CN116600636A - 植物酸性转化酶活化剂的制造方法、植物酸性转化酶活化剂及植物酸性转化酶活化方法 - Google Patents

植物酸性转化酶活化剂的制造方法、植物酸性转化酶活化剂及植物酸性转化酶活化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其包含准备修饰蓝细菌的步骤(步骤S01)，所述修饰蓝细菌的在蓝细菌中参与外膜(5)与细胞壁(4)的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；以及使所述修饰蓝细菌分泌参与植物的酸性转化酶的活化的分泌物的步骤(步骤S02)。

Description

植物酸性转化酶活化剂的制造方法、植物酸性转化酶活化剂 及植物酸性转化酶活化方法
技术领域
本公开涉及具有使植物的酸性转化酶活化的效果的天然代谢产物即植物酸性转化酶活化剂的制造方法、植物酸性转化酶活化剂及植物酸性转化酶活化方法。
背景技术
伴随着因世界人口增加的对粮食增产的要求，要求开发出用于通过有限的耕地高效地生产作物的技术。用于以作物增收为目标的方法大致分为将光、温湿度及土壤成分等环境因素控制为适于作物生长的条件的方法(即进行环境控制的方法)、和基因重组技术的利用、或通过添加生理活性物质等人为地控制植物的细胞生理而促进生长的方法(即进行细胞生理的控制的方法)。
作为进行细胞生理的控制的方法之一，已知有基于基因重组的转化酶的活性控制(非专利文献1)。转化酶是将蔗糖(sucrose)分解为葡萄糖和果糖的酶，深入参与通过在叶中进行的光合作用而生成的蔗糖向植物体各器官的流转、分配和蓄积。转化酶根据其最适pH的不同大致分为中性转化酶和酸性转化酶。酸性转化酶中有部分地存在于细胞壁的细胞壁转化酶、以及部分地存在于液泡内的液泡转化酶这2种。已知在转化酶中，特别是酸性转化酶活性与作物产量密切相关。例如，非专利文献2中公开了通过利用基因重组技术使液泡转化酶活化，棉花的棉纤维生产得到增进。另外，非专利文献3中公开了对于稻穗的生长而言液泡转化酶活性是必须的。另外，例如非专利文献4和5中公开了如下内容：通过基因重组技术使玉米和大豆的细胞壁转化酶活化，大豆的产量和玉米的产量增加，各自的籽实的含有糖分增加。由此，期待开发出通过人为地使酸性转化酶活化来提高农作物的生产率的技术。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Roitsch，T.and M.C.Gonzalez(2004)."Function and regulationof plant invertases：sweet sensations."Trends in Plant Science 9(12)：606-613.
非专利文献2：Wang，L.，et al.(2010)."Evidence that high activity ofvacuolar invertase is required for cotton fiber and Arabidopsis rootelongation through osmotic dependent and independent pathways，respectively."Plant Physiology，154(2)：744-756.
非专利文献3：Morey，S.R.，et al.(2018)."Genetic Evidence for the Role ofa Rice Vacuolar Invertase as a Molecular Sink Strength Determinant."Rice 11.
非专利文献4：Tang，X.，et al.(2017)."Suppression of extracellularinvertase inhibitor gene expression improves seed weight in soybean(Glycinemax)."Journal of Experimental Botany 68(3)：469-482.
非专利文献5：Li，B.，et al.(2013)."Constitutive expression of cellwallinvertase genes increases grain yield and starch content in maize."PlantBiotechnology Journal 11(9)：1080-1091.
发明内容
发明所要解决的课题
然而，使酸性转化酶活化的方法目前仅限于利用基因重组技术的方法，因此存在难以实用化的问题。这是因为，世界各国针对基因重组技术的法律法规、以及生产者及消费者对于将基因重组技术施用(以下也称为应用或使用)于植物的心理上的抗拒感大大妨碍了上述技术的社会实现。因此，需要寻求一种不使用基因重组技术而通过来自外部的刺激(例如将某些物质从外部添加给植物)来活化作物的酸性转化酶的方法。
因此，本公开提供一种简便且高效地制造使植物的酸性转化酶活化的植物酸性转化酶活化物质的方法。另外，本公开提供一种能够有效地使植物的酸性转化酶活化的植物酸性转化酶活化剂、以及植物酸性转化酶活化方法。
用于解决课题的手段
本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法包含：准备修饰蓝细菌的步骤，该修饰蓝细菌的在蓝细菌(cyanobacteria)中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；以及使所述修饰蓝细菌分泌参与植物的酸性转化酶的活化的分泌物的步骤。
发明效果
根据本公开的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，能够简便且高效地制造使植物的酸性转化酶活化的植物酸性转化酶活化剂。另外，根据本公开的植物酸性转化酶活化剂，能够有效地使植物的酸性转化酶活化。另外，根据本公开的植物酸性转化酶活化方法，通过将本公开的植物酸性转化酶活化剂用于植物，能够有效地使植物的酸性转化酶活化。
附图说明
图1是表示实施方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法的一例的流程图。
图2是示意性地表示蓝细菌的细胞表层的图。
图3是实施例1的修饰蓝细菌的超薄切片的透射型电子显微镜图像。
图4是图3的虚线区域A的放大图像。
图5是实施例2的修饰蓝细菌的超薄切片的透射型电子显微镜图像。
图6是图5的虚线区域B的放大图像。
图7是比较例1的修饰蓝细菌的超薄切片的透射型电子显微镜图像。
图8是图7的虚线区域C的放大图像。
图9是表示实施例1、实施例2和比较例1的修饰蓝细菌在培养液中的蛋白量(n＝3、误差条＝SD)的图表。
图10是表示实施例3和比较例2中栽培的菠菜的酸性转化酶活性的平均值的图表。
图11是表示实施例3和比较例2中栽培的每1株菠菜的地上部分干燥重量的平均值的图表。
图12是表示实施例4和比较例3中栽培的草莓的酸性转化酶活性的平均值的图表。
图13是表示实施例4和比较例3中栽培的每1株草莓的平均果实数的图表。
图14是表示实施例4和比较例3中栽培的每1株草莓的平均果实重量的图表。
图15是表示实施例4和比较例3中栽培的每1株草莓的平均糖度的图表。
图16是表示实施例4和比较例3各自的代表性的果实的状态的图。
具体实施方式
(成为本公开的基础的见解)
如背景技术中所述，要求有用于在有限的耕地中高效地生产作物的技术。作为为此的方法，期待有使植物的酸性转化酶活化的技术。
作为使植物的酸性转化酶活化的技术，公开了以下的现有技术。
例如，在非专利文献2中报告了通过使用35S启动子使棉花的液泡转化酶基因高表达，促进棉纤维的伸长。
另外，例如非专利文献4中报告了通过RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)干扰法抑制阻碍大豆的细胞壁转化酶活性的基因的表达，使细胞壁转化酶活化。具体而言，报告了通过将该技术应用于大豆，大豆每1粒的重量增加，每1株的收获重量增加，进而每1粒大豆的含有糖分增加。
另外，例如非专利文献5中报告了通过使用35S启动子使玉米的细胞壁转化酶基因高表达，玉米的产量增加。另外，还报告了每1粒籽实的含有糖分增加。
然而，使植物的酸性转化酶活化的方法目前仅限于利用基因重组技术的方法，因此存在难以实用化的问题。这是因为，世界各国针对基因重组技术的法律法规、以及生产者及消费者对于将基因重组技术应用于植物的心理上的抗拒感大大妨碍了上述技术的社会实现。因此，强烈要求有一种不使用基因重组技术而通过将某些物质从外部添加给植物，从而使作物的酸性转化酶活化的方法。此外，近年来，由于对防止地球变暖和降低环境负荷等对环境考虑的意识正在蔓延，因此在施用中期望充分利用环境负荷少的天然来源的物质。其中，特别期望该物质的制造时施用化石能源的消耗量少、环境负荷更少的天然来源的物质。
作为用于有助于农作物的生产率提高的天然来源物质的制造的微生物，本发明者们着眼于蓝细菌。蓝细菌(cyanobacteria，也称为蓝色细菌或蓝藻)是真细菌的一组，通过光合作用将水分解而产生氧，通过得到的能量将空气中的CO2固定。蓝细菌根据种类的不同，也可以固定空气中的氮(N2)。如此，由于蓝细菌能够由空气、水以及光得到菌体生长所需要的原料(即养分)和大部分能量，因此能够通过廉价的原料以简便的工艺培养蓝细菌。
另外，作为蓝细菌的特性，已知生长快、光利用效率高，除此之外，与其他藻类种类相比，基因操作容易，因此在光合微生物中，有关利用了蓝细菌的物质生产，进行了活跃的研究开发。例如，作为使用了蓝细菌的物质生产的例子，报告有乙醇、异丁醇、烷烃类、以及脂肪酸(专利文献1：日本专利第6341676号公报)等燃料的生产。另外，还进行了与成为生物的营养源的物质的生产相关的研究开发。例如，由于蛋白只能在生物中合成，因此要求开发出简便且高效地生产蛋白的技术。作为该技术中使用的生物种中的1种，期待充分利用能够利用光能和大气中的CO2的蓝细菌，并进行了活跃的研究开发(非专利文献6：Jie Zhou etal.，“Discovery of a super-strong promoter enable efficient production ofheterologous proteins in cyanobacteria”，Scientific Reports，Nature Research，2014，Vol.4，Article No.4500)。
例如，如果使用非专利文献6中记载的技术对蓝细菌的基因进行任意修饰，则能够在蓝细菌的细胞内(以下也称为菌体内)产生所期望的化合物和蛋白。但是，由于在蓝细菌的细胞内产生的所期望的化合物和蛋白难以被分泌到细胞外，因此需要将蓝细菌的细胞破碎来提取在细胞内产生的所期望的化合物和蛋白。
因此，本发明者们发现，通过使被覆蓝细菌的细胞壁的外膜部分地从细胞壁脱离，在蓝细菌的菌体内产生的所期望的化合物和蛋白以及菌体内代谢产物变得容易被分泌到菌体外。在该过程中，本发明者们还发现，蓝细菌的分泌物还具有使多种作物种类的酸性转化酶活化的效果。由此，能够在不将蓝细菌的菌体破碎的情况下，高效地回收被分泌到菌体外的使植物的酸性转化酶活化的物质(即植物酸性转化酶活化物质)。另外，由于不需要提取等操作，植物酸性转化酶活化物质的生理活性不易受损，因此通过含有该分泌物的植物酸性转化酶活化剂，能够有效地使植物的酸性转化酶活化。
因此，通过本公开的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，能够简便且高效地制造含有对多种作物种类具有使酸性转化酶活化的效果的物质的植物酸性转化酶活化剂。另外，通过本公开的植物酸性转化酶活化剂，能够有效地使植物的酸性转化酶活化。另外，根据本公开的植物酸性转化酶活化方法，通过将本公开的植物酸性转化酶活化剂用于植物，能够有效地使植物的酸性转化酶活化。
(本公开的概要)
本公开的一个方式的概要如下。
本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法包含：准备修饰蓝细菌的步骤，该修饰蓝细菌的在蓝细菌中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；以及使所述修饰蓝细菌分泌参与植物的酸性转化酶的活化的分泌物的步骤。
