CN116602962A - Ppar激动剂在制备治疗滤泡性淋巴瘤的药物中的应用 - Google Patents

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CN116602962A CN202310762733.8A CN202310762733A CN116602962A CN 116602962 A CN116602962 A CN 116602962A CN 202310762733 A CN202310762733 A CN 202310762733A CN 116602962 A CN116602962 A CN 116602962A
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查洁
周辉
鲁先平
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Shenzhen Chipscreen Biosciences Co Ltd
First Affiliated Hospital of Xiamen University
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Abstract

本发明涉及PPAR激动剂在制备治疗滤泡性淋巴瘤的药物中的应用；所述PPAR激动剂选自西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐中的任意一种。本发明开发了西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐的药物新用途，其在分子水平能够抑制滤泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma,FL)细胞株的细胞周期，其能够激活FL细胞中PPARα的蛋白表达，PPARα激活后与转录因子FOXM1启动子区结合，进而抑制FOXM1及其下游靶基因C‑MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的表达，最终抑制了FL发生发展进程。

Description

PPAR激动剂在制备治疗滤泡性淋巴瘤的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及PPAR激动剂尤其是西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐在制备治疗滤泡性淋巴瘤的药物中的应用。
背景技术
滤泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma，FL)通常是一种由转化的滤泡中心B细胞组成的惰性B细胞淋巴增生性疾病。滤泡性淋巴瘤的特点是弥漫性淋巴结病变、骨髓受累和脾肿大。FL患者一般表现为无症状的淋巴结病变，病情可反复波动或恶性转化，约70％的患者有骨髓受累。(参见Jacobsen E.Follicular lymphoma:2023update on diagnosis andmanagement.Am J Hematol.2022Dec；97(12):1638-1651.)。复发的FL患者有广泛的治疗选择，包括一些化疗免疫治疗方案、磷酸肌肽3-激酶抑制剂和来那度胺加利妥昔单抗。然而，尽管前线治疗有所改善，传统的FL治疗仍无法治愈，在化学免疫治疗后的最初2年内，仍有约20％的患者会出现难治性或早期复发。细胞周期调控作为肿瘤细胞增殖的重要调控机制，细胞周期蛋白抑制剂能够阻碍肿瘤细胞周期进展，从而抑制肿瘤细胞增殖水平。
西格列他钠(Chiglitazar)是我国深圳微芯生物科技股份有限公司自主设计合成、并具有全新化学结构和全球知识产权保护的糖尿病治疗药物，具有PPARα、PPARδ和PPARγ全激活作用，属于新一代胰岛素增敏剂，主要用于2型糖尿病的治疗(参见Cheng HS,TanWR,Low ZS,Marvalim C,Lee JYH,Tan NS.Exploration and Development of PPARModulators in Health and Disease:An Update of Clinical Evidence.Int J MolSci.2019Oct 11；20(20):5055)。
