶A(“GLA”)(“hGLA-hyFc”)，第21天-44mg人Ace2(“hACE2”)和44mg人生长激素(“hGH”)(“hGH-Fc”)。第5组：第7天-44mg利妥昔单抗(“aCD20-双”)和44mg含有抗IL5 cDNA的两个拷贝(“aIL5-aIL5”)的单一pDNA，第14天-44mgGCSF(“GCSF”)和44mg GLA(“GLA”)。第6组和第8组：第7天-44mg利妥昔单抗(“aCD20-双”)和44mg含有5J8 cDNA的两个拷贝(“5J8-5J8”)的单一pDNA，第14天-无治疗。第7组：第7天-44mg利妥昔单抗(“aCD20-双”)和44mg含有抗IL5 cDNA的两个拷贝(“aIL5-aIL5”)的单一pDNA，第14天-无治疗。在初始治疗后24小时及此后每周通过ELISA测量抗CoV2mAb蛋白的血清水平。标示的时间点全部是相对于pDNA的初始注射。图中标示了组平均值+/-SEM表达水平。
关于图5B：如标示的那样，在用含GCSF+GLA和ACE2+GH的pDNA治疗后第15天和第22天，通过ELISA测量来自第4治疗组(上文)中经过治疗的小鼠的血清中非单克隆抗体治疗性人蛋白G-CSF、GLA、GH和ACE2在血清中的表达。
图5A和图5B所示的这些结果表明在每周的基础上不同的DNA mAb载体的连续注射可以在单个小鼠中产生显著持续血清水平的总共四种不同的完整单克隆抗体和四种其他非单克隆抗体治疗性蛋白(总共八种治疗性蛋白)。
实施例6
多种MAb的表达
本实施例描述了在小鼠中单次治疗后三种不同的单克隆抗体蛋白的产生。
实验方法：在第0天，给予每组各含三只小鼠的八组小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射标示剂量的以下含有以下cDNA的pDNA：第1组：88mg编码抗SARS-CoV2B38κ和抗IL5(“mB38-haIL5”)的单一pDNA；第2组：88mg编码抗SARS-CoV2B38κ和抗IL5(“mB38-maIL5”)的单一pDNA；第3组：88mg编码抗SARS-CoV2 B38λ和抗甲型流感5J8(“mB38-h5J8”)的单一pDNA；第4组：88mg编码抗SARS-CoV2 B38λ和抗甲型流感5J8(“mB38-m5J8”)的单一pDNA；第5组：44mg编码抗IL5的两个拷贝(“aIL5-aIL5”)的单一pDNA和44mg编码SARS-CoV2(“H4”)的单一pDNA；第6组：44mg编码抗IL5的三个拷贝(“aIL5-aIL5-aIL5”)的单一pDNA和44mg编码抗SARS-CoV2(“H4”)的单一pDNA；第7组：88mg编码抗甲型流感5J8和抗IL5(“5J8-aILH-aILL”)的单一pDNA；第8组：88mg编码抗甲型流感5J8和抗IL5(“5J8-aIL5”)的单一pDNA。在初始治疗后1天、14天和22天，通过ELISA测量表达的mAb蛋白的血清水平。图6中标示了组平均值+/-SEM表达水平。
图6所示的这些结果表明，一剂呈单一pDNA的形式或由多个pDNA组成的形式的DNA编码的mAb载体(例如，使用阳离子脂质和中性脂质)可以在小鼠中产生两种单独mAb的持续表达，并且所述一种或多种pDNA的结构和组成有助于mAb表达水平。
实施例7
抗Sars-CoV2蛋白的表达
本实施例描述了在小鼠中进行单次治疗后单独的和组合的多种不同的抗SARSCoV2治疗性蛋白的产生。
实验方法：在第0天，给予每组各含三只小鼠的八组小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱)中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射88mg编码以下cDNA的单一pDNA：第1组：可溶性人ACE2(“hACE2-BV3”)，第2组：可溶性人ACE2的两个拷贝(“hACE2-hACE2”)，第3组：抗SARS-CoV2 mAb B38κ(“B38Kp”)，第4组：抗SARS-CoV2mAbH4的两个拷贝(“H4-H4”)，第5组：抗SARS-CoV2mAb B38κ和可溶性人ACE2(“B38Kp-hACE2”)，第6组：可溶性人ACE2和抗SARS-CoV2 mAb B38κ(“hACE2-B38Kp”)，第7组：抗SARS-CoV2 mAb H4和可溶性人ACE2(“H4-hACE2”)，第8组：可溶性人ACE2和抗SARS-CoV2 mAb H4(“hACE2-H4”)。通过使用重组纯化的H4或B38κ作为标准品的抗RBD ELISA或通过非抗原特异性人IgG或人κ轻链ELISA测量抗SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。通过商业ELISA确定可溶性人ACE2的血清表达水平。图7中标示了组平均值+/-SEM表达水平。
图7中的结果表明，在用单一pDNA载体单次治疗后，抗SARS-CoV2治疗剂(单独的或呈组合的可溶性人ACE2蛋白和/或对SARS-CoV2刺突蛋白具有反应性的抗SARS-CoV-2mAb)可以在动物中产生。
实施例8
抗Sars-CoV2蛋白的表达
本实施例描述了在小鼠中进行脂质体和地塞米松治疗后单独的和组合的多种抗SARS CoV2治疗剂的产生。
实验方法：在第0天，给予每组各含三只小鼠的四组小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射88mg编码以下cDNA的单一pDNA：第1组：可溶性人ACE2-Fc融合物(“shACE2-Fc”)，第2组：可溶性人ACE2-Fc融合物LALA变体(“shACE2-Fc-LALA”)，第3组：抗SARS-CoV2mAb 4A8和可溶性人ACE2-Fc融合物(“4A8-shACE2-Fc”)，第4组：可溶性人ACE2-Fc融合物的两个拷贝(“shACE2-shACE2”)。
在图8A中，在治疗后第1天和第9天，通过基于SARS-CoV2 RBD的ELISA确定含可溶性人ACE2的蛋白的血清表达水平。图中标示了组平均值+/-SEM表达水平。
在图8B中，在第1组至第3组中在治疗后第1天和第9天，通过Fc特异性ELISA确定可溶性人ACE2-Fc融合物的血清表达水平。图中标示了组平均值+/-SEM表达水平。
图8A和图8B所示的结果表明，在用pDNA载体进行脂质体和地塞米松治疗后，抗SARS-CoV2治疗剂(单独的或与对SARS-CoV2刺突蛋白具有反应性的4A8 mAb组合的可溶性人ACE2融合蛋白)可以在体内。
实施例9
ACE2蛋白的表达
本实施例描述了小鼠中人ACE2和经修饰的变体的产生。
实验方法：在第0天，给予每组各含三只小鼠的十二组小鼠IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmolDOTAPSUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着如标示的那样，注射88mg编码人ACE2 cDNA(第1组)或ACE2的经修饰型式(第2组至第12组)的单一pDNA。一天后，通过使用重组RBD蛋白进行捕获并且使用抗Fc试剂或抗ACE2试剂进行检测的ELISA确定ACE2的血清表达。在示出结果的图9中标示了组平均值+/-SEM表达水平。
实施例10
与半衰期延长肽融合的人生长激素的表达
本实施例描述了与半衰期延长肽融合的人生长激素(hGH)的体内表达。
方法：给各4只(红色)或3只(其他组)CD-1小鼠的组IP注射40mg/kg水溶性地塞米松。两小时后，首先给小鼠IV注射脂质体，接着大约2分钟后IV注射75ug编码人GH(hGH)的质粒DNA。所有脂质体混合物都含有1000nmolDOTAPSUV(其含2.5％地塞米松21-棕榈酸酯)以及1000nmol DMPC(其含5％地塞米松21-棕榈酸酯)。在注射后24小时给小鼠放血，此后每周或每隔几周放血以获得血清。通过ELISA评估hGH的血清水平。在注射后第127天，小鼠IGF-1的血清水平以及hGH的血清水平通过它们各自的ELISA协同评估。
测试结果在图45中示出。图45A显示这种程序驱动与蛋白半衰期延长DNA序列(包括Fc、血清白蛋白或Xten)融合的野生型hGH cDNA的表达，并且当与由缺少蛋白半衰期延长DNA序列的hGH DNA载体产生的hGH血清水平相比时可以随时间显著增加具有免疫能力的小鼠中的血清hGH水平。图45B显示产生的cDNA编码的hGH蛋白具有完全生物活性，因为它适当地增加hGH调控的内源性小鼠IGF-1蛋白的水平。图45C显示在这种程序中DNA载体的一次注射驱动野生型hGH cDNA，但缺少任何蛋白半衰期延长DNA序列可在具有免疫能力的小鼠中引起治疗性hGH血清水平的持久产生。尽管事实是hGH蛋白的血清半衰期小于20分钟。
实施例11
与半衰期延长肽融合的人生长激素的表达
本实施例描述了与半衰期延长肽融合的人生长激素(hGH)的体内表达。
方法：给各4只CD-1小鼠的组IP注射40mg/kg水溶性地塞米松。两小时后，首先给小鼠IV注射脂质体，接着大约2分钟后IV注射75ug编码人GH的质粒DNA。所有脂质体混合物都含有1000nmol DOTAP SUV(其含2.5％地塞米松21-棕榈酸酯)以及1000nmol DMPC(其含5％地塞米松21-棕榈酸酯)。注射后24小时以及此后每7-21天对小鼠放血以分离血清，并通过ELISA评估血清表达。
结果示于图46中，结果表明这种使用驱动与蛋白半衰期延长DNA序列(包括Fc、血清白蛋白或Xten)融合的野生型hGH cDNA的载体的程序在与由缺少蛋白半衰期延长DNA序列的hGH DNA载体产生的hGH血清水平相比时可以随时间显著增加具有免疫能力的小鼠中的血清hGH水平。
实施例12
再次注射质粒时人生长激素的表达
本实施例描述了再次注射质粒时人生长激素(hGH)的体内表达。
方法：给各4只CD-1小鼠的组IP注射40mg/kg水溶性地塞米松。两小时后，首先给小鼠IV注射脂质体，接着大约2分钟后IV注射75ug编码人GH的质粒DNA。所有脂质体混合物都含有1000nmol DOTAP SUV(其含2.5％地塞米松21-棕榈酸酯)以及1000nmol DMPC(其含5％地塞米松21-棕榈酸酯)。每周对小鼠放血以评估表达。示出了在再注射之前在初始注射后43天的表达。第49天，给予小鼠与初始注射相同的治疗。再次注射后24小时对小鼠放血以分离血清并且此后每7-21天对小鼠放血，并通过ELISA评估血清表达。
这些结果示于图47中并且表明使用这种程序，将驱动野生型hGH cDNA的DNA载体再次注射到完全具有免疫能力的小鼠中一次可显著且持久地进一步增加由初始hGH DNA载体注射产生的血清hGH水平。
实施例13
与半衰期延长肽融合的人生长激素的表达
本实施例描述了与半衰期延长肽融合的人生长激素(hGH)的体内表达。
方法：使用5只CD-1小鼠的组。给小鼠IP注射40mg/kg水溶性地塞米松。两小时后，首先给小鼠IV注射脂质体，接着大约2分钟后IV注射75ug编码人GH的质粒DNA。所有脂质体混合物都含有1000nmol DOTAP SUV(其含2.5％地塞米松21-棕榈酸酯)以及1000nmol DMPC(其含5％地塞米松21-棕榈酸酯)。注射后24小时以及此后每7-28天对小鼠放血以分离血清，并通过ELISA评估血清表达。
测试结果在图48中示出。这些结果表明，这种使用驱动与Fc蛋白半衰期延长DNA序列融合的野生型hGH cDNA的DNA载体的程序在单次注射到具有免疫能力的小鼠中之后可以在至少接下来的225天(>正常小鼠寿命的30％)内产生在1至10ng/ml hGH治疗范围内的血清hGH水平。
实施例14
与半衰期延长肽融合的人生长激素的表达
本实施例描述了与半衰期延长肽融合的人生长激素(hGH)的体内表达。
方法：给各3只CD-l小鼠的组IP注射40mg/kg水溶性地塞米松。两小时后，首先给小鼠IV注射脂质体，接着大约2分钟后IV注射75ug编码人GH的质粒DNA。所有脂质体混合物都含有1000nmol DOTAP SUV(其含2.5％地塞米松21-棕榈酸酯)以及1000nmol DMPC(其含5％地塞米松21-棕榈酸酯)。注射后24小时以及此后每7-21天对小鼠放血以分离血清，并通过ELISA评估血清表达。
测试结果在图49中示出。这些结果表明，这种使用驱动与Fc蛋白半衰期延长DNA序列融合的野生型hGH cDNA的DNA载体的程序在小鼠中产生完全具有生物活性的hGH蛋白，因为cDNA编码的hGH蛋白适当地增加了hGH调控的内源性小鼠IGF-1蛋白的水平。
实施例15
与半衰期延长肽融合的人生长激素的表达
本实施例描述了与半衰期延长肽融合的人生长激素(hGH)的体内表达。
方法：给各3只CD-1小鼠的组IP注射40mg/kg水溶性地塞米松。两小时后，首先给小鼠IV注射脂质体，接着大约2分钟后IV注射75ug编码人GH的质粒DNA。所有脂质体混合物都含有1000nmol DOTAP SUV(其含2.5％地塞米松21-棕榈酸酯)以及1000nmol DMPC(其含5％地塞米松21-棕榈酸酯)。注射后第1天和第15天对小鼠放血以分离血清，并通过ELISA评估血清表达。
图50示出了结果。图50A显示驱动与Fc蛋白半衰期延长DNA序列(包括CTP)融合的野生型hGH cDNA的DNA载体的Fc区的选择性定点诱变可以选择性地增加或降低具有免疫能力的小鼠中产生的血清hGH水平。图50B显示驱动与Fc蛋白半衰期延长DNA序列融合的野生型hGH cDNA的DNA载体的Fc区的选择性定点诱变可以选择性地增加具有免疫能力的小鼠中随时间产生的血清hGH水平。
实施例16
免疫调节剂
本实施例描述了各种免疫调节剂的测试。
第1部分
