CN116602898A - 一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用，复活草提取物发酵液的制备方法包括步骤：将低共熔溶剂、复活草粉末与水混合后进行超声处理，得到粗提物；将粗提物投入培养基发酵体系中，并向培养基发酵体系中加入枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液，经发酵处理、离心、过滤、除菌后，得到复活草提取物发酵液。利用该制备方法得到的复活草提取物发酵液具有控油防脱作用，对5α‑还原酶有抑制作用，对DHT刺激毛乳头细胞TGF‑β2基因有抑制作用；护发方面，有防断发、抚平毛鳞片的作用；护肤方面，该复活草提取物发酵液对成纤维细胞的I型胶原蛋白和弹性蛋白有促分泌作用。

Description

一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用。
背景技术
复活草，又名做还阳草或还魂草，也被称为耶利哥的玫瑰，一般指卷柏(卷柏科卷柏属植物)。文献中已有报到，卷柏中主要是黄酮、多糖类物质，其次还有生物碱、有机酸等；卷柏具有抗炎、抗脂质过氧化及清除自由基的作用，还有免疫调节及抑制绿脓杆菌作用。
目前，市面上复活草原料主要用传统溶剂法进行提取，或者用复活草粉末进行发酵，除菌过滤得到复活草/卷柏发酵液；而传统提取方式的提取效率低、溶剂影响，存在能耗高等问题。CN111135123A是干燥卷柏粉末用布氏乳杆菌进行发酵，存在微生物未能将卷柏中极性和非极性功效成分都提取出来的问题。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用，旨在解决现有方法对复活草的提取效率低以及提取不完全的问题。
本发明的技术方案如下：
一种复活草提取物发酵液的制备方法，包括步骤：
将低共熔溶剂、复活草粉末与水混合后进行超声处理，得到粗提物；
将所述粗提物投入培养基发酵体系中，并向所述培养基发酵体系中加入枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液，经发酵处理、离心、过滤、除菌后，得到复活草提取物发酵液。
所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其中，所述低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，所述低共熔溶剂的氢键给体选自苹果酸、乳酸、乙酰丙酸中的一种。
所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其中，所述氢键受体与所述氢键给体的摩尔比为1:(0.5～2)。
所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其中，所述超声处理的温度为30～40℃；所述超声处理的功率为30kHz。
所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其中，按质量百分比计，所述低共熔溶剂、所述复活草粉末和所述水的比例为(2-10)％:(1-10)％:(80-90)％。
所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其中，所述培养基发酵体系包括蛋白胨、牛肉浸膏、KH2PO4、K2HPO4、葡萄糖、柠檬酸钠。
所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其中，所述培养基发酵体系中，所述蛋白胨的浓度为4.5-5.5g/L，所述牛肉浸膏的浓度为2.5-3.5g/L，所述KH2PO4的浓度为2.0-2.6g/L，所述K2HPO4的浓度为12-13g/L，所述葡萄糖的浓度为8-12g/L，所述柠檬酸钠的浓度为0.8-1.2g/L。