但是，西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐能否用于滤泡性淋巴瘤的治疗以及其与滤泡性淋巴瘤相关细胞株的作用机制尚不清楚。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供PPAR激动剂尤其是西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐在制备治疗滤泡性淋巴瘤的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供PPAR激动剂在制备治疗滤泡性淋巴瘤的药物中的应用；所述PPAR激动剂选自西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐中的任意一种。
本发明开发了西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐的药物新用途，证明了其在分子水平能够抑制滤泡性淋巴瘤细胞株的细胞周期，其能够激活FL细胞中PPARα的蛋白表达，PPARα激活后与转录因子FOXM1启动子区结合，进而抑制FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的表达，抑制FL细胞的细胞增殖与周期进展，最终抑制了FL发生发展进程，其示意图如图10所示。同时其在细胞水平能够抑制滤泡性淋巴瘤细胞株的增殖以及诱导其细胞凋亡水平；其在动物实验中通过CDX小鼠模型还证明了西格列他钠能够抑制小鼠滤泡性淋巴瘤的成瘤进程。本发明为研究滤泡性淋巴瘤的治疗策略提供了理论依据，为制备新的治疗滤泡性淋巴瘤的药物提供了一个嵌入点。
在本发明中，所述PPAR激动剂抑制滤泡性淋巴瘤细胞的增殖。
在本发明中，所述PPAR激动剂诱导滤泡性淋巴瘤细胞的凋亡。
在本发明中，所述PPAR激动剂抑制滤泡性淋巴瘤细胞的克隆形成。
优选地，所述药学上可接受的盐为碱金属盐、碱土金属盐、铵盐或季铵盐中的任意一种。
优选地，所述药学上可接受的盐为碱金属盐。
优选地，所述药学上可接受的盐为钠盐或钾盐。
在本发明中，所述PPAR激动剂下调转录因子FOXM1及其与细胞周期相关基因的表达水平。
优选地，所述与细胞周期相关基因包括CyclinB1、C-MYC、CyclinD1或CyclinE1中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物中还含有其他活性成分。该其他活性成分可以与西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐产生协同作用，也可以二者产生相加作用，以不对西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐产生拮抗作用为宜。
第二方面，本发明还提供PPAR激动剂在制备滤泡性淋巴瘤细胞株增殖抑制剂、滤泡性淋巴瘤细胞株凋亡促进剂或滤泡性淋巴瘤细胞株细胞周期阻滞剂中的应用；所述PPAR激动剂选自西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐中的任意一种。
优选地，所述滤泡性淋巴瘤细胞株包括SC-1细胞、Karpas 422细胞或RL细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明还提供PPAR激动剂在制备具有抑制滤泡性淋巴瘤细胞株增殖、促进滤泡性淋巴瘤细胞株凋亡的功效的试剂中的应用。
根据本发明的研究结果发现，西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐具有抑制滤泡性淋巴瘤细胞株增殖、促进滤泡性淋巴瘤细胞株凋亡的作用，因为其也能够作为一种单独的科研类试剂用于基础科学研究，例如用于探究滤泡性淋巴瘤细胞的相关机制。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明开发了西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐的药物新用途，证明了其在分子水平能够抑制滤泡性淋巴瘤细胞株的细胞周期，下调转录因子FOXM1及其与细胞周期相关基因CyclinB1、C-MYC、CyclinD1或CyclinE1的表达水平，从而抑制滤泡淋巴瘤的进程，其示意图如图10所示；其在细胞水平能够抑制滤泡性淋巴瘤细胞株的增殖以及诱导其细胞凋亡水平；其在动物实验中通过CDX小鼠模型还证明了西格列他钠能够抑制小鼠滤泡性淋巴瘤的成瘤进程。本发明为研究滤泡性淋巴瘤的治疗策略提供了理论依据，为制备新的治疗滤泡性淋巴瘤的药物提供了一个嵌入点。
附图说明
图1A为西格列他钠处理SC-1细胞24h和48h后的细胞增殖抑制率结果图；
图1B为西格列他钠处理Karpas 422细胞24h和48h后的细胞增殖抑制率结果图；
图1C为西格列他钠处理RL细胞24h和48h后的细胞增殖抑制率结果图；
图2A为西格列他钠处理SC-1细胞24h和48h后的细胞凋亡水平流式检测结果图；