由此，在修饰蓝细菌中，细胞壁与外膜的结合(例如结合量和结合力)部分地降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。因此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物(以下也称为菌体内产生物质)变得容易漏出到外膜之外、即菌体外。由此，在修饰蓝细菌的菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易被分泌到菌体外，因此不需要例如将菌体破碎等菌体内产生物质的提取处理。因此，能够简便且高效地制造含有修饰蓝细菌的分泌物的植物酸性转化酶活化剂。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此也不易引起菌体内产生物质的生理活性的降低和收率的降低。因此，也不易引起修饰蓝细菌的菌体内产生物质中参与植物的酸性转化酶的活化的物质(即植物酸性转化酶活化物质)的生理活性的降低和收率的降低。由此，修饰蓝细菌的分泌物的参与植物的酸性转化酶的活化的效果(以下也称为植物酸性转化酶活化效果)提高。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此在回收了被分泌到菌体外的菌体内产生物质后，还能够重复使用修饰蓝细菌来产生菌体内产生物质。因此，不需要在每次制造植物酸性转化酶活化剂时准备新的修饰蓝细菌。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，能够简便且高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
例如，在本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法中，所述参与外膜与细胞壁的结合的蛋白可以是SLH(Surface Layer Homology，表层同源性)结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1种。
由此，在修饰蓝细菌中，例如(i)与细胞壁结合的SLH结构域保持型外膜蛋白及催化对细胞壁表面的结合糖链进行丙酮酸修饰的反应的酶(即细胞壁-丙酮酸修饰酶)中的至少1种的功能受到抑制或丧失，或者(ii)SLH结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1种的表达受到抑制。因此，外膜中的SLH结构域保持型外膜蛋白的SLH结构域与细胞壁表面的共价键型的糖链的结合(即结合量及结合力)降低。由此，在外膜与细胞壁的结合变弱的部分处，外膜变得容易从细胞壁脱离。其结果，在修饰蓝细菌中外膜与细胞壁的结合降低，由此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离，因此如上所述，在菌体内产生的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外。由此，修饰蓝细菌将菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质分泌到菌体外的分泌生产率提高。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，能够使该修饰蓝细菌高效地分泌植物酸性转化酶活化物质，因此能够高效地制造含有植物酸性转化酶活化物质的植物酸性转化酶活化剂。
例如，在本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法中，所述SLH结构域保持型外膜蛋白可以是由序列号1所示的氨基酸序列构成的Slr1841、由序列号2所示的氨基酸序列构成的NIES970_09470、由序列号3所示的氨基酸序列构成的Anacy_3458、或者氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白相同的蛋白。
由此，在修饰蓝细菌中，例如(i)上述序列号1～3所示的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白相同的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)上述序列号1～3所示的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白相同的蛋白的表达受到抑制。因此，在修饰蓝细菌中，(i)外膜中的SLH结构域保持型外膜蛋白或与SLH结构域保持型外膜蛋白具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)外膜中的SLH结构域保持型外膜蛋白或与SLH结构域保持型外膜蛋白具有同等功能的蛋白的表达量降低。其结果，在修饰蓝细菌中，由于外膜用于与细胞壁结合的结合结构域(例如SLH结构域)与细胞壁结合的结合量及结合力降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质也变得容易漏出到菌体外。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质变得容易被分泌到菌体外，因此能够高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
例如，在本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法中，所述细胞壁-丙酮酸修饰酶可以是由序列号4所示的氨基酸序列构成的Slr0688、由序列号5所示的氨基酸序列构成的Synpcc7942_1529、由序列号6所示的氨基酸序列构成的Anacy_1623、或者氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶相同的蛋白。
由此，在修饰蓝细菌中，例如(i)上述序列号4～6所示的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶相同的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)上述序列号4～6所示的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶相同的蛋白的表达受到抑制。因此，在修饰蓝细菌中，(i)细胞壁-丙酮酸修饰酶或与该酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)细胞壁-丙酮酸修饰酶或与该酶具有同等功能的蛋白的表达量降低。由此，细胞壁表面的共价键型的糖链变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁的糖链与外膜中的SLH结构域保持型外膜蛋白的SLH结构域结合的结合量及结合力降低。其结果，在修饰蓝细菌中，细胞壁表面的共价键型的糖链变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁与外膜的结合力减弱，外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质也变得容易漏出到菌体外。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质变得容易被分泌到菌体外，因此能够高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
例如，在本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法中，表达所述参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的基因可以缺失或失活。
由此，在修饰蓝细菌中，参与细胞壁与外膜的结合的蛋白的表达受到抑制，或者该蛋白的功能受到抑制或丧失，因此细胞壁与外膜的结合(即结合量及结合力)部分地降低。其结果，在修饰蓝细菌中，外膜变得容易从细胞壁部分地脱离，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到外膜之外、即菌体外。因此，修饰蓝细菌在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质的分泌生产率提高。由此，不需要对菌体进行破碎等菌体内产生物质的提取处理，因此变得不易引起菌体内产生物质的生理活性的降低和收率的降低。因此，也不易引起在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质的生理活性的降低和收率的降低，因此能够制造植物酸性转化酶活化效果提高的植物酸性转化酶活化剂。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此即使在回收了该物质后，也能够重复使用修饰蓝细菌来产生植物酸性转化酶活化物质。因此，不需要在每次制造植物酸性转化酶活化剂时准备新的修饰蓝细菌。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，能够简便且高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
例如，在本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法中，表达所述参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的基因可以是编码SLH结构域保持型外膜蛋白的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因中的至少1种。
由此，在修饰蓝细菌中，编码SLH结构域保持型外膜蛋白的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因中的至少1种基因缺失或失活。因此，在修饰蓝细菌中，例如(i)SLH结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1种的表达受到抑制，或者(ii)SLH结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1种的功能受到抑制或丧失。因此，外膜中的SLH结构域保持型外膜蛋白的SLH结构域与细胞壁表面的共价键型的糖链的结合(即结合量及结合力)降低。由此，在外膜与细胞壁的结合变弱的部分处，外膜变得容易从细胞壁脱离。其结果，在修饰蓝细菌中，外膜与细胞壁的结合降低，由此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外。由此，在菌体内产生的植物酸性转化酶活性物质也变得容易漏出到菌体外。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，能够使该修饰蓝细菌高效地分泌植物酸性转化酶活化物质，因此能够高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
例如，在本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法中，编码所述SLH结构域保持型外膜蛋白的基因可以是由序列号7所示的碱基序列构成的slr1841、由序列号8所示的碱基序列构成的nies970_09470、由序列号9所示的碱基序列构成的anacy_3458、或者碱基序列的50％以上与这些中的任一个基因相同的基因。
由此，在修饰蓝细菌中，编码上述序列号7～9所示的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白的基因或与这些中的任一个基因的碱基序列的50％以上相同的基因缺失或失活。因此，在修饰蓝细菌中，(i)上述中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白或与这些中的任一个蛋白具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白或与这些中的任一个蛋白具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。其结果，在修饰蓝细菌中，由于外膜用于与细胞壁结合的结合结构域(例如SLH结构域)与细胞壁结合的结合量及结合力降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质也变得容易漏出到菌体外。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质变得容易漏出到菌体外，因此能够高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
例如，在本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法中，所述编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因可以是由序列号10所示的碱基序列构成的slr0688、由序列号11所示的碱基序列构成的synpcc7942_1529、由序列号12所示的碱基序列构成的anacy_1623、或者碱基序列的50％以上与这些中的任一个基因相同的基因。