方法：对各3只CD-1小鼠的组注射900nmolDOTAPSUV，该DOTAPSUV含或不含摩尔百分比如图51所示的地塞米松21-棕榈酸酯或胆固醇棕榈酸酯。脂质体注射后两分钟，给小鼠注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。第二天给小鼠放血，并通过ELISA评估hG-CSF蛋白的血清水平。评估血清中的ALT水平。结果示于图51，该图显示将优化摩尔百分比的地塞米松棕榈酸酯(DexPalm)掺入到阳离子脂质体中可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性。
第2部分
方法：使用各3只CD-1小鼠的组。一组(+Dex)IP注射40mg/kg地塞米松，一组(+DexPIP)IP注射含有2.5摩尔％地塞米松21-棕榈酸酯的900nmol DOTAP脂质体，以及一组(鱼精蛋白)IP注射5mg/kg硫酸鱼精蛋白。两小时后，首先给小鼠注射900nmolDOTAPSUV，该DOTAPSUV含或不含摩尔百分比如图52所示的地塞米松21-棕榈酸酯或胆固醇棕榈酸酯。脂质体注射后两分钟，给小鼠注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。第二天给小鼠放血，并通过ELISA评估hG-CSF蛋白的血清水平。评估血清中的ALT水平。结果示于图52，该图显示将优化摩尔百分比的地塞米松棕榈酸酯掺入到阳离子脂质体中可以进一步增加基因表达并进一步降低毒性。
第3部分
方法：使用各3只CD-1小鼠的组。在IV注射前5分钟、IV注射后5分钟或IV注射前30分钟给一组中的每只IP注射含有2.5％地塞米松21-棕榈酸酯的900nmol DOTAP脂质体。在IV注射前5分钟给一组和一组(鱼精蛋白)IP注射5mg/kg硫酸鱼精蛋白。对于IV注射，首先给小鼠注射900nmolDOTAPSUV，该DOTAP SUV含有2.5％的在脂质体中的地塞米松21-棕榈酸酯。脂质体注射后两分钟，给小鼠注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。第二天给小鼠放血，并通过ELISA评估hG-CSF蛋白的血清水平。评估血清中的ALT水平。图53示出了结果，该结果显示在注射阳离子脂质体之前预先注射优化摩尔百分比的在脂质体中的地塞米松棕榈酸酯可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性。
第4部分
方法：给各3只CD-1小鼠的组注射900nmolDOTAPSUV，该DOTAPSUV含或不含在脂质体中的摩尔百分比如图54所示的许多不同内源性抗炎脂质(AIL)中的一种。脂质体注射后两分钟，给小鼠注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。第二天给小鼠放血，并通过ELISA评估hG-CSF蛋白的血清水平。评估血清中的ALT水平。结果示于图54，该图显示注射一些掺入到阳离子脂质体中的AIL可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性(ALT水平)。相反，将选定摩尔百分比的掺入到阳离子脂质体中的其他AIL可显著增加ALT。
第5部分
方法：给各3只CD-1小鼠的组注射900nmolDOTAPSUV，该DOTAPSUV含或不含摩尔百分比如图55所示的许多不同内源性抗炎脂质(AIL)中的一种。脂质体注射后两分钟，给小鼠注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。第二天给小鼠放血，并通过ELISA评估hG-CSF蛋白的血清水平。评估血清中的ALT水平。图55中所示的结果显示注射某些掺入到阳离子脂质体中的AIL可以进一步增加基因表达并且进一步降低毒性(ALT水平)。相反，将选定摩尔百分比的掺入到阳离子脂质体中的其他AIL可显著增加ALT。
第6部分
方法：使用各3只CD-1小鼠的组。给一组(+Dex)IP注射40mg/kg地塞米松，一组。两小时后，首先给小鼠注射900nmol DOTAP SUV，该DOTAP SUV含或不含5摩尔％的地塞米松21-棕榈酸酯。脂质体注射后两分钟，给小鼠注射40或130ug编码hG-CSF的质粒DNA。第二天给小鼠放血，并通过ELISA评估hG-CSF蛋白的血清水平。评估血清中的ALT水平。结果示于图56，并且显示在原本无效的hG-CSF-DNA剂量后，将优化摩尔百分比的地塞米松棕榈酸酯掺入到阳离子脂质体中可以进一步增加基因表达的峰值水平。
实施例17
鼻内施用和免疫调节
本实施例描述了在鼻内施用脂质体后对小鼠肺部中的造血细胞的靶向。
实验方法：将小鼠麻醉并且给该小鼠经由鼻内途径施用200nmol标示的脂质体制剂，每种脂质体制剂均含有1mol％的荧光磷脂酰乙醇胺以跟踪脂质体或乳酸盐林格氏对照的摄取。一天后，收获肺部，将其消化成单细胞悬浮液，并用荧光抗体进行表面染色，以在通过流式细胞术分析之前检测小鼠CD45、CD11b和F4/80标志物。DOPS＝1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸，mixPS＝1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸。结果示于图57中，该图显示通过选择性地改变鼻内施用的脂质体的脂质组成，可以使这些脂质体不同程度地选择性地靶向至肺内单核细胞和巨噬细胞，从而对肺部进行选择性地免疫调节。
实施例18
差异性T细胞活化
本实施例描述了由施用特定脂质体制剂引起的差异性T细胞活化。
实验方法：在第0天，对六组小鼠(每组含三只小鼠)给予以下治疗：
第1组-IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAPSUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码抗SARS CoV2 H4 κ mAb、抗CD20、抗甲型流感5J8和抗人IL-5的单一pDNA。
第2组-依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码抗SARS CoV2 H4 κ mAb、抗CD20、抗甲型流感5J8和抗人IL-5的单一pDNA。
第3组-依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码抗SARSCoV2 H4 κ mAb、抗CD20、抗甲型流感5J8和抗人IL-5的单一pDNA。
第4组-依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质))，接着注射编码抗SARS CoV2 H4 κ mAb、抗CD20、抗甲型流感5J8和抗人IL-5的单一pDNA。
第5组-依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码抗SARS CoV2 H4 κ mAb、抗CD20、抗甲型流感5J8和抗人IL-5的单一pDNA。
第6组-无治疗
图58示出了结果并且显示通过选择性地改变肠胃外水溶性前给剂和/或掺入到随后施用的脂质体中的地塞米松棕榈酸酯的摩尔百分比，可以选择性地免疫调节肺部和血液中的T淋巴细胞活化水平。
实施例19
差异性T细胞活化
本实施例描述了由施用脂质体制剂引起的差异性T细胞活化。
实验方法：在第0天，对八组小鼠(每组含三只小鼠)进行如下治疗：
第1组-未治疗
第2组-IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAPSUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码人PECAM-1的单一pDNA。
第3组-IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP：胆固醇(85：15)SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码人PECAM-1的单一pDNA。
第4组-IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmolDOTAP：DODAP(1：1)SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码人PECAM-1的单一pDNA。
第5组-IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后依序IV注射脂质(1000nmol DOTAPSUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)：胆固醇(1：1)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)，接着注射编码人PECAM-1的单一pDNA。
第6组-在依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)：胆固醇(1：1)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)之前2小时和在临注射该脂质之前两次IP注射地塞米松(40mg/kg)，在注射该脂质之后注射编码人PECAM-1的单一pDNA。
第7组-在依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)之前的24小时和两小时两次IP注射含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯的磷脂酰丝氨酸：胆固醇2：1 MLV，在注射该脂质之后注射编码人PECAM-1的单一pDNA。
第8组-在依序IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)之前的24小时和两小时两次IP注射含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯的DOTAP：胆固醇2：1 MLV，在注射该脂质之后注射编码人PECAM-1的单一pDNA。
一天后，收获肺部和外周血，在必要时将其消化成单细胞悬浮液，并用荧光抗体进行表面染色，以在通过流式细胞术分析之前检测小鼠CD4、CD8α、CD44、CD69及人PECAM-1标志物。
图59示出了结果，该结果显示通过选择性地改变肠胃外水溶性前给剂和/或掺入到随后施用的脂质体中的地塞米松棕榈酸酯的摩尔百分比，可以选择性地免疫调节肺部和血液中的T淋巴细胞活化水平。
实施例20
抗TNFa和类肝素药物
本实施例描述了抗TNFa单克隆抗体和类肝素剂在体内表达方法中增加表达的用途。
第1部分-抗TNFa单克隆抗体
方法：使用3只小鼠的组。在IV注射前2小时，IP给予一组每只小鼠各100ug抗TNFa单克隆抗体。然后给小鼠IV注射900nmol DOTAP SUV，接着2分钟后注射70ug或130ug编码hG-CSF的质粒DNA。注射后24小时给小鼠放血，并通过ELISA评估血清中的hG-CSF表达。测量血清ALT/AST水平。
结果示于图60，该图显示预先施用抗炎剂(这里是抗TNF单克隆抗体)可以进一步增加基因表达，同时进一步降低它的毒性。
第2部分-NSH
方法：使用3只小鼠的组。除对照组以外，在脂质和DNA注射前2小时或注射后2小时，IP给予小鼠NSH(N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素)，每只小鼠0.25或1mg。然后给小鼠IV注射900nmolDOTAP SUV，接着2分钟后注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。注射后24小时给小鼠放血，并通过ELISA评估血清中的hG-CSF表达。测量血清ALT/AST水平。
结果示于图61，该图显示NSH的预先施用或在后施用都可降低毒性。
第3部分-NSH
方法：使用3只小鼠的组。在脂质和DNA注射前2小时或注射后2小时，IP给予经过类肝素治疗的小鼠NSH(N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素)，每只小鼠0.25或1mg。然后给小鼠IV注射900nmolDOTAP SUV，接着2分钟后注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。注射后24小时给小鼠放血，并通过ELISA评估血清中的hG-CSF表达。给予经过生育酚治疗的小鼠900nmol含有α-生育酚的DOTAP SUV，接着给予70ug编码hG-CSF的质粒DNA。测量血清ALT/AST水平。
结果示于图62，结果显示NSH的预先施用或在后施用都可降低毒性。
第4部分-NSH
方法：使用3只小鼠的组。在脂质和DNA注射前2小时，IP给予经过类肝素治疗的小鼠NSH(N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素)。然后给小鼠IV注射900nmol DOTAP SUV，接着2分钟后注射70ug编码hG-CSF的质粒DNA。注射后24小时给小鼠放血，并通过ELISA评估血清中的hG-CSF表达。给予生育酚小鼠900nmol含有α-生育酚的DOTAP SUV，接着给予70ug编码hG-CSF的质粒DNA。测量血清ALT/AST水平。
图63示出的结果显示NSH的预先施用可以进一步增加基因表达，同时进一步降低它的毒性。
实施例21
脂质体施用后的免疫调节