图2B为西格列他钠处理SC-1细胞24h和48h后细胞的凋亡率统计结果图；
图2C为西格列他钠处理Karpas 422细胞24h和48h后的细胞凋亡水平流式检测结果图；
图2D为西格列他钠处理Karpas 422细胞24h和48h后细胞的凋亡率统计结果图；
图2E为西格列他钠处理RL细胞24h和48h后的细胞凋亡水平流式检测结果图；
图2F为西格列他钠处理RL细胞24h和48h后细胞的凋亡率统计结果图；
图3A为西格列他钠处理SC-1细胞后细胞周期在G1期、S期与G2期的细胞百分比统计结果图；
图3B为西格列他钠处理Karpas 422细胞后细胞周期在G1期、S期与G2期的细胞百分比统计结果图；
图3C为西格列他钠处理RL细胞后细胞周期在G1期、S期与G2期的细胞百分比统计结果图；
图4A为不同浓度的西格列他钠处理SC-1细胞的克隆形成图；
图4B为不同浓度的西格列他钠处理SC-1细胞的克隆形成统计结果图；
图4C为不同浓度的西格列他钠处理Karpas 422细胞的克隆形成图；
图4D为不同浓度的西格列他钠处理Karpas 422细胞的克隆形成统计结果图；
图4E为不同浓度的西格列他钠处理RL细胞的克隆形成图；
图4F为不同浓度的西格列他钠处理RL细胞的克隆形成统计结果图；
图5A为不同浓度的西格列他钠处理SC-1细胞24h后的Western blot结果图；
图5B为不同浓度的西格列他钠处理Karpas 422细胞24h后的Western blot结果图；
图5C为不同浓度的西格列他钠处理RL细胞24h后的Western blot结果图；
图6A为不同浓度的西格列他钠处理SC-1细胞24h后转录因子FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1表达水平的Western blot结果图；
图6B为不同浓度的西格列他钠处理Karpas 422细胞24h后转录因子FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1表达水平的Western blot结果图；
图6C为不同浓度的西格列他钠处理RL细胞24h后转录因子FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1表达水平的Western blot结果图；
图7A为不同浓度的西格列他钠处理SC-1细胞24h后转录因子FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的mRNA水平统计图；
图7B为不同浓度的西格列他钠处理Karpas 422细胞24h后转录因子FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的mRNA水平统计图；
图7C为不同浓度的西格列他钠处理RL细胞24h后转录因子FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的mRNA水平统计图；
图8A为西格列他钠处理SC-1细胞48h后激活的PPARα富集于转录因子FOXM1的启动子区结果图；
图8B为西格列他钠处理RL细胞48h后激活的PPARα富集于转录因子FOXM1的启动子区结果图；
图8C为293T细胞转染24h后PPARα转录抑制FOXM1的表达结果图；
图9A为将西格列他钠注射SC-1细胞皮下移植瘤CDX小鼠模型后第10天时的肿瘤取材图；
图9B为将西格列他钠注射SC-1细胞皮下移植瘤CDX小鼠模型后在第0天、第5天和第10天时的肿瘤体积统计图；
图9C为将西格列他钠注射SC-1细胞皮下移植瘤CDX小鼠模型后第10天时的肿瘤重量统计图；
图9D为将西格列他钠注射RL细胞皮下移植瘤CDX小鼠模型后第10天时的肿瘤取材图；
图9E为将西格列他钠注射RL细胞皮下移植瘤CDX小鼠模型后在第0天、第5天和第10天时的肿瘤体积统计图；
图9F为将西格列他钠注射RL细胞皮下移植瘤CDX小鼠模型后第10天时的肿瘤重量统计图；
图10为本发明中西格列他钠抑制FL发生发展的作用机制示意图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
下述实施例所涉及的药物西格列他钠由深圳微芯生物科技股份有限公司提供。
实施例1西格列他钠抑制滤泡性淋巴瘤(FL)细胞株增殖水平
取1×104对数生长期FL细胞株SC-1、Karpas 422与RL细胞分别接种于96孔细胞培养板中，其中SC-1、Karpas 422与RL细胞株由厦门大学医学院血液学研究所提供；
对照组用DMSO处理细胞，实验组的西格列他钠浓度梯度设置为5μM、10μM、20μM、30μM和40μM；
分别在处理24h以及48h后用CCK8试剂盒检测细胞增殖水平。