由此，在修饰蓝细菌中，上述序列号10～12所示的任一个编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因或与这些中的任一个的编码酶的基因的碱基序列的50％以上相同的基因缺失或失活。因此，在修饰蓝细菌中，(i)上述任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。由此，细胞壁表面的共价键型的糖链变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁的糖链与外膜中的SLH结构域保持型外膜蛋白的SLH结构域结合的结合量及结合力降低。其结果，在修饰蓝细菌中，细胞壁用于与外膜结合的糖链被丙酮酸修饰的量减少，因此细胞壁与外膜的结合力减弱，外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质也变得容易漏出到菌体外。因此，通过本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，在修饰蓝细菌的菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质变得容易漏出到菌体外，因此能够高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
另外，本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂含有在蓝细菌中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失的修饰蓝细菌的分泌物。
由此，在修饰蓝细菌中，细胞壁与外膜的结合(即结合量和结合力)部分地降低，因此外膜变得容易从细胞壁部分地脱离。因此，在修饰蓝细菌中，在菌体内产生的蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)变得容易露出到外膜之外(即菌体之外)。由此，修饰蓝细菌中在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易被分泌到菌体外，因此不需要例如对菌体进行破碎等的菌体内产生物质的提取处理。因此，能够简便且高效地制造含有修饰蓝细菌的分泌物的植物酸性转化酶活化剂。另外，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此不易引起菌体内产生物质的生理活性的降低和收率的降低。因此，也不易引起修饰蓝细菌的菌体内产生物质中的与植物酸性转化酶活化相关的物质(以下也称为植物酸性转化酶活化物质)的生理活性的降低和收率的降低。由此，可以得到植物酸性转化酶活化效果提高的植物酸性转化酶活化剂。因此，本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化剂能够有效地使植物的酸性转化酶活化。
另外，本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化方法对植物使用上述的植物酸性转化酶活化剂。
根据本公开的一个方式的植物酸性转化酶活化方法，通过将植物酸性转化酶活化效果提高的植物酸性转化酶活化剂用于植物，能够有效地使植物的酸性转化酶活化。
以下，参照附图对实施方式进行具体说明。
需要说明的是，以下说明的实施方式均表示概括性的或具体的例子。在以下的实施方式中示出的数值、材料、步骤、步骤的顺序等是一个例子，并不是为了限定本公开。另外，关于以下实施方式中的构成要素中的在表示最上位概念的独立权利要求中没有记载的构成要素，作为任意的构成要素进行说明。
另外，各图不一定是严格地进行图示的图。在各图中，对实质上相同的构成标注相同的附图标记，有时省略或简化重复的说明。
另外，下文中，数值范围并不是仅表示严格意义，还包括实质上同等的范围，例如对蛋白的量(例如数量或浓度等)或其范围进行测量等。
另外，在本说明书中，菌体和细胞均表示1个蓝细菌的个体。
(实施方式)
本说明书中，碱基序列和氨基酸序列的同源性通过BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool，基于局部比对算法的搜索工具)算法来计算。具体而言，通过用在NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的网页中可利用的BLAST程序进行成对(pair-wise)分析来计算。关于蓝细菌的基因及该基因所编码的蛋白的信息例如在上述NCBI数据库及Cyanobase(http：//genome.microbedb.jp/cyanobase/)中有公开。可以从这些数据库中获得目标蛋白的氨基酸序列和编码这些蛋白的基因的碱基序列。
[1.植物酸性转化酶活化剂]
首先，对本实施方式的植物酸性转化酶活化剂进行说明。植物酸性转化酶活化剂含有参与植物的酸性转化酶的活化的分泌物，具有使植物的酸性转化酶活化的效果。如上所述，转化酶是植物体中将蔗糖分解代谢为葡萄糖和果糖等还原糖的酶。特别是，酸性转化酶有助于植物体中的蔗糖的利用、以及向储藏糖的一个形态即还原糖的分解代谢。因此，本实施方式的植物酸性转化酶活化剂通过使植物的酸性转化酶活化，能够促进植物的生长，并且促进储藏糖向果实等的蓄积。因此，本实施方式的植物酸性转化酶活化剂例如通过用于农作物，能够高效地增进农作物的生产。
例如，促进植物的生长是指使植物的叶、茎、花蕾、花、或果实的数量增加，使茎或干变粗，使高度伸长。通过促进植物的生长，植物体及其果根部增大，果实数增加。
另外，酸性转化酶有助于植物病害的防除、养分吸收率的提高、果实的高糖度化等植物的品质提高。因此，植物酸性转化酶活化剂对于多种作物种类，能够有效地提高作物的增收、作物及果实的增大、果实的高糖度化、生理障碍的降低、以及病害的减少等植物的品质。
另外，植物除了在田地中栽培的作物(所谓的农作物)以外，还包括园林树木、花卉、草坪、街道树等，并且也包括几乎不进行施肥栽培的山林树木。
在本实施方式中，植物酸性转化酶活化剂包含在蓝细菌(以下也称为亲本蓝细菌)中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失的修饰蓝细菌的分泌物。其中，关于蓝细菌(即亲本蓝细菌)及修饰蓝细菌在后文叙述。
如上所述，该分泌物包含参与植物的酸性转化酶的活化的分泌物。该分泌物包含在修饰蓝细菌的菌体内产生的蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)。该菌体内产生物质中包含参与植物的酸性转化酶的活化的物质(即植物酸性转化酶活化物质)。
植物酸性转化酶活化物质例如为肽酶、核酸酶、或磷酸酶等有机物分解酶、腺苷或鸟苷等DNA代谢相关物质、对氨基苯甲酸或亚精胺等参与核酸(例如DNA或RNA)合成促进的细胞内分子、3-羟基丁酸等酮体、或葡萄糖酸等有机酸。修饰蓝细菌的分泌物可以是这些植物酸性转化酶活性物质的混合物。
[2.植物酸性转化酶活化剂的制造方法]
接着，参照图1对本实施方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法进行说明。图1是表示本实施方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法的一例的流程图。
本实施方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法包含：准备修饰蓝细菌的步骤(步骤S01)，该修饰蓝细菌的在蓝细菌(即亲本蓝细菌)中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；以及使该修饰蓝细菌分泌参与植物的酸性转化酶的活化的分泌物的步骤(步骤S02)。如上所述，修饰蓝细菌的分泌物包含在修饰蓝细菌的菌体内产生的蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)。这些菌体内产生物质中包含参与植物的酸性转化酶的活化的物质(即植物酸性转化酶活化物质)。
在步骤S01中，准备上述修饰蓝细菌。准备修饰蓝细菌是指将修饰蓝细菌的状态调整为修饰蓝细菌能够分泌分泌物的状态。准备修饰蓝细菌时，例如可以通过对亲本蓝细菌进行基因修饰来制作修饰蓝细菌，也可以从修饰蓝细菌的冷冻干燥体或甘油储备中复原菌体，也可以回收在步骤S02中使植物酸性转化酶活化物质分泌结束后的修饰蓝细菌。
在步骤S02中，使修饰蓝细菌分泌参与植物的生长促进的分泌物。本实施方式中的修饰蓝细菌的在蓝细菌(即亲本蓝细菌)中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物容易被分泌到外膜之外(即菌体外)。这些菌体内产生物质中也包含参与植物的酸性转化酶的活化的物质。因此，在步骤S02中，通过在规定的条件下培养修饰蓝细菌，参与植物的酸性转化酶的活化的菌体内产生物质被分泌到菌体外。
蓝细菌的培养通常可以基于使用了BG-11培养基(参照表2)的液体培养或其变通方法来实施。因此，修饰蓝细菌的培养也可以同样地实施。另外，作为用于制造植物酸性转化酶活化剂的蓝细菌的培养期间，只要是能够在菌体充分增殖的条件下以高浓度蓄积蛋白及代谢产物的方式进行的期间即可，例如可以是1～3天，也可以是4～7天。另外，培养方法例如可以是通气搅拌培养或振荡培养。
通过在上述条件下进行培养，修饰蓝细菌在菌体内产生蛋白及代谢产物(即菌体内产生物质)，并将该菌体内产生物质分泌到培养液中。该菌体内产生物质包含参与植物的酸性转化酶的活化的菌体内产生物质(即植物酸性转化酶活化物质)。回收被分泌到培养液中的菌体内产生物质时，可以通过对培养液进行过滤或离心分离等，从培养液中除去细胞(即菌体)等固体成分，回收培养上清液。根据本实施方式的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，由于包含参与植物的酸性转化酶的活化的菌体内产生物质(即植物酸性转化酶活化物质)的分泌物被分泌到修饰蓝细菌的细胞外，因此不需要为了回收植物酸性转化酶活化物质而将细胞破碎。因此，能够重复使用植物酸性转化酶活化物质回收后残留的修饰蓝细菌来进行植物酸性转化酶活化剂的制造。
需要说明的是，分泌到培养液中的植物酸性转化酶活化物质的回收方法并不限于上述的例子，也可以一边培养修饰蓝细菌一边回收培养液中的植物酸性转化酶活化物质。例如，也可以通过使用使蛋白透过的透过膜来回收从透过膜透过的植物酸性转化酶活化物质。这样，能够一边培养修饰蓝细菌一边回收培养液中的植物酸性转化酶活化物质，因此不需要从培养液中除去修饰蓝细菌的菌体的处理。因此，能够更简便且高效地制造植物酸性转化酶活化剂。
另外，由于不需要从培养液中回收菌体的处理和破碎菌体的处理，因此能够降低修饰蓝细菌受到的损伤和应激。因此，修饰蓝细菌的植物酸性转化酶活化物质的分泌生产率不易降低，能够更长期地使用修饰蓝细菌。
如上所述，通过使用本实施方式中的修饰蓝细菌，能够简便且高效地得到植物酸性转化酶活化剂。
以下，对蓝细菌和修饰蓝细菌进行说明。
[3.蓝细菌]
蓝细菌也被称为蓝藻或蓝色细菌，是通过叶绿素捕集光能，用得到的能量将水电解而产生氧，同时进行光合作用的原核生物中的一组。蓝细菌富有多样性，例如在细胞形状方面，有集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803那样的单细胞性的种类和鱼腥藻(Anabaenasp.)PCC 7120那样的多细胞相连而成的丝状性的种类。在生长环境方面，也有细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)那样的嗜热性的种类、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)那样的海洋性的种类、集胞藻属(Synechocystis)那样的淡水性的种类。另外，还可举出许多如铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)那样具有气体囊泡并产生毒素的种类、以及不具有类囊体而在细胞膜中具有被称为聚光天线即藻胆体的蛋白的类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)那样具有独自的特征的种类。
图2是示意性地示出了蓝细菌的细胞表层的图。如图2所示，蓝细菌的细胞表层从内侧起依次由细胞膜(也称为内膜1)、肽聚糖2、以及形成细胞最外层的脂质膜即外膜5构成。在肽聚糖2上共价键合有由葡糖胺和甘露糖胺等构成的糖链3，另外在这些共价键型的糖链3上键合有丙酮酸(非专利文献3：Jurgens and Weckesser，1986，J.Bacteriol.，168：568-573)。在本说明书中，包括肽聚糖2和共价键型的糖链3在内将其称为细胞壁4。另外，细胞膜(即内膜1)与外膜5之间的间隙存在被称为胞外质(periplasm)、参与蛋白的分解或立体结构的形成、脂质或核酸的分解、或者细胞外的营养素的摄入等的各种酶。