本实施例描述了在施用含有地塞米松和/或地塞米松棕榈酸酯的各种脂质体制剂后小鼠中淋巴细胞和单核细胞群的免疫调节。
实验方法：使用2-3只CD-1小鼠的组。在第0天，给予八组小鼠以下治疗：
第1组-仅IP注射水溶性地塞米松(40mg/kg)。
第2组-IP注射地塞米松(40mg/kg)，两小时后IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)。
第3组-IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)。
第4组-IP注射1000nmol DMPC((1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)MLV，两小时后IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)MLV，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)。
第5组-IP注射1000nmol DMPC((1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)SUV，两小时后IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)MLV，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)。
第6组-IP注射1000nmol DMPC((1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)MLV，两小时后IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmolDMPC(1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)MLV，其含5mol％的含MTAS-NLS-SPD肽的地塞米松棕榈酸酯)。
第7组-IP注射1000nmol DMPC((1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)，其含5mol％地塞米松棕榈酸酯)SUV，两小时后IV注射脂质(1000nmol DOTAP SUV，其含2.5mol％地塞米松棕榈酸酯；和1000nmol DMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱中性脂质)MLV，其含5mol％的含MTAS-NLS-SPD肽的地塞米松棕榈酸酯)。
第8组-无治疗。
脂质体治疗后24小时，在含有EDTA的微量采血管(microtainertube)中收获外周血，并通过CBC装置对外周血进行分析。显示组平均值+/-SEM。图64显示与单独地塞米松的全身施用相比，含有地塞米松棕榈酸酯的脂质体的各种制剂的施用减少了血液中的淋巴细胞计数。图65显示与单独地塞米松的全身施用相比，含有地塞米松棕榈酸酯的脂质体的各种制剂的施用减少了血液中的单核细胞计数。
实施例22
在单次HEDGES DNA载体施用后持续的完全SARS-CoV-2中和水平的单一抗SARS-CoV2 mAb的产生
本实施例描述了使用以下注射方案时小鼠中单一SARS-CoV-2抗体的表达产生完全中和水平的mAb。在小鼠中单独表达的五种不同的SARS-CoV-2抗体是：C135、C215、COV2-2355、CV07-209和C121(序列信息参见表7)。在第0天，用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松对小鼠的组进行预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1100nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药约80ug含有针对五种SARS-CoV2特异性mAb之一的一个表达盒的单一质粒DNA。在治疗后第1、8、22、30、36、50、78、92、106和120天对小鼠进行放血，并通过人IgGELISA测定法确定血清mAb蛋白水平。结果示于图66中(左轴，粉色条形图表示每种mAb的从第1天到第120天升序显示的平均值+或-SEM)。含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能生物活性通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，右轴，绿色点表示每种mAb克隆物的从第1天到第120天升序显示的平均值+或-SEM，Genscript)来确定。
本实施例表明，如图66所示，不同的单一DNA表达质粒(每个质粒编码五种不同的SARS-CoV2特异性mAb之一)的一次注射在施用后在至少120天的整个实验过程中产生完全中和性血清水平的每种SARS-CoV2特异性mAb，并且这些持续的血清mAb水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合至少120天(相当于人类20年以上)。这些结果证明，该方案(包括注射编码单个SARS-CoV2特异性mAb的DNA)可以产生持久(相当于人类20年以上)的中和性抗SARS-CoV2血清水平。
实施例23
两种抗SARS-CoV2 mAb从单个质粒的表达
本实施例描述了使用以下注射方案时小鼠中两种SARS-CoV-2抗体从单个质粒(4种不同的质粒)的表达产生中和水平的mAb。表达的SARS-CoV-2抗体如下：第一质粒(C135+CV07-209)；第二质粒(RBD215 LALA+CV07-209)；第三质粒(C121+CV07-209)；和第四质粒(CV07-209+Zost-2355)(序列信息参见表7)。在第0天，用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松对小鼠的组进行预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1100nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药约80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA。在治疗后第1、8、22、30、36、50、78、92、106、120和134天对小鼠进行放血，并通过人IgGELISA测定法确定血清mAb蛋白水平。结果示于图67中(左轴，粉色条形图表示每种mAb的从第1天到第134天升序显示的平均值+或-SEM)。含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能生物活性能量通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，右轴，绿色点表示每种mAb克隆物的从第1天到第134天升序显示的平均值+或-SEM，Genscript)来确定。
这个实施例表明，如图67所示，这种单次注射单个表达质粒的程序导致在这种程序后的至少134天的过程内两种SARS-CoV2特异性mAb从单个质粒表达，并且这些血清表达的mAb血清在功能上能够阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2相互作用至少134天。
实施例24
由三种方法引起的两种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了由以下三种不同的方法引起的两种抗SARS-CoV2 mAb的同时表达：1)单次注射编码两种独特mAb的单个表达质粒；2)将两种独特的质粒作为混合物同时单次注射(共同注射)；和3)两次注射单个mAb表达质粒，这两次注射间隔一定时间，这里为7天(再次注射)。表达的各种抗SARS-CoV2mAb示于图68中(序列参见表7)。
在第0天，用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松对小鼠的组进行预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药75ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的一个或两个表达盒的单一质粒DNA，或38ug的各自含有针对一种或两种mAb克隆物的表达盒的两种质粒中每一种(共同注射-“共注射(coinj)”)。在第7天，这些组的小鼠中的一些小鼠与第0天一样接受地塞米松再治疗剂(retreatment)、脂质体配剂(dosing)和质粒DNA的额外注射(再次注射(re-injection)-“再注射(reinj)”)，并且类似地用75ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。在第1、8和15、22天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析血清mAb表达。结果示于图68a中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15和22天的平均值+/-SEM mAb表达或抑制量。
图68b示出了含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力，该功能能力通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。
每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15和22天的平均值+/-SEM mAb表达或抑制量。
本实施例显示了(图68中的结果)这种方案是如何通过所尝试的三种方法同时产生两种抗SARS-CoV2 mAb。所有方法都成功地允许两种mAb在动物血清中以允许中和SARS-CoV2/ACE2相互作用的水平表达。
实施例25
三种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了基于每周两次的质粒注射使三种不同的抗SARS-CoV2 mAb从一个或两个质粒表达。这是用三个不同的mAb集合体执行的，如图69(表7中的序列)所示。
在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的一个表达盒的单一质粒DNA。第7天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂(pretreatment)、脂质体配剂和质粒DNA的额外注射。对这些组用80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图69中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。这些抑制结果在图69中以绿色示出。每个系列的条形图标示第1、8、15、21、36、50、78、92、106、120天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
这些实施例表明，每周注射两次编码总共三种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb的一种或两种DNA表达质粒在施用后至少70天的过程中产生完全中和性血清水平的三种不同的SARS-CoV2特异性mAb，并且这些持续的血清mAb水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2至少70天，这相当于人类10年以上。这些结果表明，每周两次注射编码三种不同的SARS-CoV2特异性mAb的hedges DNA产生持久(相当于人类10年以上)的完全中和性抗SARS-CoV2 mAb血清水平。
实施例26
四种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图70所示的四(4)种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、92和106天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图70中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78、92和106天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。每个系列的条形图标示第1、8、15、21、36、50、78、92和106天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例27
注射一次时四种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图71所示的四种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图71中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。每个系列的条形图(在图71中为绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例28
四种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图72所示的四种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药45ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
