CN116593706A - 以β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点在制备检测孤独症试剂盒中的应用 - Google Patents

以β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点在制备检测孤独症试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了以β‑甲氨基‑L‑丙氨酸为靶点在制备检测孤独症试剂盒中的应用，同时记载了一种检测孤独症的试剂盒，试剂盒包括特异性与β‑甲氨基‑L‑丙氨酸结合的ELISA试剂，属于孤独症检测技术领域，本发明在血清水平上直接对孤独症进行检测，节约了检测时间，提高了检测结果的准确度。

Description

以β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点在制备检测孤独症试剂盒中的 应用
技术领域
本发明涉及孤独症检测技术领域，更具体地说是涉及以β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点在制备检测孤独症试剂盒中的应用。
背景技术
孤独症(autism)，又称孤独性障碍(autistic disorder)等，是广泛性发育障碍(pervasive developmental disorder，PDD)的代表性疾病。《DSM-IV-TR》将PDD分为5种：孤独性障碍、Retts综合症、童年瓦解性障碍、阿斯伯格综合征和未特定的PDD。其中，孤独性障碍与阿斯伯格综合征较为常见。
孤独症分为真性孤独症和假性孤独症。真性孤独症(器质性孤独症)是患者由于基因突变造成大脑思维功能缺失，失去或严重缺失思维功能。他们的面相与常人无异，但其先天缺失总结、归纳、分析、判断等逻辑思维能力，终身智力低下。假性孤独症(功能性孤独症)是指患儿大脑思维区域无器质性病变，具有正常的思维能力，但是他们智力的缺失是由于后天某项能力的发展不平衡。假性孤独症与真性孤独症存在本质的区别。真性孤独症是由基因突变所致，根据演算所得人类真性孤独症比例应该接近十五万分之一，推算出中国每年出生真性孤独症儿童应该不超过120个，美国每年出生真性孤独症患者应低于36个。真性孤独症是应该属于罕见疾病。目前没有有效的康复办法。假性孤独症是由于影响人类学习能力中的几项能力要素发展不均衡。即某项能力极弱或某项能力过强，致使患儿有可能丧失部分或全部的思维能力，造成终身智力缺陷，表现出真性孤独症的特质。
孤独症的诊断目前较为普遍的方法是采用儿童孤独症评定量表来进行诊断。该表是1980年由E.Schopler、R.J.Reichler和B.R.Renner所编制的。儿童孤独症评定量表是根据儿童的表现，对儿童的人际关系、模仿(词和动作)、情感反应、躯体应用能力、与非生命物体的关系、对环境变化的适应、视觉反应、听觉反应、近处感觉反应、焦虑反应、语言交流、非语言交流、活动水平、智力功能和总的印象等十五个方面进行评分。评分标准如下：总分低于30分：无孤独症；30-60分：有孤独症；其中30-37分：为轻到中度孤独症；37-60分：重度自用儿童孤独症评定量表诊断孤独症，这种方法主要依靠主观经验判断，会影响诊断的准确率，对孤独症严重程度的分级评定造成影响。
因此，如何提供一种血清标志物以作为孤独症的检测标志是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明以β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点制备检测孤独症的试剂盒，提高了孤独症检测的灵敏度和特异性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
以β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点在制备检测孤独症试剂盒中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种检测孤独症的试剂盒，所述试剂盒包括特异性与β-甲氨基-L-丙氨酸结合的ELISA试剂。
优选地，所述ELISA检测试剂包括山羊抗兔抗体的磷酸盐缓冲液、冻干BMAA校准品/标准品、兔抗BMAA的抗体溶液、HRP标记的BMAA溶液、洗涤液、TMB显色液和终止液。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种以试剂盒进行孤独症检测的方法，过程包括：