SLH结构域保持型外膜蛋白6(例如图中的Slr1841)由埋入到脂质膜(也称为外膜5)中的C末端侧区域和从脂质膜突出的N末端侧的SLH结构域7构成，广泛地分布于属于作为蓝细菌和革兰氏阴性细菌的一组的厚壁菌(Negativicutes)纲的细菌中(非专利文献4：Kojima et al.，2016，Biosci.Biotech.Biochem.，10：1954-1959)。埋入到脂质膜(即外膜5)中的区域形成用于使亲水性物质能够透过外膜的通道，另一方面，SLH结构域7具有与细胞壁4结合的功能(非专利文献5：Kowata et al.，2017，J.Bacteriol.，199：e00371-17)。为了使SLH结构域7与细胞壁4结合，需要用丙酮酸修饰肽聚糖2中的共价键型的糖链3(非专利文献6：Kojima et al.，2016，J.Biol.Chem.，291：20198-20209)。作为编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因的例子，可举出集胞藻PCC 6803所保持的slr1841或slr1908、或鱼腥藻90所保持的oprB等。
催化肽聚糖2中的共价键型的糖链3的丙酮酸修饰反应的酶(以下称为细胞壁-丙酮酸修饰酶9)是在革兰氏阳性菌炭疽杆菌(Bacillus anthracis)中鉴定出的，被命名为CsaB(非专利文献7：Mesnage et al.，2000，EMBO J.，19：4473-4484)。在公开了基因组碱基序列的蓝细菌中，多数种类保持有编码与CsaB的氨基酸序列的同源性为30％以上的同源蛋白的基因。作为例子，可举出集胞藻PCC 6803所保持的slr0688或聚球藻(Synechococcussp.)7502所保持的syn7502_03092等。
在蓝细菌中，通过光合作用固定的CO2经过多阶段的酶反应被转换为各种氨基酸和细胞内分子的前体。将它们作为原料，在蓝细菌的细胞质内合成蛋白及代谢产物。在这些蛋白及代谢产物中，既存在在细胞质内发挥功能的蛋白及代谢产物，也存在从细胞质被输送至胞外质而在胞外质内发挥功能的蛋白及代谢产物。但是，迄今为止在蓝细菌中尚没有报告过将蛋白及代谢产物主动分泌到细胞外的情况。
由于蓝细菌具有较高的光合作用能力，因此不一定需要将有机物作为营养成分从外部摄入。因此，如图2的有机物通道蛋白8(例如Slr1270)那样，蓝细菌在外膜5仅具有非常微小的使有机物透过的通道蛋白。例如，在集胞藻PCC 6803中，使有机物透过的有机物通道蛋白8仅存在外膜5的总蛋白量的约4％。另一方面，蓝细菌为了高效地将生长所需的无机离子类摄入到细胞内，如图2的SLH结构域保持型外膜蛋白6(例如Slr1841)那样，在外膜5中具有大量仅使无机离子类透过的离子通道蛋白。例如，在集胞藻PCC 6803中，使无机离子透过的离子通道蛋白占外膜5的总蛋白量的约80％。
如此，认为由于在蓝细菌中，使外膜5中的蛋白等有机物透过的通道非常少，因此难以将在菌体内产生的蛋白及代谢产物主动地分泌到菌体外。
[4.修饰蓝细菌]
接着，参照图2对本实施方式中的修饰蓝细菌进行说明。
本实施方式中的修饰蓝细菌的在蓝细菌中参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白(以下也称为结合相关蛋白)的功能受到抑制或丧失。由此，在修饰蓝细菌中，由于外膜5与细胞壁4的结合(例如结合量及结合力)部分地降低，因此外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。因此，修饰蓝细菌的将菌体内产生的蛋白及代谢产物分泌到菌体外的菌体内产生物质的分泌生产率提高。如上所述，菌体内产生物质中包含参与植物的酸性转化酶的活化的菌体内产生物质(即植物酸性转化酶活化物质)。因此，修饰蓝细菌将在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质分泌到菌体外的植物酸性转化酶活化物质的分泌生产率也提高。另外，由于不需要将菌体破碎来回收植物酸性转化酶活化物质，因此在回收植物酸性转化酶活化物质后，还可以重复使用修饰蓝细菌。需要说明的是，在本说明书中，将修饰蓝细菌在菌体内产出蛋白及代谢物称为产生，将所产生的蛋白及代谢物分泌到菌体外称为分泌生产。
参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白例如可以是SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种。在本实施方式中，修饰蓝细菌的例如SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种蛋白的功能受到抑制或丧失。例如，在修饰蓝细菌中，(i)SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种的功能可以受到抑制或丧失，(ii)与细胞壁4结合的SLH结构域保持型外膜蛋白6的表达、以及催化细胞壁4表面的结合糖链的丙酮酸修饰反应的酶(即细胞壁-丙酮酸修饰酶9)的表达中的至少1种可以受到抑制。由此，外膜5中的SLH结构域保持型外膜蛋白6的SLH结构域7与细胞壁4表面的共价键型的糖链3的结合(即结合量及结合力)降低。因此，在这些结合变弱的部分处，外膜5变得容易从细胞壁4脱离。通过外膜5从细胞壁4部分地脱离，修饰蓝细菌的细胞内、特别是存在于胞外质中的蛋白及代谢产物等菌体内产生物质变得容易漏出到细胞之外(外膜5之外)。由此，修饰蓝细菌的将在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质分泌到菌体外的分泌生产率提高。
以下，对因SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种结合相关蛋白的功能受到抑制而修饰为外膜5部分地从细胞壁4脱离的蓝细菌更具体地进行说明。
对成为本实施方式中的修饰蓝细菌的亲本微生物的抑制SLH结构域保持型外膜蛋白6的表达和细胞壁-丙酮酸修饰酶9的表达中的至少1种或使其丧失之前的蓝细菌(即亲本蓝细菌)的种类没有特别限制，可以是任意种类的蓝细菌。例如，亲本蓝细菌可以是集胞藻(Synechocystis)属、聚球藻(Synechococcus)属、鱼腥藻(Anabaena)属或嗜热聚球藻(Thermosynechococcus)属，其中，可以是集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803、聚球藻(Synechococcus sp)PCC 7942或嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-1。
这些亲本蓝细菌中的SLH结构域保持型外膜蛋白6和催化细胞壁-丙酮酸修饰反应的酶(即细胞壁-丙酮酸修饰酶9)的氨基酸序列、编码这些结合相关蛋白的基因的碱基序列、以及该基因在染色体DNA或质粒上的位置可以通过上述的NCBI数据库和Cyanobase来确认。
需要说明的是，本实施方式的修饰蓝细菌中功能受到抑制或丧失的SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9只要亲本蓝细菌保有，则可以是任意的亲本蓝细菌的蛋白或酶，不受编码它们的基因的存在部位(例如染色体DNA上或质粒上)的限制。
例如，SLH结构域保持型外膜蛋白6在亲本蓝细菌为集胞藻(Synechocystis)属的情况下，可以是Slr1841、Slr1908、或Slr0042等，在亲本蓝细菌为聚球藻(Synechococcus)属的情况下，可以是NIES970_09470等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(Anabaena)属的情况下，可以是Anacy_5815或Anacy_3458等，在亲本蓝细菌为微囊藻(Microcystis)属的情况下，可以是A0A0F6U6F8_MICAE等，在亲本蓝细菌为蓝丝菌(Cyanothece)属的情况下，可以是A0A3B8XX12_9CYAN等，在亲本蓝细菌为瘦鞘丝藻(Leptolyngbya)属的情况下，可以是A0A1Q8ZE23_9CYAN等，在亲本蓝细菌为眉藻(Calothrix)属的情况下，可举出A0A1Z4R6U0_9CYAN，在亲本蓝细菌为念珠藻(Nostoc)属的情况下，可以是A0A1C0VG86_9NOSO等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(Crocosphaera)属的情况下，可以是B1WRN6_CROS5等，在亲本蓝细菌为宽球藻(Pleurocapsa)属的情况下，可以是K9TAE4_9CYAN等。
更具体而言，SLH结构域保持型外膜蛋白6可以是例如集胞藻PCC 6803的Slr1841(序列号1)、聚球藻NIES-970的NIES970_09470(序列号2)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaenacylindrica)PCC 7122的Anacy_3458(序列号3)等。另外，也可以是氨基酸序列的50％以上与这些SLH结构域保持型外膜蛋白6相同的蛋白。
由此，在修饰蓝细菌中，例如可以是(i)上述序列号1～3所示的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白6或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白6相同的蛋白的功能受到抑制或丧失，也可以是(ii)上述序列号1～3所示的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白6或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白6相同的蛋白的表达受到抑制。因此，在修饰蓝细菌中，(i)外膜5中的SLH结构域保持型外膜蛋白6或与SLH结构域保持型外膜蛋白6具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)外膜5中的SLH结构域保持型外膜蛋白6或与SLH结构域保持型外膜蛋白6具有同等功能的蛋白的表达量降低。其结果，在修饰蓝细菌中，由于外膜5用于与细胞壁4结合的结合结构域(例如SLH结构域7)与细胞壁4结合的结合量及结合力降低，因此外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。由此，修饰蓝细菌中，菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质也变得容易漏出到菌体外。
通常认为，如果蛋白的氨基酸序列的30％以上相同，则蛋白的立体结构的同源性高，因此与该蛋白具有同等功能的可能性高。因此，作为功能受到抑制或丧失的SLH结构域保持型外膜蛋白6，例如可以是由与上述序列号1～3所示的SLH结构域保持型外膜蛋白6中的任一个氨基酸序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选80％以上、另外优选90％以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有与细胞壁4的共价键型的糖链3结合的功能的蛋白或多肽。
另外，例如，细胞壁-丙酮酸修饰酶9在亲本蓝细菌为集胞藻(Synechocystis)属的情况下，可以是Slr0688等，在亲本蓝细菌为聚球藻(Synechococcus)属的情况下，可以是Syn7502_03092或Synpcc7942_1529等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(Anabaena)属的情况下，可以是ANA_C20348或Anacy_1623等，在亲本蓝细菌为微囊藻(Microcystis)属的情况下，可以是CsaB(NCBI的登录ID：TRU80220)等，在亲本蓝细菌为蓝丝菌(Cyanothece)属的情况下，可以是CsaB(NCBI的登录ID：WP_107667006.1)等，在亲本蓝细菌为螺旋藻(Spirulina)属的情况下，可以是CsaB(NCBI的登录ID：WP_026079530.1)等，在亲本蓝细菌为眉藻(Calothrix)属的情况下，可以是CsaB(NCBI的登录ID：WP_096658142.1)等，在亲本蓝细菌为念珠藻(Nostoc)属的情况下，可以是CsaB(NCBI的登录ID：WP_099068528.1)等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(Crocosphaera)属的情况下，可以是CsaB(NCBI的登录ID：WP_012361697.1)等，在亲本蓝细菌为宽球藻(Pleurocapsa)属的情况下，可以是CsaB(NCBI的登录ID：WP_036798735)等。