在小鼠首次治疗后第1、8、22、36、50、64、78、99天对小鼠进行放血，并通过人IgGELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图72中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、22、36、50、64、78、99天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。这些结果以绿色示出，在该图中每个系列的条形图标示第1、8、22、36、50、64、78、99天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
这些实施例表明，单次共同注射各自编码两种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb的两种不同的单一DNA表达质粒(一起共同注射产生总共四种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb)在施用后至少90天内产生完全中和性血清水平的四种不同的SARS-CoV2特异性mAb，并且这些持续的血清mAb水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合至少90天，这相当于人类15年以上。
实施例29
注射两次时四种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图73所示的四种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA。
第7天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的额外注射(由散列条标示)。用80ug的含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA治疗小鼠。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图73中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。每个系列的条形图(在图73中为绿色)标示第1、8、15、21、36、50、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb抑制(右侧y轴)。
实施例30
注射两次时四种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图74所示的四种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA。
第7天，这些组的小鼠中的一些小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射(由点填充图案标示)。对这些组用40ug的各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图74中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。每个系列的条形图(绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
这些实施例表明，连续每周共同注射各自编码两种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb的两种不同的单一DNA表达质粒(一起连续共同注射产生总共四种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb)在施用后至少70天的过程内产生完全中和性血清水平的四种不同的SARS-CoV2特异性mAb，并且这些持续的血清mAb水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合至少70天，这相当于人类10年以上。
实施例31
注射两次时五种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图75所示的五种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的一个表达盒的单一质粒DNA。
第7天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的额外注射。对一些组用40ug的各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图75中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。每个系列的条形图(在图75中以绿色示出)标示第1、8、15、21、36、50、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb抑制(右侧y轴)。
实施例32
单次注射时六种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图76所示的六种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药30ug各自含有两个mAb表达盒的三种质粒中的每一种。
在小鼠首次治疗后第1、8、22、36、50、64、78、99天对小鼠进行放血，并通过人IgGELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图76中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、22、36、50、64、78、99天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图76中为绿色)标示第1、8、22、36、50、64、78、99天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例33
注射两次时六种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图77所示的六种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA，或40ug的各自含有一个或两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的额外注射。对这些组用80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA或者40ug的各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的一种进行治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图77中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图77中为绿色)标示第1、8、15、21、36、50、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb抑制(右侧y轴)。
实施例34
注射2次或3次时六种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图78所示的六种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA，或40ug的各自含有一个或两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射(由点填充图案标示)。对这些组用40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
第14天，这些组的小鼠中的一些小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第三轮注射。对这些组用80ug的含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图78中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)来确定。每个系列的条形图(在图78中为绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
这些实施例表明，连续共同注射各自编码两种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb的三种不同的单一DNA表达质粒(一起连续注射产生总共六种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb)各自在施用后至少90天的过程内产生完全中和性血清水平的六种不同的SARS-CoV2特异性mAb，并且产生的这些持续的血清mAb水平在功能上阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合并且这些在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合至少90天，这相当于人类15年以上。
实施例35
注射两次时八种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图79所示的八种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的额外注射。对小鼠用40ug的各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图79中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78、92、106、120天的平均值+/-SEMmAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图79中为绿色)标示第1、8、15、21、36、50、78、92、106、120天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例36
注射两次时八种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图80所示的八种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射。对这些小鼠用40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图80中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图80中以绿色示出)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例37
注射三次时八种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图81所示的八种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射。对这些组用80ug的含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。
第14天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第三轮注射(由散列条标示)。对这些组用80ug含有两个mAb表达盒的单一质粒中的每一种进行治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图81中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图81中为绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例38
八种抗SARS-CoV2 mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图82所示的八种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有一个或两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射。对这些组用80ug的含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA或40ug的各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
第14天，这些组的小鼠中的一些小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第三轮注射(由散列条标示)。对这些组用80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图82中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图82中为绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例39