步骤一：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16h；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
步骤二：将冻干的BMAA校准品/标准品用纯化水溶解，稀释BMAA校准品/标准品的浓度分别为0ppb、5ppb、25ppb、100ppb、250ppb、500ppb；
步骤三：在包被好的ELISA板孔中加入下述溶液：100μl BMAA参考品/标准溶液或100μl样品溶液，50μl BMAA-HRP结合液，50μl BMAA抗体溶液；每个BMAA参考品/标准溶液或样品至少做2个重复孔；
步骤四：混匀30秒后，室温下避光孵育90min；
步骤五：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
步骤六：于终止反应后15min内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值；
步骤七：绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品BMAA的浓度；
步骤八：根据样品的BMAA的浓度，进行孤独症严重程度的分级评定。
以上技术方案达到的技术效果是：本发明在进行孤独症与肠道微生物相关性的研究过程中，发现，肠道微生物中存在的原核生物Cyanobacteria与孤独症的发生存在显著的相关性，这表明原核生物Cyanobacteria与孤独症的发生有密切的关系。而β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)是原核生物Cyanobacteria分泌的一种神经毒素，本发明发现β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)的浓度与孤独症严重程度有显著相关性，且BMAA浓度越高，孤独症越严重。说明BMAA可能是导致孤独症发生的重要原因。本发明将血清中的BMAA含量作为孤独症严重程度分级的检测标志物，通过检测BMAA的浓度来确定孤独症的严重程度，改变了目前采用的依靠孤独症评定量表诊断孤独症，确定孤独症严重程度的方法，克服了孤独症严重程度分级的诊断较大程度的依赖于主观经验判断的缺陷，极大提高了诊断准确率。
本发明提供的试剂盒检测时间只需要3h左右，而且只需要对孤独症患者进行静脉采血。本发明的ELISA检测试剂盒较现有孤独症检测技术具有客观、简便、快捷等特点，减少了孤独症患者的参与时间，也极大地减少了医护人员的工作难度。再者，相较于依靠孤独症评定量表诊断孤独症，确定孤独症严重程度的方法，本发明检测BMAA的浓度灵敏度高，即使BMAA浓度发生轻微的变化也能检测的出来，因此将来会有非常广泛的用途，比如在临床上对孤独症治疗疗效的评价，孤独症患者病情的动态监测等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明ELISA试剂盒进行对照组和孤独症组的BMAA浓度测定的ROC曲线分析图；
图2是本发明ELISA试剂盒进行孤独症严重程度检测和分级评定的ROC曲线分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了评估血清中BMAA的浓度能否作为孤独症严重程度的评价因子，本发明通过收集孤独症患者的血液样本，进行ELISA实验检测孤独症患者血清中BMAA的浓度，并根据浓度评定患者孤独症严重程度的分级情况，再与医生通过儿童孤独症评定量表的诊断结果进行比较，发现二者结果一致性达到了90％，说明本发明提供的ELISA试剂盒可以替代儿童孤独症评定量表用于孤独症严重程度的分级评价。
实施例1
本实施例运用ELISA检测分析孤独症患者的血液样本，继而进行统计分析，从而确定可以将BMAA的浓度作为是否患有孤独症及病情严重程度分级评定的生物标志物。具体步骤如下：
样品来源
样本来源及入选标准如下：
诊断为孤独症的患者。排除标准：①患有其他精神疾病(如精神分裂症)和其他神经发育障碍疾病；②患有遗传代谢性疾病；③患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史；
本研究分两期：一期进行本发明与孤独症评定量表诊断结果一致性的比较研究，第二期进行本发明与孤独症评定量表诊断方法的灵敏度的比较研究。
一期研究共收集10例孤独症患儿，男9例，女1例；年龄3～7岁；