所得细胞增殖水平结果如图1A、图1B、图1C所示；
使用西格列他钠分别处理SC-1、Karpas 422与RL细胞24h和48h后，检测得到的西格列他钠的IC50值如下表1所示：
表1
结合上述结果可知，西格列他钠能够抑制FL细胞的增殖水平，并且表现出时间与浓度的依赖性；随着处理浓度和处理时间的增加，其抑制率逐渐上升。
实施例2西格列他钠诱导滤泡性淋巴瘤(FL)细胞株发生凋亡
取1×105对数生长期FL细胞株SC-1、Karpas 422与RL分别接种于24孔细胞培养板中；
对照组用DMSO处理细胞，实验组的西格列他钠浓度梯度设置为2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM；
处理24h和48h后用Annexin V/PI流式染色法检测细胞凋亡水平并统计细胞凋亡率。
图2A和图2B为使用不同浓度的西格列他钠处理SC-1细胞，在24h和48h后的细胞凋亡水平流式检测结果以及凋亡率统计结果；
图2C和图2D为使用不同浓度的西格列他钠处理Karpas 422细胞，在24h和48h后的细胞凋亡水平流式检测结果以及凋亡率统计结果；
图2E和图2F为使用不同浓度的西格列他钠处理RL细胞，在24h和48h后的细胞凋亡水平流式检测结果以及凋亡率统计结果；
由上述结果可知，西格列他钠诱导FL细胞发生凋亡，提高FL细胞的凋亡水平，且呈现浓度依赖性。
实施例3西格列他钠阻滞滤泡性淋巴瘤(FL)细胞株的细胞周期
取1×105FL细胞株SC-1、Karpas 422与RL分别接种于24孔细胞培养板中；
对照组用DMSO处理细胞，西格列他钠浓度为5μM、10μM、20μM；
处理48h后，300g离心5min收集细胞，PBS洗一次，75％酒精4℃固定过夜，用PI染色15min后流式检测分析细胞周期的阻滞情况。
所得结果如图3A、图3B、图3C所示，由图可知，使用西格列他钠处理FL细胞株之后，相比对照组，其G1期细胞数量明显上升，G2细胞数量明显下降，说明西格列他钠能够阻滞FL细胞周期进程。
实施例4西格列他钠抑制滤泡性淋巴瘤(FL)细胞株的细胞克隆形成
取1×104FL细胞株SC-1、Karpas 422与RL细胞分别接种于24孔细胞培养板中；
对照组用DMSO处理细胞，西格列他钠浓度为5μM、10μM、20μM；
处理72h，细胞计数后取每孔1000个细胞铺板，待形成克隆后用MTT(噻唑蓝)染色拍照。
所得结果如图4A、图4B、图4C、图4D、图4E与图4F所示，由图可知，使用西格列他钠处理FL细胞株之后，相比对照组，克隆细胞数显著减少，说明西格列他钠能够抑制FL细胞的克隆形成，且呈现浓度依赖性。
实施例5西格列他钠对PPAR蛋白水平的影响
取5×105对数生长期的FL细胞株SC-1、Karpas 422与RL细胞分别接种于六孔板细胞培养皿中；
对照组用DMSO处理细胞，实验组的西格列他钠浓度设置为5μM、10μM与20μM；
处理24h后，300g离心5min收集细胞，裂解液冰置裂解1h，提取总蛋白进行Westernblot，检测PPARα、PPARγ以及PPARδ蛋白水平表达；
所得结果如图5A、图5B和图5C所示，由图可知，不同浓度的西格列他钠处理SC-1、Karpas 422与RL细胞24h后，PPARα表达上调，PPARγ以及PPARδ表达未明显上调。
该结果表明，在SC-1、Karpas 422与RL细胞中西格列他钠主要激活PPARα的蛋白表达。
实施例6西格列他钠对滤泡性淋巴瘤(FL)细胞株的FOXM1及其下游靶基因表达的影响
取5×105对数生长期的FL细胞株SC-1、Karpas 422与RL细胞分别接种于六孔板细胞培养皿中；
对照组用DMSO处理细胞，西格列他钠浓度分别为5μM、10μM、20μM与30μM；
处理24h后300g离心5min收集细胞，取一半细胞用200μL RIPA裂解液冰置裂解1h，提取总蛋白进行Western blot，检测FOXM1及其下游靶基因蛋白水平表达；
另一半细胞加500μL Trizol试剂，用RNA提取试剂盒提取得到总RNA，进一步用反转录试剂盒进行反转录实验得到总cDNA，最后设计引物进行RT-PCR检测FOXM1及其下游靶基因在mRNA水平的表达情况；
SC-1细胞所得结果如图6A以及图7A所示，不同浓度的西格列他钠处理后蛋白表达水平的Western blot结果显示，FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1的表达量明显下降；同时通过反转录实验可知，FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的mRNA水平表达明显下调。