所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其中，所述发酵处理的温度为36-38℃，所述发酵处理的时间为24-30h。
一种复活草提取物发酵液，利用复活草提取物发酵液的制备方法制得。
一种复活草提取物发酵液在制备洗护用品中的应用。
有益效果：本发明提供一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用，复活草提取物发酵液的制备方法包括步骤：将低共熔溶剂、复活草粉末与水混合后进行超声处理，得到粗提物；将所述粗提物投入培养基发酵体系中，并向所述培养基发酵体系中加入枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液，经发酵处理、离心、过滤、除菌后，得到复活草提取物发酵液。本发明通过利用低共熔溶剂(DES)作为提取复活草有效成分的溶剂，可将植物中的极性成分和非极性成分进行全成分萃取，不但效率高、用时少，而且能耗低；然后经低共熔溶剂提取得到的粗提物再经枯草芽胞杆菌发酵后，得到的复活草提取物发酵液中的氨基酸和多糖含量提高。利用该制备方法得到的复活草提取物发酵液具有控油防脱作用，对5α-还原酶有抑制作用，对DHT刺激毛乳头细胞TGF-β2基因有抑制作用；护发方面，有防断发、抚平毛鳞片的作用；护肤方面，该复活草提取物发酵液对成纤维细胞的I型胶原蛋白和弹性蛋白有促分泌作用。
附图说明
图1为本发明一种复活草提取物发酵液制备方法的工艺流程示意图；
图2为实施例7的防断发测试结果数据图；
图3为实施例8的干梳测试结果数据图；
图4为实施例8的毛鳞片修护结果扫描电镜测试图；
图5为实施例9的5α-还原酶抑制结果数据图；
图6为实施例11的I型胶原蛋白测试结果数据图；
图7为实施例11的弹性蛋白测试结果数据图。
具体实施方式
本发明提供一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
如图1所示，本发明提供一种复活草提取物发酵液的制备方法，包括步骤：
步骤S10：将低共熔溶剂、复活草粉末与水混合后进行超声处理，得到粗提物；
步骤S20：将所述粗提物投入培养基发酵体系中，并向所述培养基发酵体系中加入枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液，经发酵处理、离心、过滤、除菌后，得到复活草提取物发酵液。
本实施方式中，利用低共熔溶剂(DES)会加速溶解植物细胞的细胞壁，促使活性成分流出，在不破坏植物成分结构下，进行与目标活性成分形成一种新的体系，实现活性成分的靶向高效萃取。将所述复活草粉末中的极性成分和非极性成分进行全成分萃取，然后再利用枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)及发酵体系对萃取得到的粗提物进行发酵，将大分子的活性物质分解为小分子活性物，更利于皮肤吸收且提升活性成分的水溶性和稳定性，使得所述复活草提取物发酵液氨基酸含量和多糖含量提高。经验证，采用该制备方法得到的复活草提取物发酵液具有控油防脱作用，对5α-还原酶有抑制作用，对DHT刺激毛乳头细胞TGF-β2基因有抑制作用；在护发方面，有防断发、抚平毛鳞片的作用；在护肤方面，复活草提取物发酵液对成纤维细胞的I型胶原蛋白和弹性蛋白有促分泌作用。
进一步地，所述枯草芽胞杆菌枯草亚种编号为CICC 24713，源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，枯草芽孢杆菌具有抗逆性、耐高温高压、较强的耐酸碱等生物特性，且在化妆品已使用原料目录表中有芽孢杆菌发酵产物，枯草芽孢杆菌更适合用于化妆品原料发酵。