二期研究收集9例患儿，其中6例孤独症患儿和3例发育迟缓患儿，孤独症患儿男6例，女0例；年龄3～7岁。3例发育迟缓患儿，男1例，女2例；年龄3～7岁；上述19例患者信息见表1；可知，两种孤独症严重程度的评价方法只有1例出现了不一致；另外，有3例采用的孤独症评定量表诊断结果医生认为是发育迟缓，不是孤独症，但是通过本发明的试剂盒检测，可以判定其孤独症的严重程度。可见本发明试剂盒的灵敏度是强于目前普遍采用的孤独症评定量表的。3名发育迟缓的患儿目前也在进行孤独症的康复训练，可见病情与孤独症是有很多相似性的。但是如果因为被评价为发育迟缓，可能会导致家长的不重视，从而延迟了对病情的干预和治疗。从这点来说，本发明具有更高的灵敏度是非常重要的。
表116例孤独症和3例发育缓慢患者的取样信息表
为了进一步表征β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点诊断的具体效果，现补充336例患者信息，以确定其可行性，见表2；
表2机构提供的336例血清样本信息表
对机构提供的336例血清样本进行分组，第一组是孤独症患者的血清组，336个样本中有123个孤独症的样本，年龄段为4-13岁。
第二组为从剩余样本中选出的对照组。入选标准为未患有神经性疾病，因此排除了神经感染2个，帕金森1个，脑部疾病(脑出血，脑梗等)7个，麻痹1个，颅内疾病19个，抽动障碍4个，鞍区病变4个，癫痫1个，以及其他与神经系统可能有关的疾病，比如晕厥、痉挛、焦虑等疾病共5个。然后再去掉因样本提供的血清样过少，无法进行BMAA浓度检测的样本14个，按年龄大小去掉年龄偏大的32个，最后选取123个样本做为对照组。这123个对照组样本的组成，含有子宫相关疾病人数4人，胸痛胸闷以及与心脏相关疾病的6人，正常体检55人，胃镜检查的4人，妊娠采血6人。全血、贫血病人采血的2个，关节炎，骨折共4人，甲状腺疾病13人，SLE(红斑狼疮)5人，另外还有包括眼科疾病，糖尿病，面部疾病，膀胱疾病，肠肿肠炎急性胰炎。低钾、喘憋、更年期、高血压、高血脂等其他与神经系统不相关的疾病共24人。对照组样本，年龄段为8天-67岁。
验证以BMAA为靶点进行孤独症诊断的可行性
对上述123例已知的孤独症患者和对照组的患者进行血液采集与获取上清(以BMAA为检测指标)，结果见表3和表4；
用一次性采血管采集静脉血约3ml，然后用离心机3000rpm离心5分钟，收集上清液为血清样品。
ELISA检测：
反应板包被：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
加入参考品/标准溶液：包被好的酶标板孔中依次加入100μl稀释好的BMAA校准品/标准品，浓度分别为0ppb、5ppb、25ppb、100ppb、250ppb、500ppb。每个浓度做至少两个平行孔。
加入血清样品：其他包被好的酶标板孔中依次加入100μl各个血清样品。
加入结合液：每孔加入50μl BMAA-HRP结合液。
加入抗体溶液：每孔加入50μl BMAA抗体溶液。
孵育：混匀30秒后，室温下避光孵育90分钟。
洗板：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。
显色和反应终止：洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
检测：于终止反应后15分钟内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值。
计算样品的BMAA浓度：绘制标准品450nm处吸光度与BMAA浓度的标准曲线，并根据标准曲线计算样品的BMAA浓度。
孤独症严重程度的分级评定：根据样品的BMAA浓度确定血清供试者孤独症严重程度。
试剂盒检测BMAA浓度与孤独症严重程度评价标准：BMAA浓度≤101ppb，孤独症严重程度为轻度到中度；BMAA浓度>101ppb，孤独症严重程度为重度。
上述各步骤涉及到的试剂的配制方法如下：
PBS：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.9g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCI)0.2g，加水至1000mL。
含0.2％吐温-20的PBS：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.9g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCI)0.2g，吐温-202mL，加水至1000mL。
本发明与孤独症评定量表诊断结果一致性分析：用本发明试剂盒和孤独症评定量表诊断123份患者样本，结果如表3所示：
表3分别用本发明ELISA试剂盒和孤独症评定量表诊断123份患者样本
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表4分别用本发明ELISA试剂盒和孤独症评定量表诊断123份对照组样本