10种抗SARS-CoV2 mAb与其他蛋白和mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图83所示的十种抗SARS-CoV2 mAb(序列信息参见表7)与其他蛋白和mAb表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有一个或两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射(由点填充图案标示)。对这些组用40ug的各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
第14天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第三轮注射。对这些组用80ug的含有针对SARS-CoV2特异性mAb克隆物的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。
第21天，这些组的小鼠中的一些小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第四轮注射。对这些组用80ug的含有针对非SARS-CoV2相关蛋白的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。这些非SARS-CoV2相关蛋白包括美泊利单抗(mepoluzimab)(aIL5)和抗甲型流感血凝素H1(5J8)。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图83中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEMmAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图83中为绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
实施例40
11种抗SARS-CoV2 mAb与其他蛋白和mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图84所示的十一种抗SARS-CoV2mAb(序列信息参见表7)与其他蛋白和mAb表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射。对这些组用40ug的各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
第14天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第三轮注射。对这些组用40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
第21天，这些组的小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第四轮注射。对这些组用以下进行治疗：80ug含有针对非SARS-CoV2相关蛋白的两个或更多个表达盒的单一质粒DNA，40ug的各自含有两个非SARS-CoV2相关蛋白的两种质粒中的每一种，或25ug的各自含有两个非SARS-CoV2特异性蛋白表达盒的三种质粒中的每一种。这些非SARS-CoV2相关蛋白包括人生长激素(GH)、半乳糖苷酶α(GLA)、G-CSF和mAb利妥昔单抗(aCD20)、美泊利单抗(aIL5)和抗甲型流感血凝素H1(5J8)。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图84中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb表达(左侧y轴)。
并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图84中为绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
这些实施例表明，连续共同注射至多六种不同的单一DNA表达质粒(每种质粒编码两种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb)(一起连续注射产生总共至多11种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb)在施用后至少90天的过程内产生中和性血清水平的至多11种不同的SARS-CoV2特异性mAb，并且这些持续的血清mAb水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合至少90天，这相当于人类15年以上。
实施例41
10种抗SARS-CoV2 mAb与其他蛋白和mAb的表达
本实施例描述了使用以下方案来使图85所示的十种抗SARS-CoV-2mAb(序列信息参见表7)与其他非Sars-CoV-2mAb表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种。
第7天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第二轮注射(由点填充图案标示)。对小鼠用40ug各自含有两个mAb表达盒的两种质粒中的每一种进行治疗。
第14天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第三轮注射(由散列条标示)。对这些小鼠用80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。
第21天，小鼠与第0天一样接受地塞米松预先治疗剂、脂质体配剂和质粒DNA的第四轮注射。对这些组用80ug的含有针对非SARS-CoV2相关蛋白的两个表达盒的单一质粒DNA进行治疗。这些非SARS-CoV2相关蛋白包括美泊利单抗生物仿制药(aIL5)和抗甲型流感血凝素H1(5J8)。
在小鼠首次治疗后第1、8、15、21、36、50、64、78、和92天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法分析SARS-CoV2 mAb的血清表达水平。结果示于图85中，在该图中每个系列的条形图按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEMmAb表达(左侧y轴)。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。每个系列的条形图(在图85中为绿色)按从左到右的顺序标示第1、8、15、21、36、50、64、78和92天的平均值+/-SEM mAb抑制(右侧y轴)。
本实施例证明，连续共同注射总共6种不同的单一DNA表达质粒，其中5种编码两种不同的单独SARS-CoV2特异性mAb并且第6种编码针对1918年大流行性流感病毒的mAb 5J8的重链和轻链cDNA。这些连续注射一起产生中和水平的总共10种不同的单独SARS-CoV2特异性血清mAb蛋白和一种1918年大流行性流感特异性血清mAb蛋白。这些注射在施用后至少90天的过程内产生中和血清水平的所有10种不同的SARS-CoV2特异性mAb以及中和血清水平的1918年大流行性流感特异性mAb，并且这些持续的SARS-CoV2特异性mAb血清水平在功能上连续地阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合。此外，hedges产生的抗大流行性甲型流感mAb5J8血清水平中和Cal/09大流行性流感病毒株至少90天，这相当于人类15年以上。这意味着总共四次连续的DNA载体施用可以在此后几十年内同时中和SARS-CoV-2病毒和大流行性流感病毒。
实施例42
到治疗后14小时时的SARS-CoV2抑制。
本实施例描述了到用图86中所示的抗SARS-CoV-2mAb(序列信息参见表7)治疗后14小时时的SARS-CoV2抑制。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1000nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药80ug含有针对SARS-CoV2特异性mAb克隆物的一个或两个表达盒的单一质粒DNA。
在用质粒DNA治疗后1、4、8、14、18、20、24和48小时，对小鼠进行放血，并通过人IgGELISA测定法分析mAb的血清表达水平。结果示于图86A中，在该图中每个系列的条形图标示在标示时间(小时)的平均值+/-SEM mAb表达。并行地，含有SARS-CoV2特异性mAb的血清抑制SARS-CoV2刺突-人ACE2蛋白相互作用的功能能力在整个时间过程中通过可商购获得的体外SARS-CoV2刺突/ACE2阻断测定法(cPASS，Genscript)确定。结果示于图86B中，在该图中每个系列的条形图标示在治疗后的标示时间(小时)的平均值+/-SEM mAb抑制。
本实施例使用测定在单次施用编码一种或两种抗SARS-CoV-2mAb重链和轻链cDNA的抗SARS-CoV-2DNA载体之后1与24小时之间随时间推移产生的抗SARS-CoV-2mAb血清水平在功能上阻断SARS-CoV2刺突-人ACE2结合的能力的时间过程。结果表明，SARS-CoV2刺突-人ACE2结合在一次IV注射编码一种或两种抗SARS-CoV-2mAb的hedges DNA载体后8小时内受到有效阻断。相比之下，在两种不同的抗SARS-CoV-2疫苗施用后的中和保护通常需要五周。
实施例43
多种不同的mAb和基因的同时表达
本实施例描述了使用单次注射来使六种不同的mAb和基因同时表达。对每组四只小鼠IP注射40mg/kg水溶性地塞米松。两小时后，对小鼠i.v.注射剂量如图87所示的含有2.5％地塞米松21-棕榈酸酯的阳离子脂质体，以及含有5％棕榈酸酯的1000nmol DMPC脂质体。第一次i.v.注射后两分钟，对小鼠注射各25ug、各30ug或各34ug的三种DNA质粒：一种编码抗IL5和5J8的DNA质粒、一种编码hGH和hGCSF的DNA质粒，以及一种编码抗SARS-CoV2和GLA的DNA质粒。第二天为小鼠放血并分析血清中靶基因的表达。表达结果示于图87。本实施例表明，三种不同的DNA载体(每种载体编码两个或三个不同的人类基因)的单次共同注射产生显著血清水平的所有六种不同人类蛋白。
实施例44
用各种真核启动子控制基因表达
本实施例描述了使用各种真核启动子来使靶基因(人生长激素)表达。在第0天，对小鼠的组用i.p.给予的40mg/kg水溶性地塞米松预先治疗，两小时后i.v.给药脂质体，该脂质体由1100nmol的DOTAP/2.5mol％地塞米松棕榈酸酯/SUV和DMPC/5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV中的每一者组成。两分钟后，对小鼠i.v.给药75ug如图88所示的各种单一质粒DNA构建体，这些质粒DNA构建体各自含有针对由异源基因启动子驱动的人生长激素-Fc融合物的表达盒。在治疗后第1、8、22、29、43、50、84和120天对小鼠进行放血，并通过人IgG ELISA测定法确定血清mAb蛋白水平。图88中针对每个启动子示出的条形图各自从第1天到第120天按升序排列。显示了平均hGH-FC表达和SEM。
该数据显示，DNA载体表达盒内的DNA载体启动子元件的身份(identity)和组成的选定变化允许在不使用基因开关或任何其他额外修饰的情况下纵向控制蛋白表达和生物活性的量级。
实施例45
测试11种不同的hGLA DNA载体
本实施例描述了对11种不同的hGLADNA载体的同时测试，结果显示它们随时间产生一系列血清水平。例如，这允许鉴定将hGLA水平维持在1-19ng/ml范围内的载体。第0天，在i.v.注射前两小时用40mg/kg水溶性地塞米松IP预先治疗小鼠的组。脂质体i.v.注射液含有1000nmol的含2.5mol％地塞米松21-棕榈酸酯的DOTAP SUV和含5mol％地塞米松棕榈酸酯/MLV的DMPC MLV中的每一者。两分钟后，将75ug DNA与如图89所示的编码GLA的构建体一起i.v.注射。第二天以及此后每7天或14天对小鼠进行放血，并评估血清的hGLA蛋白产量。结果示于图89中。
实施例46
Fc修饰的蛋白表达
图89a显示多种不同的FC修饰的人GLA cDNA编码的hedges DNA载体在施用后第一天产生治疗性血清hGLA水平(>1ng/ml)。然而，到第8天时(图89b)，只有含有HyFc，特别是含有Hy-Fc 1xL的hGLA DNA载体仍在GLA治疗范围内。到第8天时，所有其他9种Fc修饰的DNA载体均已降至治疗水平以下。这些结果显示，优化Fc杂交DNA载体的Fc部分可以大大提高含有经修饰的Fc的DNA载体的血清半衰期。
图90表明这种Fc修饰具有临床重要性，因为使用这种含有hyFc hGLA的DNA载体在单次hedges DNA载体施用后104天显著增加心脏中的hGLA组织水平。心脏是缺乏GLA的法布里病患者中受损最严重的靶器官之一。对于本实施例，Fc修饰的GLA可以在载体注射后104天以治疗水平在心脏组织中表达：第0天，在i.v.注射前两小时用40mg/kg水溶性地塞米松IP预先治疗小鼠的组。脂质体i.v.注射液含有1000nmol的含2.5mol％地塞米松21-棕榈酸酯的DOTAPSUV和含5mol％地塞米松21-棕榈酸酯的DMPC MLV中的每一者。两分钟后，将75ugDNA与如图91所示的编码带有点突变的GLA-Fc的构建体一起i.v.注射。在注射后第104天处死小鼠。给心脏灌注PBS，然后将心脏移至冰上的裂解缓冲液中。对心脏进行超声处理并且通过Lowry量化蛋白质。将50ug总蛋白装入孔中，并通过ELISA测量GLA。心脏组织表达水平示于图92。