在一些实施方式中，所述步骤S10前，还包括对复活草进行预处理，得到复活草粉末，具体包括步骤：将复活草利用清水洗净晾干后，在40℃下进行烘干处理，然后用粉碎机对烘干后的复活草进行打粉过筛，得到复活草粉末。其中，所述烘干处理的时间至少2天。先对复活草进行烘干打粉过筛，有利于提高复活草与所述低共熔溶剂的接触面积，提高溶剂对复活草中有效成分的提取效率。
在一些实施方式中，所述低共熔溶剂的氢键受体可以为但不限于甜菜碱，所述低共熔溶剂的氢键给体选自但不限于苹果酸、乳酸、乙酰丙酸中的一种。利用低共熔溶剂可以将复活草中的极性成分和非极性成分进行全成分萃取，并且具有效率高、用时少和能耗低的优点。
具体地，所述低共熔溶剂选自甜菜碱苹果酸、甜菜碱乳酸、甜菜碱乙酰丙酸中的一种，可提高对复活草中有效成分的提取效率。
在一些实施方式中，所述氢键受体与所述氢键给体的摩尔比为1:(0.5～2)，按该比例合成的低共熔溶剂在对复活草中的有效成分进行提取时，具有效率高、用时少以及能耗低的特点，提高溶剂对复活草中有效成分的提取率。
在一些优选地实施方式中，所述氢键受体与所述氢键给体的摩尔比为1:1，可在节省原材料的情况下合成低共熔溶剂，节约成本。
在一些实施方式中，所述低共熔溶剂在常温(25±2℃)下合成，转速3000-5000rpm/min，用乙醇水溶液溶解前驱体，全部溶解后进行旋蒸，将乙醇水溶液蒸干。以甜菜碱苹果酸DES为例，甜菜碱、苹果酸即为其前驱体，先用乙醇水溶解、反应后是液体，要把水和乙醇蒸掉。
在一些实施方式中，所述超声处理的温度为30～40℃；所述超声处理的功率为30kHz。利用超声处理，可提高所述低共熔溶剂对复活草中有效成分的提取效果，实现对复活草中的极性成分和非极性成分进行全成分提取。
在一些实施方式中，按质量百分比计，所述低共熔溶剂、所述复活草粉末和所述水的比例为(2-10)％:(1-10)％:(80-90)％，按该比例混合得到的体系进行超声处理时，可以使得复活草中有效成分得以充分被萃取。
在一些实施方式中，所述枯草芽胞杆菌枯草亚种需先进行种子活化处理，种子活化处理的条件为：蛋白胨浓度为5g/L、牛肉浸膏浓度为3g/L、NaCl浓度为5g/L、溶剂为去离子水，pH＝7，培养温度为35-37℃，培养时间为12-48h，转速为100-250rpm，获得对数生长中期的种子液，即所述枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液。利用所述枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液对DES提取的复活草提取液进行发酵处理，可以得到氨基酸含量高和多糖含量高的复活草提取液发酵液。
在一些优选地实施方式中，所述种子活化处理的培养温度为37℃，培养时间为16h，转速为220rpm。
在一些实施方式中，所述培养基发酵体系包括蛋白胨、牛肉浸膏、KH2PO4、K2HPO4、葡萄糖、柠檬酸钠。
在一些实施方式中，所述培养基发酵体系中，所述蛋白胨的浓度为4.5-5.5g/L，所述牛肉浸膏的浓度为2.5-3.5g/L，所述KH2PO4的浓度为2.0-2.6g/L，所述K2HPO4的浓度为12-13g/L，所述葡萄糖的浓度为8-12g/L，所述柠檬酸钠的浓度为0.8-1.2g/L；按上述浓度配制得到的培养基发酵体系可以给菌种提供C、N源，提供营养成分。
在一些实施方式中，所述发酵处理的温度为36-38℃，所述发酵处理的时间为24-30h。
在一种优选地实施方式中，摇瓶发酵培养基发酵体系中，所述蛋白胨的浓度为5g/L，所述牛肉浸膏的浓度为3g/L，所述KH2PO4的浓度为2.3g/L，所述K2HPO4的浓度为12.5g/L，所述葡萄糖的浓度为10g/L，所述柠檬酸钠的浓度为1g/L；种子液以5％的接种量接入瓶中，发酵温度为37℃，发酵时间为24-30h，发酵结束后用陶瓷膜进行过滤，再进行超滤、纳滤、脱臭，得到复活草提取物发酵液。
具体地，所述枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液的加入量占所述培养基发酵体系总量的5％。