更具体而言，细胞壁-丙酮酸修饰酶9例如可以是集胞藻PCC 6803的Slr0688(序列号4)、聚球藻PCC 7942的Synpcc7942_1529(序列号5)、或柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaenacylindrica)PCC 7122的Anacy_1623(序列号6)等。另外，也可以是氨基酸序列的50％以上与这些细胞壁-丙酮酸修饰酶9相同的蛋白。
由此，在修饰蓝细菌中，例如(i)上述序列号4～6所示的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9相同的蛋白的功能可以受到抑制或丧失，或者(ii)上述序列号4～6所示的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9或氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9相同的蛋白的表达可以受到抑制。因此，在修饰蓝细菌中，(i)细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与该酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失，或者(ii)细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与该酶具有同等功能的蛋白的表达量降低。由此，细胞壁4表面的共价键型的糖链3变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁4的糖链3与外膜5中的SLH结构域保持型外膜蛋白6的SLH结构域7结合的结合量及结合力降低。因此，在本实施方式的修饰蓝细菌中，细胞壁4表面的共价键型的糖链3变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁4与外膜5的结合力减弱，外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。由此，修饰蓝细菌中，菌体内产生物质变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质也变得容易漏出到菌体外。
另外，如上所述，认为若蛋白的氨基酸序列的30％以上相同，则与该蛋白具有同等功能的可能性高。因此，作为功能受到抑制或丧失的细胞壁-丙酮酸修饰酶9，例如可以是由与上述序列号4～6所示的细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的任一个氨基酸序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选80％以上、另外优选90％以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有催化用丙酮酸修饰细胞壁4的肽聚糖2的共价键型的糖链3的反应的功能的蛋白或多肽。
另外，在本说明书中，抑制SLH结构域保持型外膜蛋白6的功能或使其丧失是指抑制该蛋白与细胞壁4的结合能力或使其丧失、抑制该蛋白向外膜5的输送或使其丧失、或者抑制该蛋白埋入外膜5而发挥功能的能力或使其丧失。
需要说明的是，抑制细胞壁-丙酮酸修饰酶9的功能或使其丧失是指抑制该蛋白的用丙酮酸修饰细胞壁4的共价键型的糖链3的功能或使其丧失。
作为抑制这些蛋白的功能或使其丧失的方法，只要是通常用于蛋白的功能抑制或丧失的方法，就没有特别限定。该方法例如可以是使编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因缺失或失活、抑制这些基因的转录、抑制这些基因的转录产物的翻译、或给予特异性地抑制这些蛋白的抑制剂等。
在本实施方式中，修饰蓝细菌中，外膜5与细胞壁4，由此，在修饰蓝细菌中，由于参与细胞壁4与外膜5的结合的蛋白的表达受到抑制，或者该蛋白的功能受到抑制或丧失，因此细胞壁4与外膜5的结合(即结合量及结合力)部分地降低。其结果，在修饰蓝细菌中，外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离，因此在修饰蓝细菌中，在菌体内产生的蛋白及代谢产物等变得容易漏出到外膜5之外、即菌体外。因此，修饰蓝细菌的将在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质分泌到菌体外的植物酸性转化酶活化物质的分泌生产率提高。由此，由于不需要将菌体破碎等的菌体内产生物质的提取处理，因此不易引起菌体内产生物质的生理活性的降低和收率的降低。因此，也不易引起在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质的生理活性的降低和收率的降低，因此能够制造植物酸性转化酶活化效果提高的植物酸性转化酶活化剂。并且，由于不需要上述的菌体内产生物质的提取处理，因此在回收该物质后，还可以重复使用修饰蓝细菌来产生植物酸性转化酶活化物质。
使参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白表达的基因例如可以是编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的至少1种。在修饰蓝细菌中，编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的至少1种基因缺失或失活。因此，在修饰蓝细菌中，例如(i)SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种的表达受到抑制，或者(ii)SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种的功能受到抑制或丧失。因此，外膜5中的SLH结构域保持型外膜蛋白6的SLH结构域7与细胞壁4表面的共价键型的糖链3的结合(即结合量及结合力)降低。由此，在外膜5与细胞壁4的结合变弱的部分处，外膜5变得容易从细胞壁4脱离。其结果，在修饰蓝细菌中，由于外膜5与细胞壁4的结合降低，外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离，因此在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外。由此，修饰蓝细菌在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质也变得容易漏出到菌体外。
在本实施方式中，为了抑制蓝细菌中的SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种的功能或使其丧失，例如可以抑制编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的至少1种的转录。
例如，编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因在亲本蓝细菌为集胞藻(Synechocystis)属的情况下，可以是slr1841、slr1908或slr0042等，在亲本蓝细菌为聚球藻(Synechococcus)属的情况下，可以是nies970_09470等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(Anabaena)属的情况下，可以是anacy_5815或anacy_3458等，在亲本蓝细菌为微囊藻(Microcystis)属的情况下，可以是A0A0F6U6F8_MICAE等，在亲本蓝细菌为蓝丝菌(Cyanothece)属的情况下，可以是A0A3B8XX12_9CYAN等，在亲本蓝细菌为瘦鞘丝藻(Leptolyngbya)属的情况下，可以是A0A1Q8ZE23_9CYAN等，在亲本蓝细菌为眉藻(Calothrix)属的情况下，可以是A0A1Z4R6U0_9CYAN等，在亲本蓝细菌为念珠藻(Nostoc)属的情况下，可以是A0A1C0VG86_9NOSO等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(Crocosphaera)属的情况下，可以是B1WRN6_CROS5等，在亲本蓝细菌为宽球藻(Pleurocapsa)属的情况下，可以是K9TAE4_9CYAN等。这些基因的碱基序列可以从上述的NCBI数据库或Cyanobase获得。
更具体而言，编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因可以是集胞藻PCC 6803的slr1841(序列号7)、聚球藻NIES-970的nies970_09470(序列号8)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)PCC 7122的anacy_3458(序列号9)、或者氨基酸序列的50％以上与这些基因相同的基因。
由此，在修饰蓝细菌中，编码上述序列号7～9所示的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因或与这些中的任一个基因的碱基序列的50％以上相同的基因缺失或失活。因此，在修饰蓝细菌中，(i)上述任一个SLH结构域保持型外膜蛋白6或与这些中的任一个蛋白具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述任一个SLH结构域保持型外膜蛋白6或与这些中的任一个蛋白具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。其结果，在修饰蓝细菌中，由于外膜5用于与细胞壁4结合的结合结构域(例如SLH结构域7)与细胞壁4结合的结合量及结合力降低，因此外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活性物质变得容易漏出到菌体外。
如上所述，认为如果蛋白的氨基酸序列的30％以上相同，则与该蛋白具有同等功能的可能性高。因此，认为如果编码蛋白的基因的碱基序列的30％以上相同，则表达与该蛋白具有同等功能的蛋白的可能性高。因此，作为编码功能受到抑制或丧失的SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因，例如可以是由与编码上述序列号7～9所示的SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因中的任一个的碱基序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选80％以上、另外优选90％以上的同源性的碱基序列构成、且编码具有与细胞壁4的共价键型的糖链3结合的功能的蛋白或多肽的基因。
另外，例如编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因在亲本蓝细菌为集胞藻(Synechocystis)属的情况下，可以是slr0688等，在亲本蓝细菌为聚球藻(Synechococcus)属的情况下，可以是syn7502_03092或synpcc7942_1529等，在亲本蓝细菌为鱼腥藻(Anabaena)属的情况下，可以是ana_C20348或anacy_1623等，在亲本蓝细菌为微囊藻(Microcystis)属的情况下，可以是csaB(NCBI的登录ID：TRU80220)等，在亲本蓝细菌为Cynahothese属的情况下，可以是csaB(NCBI的登录ID：WP_107667006.1)等，在亲本蓝细菌为螺旋藻(Spirulina)属的情况下，可以是csaB(NCBI的登录ID：WP_026079530.1)等，在亲本蓝细菌为眉藻(Calothrix)属的情况下，可以是csaB(NCBI的登录ID：WP_096658142.1)等，在亲本蓝细菌为念珠藻(Nostoc)属的情况下，可以是csaB(NCBI的登录ID：WP_099068528.1)等，在亲本蓝细菌为固氮蓝藻(Crocosphaera)属的情况下，可以是csaB(NCBI的登录ID：WP_012361697.1)等，在亲本蓝细菌为宽球藻(Pleurocapsa)属的情况下，可以是csaB(NCBI的登录ID：WP_036798735)等。这些基因的碱基序列可以从上述的NCBI数据库或Cyanobase获得。
更具体而言，编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因可以是集胞藻PCC 6803的slr0688(序列号10)、聚球藻PCC 7942的synpcc 7942_1529(序列号11)、或柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)PCC 7122的anacy_1623(序列号12)。另外，也可以是碱基序列的50％以上与这些基因相同的基因。