实施例47
各种Fc蛋白突变影响表达
本实施例比较了各种突变的Fc区(示于图91)的GLA-Fc表达。第0天，在i.v.注射前两小时用40mg/kg水溶性地塞米松IP预先治疗小鼠的组。脂质体i.v.注射液含有1000nmol的含2.5mol％地塞米松21-棕榈酸酯的DOTAP SUV和含5mol％地塞米松21-棕榈酸酯的DMPCMLV中的每一者。两分钟后，将75ug DNA与如图91所示的编码带有点突变的GLA的构建体一起i.v.注射。第二天以及此后每7天或14天对小鼠进行放血，并评估血清的hGLA蛋白产量。图91表明经由定点诱变对HyFC-1xL-hGLADNA载体进行靶向性单个或数个DNA碱基修饰允许对杂交Fc DNA载体编码的蛋白功能进行精确靶向性单碱基修饰。
实施例48
低剂量地塞米松的使用
本实施例描述了低剂量地塞米松预先治疗剂的使用不干扰蛋白表达的持久性(并且急性表达可能会增强)。第0天，在i.v.注射前两小时用标示量的(图92)的水溶性地塞米松IP预先治疗25克小鼠的组。脂质体i.v.注射液含有1000nmol的含2.5mol％地塞米松21-棕榈酸酯的DOTAP SUV和含5mol％地塞米松21-棕榈酸酯的DMPC MLV中的每一者。两分钟后，i.v.注射75ug利妥昔单抗生物仿制药表达DNA质粒。第二天以及第8、15和22天对小鼠进行放血。通过商业ELISA确定利妥昔单抗生物仿制药的血清表达，并且将该血清表达以平均值+/-SEM的形式示出。结果示于图92，该图显示游离地塞米松，当以1至40mg/kg的剂量范围预先给药时，各自维持已经高水平的IVDNA载体、长期的蛋白产生，以及它们将关键毒性标志物限制为处于背景对照水平或密切接近背景对照水平的能力。另外，许多最低游离地塞米松剂量在i.v.治疗后第1天在统计学上显著增加利妥昔单抗血清蛋白水平。
本申请中提及的所有出版物和专利均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和组合物的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解所要求保护的本发明不应当不适当地限于此类具体实施方案。实际上，用于进行本发明的所述方式的各种修改对于相关领域技术人员而言是明显的，并且旨在落在在所附权利要求书的范围内。
Claims (142)
1.一种方法，其包括：
a)向受试者施用第一组合物，其中所述第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子；以及
b)在施用所述第一组合物之后向所述受试者施用第二组合物，其中所述第二组合物包含编码至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分和/或重组ACE2的多个一种或多种非病毒表达载体，以及
其中，作为所述施用所述第一和第二组合物的结果，所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分和/或所述重组ACE2在所述受试者中表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中：
A)所述受试者感染SARS-CoV-2病毒，并且其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分，或重组ACE2在所述受试者中以足以降低以下的表达水平表达：i)所述受试者中的SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)所述受试者中由所述SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状；或者
B)所述受试者未感染SARS-CoV-2病毒，并且其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分，或重组ACE2在所述受试者中以足以防止所述受试者感染所述SARS-CoV-2病毒的表达水平表达。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述表达水平在所述受试者中维持至少两周而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次、两次或三次进一步重复，及ii)编码所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或所述ACE2的载体的任何进一步施用。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述表达水平在所述受试者中维持至少一个月而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次、两次或三次进一步重复，及ii)编码所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或所述ACE2的载体的任何进一步施用。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述表达水平在所述受试者中维持至少一年而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次、两次或三次进一步重复，及ii)编码所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或所述ACE2的载体的任何进一步施用。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分在所述受试者中以以下的水平和持续时间表达：i)介于500ng/ml与50ug/ml之间，或10-20ug/ml，持续至少25天，或ii)至少250ng/ml，持续至少25天。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一组合物包含多种脂质体，其中所述脂质体中的至少一些脂质体包含所述阳离子脂质。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述脂质体中的至少一些脂质体包含中性脂质。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述脂质体中所述阳离子脂质与所述中性脂质的比率为95∶05-80∶20或约1∶1。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述阳离子脂质和中性脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰磷酯酰胆碱(DSPC)；氢化或非氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；蛋磷脂酰胆碱(EPC)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油(DSPG)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)；1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐(DPPA)；三甲基铵丙烷脂质；DOTIM(1-[2-9(2)-十八碳烯酰基氧基)乙基]-2-(8(2)-十七碳烯)-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物)脂质；及它们中两种或更多种的混合物。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体包含质粒，其中所述质粒不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体包含编码抗体轻链可变区的第一核酸序列，和编码抗体重链可变区的第二核酸序列，及任选地，编码抗体轻链可变区的第三核酸序列，和编码抗体重链可变区的第四核酸序列。
14.如权利要求1所述的方法，其中：A)所述的其抗原结合部分选自由以下组成的组：Fab′、F(ab)2、Fab和微型抗体，并且/或者B)所述其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分对不同的SARS-CoV-2抗原具有双特异性。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述抗SARS-CoV-2抗体是单克隆抗体或其抗原结合部分，选自由以下组成的组：REGN10933、REGN10987；VIR-7831；LY-CoV1404；LY3853113；Zost2355K；CV07-209K；C121L；Zost2504L；CV38-183L；COVA215K；RBD215；CV07-250L；C144L；COVA118L；C135K；和B38。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包含以下的任何组合中的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种：REGN10933、REGN10987；VIR-7831；LY-CoV1404；LY3853113；Zost2355K；CV07-209K；C121L；Zost2504L；CV38-183L；COVA215K；RBD215；CV07-250L；C144L；COVA118L；C135K；和B38。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分如表7中所述。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包括至少两种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分，所述至少两种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分在所述受试者中以足以降低以下的表达水平表达：i)所述受试者中的所述SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)所述受试者中由所述SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包括至少四种或至少八种或至少11种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分包括至少四种或至少八种或至少11种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分，并且所述至少四种或至少八种或至少11种抗SARS-CoV-2抗体和/或其抗原结合部分在所述受试者中以足以降低以下的表达水平表达：i)所述受试者中的所述SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)所述受试者中由所述SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述施用包括静脉内施用。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述第二组合物在以下时间施用：i)在所述第一组合物之后0.5分钟与80分钟之间，或在所述第一组合物之后约1分钟与20分钟之间。
23.如权利要求1所述的方法，其还包括：c)施用处于所述第一和/或第二组合物中，或存在于第三组合物中的剂，其中与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)增加所述至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的表达水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述剂存在于所述第一组合物中。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述剂存在于所述第三组合物中，并且在所述第一组合物之前至少一小时施用。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述剂是地塞米松脂肪酸酯。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述地塞米松脂肪酸酯具有下式：
其中R1为C5-C23烷基或C5-C23烯基。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述剂以0.01-35mg/ml的浓度存在于所述第一、第二或第三组合物中。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有肺部、心血管和/或多器官炎症。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者佩戴着呼吸机。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和/或第二组合物还包含生理上可耐受的缓冲液或静脉内溶液。