除此之外，本发明还提供一种复活草提取物发酵液，利用所述复活草提取物发酵液的制备方法制得。
本实施方式中，利用所述复活草提取物发酵液的制备方法制得的复活草提取物发酵液含有复活草中极性成分和非极性成分，且利用DES和发酵处理结合的方式，得到的发酵液中氨基酸和多糖含量较高，使得其功能性更好。
另外，本发明还提供一种复活草提取物发酵液在制备洗护用品中的应用。
本实施方式中，复活草发酵液有控油防脱作用，对5α-还原酶有抑制作用，对DHT刺激毛乳头细胞TGF-β2基因有抑制作用；护发方面，有防断发、抚平毛鳞片的作用；护肤方面，发现复活草发酵液对成纤维细胞的I型胶原蛋白和弹性蛋白有促分泌作用。
在一些实施方式中，所述复活草提取物发酵液在制备洗护防脱用品中的应用。
在一些实施方式中，所述复活草提取物发酵液在制备护肤用品中的应用。
下面进一步举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
实施例1
复活草清水洗净晾干后，在40℃下烘干2天后，用粉碎机打粉后过筛，得到复活草粉末。将甜菜碱和苹果酸按摩尔比为1:1的比例合成DES；向DES中加入复活草粉末和去离子水进行混合得到混合悬浊液；该混合悬浊液按质量百分比计，DES 10wt％、复活草粉末5wt％、余量为去离子水。
所述混合悬浊液在37℃下超声提取10min后，进行过滤后，得到粗提物。发酵摇瓶加入培养基，培养基中蛋白胨浓度为5g/L，牛肉浸膏浓度为3g/L，KH2PO4浓度为2.3g/L，K2HPO4浓度为12.5g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/，摇瓶加入占培养基总量的5％的种子液，加入复活草DES粗提物。进行28h发酵培养。上清液用陶瓷膜进行过滤、纳滤，除去菌体和离子盐等物质，脱臭后得到复活草提取物发酵液。
实施例2
复活草清水洗净晾干后，在40℃下烘干2天后，用粉碎机打粉后过筛，得到复活草粉末。将甜菜碱和乳酸按摩尔比为1:1的比例合成DES；向DES中加入复活草粉末和去离子水进行混合得到混合悬浊液；该混合悬浊液按质量百分比计，DES 10wt％、复活草粉末5wt％、余量为去离子水。
所述混合悬浊液在37℃下超声提取10min后，进行过滤后，得到粗提物。发酵摇瓶加入培养基，培养基中蛋白胨浓度为5g/L，牛肉浸膏浓度为3g/L，KH2PO4浓度为2.3g/L，K2HPO4浓度为12.5g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/，摇瓶加入占培养基总量的5％的种子液，加入复活草DES粗提物。进行28h发酵培养。上清液用陶瓷膜进行过滤、纳滤，除去菌体和离子盐等物质，脱臭后得到复活草提取物发酵液。
实施例3
复活草清水洗净晾干后，在40℃下烘干2天后，用粉碎机打粉后过筛，得到复活草粉末。将甜菜碱和乙酰丙酸按摩尔比为1:1的比例合成DES；向DES中加入复活草粉末和去离子水进行混合得到混合悬浊液；该混合悬浊液按质量百分比计，DES 10wt％、复活草粉末5wt％、余量为去离子水。
所述混合悬浊液在37℃下超声提取10min后，进行过滤后，得到粗提取。发酵摇瓶加入培养基，培养基的蛋白胨浓度为5g/L，牛肉浸膏浓度为3g/L，KH2PO4浓度为2.3g/L，K2HPO4浓度为12.5g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/，摇瓶加入占培养基总量的5％的种子液，加入复活草DES粗提物。进行28h发酵培养。上清液用陶瓷膜进行过滤、纳滤，除去菌体和离子盐等物质，脱臭后得到复活草提取物发酵液。
实施例4
复活草清水洗净晾干后，在40℃下烘干2天后，用粉碎机打粉后过筛，得到复活草粉末。将甜菜碱和苹果酸按摩尔比为1:1的比例合成DES；向DES中加入复活草粉末和去离子水进行混合得到混合悬浊液；该混合悬浊液按质量百分比计，DES 10wt％、复活草粉末3wt％、余量为去离子水。