由此，在修饰蓝细菌中，上述序列号10～12所示的任一个编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因或与这些中的任一个编码酶的基因的碱基序列的50％以上相同的基因缺失或失活。因此，在修饰蓝细菌中，(i)上述任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的表达受到抑制，或者(ii)上述任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶9或与这些中的任一个酶具有同等功能的蛋白的功能受到抑制或丧失。由此，细胞壁4表面的共价键型的糖链3变得不易被丙酮酸修饰，因此细胞壁4的糖链3与外膜5中的SLH结构域保持型外膜蛋白6的SLH结构域7结合的结合量及结合力降低。因此，在本实施方式的修饰蓝细菌中，细胞壁4用于与外膜5结合的糖链3被丙酮酸修饰的量减少，因此细胞壁4与外膜5的结合力减弱，外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。由此，在菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到菌体外，因此在菌体内产生的植物酸性转化酶活性物质也变得容易漏出到菌体外。
如上所述，认为如果编码蛋白的基因的碱基序列的30％以上相同，则表达与该蛋白具有同等功能的蛋白的可能性高。因此，作为编码功能受到抑制或丧失的细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因，例如可以是由与上述序列号10～12所示的编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因中的任一个的碱基序列具有40％以上、优选50％以上、更优选60％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选80％以上、另外优选90％以上的同源性的碱基序列构成，且是编码具有催化用丙酮酸修饰细胞壁4的肽聚糖2的共价键型的糖链3的反应的功能的蛋白或多肽的基因。
[5.修饰蓝细菌的制造方法]
接着，对本实施方式中的修饰蓝细菌的制造方法进行说明。修饰蓝细菌的制造方法包含抑制在蓝细菌中参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白的功能或使其丧失的步骤。
在本实施方式中，参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白例如可以是SLH结构域保持型外膜蛋白6和细胞壁-丙酮酸修饰酶9中的至少1种。
需要说明的是，作为抑制蛋白的功能或使其丧失的方法，没有特别限定，例如可以是使编码SLH结构域保持型外膜蛋白6的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶9的基因缺失或失活、抑制这些基因的转录、抑制这些基因的转录产物的翻译、或给予特异性地抑制这些蛋白的抑制剂等。
使上述基因缺失或失活的方法例如可以是导入该基因的碱基序列上的1个以上碱基的突变、将该碱基序列替换为其他碱基序列或插入其他碱基序列、或者删除该基因的碱基序列的一部分或全部等。
抑制上述基因的转录的方法例如可以是由向该基因的启动子区域导入突变、替换为其他碱基序列或插入其他碱基序列所导致的该启动子的失活、或CRISPR干扰法(非专利文献8：Yao et al.，ACS Synth.Biol.，2016，5：207-212)等。上述导入突变、或替换或插入碱基序列的具体方法例如可以是紫外线照射、部位特异性突变导入、或同源重组法等。
另外，抑制上述基因的转录产物的翻译的方法例如可以是RNA干扰法等。
通过使用以上的任一方法，可以抑制蓝细菌中的参与外膜5与细胞壁4的结合的蛋白的功能或使其丧失来制造修饰蓝细菌。
由此，通过上述制造方法制造的修饰蓝细菌的细胞壁4与外膜5的结合(即结合量及结合力)部分地降低，因此外膜5变得容易从细胞壁4部分地脱离。其结果，在修饰蓝细菌中，菌体内产生的蛋白及代谢产物变得容易漏出到外膜5之外(即菌体之外)，因此参与植物的酸性转化酶的活化的物质(即植物酸性转化酶活化物质)也变得容易漏出到菌体外。因此，根据本实施方式中的修饰蓝细菌的制造方法，能够提供植物酸性转化酶活化物质的分泌生产率提高的修饰蓝细菌。
另外，在通过本实施方式中的制造方法制造的修饰蓝细菌中，在菌体内产生的植物酸性转化酶活化物质漏出到菌体外，因此不需要为了回收该物质而将菌体破碎。例如，只要在适当的条件下培养修饰蓝细菌，接着回收分泌到培养液中的植物酸性转化酶活化物质即可，因此还能够一边培养修饰蓝细菌一边回收培养液中的植物酸性转化酶活化物质。因此，如果使用通过本制造方法得到的修饰蓝细菌，则能够实施高效的微生物学上的植物酸性转化酶活化物质的生产。因此，根据本实施方式中的修饰蓝细菌的制造方法，能够提供在回收植物酸性转化酶活化物质后还能够重复使用的利用效率高的修饰蓝细菌。
[6.植物酸性转化酶活化方法]
本实施方式的植物酸性转化酶活化方法将上述的植物酸性转化酶活化剂用于植物。如上所述，本实施方式的植物酸性转化酶活化剂是具有植物酸性转化酶活化效果的植物酸性转化酶活化剂，因此通过将上述的植物酸性转化酶活化剂用于植物，能够有效地使植物的酸性转化酶活化。
上述的植物酸性转化酶活化剂当然可以直接使用，也可以浓缩或稀释后使用。在该植物生长促进剂对植物应用(即施用)时，可以根据植物的种类、土壤的性质、以及目的等，适当地决定植物酸性转化酶活化剂的浓度和应用方法。植物酸性转化酶活化剂可以是例如修饰蓝细菌的培养液本身，也可以是从该培养液中除去修饰蓝细菌的菌体后的溶液，也可以是通过膜技术等从该培养液中提取所希望的物质而得到的提取物。所希望的物质可以是可分解土壤中的养分的酶，也可以是使土壤中的不溶物质(例如铁等金属)可溶化的物质(例如具有螯合效果的物质)，也可以是提高植物的细胞内生理活性的物质。另外，植物酸性转化酶活化剂对植物的应用方法例如可以是向植物喷雾、向土壤喷雾、灌溉、或者混合、或者在水耕液体中混合等。例如，可以以每周1次左右向植物体的根部每1个植物体个体添加数毫升的植物酸性转化酶活化剂。
实施例
以下，用实施例对本公开的修饰蓝细菌、修饰蓝细菌的制造方法以及植物酸性转化酶活化剂的制造方法具体地进行说明，但本公开并不仅仅限定于以下的实施例。
在以下的实施例中，作为使蓝细菌的外膜从细胞壁部分地脱离的方法，进行编码SLH结构域保持型外膜蛋白的slr1841基因的表达抑制(实施例1)、以及编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的slr0688基因的表达抑制(实施例2)，制造2种修饰蓝细菌。然后，进行这些修饰蓝细菌的蛋白的分泌生产率的测定和所分泌的菌体内产生物质(在此为蛋白和细胞内代谢产物)的鉴定。其中，本实施例中使用的蓝细菌种类为集胞藻PCC 6803(以下简称为“蓝细菌”)。
(实施例1)
在实施例1中，制造了编码SLH结构域保持型外膜蛋白的slr1841基因的表达受到抑制的修饰蓝细菌。
(1)slr1841基因的表达受到抑制的蓝细菌修饰株的构建
作为基因表达抑制法，使用了CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat，规律间隔的短回文重复序列)干扰法。在本方法中，通过将编码dCas9蛋白的基因(以下称为dCas9基因)和slr1841_sgRNA(single-guide Ribonucleic Acid，单导核糖核酸)基因导入到蓝细菌的染色体DNA中，能够抑制slr1841基因的表达。
由本方法进行的基因表达抑制的机制如下所述。
首先，核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白(dCas9)和与slr1841基因的碱基序列互补结合的sgRNA(slr1841_sgRNA)形成复合物。
接着，该复合物识别蓝细菌的染色体DNA上的s1r1841基因，与slr1841基因特异性地结合。该结合构成空间位阻，由此slr1841基因的转录受到抑制。其结果，蓝细菌的slr1841基因的表达受到抑制。
以下，对将上述2个基因分别导入蓝细菌的染色体DNA的方法具体地进行说明。
(1-1)dCas9基因的导入
以集胞藻(Synechocystis)LY07株(以下也称为LY07株)(参照非专利文献8)的染色体DNA为模板，使用表1中记载的引物psbA1-Fw(序列号13)和psbA1-Rv(序列号14)通过PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)法对用于控制dCas9基因和dCas9基因的表达的操纵基因、以及成为基因导入的标记的大观霉素抗性标记基因进行扩增。其中，LY07株中，上述3个基因以连接的状态插入到染色体DNA上的psbA1基因中，因此可以作为1个DNA片段通过PCR法进行扩增。在此，将得到的DNA片段记为“psbA1：：dCas9盒”。使用In-FusionPCR克隆法(注册商标)，将psbA1：：dCas9盒插入到pUC19质粒中，得到pUC19-dCas9质粒。
表1
引物名 碱基序列 序列号
psbA1-Fw 5′-CAGTGAATTCGAGCTCGGTATATAGCGTTGCAGTCCCTGG-3′ 13
psbA1-Rv 5′-GATTACGCCAAGCTTGCATGACCGCGGTCACTTCATAACC-3′ 14
slr2030-Fw 5′-CAGTGAATTCGAGCTCGGTAATAACCGTTGTCCCTTTTGTTTCATCG-3′ 15
sgRNA_slr1841-Rv 5′-TGTTAGTGAGCCCTGCTGTTAGCTCCCAGTATCTCTATCACTGAT-3′ 16
sgRNA-slr1841-Fw 5′-ACAGCAGGGCTCACTAACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA-3′ 17
slr2031-Rv 5′-GATTACGCCAAGCTTGCATGGGGAACAAGCTGAATCTGGGCATC-3′ 18
sgRNA_slr0688-Rv 5′-TTTTAGTCTGTTTGCTGCATAGCTCCCAGTATCTCTATCACTGAT-3′ 19
sgRNA_slr0688-Fw 5′-TGCAGCAAACAGACTAAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA-3′ 20
将得到的pUC19-dCas9质粒1μg与蓝细菌培养液(菌体浓度OD730＝0.5左右)混合，通过自然转化将pUC19-dCas9质粒导入到蓝细菌的细胞内。通过使转化后的细胞在含有20μg/mL的大观霉素的BG-11琼脂培养基上生长来进行筛选。在筛选出的细胞中，染色体DNA上的psbA1基因与pUC19-dCas9质粒上的psbA1上游片段区域和psbA1下游片段区域之间发生同源重组。由此，得到在psbA1基因区域插入有dCas9盒的集胞藻dCas9株。其中，所使用的BG-11培养基的组成如表2所示。
表2
成分 含量(mg/L)
EDTA-Na 1
柠檬酸铁铵 6
NaNO3 1500
MgSO4 75
K2HPO4 39
CaCl2 28.6
H3BO4 2.8
MnCl2 1.8
ZnSO4 0.2
CuSO4 0.08
Na2MoO4 002
Co(NO3)2 0.005
TES-KOH(pH 7.5) 4580
(1-2)slr1841_sgRNA基因的导入
在CRISPR干扰法中，通过向sgRNA基因上的被称为前间隔序列(protospacer)的区域导入与靶序列互补的约20个碱基的序列，sgRNA与靶基因特异性结合。将本实施例中使用的前间隔序列示于表3。
表3
前间隔序列靶基因 碱基序列 序列号
slr1841 5′-ACAGCAGGGCTCACTAACA-3′ 21
slr0688 5′-TGCAGCAAACAGACTAAAA-3′ 22
集胞藻LY07株中，sgRNA基因(前间隔序列区域除外)与卡那霉素抗性标记基因以连接的形式插入到染色体DNA上的slr2030-slr2031基因中。因此，通过对利用PCR法扩增该sgRNA基因时使用的引物赋予与slr1841基因(序列号7)互补的前间隔序列(序列号21)，能够容易地得到特异性识别slr1841的sgRNA(slr1841_sgRNA)。
首先，以LY07株的染色体DNA为模板，使用表1中记载的引物slr2030-Fw(序列号15)和sgRNA_slr1841-Rv(序列号16)的组、以及sgRNA_slr1841-Fw(序列号17)和slr2031-Rv(序列号18)的组，通过PCR法对2个DNA片段进行扩增。