32.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和/或第二组合物还包含乳酸盐林格氏溶液或盐水溶液。
33.如权利要求1所述的方法，其中所述第一组合物包含含有所述聚阳离子结构的脂质体，其中所述脂质体还包含选自由以下组成的组的一种或多种巨噬细胞靶向部分：甘露糖部分、马来酰亚胺部分、叶酸受体配体、叶酸、叶酸受体抗体或其片段、甲酰肽受体配体、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、四肽Thr-Lys-Pro-Arg、半乳糖和乳糖酸。
34.如权利要求1所述的方法，其中所述多个一种或多种非病毒表达载体不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。
35.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。
36.如权利要求1所述的方法，其中0.05-60mg/mL所述表达载体存在于所述第二组合物中。
37.如权利要求1所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质体，所述阳离子脂质体在所述第一组合物中以0.5-100mM的浓度存在。
38.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人，其中：
i)施用一定量的所述第一组合物，使得所述人接受2-50mg/kg剂量的所述聚阳离子结构；以及/或者
ii)施用一定量的所述第二组合物，使得所述人接受0.05-60mg/kg剂量的所述表达载体。
39.如权利要求1所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质体，其中所述阳离子脂质体还包含脂质双层整合肽和/或靶肽。
40.如权利要求39所述的方法，其中：i)所述脂质双层整合肽选自由以下组成的组：表面活性蛋白D(SPD)、表面活性蛋白C(SPC)、表面活性蛋白B(SPB)和表面活性蛋白A(SPA)，并且ii)所述靶肽选自由以下组成的组：微管相关序列(MTAS)、核定位信号(NLS)、ER分泌肽、ER保留肽和过氧物酶体肽。
41.如权利要求1所述的方法，其中在初始步骤b)之后1与60天之间重复步骤a)和b)。
42.如权利要求1所述的方法，其中所述非病毒表达载体中的每一种均包含5,500个与30,000个之间的核酸碱基对。
43.如权利要求1所述的方法，其还包括：向所述受试者施用抗病毒剂。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述抗病毒剂包括瑞德西韦或包含ACE2受体的至少一部分的蛋白。
45.如权利要求1所述的方法，其还包括：向所述受试者施用抗炎剂和/或抗凝血剂。
46.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体是不合CPG的或CPG减少的。
47.一种系统，其包括：
a)第一容器；
b)处于所述第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中所述第一组合物不合或基本上不合核酸分子；
c)第二容器；和
d)处于所述第二容器内部并且包含编码至少一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或ACE2蛋白的多个一种或多种非病毒表达载体的第二组合物。
48.如权利要求47所述的系统，其还包含这样的剂，与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)当施用于受试者时，增加所述至少一种SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分或所述ACE2蛋白的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。
49.如权利要求48所述的系统，其中所述剂以0.01-35mg/ml的浓度存在于所述第一、第二或第三组合物中。
50.如权利要求48所述的系统，其中所述剂存在于所述第一组合物和/或所述第二组合物中。
51.如权利要求48所述的系统，其还包括第三容器，并且其中所述剂存在于所述第三容器中。
52.一种使至少三种不同的抗体或其抗原结合部分在受试者中同时表达的方法，其包括：
a)向受试者施用第一组合物，其中所述第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中所述第一组合物不合或基本上不合核酸分子；以及
b)在施用所述第一组合物之后向所述受试者施用第二组合物，其中所述第二组合物包含编码至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的多个一种或多种非病毒表达载体，以及
其中，作为所述施用所述第一和第二组合物的结果，所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分在所述受试者中同时表达。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自在所述受试者中以至少100ng/ml的水平表达。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自在所述受试者中以至少100ng/ml的水平表达至少25天。
55.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分在所述受试者中以至少200ng/ml的水平表达。
56.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分在所述受试者中以至少200ng/ml的水平表达至少25天。
57.如权利要求52所述的方法，其中：
A)所述三种不同的抗体或其抗原结合部分中的每一种的所述表达水平在所述受试者中维持至少两周，或至少3周，无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的载体的任何进一步施用；
B)重复步骤a)和步骤b)至少一次或至少两次。
58.如权利要求52所述的方法，其中所述表达水平在所述受试者中维持至少两周，或至少3周，无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次或两次进一步重复，及ii)编码所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的载体的任何进一步施用。
59.如权利要求52所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质。
60.如权利要求52所述的方法，其中所述第一组合物包含多种脂质体，其中所述脂质体中的至少一些脂质体包含所述阳离子脂质。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述脂质体中的至少一些脂质体包含中性脂质。
62.如权利要求60所述的方法，其中所述脂质体中所述阳离子脂质与所述中性脂质的比率为95∶05-80∶20或约1∶1。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述阳离子脂质和中性脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰磷酯酰胆碱(DSPC)；氢化或非氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；蛋磷脂酰胆碱(EPC)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油(DSPG)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)；1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐(DPPA)；三甲基铵丙烷脂质；DOTIM(1-[2-9(2)-十八碳烯酰基氧基)乙基]-2-(8(2)-十七碳烯)-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物)脂质；及它们中两种或更多种的混合物。
64.如权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体包含质粒或合成质粒，其中所述质粒和合成质粒不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。
65.如权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体包括三种非病毒表达载体。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述三种非病毒表达载体中的每一种编码不同的抗体或其抗原结合片段。
67.如权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体包括六种非病毒表达载体。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述六种非病毒表达载体中的每一种编码不同的抗体轻链可变区或重链可变区。
69.如权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体包含各自编码抗体轻链可变区的第一、第二和第三核酸序列，及各自编码抗体重链可变区的第四、第五和第六核酸序列。
70.如权利要求52所述的方法，其中所述的其抗原结合部分选自由以下组成的组：Fab′、F(ab)2、Fab和微型抗体。
71.如权利要求52所述的方法，其中：i)所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种是抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分，或ii)所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种对SARS-CoV-2具有特异性并且至少一种对甲型流感病毒具有特异性，并且/或者至少一种对乙型流感病毒具有特异性。
72.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分包含以下的任何组合中的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或更多种：REGN10933、REGN10987；VIR-7831；LY-CoV1404；LY3853113；Zost 2355K；CV07-209K；C121L；Zost 2504L；CV38-183L；COVA215K；RBD215；CV07-250L；C144L；COVA118L；C135K；5J8和B38。
73.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自对SARS-CoV-2是完全或大体上中和的。
74.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分各自对选自由以下组成的组的病毒是完全或大体上中和的：HIV、甲型流感、乙型流感和疟疾。
75.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种是选自表4、表5和/或表7的抗体或其抗原结合部分。
76.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分包括至少四种不同的抗体或其抗原结合部分。
77.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分包括至少六种不同的抗体或其抗原结合部分。
78.如权利要求52所述的方法，其中所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分包括至少十一种不同的抗体或其抗原结合部分。
79.如权利要求52所述的方法，其中所述施用包括静脉内施用。
80.如权利要求52所述的方法，其中所述第二组合物在以下时间施用：i)在所述第一组合物之后0.5分钟与80分钟之间，或在所述第一组合物之后约1分钟与20分钟之间。
81.如权利要求52所述的方法，其还包括：c)施用处于所述第一和/或第二组合物中，或存在于第三组合物中的剂，其中与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)增加所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种的表达水平，并且/或者ii)增加所述三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种的所述表达的时间长度。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述剂存在于所述第一组合物中。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述剂存在于所述第三组合物中，并且在所述第一组合物之前至少一小时施用。
84.如权利要求81所述的方法，其中所述剂是地塞米松脂肪酸酯。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述地塞米松脂肪酸酯具有下式：