所述混合悬浊液在37℃下超声提取10min后，进行过滤后，得到粗提物。发酵摇瓶加入培养基，培养基的蛋白胨浓度为5g/L，牛肉浸膏浓度为3g/L，KH2PO4浓度为2.3g/L，K2HPO4浓度为12.5g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/，摇瓶加入占培养基总量的5％的种子液，加入复活草DES粗提物。进行28h发酵培养。上清液用陶瓷膜进行过滤、纳滤，除去菌体和离子盐等物质，脱臭后得到复活草提取物发酵液。
对比例1
复活草清水洗净晾干后，在40℃下烘干2天后，用粉碎机打粉后过筛。加入占培养基总量的5％复活草粉末，发酵摇瓶加入培养基，培养基的蛋白胨浓度为5g/L，牛肉浸膏浓度为3g/L，KH2PO4浓度为2.3g/L，K2HPO4浓度为12.5g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/，摇瓶加入占培养基总量的5％的种子液。进行28h发酵培养。上清液用陶瓷膜进行过滤、纳滤，除去菌体和离子盐等物质，脱臭后得到复活草发酵液。
对比例2
复活草清水洗净晾干后，在40℃下烘干2天后，用粉碎机打粉后过筛。加入5％复活草粉末，其余为溶剂去离子水，37℃超声提取10min后，进行过滤后。上清液用陶瓷膜进行过滤，脱臭后得到复活草提取物。
实施例5(氨基酸含量测试)
参考标准《NY/T 1975-2010水溶肥料游离氨基酸含量的测定》
对实施例1-4及对比例1-2样品进行氨基酸含量测试，取2mL于10mL离心管或试管中，准确加入2mL磺基水杨酸溶液，混匀，放置1h。准确加入1mL EDTA-Na溶液和1mL盐酸溶液，混匀，离心15min。吸取上清液1mL，蒸干。准确加入2mL柠檬酸钠缓冲液溶解，加入氨基酸自动分析仪进行测试，实施例1-4和对比例1-2的氨基酸含量如表1所示。
由表1结果可知，不同的DES提取、传统水提及粉末发酵的氨基酸含量可知，甜菜碱苹果酸提取复活草后再进行发酵的原料游离氨基酸含量最高，其次为甜菜碱乳酸>甜菜碱乙酰丙酸>粉末发酵>传统水提。且从投料复活草比例进行探究，3％和5％对比，投料DES提取的5％复活草粗提物的游离氨基酸浓度更高。
实施例6(总多糖含量测试)
参考标准《DB12/T 884-2019百合鳞茎中多糖的含量测定紫外/可见分光光度法》。
实施例1-4及对比例1-2样品进行总多糖含量测试，将1mL的各待测样品置于试管中，再分别加入蒽酮试剂4mL盖上盖子，沸水浴10min，再用流水冷却至室温，在波长626nm处测定各试管溶液吸光值，根据其吸光值在标曲计算样品含多糖浓度c，再计算回所稀释倍数X，即得样品多糖含量。其多糖标准品曲线数据如表2所示，实施例1-4和对比例1-2的多糖含量数据如表3所示。
样品多糖含量：
式中：C为样品多糖含量，mg/mL；
c为实验浓度样品多糖含量，μg/mL；
X为样品稀释倍数。
由表3可知，不同的DES提取、传统水提及粉末发酵的总多糖含量可知，甜菜碱苹果酸提取复活草后再进行发酵的原料总多糖含量最高，其次为甜菜碱乙酰丙酸>甜菜碱乳酸>粉末发酵>传统水提。且从投料复活草比例进行探究，3％和5％对比，投料DES提取的5％复活草粗提物的总多糖浓度更高。
实施例7(防断发测试结果)
以实施例1的复活草提取物发酵液按表4配方打样，进行防断发测试。
随机选取2束相同的扁平发束(2.5g，15cm，健康发束)，于恒温恒湿20-22℃，40-60％RH，平衡24h。洗净发束后，擦拭多余水分，取0.5g样品涂抹于发丝，受样1min，然后用水流冲洗30s，共操作1次。对照组发片则用清水按照上述流程操作。将离体发放置在恒温恒湿环境自然晾干24h。24h后，使用发束测试仪测量单根头发断裂。