接着，以上述DNA片段的混合溶液为模板，使用表1中记载的引物slr2030-Fw(序列号15)和slr2031-Rv(序列号18)通过PCR法进行扩增，由此得到(i)slr2030基因片段、(ii)slr1841_sgRNA、(iii)卡那霉素抗性标记基因、(iv)slr2031基因片段依次连接而成的DNA片段(slr2030-2031：：slr1841_sgRNA)。使用In-Fusion PCR克隆法(注册商标)，将s1r2030-2031：：slr1841_sgRNA插入到pUC19质粒中，得到pUC19-slr1841_sgRNA质粒。
通过与上述(1-1)同样的方法将pUC19-slr1841_sgRNA质粒导入到集胞藻dCas9株中，在含有30μg/mL卡那霉素的BG-11琼脂培养基上对转化后的细胞进行筛选。由此，得到在染色体DNA上的slr2030-slr2031基因中插入有slr1841_sgRNA的转化体集胞藻dCas9slr1841_sgRNA株(以下也称为slr1841抑制株)。
(1-3)slr1841基因的抑制
上述dCas9基因和s1r1841_sgRNA基因的启动子序列被设计为可在无水四环素(aTc)的存在下被表达诱导。本实施例中，通过在培养基中添加终浓度为1μg/mL的aTc，抑制了slr1841基因的表达。
(实施例2)
实施例2中，通过下述的步骤，得到编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的slr0688基因的表达受到抑制的修饰蓝细菌。
(2)slr0688基因的表达受到抑制的蓝细菌修饰株的构建
通过与上述(1-2)同样的步骤，将包含与slr0688基因(序列号4)互补的前间隔序列(序列号22)的sgRNA基因导入到集胞藻dCas9株中，得到集胞藻dCas9 slr0688_sgRNA株。其中，使用表1中记载的引物slr2030-Fw(序列号15)和sgRNA_slr0688-Rv(序列号19)的组、以及sgRNA_slr0688-Fw(序列号20)和slr2031-Rv(序列号18)的组；和使用In-Fusion PCR克隆法(注册商标)将(i)slr2030基因片段、(ii)slr0688_sgRNA、(iii)卡那霉素抗性标记基因、(iv)slr2031基因片段依次连接而成的DNA片段(slr2030-2031：：slr0688_sgRNA)插入到pUC19质粒中，得到pUC19-slr0688_sgRNA质粒，除此以外，在与上述(1-2)同样的条件下进行。
此外，通过与上述(1-3)同样的步骤，抑制了slr0688基因的表达。
(比较例1)
比较例1中，通过与实施例1的(1-1)同样的步骤，得到集胞藻dCas9株。
接着，对于实施例1、实施例2和比较例1中得到的菌株，分别进行细胞表层的状态的观察和蛋白的分泌生产率试验。以下，对详细情况进行说明。
(3)菌株细胞表层的状态的观察
分别制作实施例1中得到的修饰蓝细菌集胞藻dCas9 slr1841_sgRNA株(即slr1841抑制株)、实施例2中得到的修饰蓝细菌集胞藻dCas9slr0688_sgRNA株(以下也称为slr0688抑制株)、以及比较例1中得到的修饰蓝细菌集胞藻dCas9株(以下称为对照株)的超薄切片，使用电子显微镜观察细胞表层的状态(换言之，外膜结构)。
(3-1)菌株的培养
以初始菌体浓度OD730＝0.05的方式，将实施例1的slr1841抑制株接种于含有1μg/mL aTc的BG-11培养基，在光量为100μmol/m2/s、30℃的条件下振荡培养5天。另外，实施例2的slr0688抑制株和比较例1的对照株也在与实施例1同样的条件下进行培养。
(3-2)菌株的超薄切片的制作
将上述(3-1)中得到的培养液在室温下以2,500g离心分离10分钟，回收实施例1的slr1841抑制株的细胞。接着，将细胞用-175℃的液体丙烷急速冷冻后，使用含有2％戊二醛和1％单宁酸的乙醇溶液在-80℃下固定2天。利用乙醇对固定后的细胞进行脱水处理，使脱水后的细胞浸透到氧化丙烯中后，沉入树脂(Quetol-651)溶液中。然后，在60℃下静置48小时，使树脂固化，用树脂将细胞包埋。使用超薄切片机(Ultracut)将树脂中的细胞薄切成70nm的厚度，制作超薄切片。使用2％乙酸铀和1％柠檬酸铅溶液对该超薄切片进行染色，准备实施例1的slr1841抑制株的透射型电子显微镜的试样。另外，对于实施例2的slr0688抑制株和比较例1的对照株也分别进行同样的操作，准备透射型电子显微镜的试样。
(3-3)利用电子显微镜的观察
使用透射型电子显微镜(JEOL JEM-1400Plus)，在100kV的加速电压下，进行上述(3-2)中得到的超薄切片的观察。将观察结果示于图3～图8。
首先，对实施例1的slr1841抑制株进行说明。图3是实施例1的slr1841抑制株的TEM(Transmission Electron Microscope，透射型电子显微镜)图像。图4是图3的虚线区域A的放大图像。图4的(a)是图3的虚线区域A的放大TEM图像，图4的(b)是描绘了图4的(a)的放大TEM图像的图。
如图3所示，在实施例1的slr1841抑制株中，外膜从细胞壁部分地剥离(即外膜部分地剥落)，且外膜部分地弯曲。
为了更详细地确认细胞表层的状态，对虚线区域A进行放大观察，结果如图4的(a)和图4的(b)所示，确认到外膜部分地剥落的部分(图中的单点虚线区域a1和a2)。另外，在单点虚线区域a1的旁边确认到外膜大幅弯曲的部分。考虑该部分是外膜与细胞壁的结合减弱的部分，由于培养液从外膜浸透到胞外质内，因此外膜向外侧膨胀而弯曲。
接着，对实施例2的slr0688抑制株进行说明。图5是实施例2的slr0688抑制株的TEM图像。图6是图5的虚线区域B的放大图像。图6的(a)是图5的虚线区域B的放大TEM图像，图6的(b)是描绘了图6的(a)的放大TEM图像的图。
如图5所示，在实施例2的slr0688抑制株中，外膜从细胞壁部分地剥离，且外膜部分地弯曲。另外，确认到slr0688抑制株中，外膜部分地从细胞壁脱离。
为了更详细地确认细胞表层的状态，对虚线区域B进行放大观察，结果如图6的(a)和图6的(b)所示，确认到外膜大幅弯曲的部分(图中的单点虚线区域b1)和外膜部分地剥落的部分(图中的单点虚线区域b2和b3)。另外，在单点虚线区域b1、b2及b3各自的附近还确认到外膜从细胞壁脱离的部分。
接着，对比较例1的对照株进行说明。图7是比较例1的对照株的TEM图像。图8是图7的虚线区域C的放大图像。图8的(a)是图7的虚线区域C的放大TEM图像，图8的(b)是描绘了图8的(a)的放大TEM图像的图。
如图7所示，比较例1的对照株的细胞表层整齐，保持依次层叠有内膜、细胞壁、外膜和S层的状态。即，在对照株中，没有发现如实施例1和2那样外膜从细胞壁脱离的部分、外膜从细胞壁剥离(即剥落)的部分、以及外膜弯曲的部分。
(4)蛋白的分泌生产率试验
分别培养实施例1的slr1841抑制株、实施例2的slr0688抑制株和比较例1的对照株，测定分泌到细胞外的蛋白量(以下也称为分泌蛋白量)。根据培养液中的蛋白量，评价上述菌株各自的蛋白的分泌生产率。其中，蛋白的分泌生产率是指通过将在细胞内产生的蛋白分泌到细胞外来生产蛋白的能力。以下，对具体的方法进行说明。
(4-1)菌株的培养
用与上述(3-1)同样的方法培养实施例1的slr1841抑制株。培养独立地进行3次。另外，对于实施例2和比较例1的菌株，也在与实施例1的菌株同样的条件下进行培养。
(4-2)分泌到细胞外的蛋白的定量
将上述(4-1)中得到的培养液在室温下以2,500g离心分离10分钟，得到培养上清液。使用孔径为0.22μm的膜过滤器对得到的培养上清液进行过滤，完全除去实施例1的slr1841抑制株的细胞。通过BCA(Bicinchoninic Acid，二喹啉甲酸)法对过滤后的培养上清液中所含的总蛋白量进行定量。对独立培养得到的3个培养液分别进行这一系列操作，求出实施例1的slr1841抑制株分泌到细胞外的蛋白量的平均值和标准偏差。另外，对于实施例2和比较例1的菌株，分别在同样的条件下进行3个培养液的蛋白的定量，求出3个培养液中的蛋白量的平均值和标准偏差。
将结果示于图9。图9是表示实施例1、实施例2和比较例1的修饰蓝细菌的培养液中的蛋白量(n＝3、误差条＝SD)的图表。
如图9所示，实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株与比较例1的对照株相比，分泌到培养上清液中的蛋白量(mg/L)均提高了约25倍。
虽然省略数据的记载，但测定培养液的吸光度(730nm)，计算了每1g菌体干燥重量的分泌蛋白量(mg蛋白/g菌体干燥重量)，结果实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株的每1g菌体干燥重量的分泌蛋白量(mg蛋白/g菌体干燥重量)与比较例1的对照株相比均提高了约36倍。
另外，如图9所示，与抑制了编码SLH结构域保持型外膜蛋白的基因(slr1841)的表达的实施例1的slr1841抑制株相比，抑制了编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因(slr0688)的表达的实施例2的slr0688抑制株分泌到培养上清液中的蛋白量更多。考虑这与细胞壁表面的共价键型的糖链的数量比外膜中的SLH结构域保持型外膜蛋白(Slr1841)的数量多有关。即，考虑实施例2的slr0688抑制株与实施例1的slr1841抑制株相比，外膜与细胞壁的结合量及结合力进一步降低，因此所分泌的蛋白量比实施例1的slr1841抑制株多。
由以上结果确认了，通过抑制与外膜和细胞壁的结合相关的蛋白的功能，蓝细菌的外膜与细胞壁的结合被部分地变弱，外膜从细胞壁部分地脱离。还确认了，由于外膜与细胞壁的结合变弱，在蓝细菌的细胞内产生的蛋白变得容易漏出到细胞外。因此，根据本实施方式的修饰蓝细菌及其制造方法，显示出蛋白的分泌生产率大幅提高。
(5)所分泌的蛋白的鉴定
接着，通过LC-MS/MS鉴定上述(4-2)中得到的培养上清液中所含的分泌蛋白。以下对方法进行说明。
(5-1)试样制备
加入相对于培养上清液的液量为8倍量的冷丙酮，在20℃下静置2小时后，在20,000g下离心分离15分钟，得到蛋白的沉淀物。在该沉淀物中加入100mM Tris pH8.5、0.5％的十二烷酸钠(SDoD)，利用密闭式超声波破碎机溶解蛋白。调整至蛋白浓度为1μg/mL后，添加终浓度为10mM的二硫苏糖醇(DTT)，在50℃下静置30分钟。接着，添加终浓度为30mM的碘乙酰胺(IAA)，在室温(遮光)下静置30分钟。为了停止IAA的反应，添加终浓度为60mM的半胱氨酸，在室温下静置10分钟。添加胰蛋白酶400ng，在37℃下静置一晚，将蛋白进行肽片段化。加入5％TFA(Trifluoroacetic Acid，三氟乙酸)后，在室温下以15,000g离心分离10分钟，得到上清液。通过该操作除去SDoD。使用C18旋转柱进行脱盐后，利用离心蒸发器使试样干固。然后，加入3％乙腈、0.1％甲酸(formic acid)，使用密闭式超声波破碎机将试样溶解。以肽浓度达到200ng/μL的方式进行制备。
(5-2)LC-MS/MS分析
使用LC-MS/MS装置(UltiMate 3000RSLCnano LC System)在以下的条件下对上述(5-1)中得到的试样实施分析。
试样注入量：200ng
柱：CAPCELL CORE MP 75μm×250mm
溶剂：A溶剂为0.1％甲酸水溶液，B溶剂为0.1％甲酸+80％乙腈
梯度程序(gradient program)：试样注入4分钟后使B溶剂为8％、27分钟后使B溶剂为44％、28分钟后使B溶剂为80％、34分钟后测定结束
(5-3)数据分析
得到的数据在以下的条件下进行分析，进行蛋白和肽的鉴定以及定量值的计算。
软件：Scaffold DIA
数据库：UniProtKB/Swiss Prot database(集胞藻PCC 6803)
破碎(Fragmentation)：HCD
前体公差(Precursor Tolerance)：8ppm
片段公差(Fragment Tolerance)：10ppm
数据采集类型(Data Acquisition Type)：重叠DIA
肽长度(Peptide Length)：8-70
肽电荷(Peptide Charge)：2-8
最大漏切数量(Max Missed Cleavages)：1
固定修饰(Fixed Modification)：半胱氨酸碘乙酰胺化(Carbamidomethylation)
肽FDR(Peptide FDR)：1％以下
将从所鉴定的蛋白中相对定量值最大的30种蛋白中推测的具有明显的酶活性的蛋白示于表4。
表4
蛋白名 Uniprot登录ID 基因名
1 羧基末端蛋白酶 P73458 Prc
2 铁摄入蛋白A2 Q55835 futA2
3 胞外核酸酶 P72938 nucH
4 碱性磷酸酶 P72939 sll0654
5 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶 P73736 amiA
6 肽基脯氨酰基顺反异构酶 P73037 ytfc