其中R1为C5-C23烷基或C5-C23烯基。
86.如权利要求81所述的方法，其中所述剂以0.01-35mg/ml的浓度存在于所述第一、第二或第三组合物中。
87.如权利要求52所述的方法，其中所述第一和/或第二组合物还包含生理上可耐受的缓冲液或静脉内溶液。
88.如权利要求52所述的方法，其中所述第一和/或第二组合物还包含乳酸盐林格氏溶液或盐水溶液。
89.如权利要求52所述的方法，其中所述第一组合物包含含有所述聚阳离子结构的脂质体，其中所述脂质体还包含选自由以下组成的组的一种或多种巨噬细胞靶向部分：甘露糖部分、马来酰亚胺部分、叶酸受体配体、叶酸、叶酸受体抗体或其片段、甲酰肽受体配体、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、四肽Thr-Lys-Pro-Arg、半乳糖和乳糖酸。
90.如权利要求52所述的方法，其中所述多个一种或多种非病毒表达载体不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。
91.如权利要求52所述的方法，其中所述受试者是人。
92.如权利要求52所述的方法，其中0.05-60mg/mL所述表达载体存在于所述第二组合物中。
93.如权利要求52所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质体，所述阳离子脂质体在所述第一组合物中以0.5-100mM的浓度存在。
94.如权利要求52所述的方法，其中所述受试者是人，其中：
i)施用一定量的所述第一组合物，使得所述人接受2-50mg/kg剂量的所述聚阳离子结构；以及/或者
ii)施用一定量的所述第二组合物，使得所述人接受0.05-60mg/kg剂量的所述表达载体。
95.如权利要求52所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质体，其中所述阳离子脂质体还包含脂质双层整合肽和/或靶肽。
96.如权利要求94所述的方法，其中：i)所述脂质双层整合肽选自由以下组成的组：表面活性蛋白D(SPD)、表面活性蛋白C(SPC)、表面活性蛋白B(SPB)和表面活性蛋白A(SPA)，并且ii)所述靶肽选自由以下组成的组：微管相关序列(MTAS)、核定位信号(NLS)、ER分泌肽、ER保留肽和过氧物酶体肽。
97.如权利要求52所述的方法，其中在初始步骤b)之后1与60天之间重复步骤a)和b)至少一次。
98.如权利要求52所述的方法，其中所述非病毒表达载体中的每一种均包含5,500个与30,000个之间的核酸碱基对。
99.如权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种非病毒表达载体是不合CPG的或CPG减少的。
100.一种系统，其包括：
a)第一容器；
b)处于所述第一容器内部并且包含聚阳离子结构的第一组合物，其中所述第一组合物不合或基本上不合核酸分子；
c)第二容器；和
d)处于所述第二容器内部并且包含编码至少三种不同的抗体或其抗原结合部分的多个一种或多种非病毒表达载体的第二组合物。
101.如权利要求99所述的系统，其还包含这样的剂，与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)当施用于受试者时，增加所述至少三种不同的抗体或其抗原结合部分中的至少一种的表达的水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。
102.如权利要求100所述的系统，其中所述剂以0.01-35mg/ml的浓度存在于所述第一、第二或第三组合物中。
103.如权利要求100所述的系统，其中所述剂存在于所述第一组合物和/或所述第二组合物中。
104.如权利要求100所述的系统，其还包括第三容器，并且其中所述剂存在于所述第三容器中。
105.一种方法，其包括：
a)向受试者施用第一组合物，其中所述第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中所述第一组合物不含或基本上不合核酸分子；以及
b)在施用所述第一组合物之后向所述受试者施用第二组合物，其中所述第二组合物包含编码人生长激素(hGH)和/或与半衰期延长肽连接的hGH(hGH-ext)的多个非病毒表达载体，以及
其中，作为所述施用所述第一和第二组合物的结果，所述hGH在所述受试者中表达。
106.如权利要求104所述的方法，其中所述hGH和/或hGH-ext在所述受试者中以至少1ng/ml的血清表达水平表达。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述表达水平在所述受试者中维持至少两周而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码所述hGH或hGH-ext的载体的任何进一步施用。
108.如权利要求105所述的方法，其中所述表达水平在所述受试者中维持至少一个月而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码所述hGH或hGH-ext的载体的任何进一步施用。
109.如权利要求105所述的方法，其中所述表达水平在所述受试者中维持至少一年而无需：i)步骤a)和b)的任何进一步重复或仅一次进一步重复，及ii)编码所述hGH或hGH-ext的载体的任何进一步施用。
110.如权利要求104所述的方法，其中所述多个非病毒表达载体编码所述hGH-ext，并且其中所述半衰期延长肽选自由以下组成的组：Fc区肽、血清白蛋白、人绒毛膜促性腺激素b-亚基的羧基端肽(CTP)和XTEN(参见，Schellenberger等人，Nat Biotechnol.2009年12月；27(12)：1186-90)。
111.如权利要求104所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质。
112.如权利要求110所述的方法，其中所述第一组合物包含多种脂质体，其中所述脂质体中的至少一些脂质体包含所述阳离子脂质。
113.如权利要求110所述的方法，其中所述脂质体中的至少一些脂质体包含中性脂质。
114.如权利要求112所述的方法，其中所述脂质体中所述阳离子脂质与所述中性脂质的比率为95∶05-80∶20或约1∶1。
115.如权利要求112所述的方法，其中所述阳离子脂质和中性脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰磷酯酰胆碱(DSPC)；氢化或非氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；蛋磷脂酰胆碱(EPC)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油(DSPG)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)；1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐(DPPA)；三甲基铵丙烷脂质；DOTIM(1-[2-9(2)-十八碳烯酰基氧基)乙基]-2-(8(2)-十七碳烯)-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物)脂质；及它们中两种或更多种的混合物。
116.如权利要求104所述的方法，其中所述表达载体包含质粒，其中所述质粒不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。
117.如权利要求104所述的方法，其中所述施用包括静脉内施用。
118.如权利要求104所述的方法，其中所述第二组合物在以下时间施用：i)在所述第一组合物之后0.5分钟与80分钟之间，或在所述第一组合物之后约1分钟与20分钟之间。
119.如权利要求104所述的方法，其还包括：c)施用处于所述第一和/或第二组合物中，或存在于第三组合物中的剂，其中与未向所述受试者施用所述剂时相比，所述剂：i)增加所述hGH和/或hGH-ext的表达水平，并且/或者ii)增加所述表达的时间长度。
120.如权利要求116所述的方法，其中所述剂存在于所述第一组合物中。
121.如权利要求116所述的方法，其中所述剂存在于所述第三组合物中，并且在所述第一组合物之前至少一小时施用。
122.如权利要求117所述的方法，其中所述剂是地塞米松脂肪酸酯。
123.如权利要求119所述的方法，其中所述地塞米松脂肪酸酯具有下式：
其中R1为C5-C23烷基或C5-C23烯基。
124.如权利要求116所述的方法，其中所述剂以0.01-35mg/ml的浓度存在于所述第一、第二或第三组合物中。
125.如权利要求104所述的方法，其中所述第一和/或第二组合物还包含生理上可耐受的缓冲液或静脉内溶液。
126.如权利要求104所述的方法，其中所述第一和/或第二组合物还包含乳酸盐林格氏溶液或盐水溶液。
127.如权利要求104所述的方法，其中所述第一组合物包含含有所述聚阳离子结构的脂质体，其中所述脂质体还包含选自由以下组成的组的一种或多种巨噬细胞靶向部分：甘露糖部分、马来酰亚胺部分、叶酸受体配体、叶酸、叶酸受体抗体或其片段、甲酰肽受体配体、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、四肽Thr-Lys-Pro-Arg、半乳糖和乳糖酸。
128.如权利要求104所述的方法，其中所述多个非病毒表达载体不附接至任何递送剂或封装在任何递送剂中。
129.如权利要求104所述的方法，其中所述受试者是人。
130.如权利要求104所述的方法，其中0.05-60mg/mL所述表达载体存在于所述第二组合物中。
131.如权利要求104所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质体，所述阳离子脂质体在所述第一组合物中以0.5-100mM的浓度存在。
132.如权利要求104所述的方法，其中所述受试者是人，其中：
i)施用一定量的所述第一组合物，使得所述人接受2-50mg/kg剂量的所述聚阳离子结构；以及/或者
ii)施用一定量的所述第二组合物，使得所述人接受0.05-60mg/kg剂量的所述表达载体。
133.如权利要求104所述的方法，其中所述聚阳离子结构包含阳离子脂质体，其中所述阳离子脂质体还包含脂质双层整合肽和/或靶肽。
134.如权利要求130所述的方法，其中：i)所述脂质双层整合肽选自由以下组成的组：表面活性蛋白D(SPD)、表面活性蛋白C(SPC)、表面活性蛋白B(SPB)和表面活性蛋白A(SPA)，并且ii)所述靶肽选自由以下组成的组：微管相关序列(MTAS)、核定位信号(NLS)、ER分泌肽、ER保留肽和过氧物酶体肽。
135.如权利要求104所述的方法，其中在初始步骤b)之后1与60天之间重复步骤a)和b)。
136.如权利要求104所述的方法，其中所述非病毒表达载体中的每一种均包含5,500个与30,000个之间的核酸碱基对。
137.如权利要求104所述的方法，其中所述非病毒表达载体是不含CPG的或CPG减少的。
138.一种方法，其包括：
a)向动物模型施用第一组合物，其中所述第一组合物包含聚阳离子结构，并且其中所述第一组合物不含或基本上不含核酸分子，并且
其中所述动物模型感染SARS-CoV-2；以及
b)在施用所述第一组合物之后向所述动物模型施用第二组合物，其中所述第二组合物包含编码第一和第二抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的多个一种或多种非病毒表达载体，并且
其中，作为所述施用所述第一和第二组合物的结果，所述第一和第二候选抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分在所述动物模型中表达；以及
c)确定所述第一和第二候选抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合部分的所述表达使以下发生的程度：i)降低所述动物模型中的所述SARS-CoV-2病毒载量，和/或ii)降低所述动物模型中由所述SARS-CoV-2感染引起的至少一种症状。
139.如权利要求135所述的方法，其中所述多个一种或多种非病毒表达载体还编码第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一候选抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段。
140.如权利要求135所述的方法，其中所述动物模型选自：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、灵长类动物、猴子、黑猩猩或兔。
141.如权利要求135所述的方法，其中所述第一抗体和抗SARS-CoV2抗体或其抗原结合部分来自表7。
142.如权利要求135所述的方法，其中所述第一和第二抗SARS-CoV2抗体或其抗原结合部分选自由以下组成的组：REGN10933、REGN10987；VIR-7831；LY-CoV1404；LY3853113；Zost2355K；CV07-209K；C121L；Zost2504L；CV38-183L；COVA215K；RBD215；CV07-250L；C144L；COVA118L；C135K；和B38。
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