用SPSS软件进行正态分布的显著性检验，若样品组数据sig.(双侧)>0.01，则呈正态分布，进行配对样本t检验，检验水准α＝0.05；否则，进行秩和检验，分析使用测试样品处理前后对比的改善百分比，其结果如表5和图2所示。
由表5可知，使用复活草提取物发酵液护发精华处理1次后的发束和清水处理1次后的发束相比，样品处理后的发束(50根头发)断裂力显著性提升(P<0.001)，其防断发能力相比清水提升了40.95％，说明复活草提取物发酵液护发精华具有防断发的效果。
实施例8(干梳、毛鳞片损伤)
干梳测试
头发多功能测试系统(MTT175，Dia-Stron，英国)是一个功能齐全的头发测试系统。测试时，梳理测试仪器上端的夹子1将发束垂直固定，夹子2固定梳子使梳子可随移动桥移动，通过设定仪器参数，使梳子均速向下垂直梳理发束，通过计算可得出从开始到梳理测试结束所做的功，即梳理功，通常测定发束在干燥、湿润状态下的梳理功。通过测试6束发束(20cm，3g)使用样品前、后干梳梳理功的变化，来评价样品对头发梳理性能的改善情况。
毛鳞片修护测试
扫描电镜(Apreo2CSEM)的工作原理是由电子枪发射出来直径为50um(微米)的电子束，在加速电压的作用下经过磁透镜系统会聚，形成直径为5nm(纳米)的电子束，聚焦在样品表面上，在第二聚光镜和物镜之间偏转线圈的作用下,电子束在样品上做光栅状扫描，同时同步探测入射电子和研究对象相互作用后从样品表面散射出来的电子和光子，获得相应材料的表面形貌和成分分析。
用SPSS软件进行正态分布的显著性检验，其结果如表6和表7所示，且干梳测试结果数据图如图3所示。
本项目以离体真人发束作为测试材料，测试离体发束干梳梳理功和毛鳞片扫描电镜成像的变化，评价测试样品的护发、修护毛鳞片的功效。
若样品使用后于梳梳理功与使用前对比显著降低(P<0.05)，则认为该产品具有护发的功效；若从扫描电镜图片看，使用后毛鳞片翘起现象改善，更贴合毛干，则认为该产品具有修护毛鳞片损伤的功效。
干梳梳理功，用于评价样品对头发梳理性能的改善情况：毛鳞片扫描电镜成像图片，用于评价样品对头发毛鳞片的改善效果。
干梳梳理功测试结果显示，在使用测试样品前、后，发束的干梳梳理功分别为0.01835J、0.01503J，与使用前相比，使用样品后受损离体真人发束的干梳梳理功显著降低(P<0.05)。
由图4的毛鳞片修护结果扫描电镜测试图显示，与使用前相比，在使用测试样品后头发毛鳞片更贴合毛干，毛鳞片翘起现象得到改善。
综上所述，复活草提取物发酵液护发精华具有提升受损离体真人发束梳理性的护发功效和修复毛鳞片的功效。
实施例9(5α-还原酶抑制)
II型5α-还原酶的制备：取雄性大鼠10只，禁食不禁水过夜后脱颈椎处死，取出前列腺于冰台上剪碎。于0℃下用预冷的缓冲液在玻璃匀浆器制成1:5匀浆，3000g离心10min，取上清液10000g离心30min，取上清分装至EP管中，每管1mL，即为酶提取物，-80℃冰箱保存。
II型5α-还原酶活性测定：在2mL反应体系中含有:磷酸盐缓冲液0.25mL，酶提取物0.70mL，睾酮溶液(0.5mg/mL)0.1mL，NADPH溶液(1mg/mL)0.35mL，(完全反应组中为10％乙醇，阳性对照组中为非那雄胺，样品组中为样品溶液)0.6mL。对照组将酶提取物替换为磷酸缓冲液，并加入2.0mL二氯甲烷终止反应；完全反应组、阳性组和样品组在37℃下反应30min，反应结束后加入20mL
二氯甲烷使反应停止，震荡1min后5000r/min离心10min。去除上层水相，移出约1.0mL有机相并蒸干，残留物溶于10mL甲醇，采用高效液相色谱法测定睾酮峰面积(T)。每个反应设3个平行管。由以下公式进行计算，5α-还原酶抑制结果如图5和表8所示。
经统计分析，与完全反应组对比，阳性组睾酮平均峰面积升高，对II型5α-还原酶抑制率为73.55％，具有统计学差异(P<0.05)，样品在80％，50％(v/v)浓度下睾酮平均峰面积升高，对II型5α-还原酶抑制率分别为31.02％、61.76％，具有统计学差异(P<0.05)，具有防脱功效。