这6种蛋白全部分别包含在实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株的培养上清液中。在这些蛋白中，全部保持有胞外质(指外膜与内膜的间隙)转移信号。根据该结果确认了，在实施例1和实施例2的修饰株中，外膜从细胞壁部分地脱离，由此胞外质内的蛋白变得容易漏出到外膜之外(即菌体外)。因此，显示出本实施方式的修饰蓝细菌的蛋白的分泌生产率大幅提高。
(6)所分泌的细胞内代谢产物的鉴定
(6-1)试样制备
相对于修饰蓝细菌的培养上清液80μl，加入20μl的水溶液，将内部标准物质的浓度调整为1,000μM，搅拌、超滤后，供于测定。
(6-2)CE(Capillary electrophoresis，毛细管电泳)-TOFMS(Time-Of-FlightMass Spectrometry，飞行时间质谱)分析
在本试验中，在以下所示的条件下进行阳离子模式和阴离子模式的测定。
[阳离子模式]
装置：Agilent CE-TOFMS系统
毛细管：熔融石英毛细管i.d.50μm×80cm
测定条件：
电泳缓冲液(Run buffer)：阳离子缓冲液(p/n：H3301-1001)
CE电压：阳极，30kV
MS电离：ESI阳极
MS扫描范围：m/z 50-1,000
[阴离子模式]
装置：Agilent CE-TOFMS系统
毛细管：熔融石英毛细管i.d.50μm×80cm
测定条件：
电泳缓冲液(Run buffer)：阴离子缓冲液(p/n：H3301-1001)
CE电压：阳极，30kV
MS电离：ESI阴极
MS扫描范围：m/z 50-1,000
(6-3)数据处理
使用自动积分软件MasterHands(注册商标)ver.2.17.1.11，自动检测由CE-TOFMS检测到的峰的信号/噪声比为3以上的峰。对于检测出的峰，根据各代谢产物固有的质荷比(m/z)和泳动时间的值，与在HMT(Human Metabolome Technologies(株式会社))的代谢物质库中登记的全部物质的值进行对照，检索修饰蓝细菌的培养上清液中所含的代谢产物。用于检索的容许误差：泳动时间为+/-0.5min，m/z为+/-10ppm。关于所鉴定的各代谢产物，作为100μM的单点校准计算出浓度。所鉴定的主要代谢产物见表5。
表5
这12种细胞内代谢产物全部包含在实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株的培养上清液中。虽然没有记载数据，但比较例1的对照株的培养上清液中不包含这些代谢产物。根据该结果确认了，在实施例1和实施例2的修饰株中，外膜从细胞壁部分地脱离，由此细胞内代谢产物变得容易漏出到外膜之外(即菌体外)。
(7)栽培试验及酸性转化酶活性测定试验
接着，为了评价修饰蓝细菌的分泌物(在此为修饰蓝细菌的培养上清液)的植物酸性转化酶活化效果，实施了以下的植物栽培试验。具体而言，为了评价对叶菜类生产的效果，实施了菠菜的栽培试验。另外，为了评价对果实生产的效果，实施了草莓的栽培试验。以下，对这些栽培试验分别进行说明。
(7-1)菠菜栽培试验
首先，在栽培用盆(12cm×10cm)中加入市售的培养土，每盆播种3粒菠菜的种子。在室内温度为23℃、白色光源的光量子通量密度为200μmol/m2/s、亮条件为10小时和暗条件为14小时的条件下进行40天栽培。在此期间，每隔2天向各盆供水50mL的蒸馏水。从栽培开始起大约1周后，在子叶展开的阶段将子叶间隔剔除，使各盆中的个体尺寸一致。
(实施例3)
在如上所述使各盆的个体尺寸一致后，将修饰蓝细菌的培养上清液(以下称为修饰蓝细菌的分泌物)每1株5mL、1周1次添加到菠菜的根部。栽培40天并收获后测定地上部分干重，求出其平均值及标准偏差(SD)。另外，利用下述所示的方法测定酸性转化酶活性，求出其平均值及标准偏差(SD)。其中，修饰蓝细菌为实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株。
(酸性转化酶活性测定)
从各株切取数片叶片为10cm左右的叶，测定重量。将叶用液氮冷冻后，用乳钵捣碎。向其中加入3mL下述的提取缓冲液，使用玻璃均质器均化，制备提取液。将该提取液20μL加入到180μL的酸性转化酶反应用溶液(由50mM醋酸钠(pH为4.3)、0.1M蔗糖构成)中，在30℃下静置1小时，使提取液与酸性转化酶反应溶液反应。然后，在85℃下孵育3分钟，使反应停止。使用市售的葡萄糖定量试剂盒对在该反应期间生成的葡萄糖量进行定量。根据该值，计算出1g叶重量在1小时中生成的葡萄糖量作为酸性转化酶活性，求出其平均值及标准偏差(SD)。
＜提取缓冲液＞
提取缓冲液由下述组成构成。
100mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)-KOH pH为7.4
5mM MgCl2
1mM EDTA(乙二胺四乙酸)
1mM EGTA(乙二醇双(β-氨基乙基醚)-四乙酸)
1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)
5mM DTT(二硫苏糖醇)
1mL/L Triton X-100
200mL/L甘油
5mM硫脲
(比较例2)
除了使用水代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例3同样地进行。
(结果)
将实施例3和比较例2的结果示于图10和图11。图10是表示实施例3和比较例2中栽培的菠菜的酸性转化酶活性的平均值的图表。图11是表示实施例3和比较例2中栽培的每1株菠菜的地上部分干燥重量的平均值(称为平均株重量)的图表。
如图10所示，与比较例2相比，实施例3中栽培的菠菜的酸性转化酶活性上升至约2.3倍。
另外，如图11所示，与比较例1相比，实施例3中栽培的菠菜的株重量增加至约1.4倍。
因此，确认了当将修饰蓝细菌的分泌物施用给菠菜时，菠菜的酸性转化酶被活化，以及通过酸性转化酶的活化，可见菠菜的生长促进、以及体积增加等效果。
(7-2)草莓栽培试验
将叶片数为约9片、株长为约7cm的草莓苗定植于装有市售的培养土的栽培用盆(12cm×10cm)中。在明期温度为20℃、暗期温度为15℃、白色光源的光量子通量密度为200μmol/m2/s、明条件为14小时和暗条件为10小时的条件下进行150天栽培。在此期间，每隔1天向各盆供水50mL的蒸馏水。另外，50天时向各盆每一盆施用100mL市售的化肥(含有氮总量6％、水溶性磷酸10％、水溶性钾5％、水溶性氧化镁0.05％、水溶性锰0.001％和水溶性硼0.005％的原液的500倍稀释液)。
(实施例4)
在上述栽培期间中，将修饰蓝细菌的分泌物每1株5mL、1周1次添加到根部。草莓果实从红色成熟的草莓起依次收获，记录收获的果实数。另外，测定所收获的果实的重量和糖度(Brix值)，求出它们的平均值和标准偏差(SD)。另外，除了使用数个果实之外，用与实施例3同样的方法测定酸性转化酶活性。在此，将1g果实在1小时中生成的葡萄糖量作为酸性转化酶活性。其中，修饰蓝细菌为实施例1的slr1841抑制株和实施例2的slr0688抑制株。
(比较例3)
除了使用水代替修饰蓝细菌的分泌物以外，与实施例4同样地进行。
(结果)
将实施例4和比较例3的结果示于图12～图16。图12是表示实施例4和比较例3中栽培的草莓的酸性转化酶活性的平均值的图表。图13是表示实施例4和比较例3中栽培的每1株草莓的平均果实数的图表。图14是表示实施例4和比较例3中栽培的每1株草莓的平均果实重量的图表。图15是表示实施例4和比较例3中栽培的每1株草莓的平均糖度的图表。
另外，为了在视觉上显示实施例4和比较例3各自的果实的状态，在图16中记载有代表性的果实的照片。
如图12所示，与比较例1相比，实施例3中栽培的草莓的植物酸性转化酶活性上升至约2.3倍。
另外，如图13所示，与比较例3相比，实施例4中收获的每1株的平均果实数增加至约1.4倍。
另外，如图14所示，实施例4中收获的草莓的平均果实重量没有显著性差异。即，实施例4中栽培的草莓虽然每1株收获的果实数增多，但平均果实重量与比较例3为同等。
另外，如图15所示，与比较例3相比，实施例4中收获的草莓果实的平均糖度(Brix糖度)提高了约1.1倍。即，实施例4中栽培的草莓尽管收获的果实数增多，但果实的平均糖度也变高了。
另外，如图16所示，实施例4和比较例3中分别收获的草莓在果实的大小、形状和色味等外观上没有差异。即，实施例4中栽培的草莓尽管收获的果实数增多，但果实的尺寸等也与比较例3为同等。
因此，确认了当将修饰蓝细菌的分泌物施用给草莓时，草莓的酸性转化酶被活化，以及通过酸性转化酶的活化，可见草莓的生长促进、果实数的增加、果实尺寸的维持、以及果实糖度的上升等效果。
(总结)
从菠菜和草莓的栽培试验以及酸性转化酶活性测定的结果确认了，本实施方式的植物酸性转化酶活化剂对多个作物种类具有生长促进、增收、体积增加、以及果实的糖度上升等效果。
产业上的可利用性
根据本公开，能够提供一种植物酸性转化酶活化剂物质的分泌生产率提高的修饰蓝细菌。另外，当培养本公开的修饰蓝细菌时，能够高效地制造上述物质，例如通过将该物质添加到土中，能够使植物的酸性转化酶活化，因此能够增进作物生产。
符号说明
1 内膜
2 肽聚糖
3 糖链
4 细胞壁
5 外膜
6 SLH结构域保持型外膜蛋白
7 SLH结构域
8 有机物通道蛋白
9 细胞壁-丙酮酸修饰酶

Claims (10)

1.一种植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其包含：
准备修饰蓝细菌的步骤，所述修饰蓝细菌的在蓝细菌中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失；以及
使所述修饰蓝细菌分泌参与植物的酸性转化酶的活化的分泌物的步骤。
2.根据权利要求1所述的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其中，参与所述外膜与所述细胞壁的结合的蛋白是SLH(Surface Layer Homology，表层同源性)结构域保持型外膜蛋白和细胞壁-丙酮酸修饰酶中的至少1种。
3.根据权利要求2所述的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其中，所述SLH结构域保持型外膜蛋白是：
由序列号1所示的氨基酸序列构成的Slr1841、
由序列号2所示的氨基酸序列构成的NIES970_09470、
由序列号3所示的氨基酸序列构成的Anacy_3458、或者
氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个SLH结构域保持型外膜蛋白相同的蛋白。
4.根据权利要求2所述的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其中，所述细胞壁-丙酮酸修饰酶是：
由序列号4所示的氨基酸序列构成的Slr0688、
由序列号5所示的氨基酸序列构成的Synpcc7942_1529、
由序列号6所示的氨基酸序列构成的Anacy_1623、或者
氨基酸序列的50％以上与这些中的任一个细胞壁-丙酮酸修饰酶相同的蛋白。
5.根据权利要求1所述的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其中，表达参与所述外膜与所述细胞壁的结合的蛋白的基因缺失或失活。
6.根据权利要求5所述的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其中，表达参与所述外膜与所述细胞壁的结合的蛋白的基因是编码SLH结构域保持型外膜蛋白的基因和编码细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因中的至少1种。
7.根据权利要求6所述的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其中，编码所述SLH结构域保持型外膜蛋白的基因是：
由序列号7所示的碱基序列构成的slr1841、
由序列号8所示的碱基序列构成的nies970_09470、
由序列号9所示的碱基序列构成的anacy_3458、或者
碱基序列的50％以上与这些中的任一个基因相同的基因。
8.根据权利要求6所述的植物酸性转化酶活化剂的制造方法，其中，编码所述细胞壁-丙酮酸修饰酶的基因是：
由序列号10所示的碱基序列构成的slr0688、
由序列号11所示的碱基序列构成的synpcc7942_1529、
由序列号12所示的碱基序列构成的anacy_1623、或者
碱基序列的50％以上与这些中的任一个基因相同的基因。
9.一种植物酸性转化酶活化剂，其含有在蓝细菌中参与外膜与细胞壁的结合的蛋白的功能受到抑制或丧失的修饰蓝细菌的分泌物。
10.一种植物酸性转化酶活化方法，其中，对植物使用权利要求9所述的植物酸性转化酶活化剂。
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