同样地，Karpas 422细胞所得结果如图6B以及图7B所示，不同浓度的西格列他钠处理后蛋白表达水平的Western blot结果显示，FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1的表达量明显下降；同时通过反转录实验可知，FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的mRNA水平表达明显下调。
同样地，RL细胞所得结果如图6C以及图7C所示，不同浓度的西格列他钠处理后蛋白表达水平的Western blot结果显示，FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1的表达量明显下降；同时通过反转录实验可知，FOXM1及其下游靶基因C-MYC、CyclinD1、CyclinE1及CyclinB1等的mRNA水平表达明显下调。
实施例7西格列他钠激活PPARα后抑制FOXM1的转录活性
首先，取1×107对数生长期的FL细胞株SC-1与RL分别接种于10cm细胞培养皿中；
对照组用DMSO处理细胞，实验组的西格列他钠浓度设置为10μM；
处理48h后，用甲醛固定细胞后离心收集细胞，加500μL RIPA裂解液超声破碎细胞，分成两份分别加入IGg和PPARα的抗体，与超声后的靶蛋白-DNA复合物相互结合，过夜孵育；
次日加入Protein A/G beads，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，清洗沉淀后洗脱，解交联后纯化富集得到DNA片断，进行荧光定量qPCR分析；
所得结果如图8A与图8B所示，由图可知，西格列他钠能激活PPARα蛋白的表达，且PPARα富集至转录因子FOXM1的启动子区。
其次，取2×105对数生长期的293T细胞接种于24孔板细胞培养皿中；
待贴壁后转染3×flag-PPARα(0，200ng，400ng，800ng)、R-LUC与FOXM1-LUC质粒，24小时后检测荧光素酶活性。
所得结果如图8C所示，由图可知，PPARα能与FOXM1启动子区结合并抑制FOXM1的转录表达。
该结果表明，西格列他钠激活的PPARα能富集至FOXM1的启动子区，抑制FOXM1的基因转录活性。
实施例8西格列他钠抑制滤泡性淋巴瘤(FL)细胞移植瘤的成瘤进程
收集1×106对数生长期FL细胞株SC-1细胞与RL细胞皮下注射到CB17小鼠体内进行皮下移植瘤；
待成瘤后通过游标卡尺测量移植瘤的大小，按15mg/kg/day剂量给药10天，以给药起始日记为0天并于10天后处死取材，拍照称重，统计实验结果。
SC-1细胞所得结果如图9A、图9B与图9C所示，由图可知，西格列他钠能够明显抑制皮下移植瘤的成瘤进程。RL细胞所得结果如图9D、图9E与图9F所示，由图可知，西格列他钠能够明显抑制皮下移植瘤的成瘤进程。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的载药纳米复合纤维膜系统及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.PPAR激动剂在制备治疗滤泡性淋巴瘤的药物中的应用；
所述PPAR激动剂选自西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为碱金属盐、碱土金属盐、铵盐或季铵盐中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为碱金属盐。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为钠盐或钾盐。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PPAR激动剂下调转录因子FOXM1及其与细胞周期相关基因的表达水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述与细胞周期相关基因包括CyclinB1、C-MYC、CyclinD1或CyclinE1中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
9.PPAR激动剂在制备滤泡性淋巴瘤细胞株增殖抑制剂、滤泡性淋巴瘤细胞株凋亡促进剂或滤泡性淋巴瘤细胞株细胞周期阻滞剂中的应用；
所述PPAR激动剂选自西格列羧或其左旋体异构体、晶型、无定形或药学上可接受的盐中的任意一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述滤泡性淋巴瘤细胞株包括SC-1细胞、Karpas 422细胞或RL细胞中的任意一种或至少两种的组合。
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