实施例10(毛乳头细胞TGF-β2基因抑制)
1)测试方案如表9所示
2)细胞接种：按1.1×104个/孔接种密度接种毛乳头细胞至6孔板中，(37℃，CO2)培养箱孵育过夜。
3)DHT刺激及给药：根据测试方案(表9)，待6孔板中细胞铺板率达到50～60％左右时，进行给药和对有DHT刺激条件的组别进行DHT刺激，结束后置于(37℃，CO2)培养箱中孵育培养24h。
4)收集细胞：培养24h后，收集细胞上清后，1mL/孔PBS清洗两次，每孔加入1mLRNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。
5)基因表达检测：提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
6)结果统计分析：应用GraphPad Prism Program软件作图，各组间采用t-test统计分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，其结果如表10所示。
备注：采用2-△△CT方法进行结果计算，用t-test方法进行统计分析时，将BC组mRNA扩增倍数归一处理，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；PC组(阳性对照组)和样品组与BC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
与BC组相比，NC组TGFβ2基因的表达量明显提升，说明本次测试刺激条件有效；与NC组相比，PC组TGFβ2基因的表达量明显下调，说明本次阳性对照测试有效；与NC组相比，样品复活草提取物发酵液-8％、复活草提取物发酵液-4％、复活草提取物发酵液-2％对基因TGFβ2的表达量有明显的下调作用，下调率分别为51.31％、42.30％、38.01％。
实施例11(I型胶原和弹性蛋白测试)
(1)细胞铺板：以2.2*105个/孔的密度接种细胞至6孔板，过夜贴壁。
(2)配液：根据测试方案(表11)分别配制受试物工作液。
(3)根据表11测试方案，待6孔板中细胞融合率达到40％～60％时，进行分组加药，每孔加样2mL，每组3个复孔，作用24h。
(4)UVA刺激：除BC对照组别外，其余组别进行辐射。30J/cm2UVA照射人皮肤成纤维细胞。刺激结束后，孵育24h。
(5)收集细胞上清液，采用ELISA试剂盒测定Elastin、I型胶原蛋白含量，其结果如表12和表13所示，且I型胶原蛋白测试结果数据图和弹性蛋白测试结果数据图分别如图6和图7所示。
与BC组相比，NC组的Elastin蛋白含量显著下降，说明本次测试刺激条件有效。
与NC组相比，PC(TGF-β1)组的Elastin蛋白含量显著上升，说明本次测试阳性对照有效。样品复活草提取物发酵液在0.625％的浓度下，Elastin蛋白含量显著上升，认为样品复活草提取物发酵液在该浓度下，通过提升Elastin蛋白含量达到紧致功效。
*统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；P＞0.05，表示无统计学差异；0.01＜P＜0.05，有显著性差异；P＜0.01，非常有显著性差异；P＜0.001，极显著性差异。与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
与BC组相比，NC组的Ⅰ型胶原蛋白含量显著下降，说明本次测试阴性对照检测有效。
与NC组相比，PC(TGF-β1)组的Ⅰ型胶原蛋白含量含量上调率≥20％，说明本次测试阳性对照检测有效。复活草提取物发酵液(0.625％)的I型胶原蛋白含量上调率为179.54％，则有促进I型胶原蛋白合成的能力，可达到抗皱功效。
实施例12(安全性测试)
农残测试参考标准GB/T 39665-2020《含植物提取物类化妆品中55种禁用农残留量的测定》，多次皮肤刺激性试验参考标准《化妆品安全技术规范》(2015年版)第六章，斑贴测试参考《化妆品安全技术规范》(2015年版)，其结果如表13、表14和表15所示。
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综上所述，本发明提供的一种复活草提取物发酵液及其制备方法与应用，复活草提取物发酵液的制备方法包括步骤：将低共熔溶剂、复活草粉末与水混合后进行超声处理，得到粗提物；将所述粗提物投入培养基发酵体系中，并向所述培养基发酵体系中加入枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液，经发酵处理、离心、过滤、除菌后，得到复活草提取物发酵液。本发明通过利用低共熔溶剂(DES)作为提取复活草有效成分的溶剂，可将植物中的极性成分和非极性成分进行全成分萃取，不但效率高、用时少，而且能耗低；然后经低共熔溶剂提取得到的粗提物再经枯草芽胞杆菌发酵后，得到的复活草提取物发酵液中的氨基酸和多糖含量提高。利用该制备方法得到的复活草提取物发酵液具有控油防脱作用，对5α-还原酶有抑制作用，对DHT刺激毛乳头细胞TGF-β2基因有抑制作用；护发方面，有防断发、抚平毛鳞片的作用；护肤方面，该复活草提取物发酵液对成纤维细胞的I型胶原蛋白和弹性蛋白有促分泌作用。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将低共熔溶剂、复活草粉末与水混合后进行超声处理，得到粗提物；
将所述粗提物投入培养基发酵体系中，并向所述培养基发酵体系中加入枯草芽胞杆菌枯草亚种菌液，经发酵处理、离心、过滤、除菌后，得到复活草提取物发酵液。
2.根据权利要求1所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，所述低共熔溶剂的氢键受体为甜菜碱，所述低共熔溶剂的氢键给体选自苹果酸、乳酸、乙酰丙酸中的一种。
3.根据权利要求2所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，所述氢键受体与所述氢键给体的摩尔比为1:(0.5～2)。
4.根据权利要求1所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，所述超声处理的温度为30～40℃；所述超声处理的功率为30kHz。
5.根据权利要求1所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，按质量百分比计，所述低共熔溶剂、所述复活草粉末和所述水的比例为(2-10)％:(1-10)％:(80-90)％。
6.根据权利要求1所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，所述培养基发酵体系包括蛋白胨、牛肉浸膏、KH2PO4、K2HPO4、葡萄糖、柠檬酸钠。
7.根据权利要求6所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，所述培养基发酵体系中，所述蛋白胨的浓度为4.5-5.5g/L，所述牛肉浸膏的浓度为2.5-3.5g/L，所述KH2PO4的浓度为2.0-2.6g/L，所述K2HPO4的浓度为12-13g/L，所述葡萄糖的浓度为8-12g/L，所述柠檬酸钠的浓度为0.8-1.2g/L。
8.根据权利要求1所述的复活草提取物发酵液的制备方法，其特征在于，所述发酵处理的温度为36-38℃，所述发酵处理的时间为24-30h。
9.一种复活草提取物发酵液，其特征在于，利用如权利要求1-8任一项所述的复活草提取物发酵液的制备方法制得。
10.一种如权利要求9所述的复活草提取物发酵液在制备洗护用品中的应用。
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