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/>
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同时，为了验证BMAA的浓度可以用于进行孤独症的筛查和诊断，用本发明试剂盒和孤独症评定量表对123名孤独症患者和123名对照组患者的诊断结果进行统计分析，表明本发明试剂盒检测孤独症组与对照组血清中的BMAA浓度存在显著差异，P值为0.000，小于0.01。结果见表5。
表5本发明试剂盒检测孤独症组与对照组血清中的BMAA浓度T-test结果分析
T-Test检验结果，P值为0.000，小于0.01，显示BMAA浓度在孤独症组和对照组中存在显著差异。从两组BMAA浓度的均值来看，组别1(孤独症组)的浓度平均值为123.2154ng/ml，远远高于对照组的平均值71.8558ng/ml，因此123对数据的统计结果显示孤独症组样本的血清中含有的BMAA浓度高于对照组，且孤独症组与对照组血清中的BMAA浓度存在显著差异。
本发明试剂盒对对照组和孤独症组的BMAA浓度的ROC曲线分析显示，临界值为81.505ng/ml时，灵敏度为0.935，特异性为0.683(见图1)。具有较高的灵敏度和特异性，因此，BMAA的浓度可以用于进行孤独症的筛查和诊断。
本发明替代孤独症评定量表诊断孤独症严重程度的可行性和必要性，用本发明试剂盒和孤独症评定量表对100名孤独症患者严重程度的诊断结果进行统计分析，表明本发明试剂盒的检测的毒素浓度与孤独症评定量表评价结果具有显著相关性，相关系数为1.00，P值为0.011。结果见表6。
表6本发明试剂盒的检测的毒素浓度与孤独症评定量表评价结果相关性结果相关系数
孤独症严重程度 BMAA毒素浓度
Spearman的rho 孤独症严重程度 相关系数 1.000 0.615*
Sig.(双侧) 0.011
N 16 16
BMAA毒素浓度 相关系数 0.615* 1.000
Sig.(双侧) 0.011
N 16 16
*.在置信度(双侧)为0.05时，相关性是显著的。
本发明试剂盒孤独症严重程度分级结果的ROC曲线分析显示，AμC为0.857，P值为0.017，具有统计学意义。最佳临界值为101.1617，对应特异性为0.889，敏感性为0.857(见图2)，提示本试剂盒应用于孤独症严重程度的检测具有较高的敏感性和特异性。
实验结果表明患者血清BMAA浓度与孤独症严重程度具有显著相关性，因此采用本发明试剂盒检测患者血清中BMAA浓度来确定患者孤独症严重程度是可行的，ROC曲线分析结果也表明本发明试剂盒应用于孤独症严重程度的检测具有较高的敏感性和特异性。
而且由于本发明试剂盒采用ELISA方法进行患者血清中BMAA浓度的检测，ELISA的灵敏度能达到ng级，因此能非常灵敏的检测到患者血清中BMAA浓度的变化，这对于孤独症患者治疗效果和孤独症患者自身病情的变化状况的判断是极为有利的，因此本发明用来替代孤独症评定量表诊断孤独症严重程度具有很强的可行性和必要性。
实施例2验证BAMM浓度临界值作为诊断孤独症严重程度标准的准确性
机构的123例孤独症的病情严重情况是机构用孤独症量表进行病例诊断时提供的。接收样本时，所有样本按我们公司的要求进行了重新编号，ELISA人员只知道新的样本编号，并不知道对应样本的病情信息，因此检测是盲测的。如前所述，ROC分析所得孤独症严重程度的临界值是101.1617，我们用这个检测标准，对123例孤独症患者的严重程度进行揭盲，验证临界值作为检测标准的准确度，结果见表7。
揭盲标准为：
方法1：按病情描述划分，中重度与重度为一类，表示病情严重；轻度和中度为一类，表示病情较轻；
方法2：按BMAA浓度划分，检测浓度值≥101.1617ng/ml，表示病情严重，＜101.1617ng/ml表示病情较轻。
按以上标准，对孤独症患者按两个方法进行病情分类，统计二者一致的所占比例为用临界值作为孤独症严重程度标准的准确度。
表7分别用本发明ELISA试剂盒和孤独症评定量表诊断123份盲测样本
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/>
/>
由表7可知，123例盲测样本中出现了19例判断不一致的情况，准确度达到了84.6％。揭盲的结果显示，用样本血液中BMAA浓度的检测值≥101.1617ng/ml来确定孤独症的病情是否属于严重的情况，具有较高的准确度。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.以β-甲氨基-L-丙氨酸为靶点在制备检测孤独症试剂盒中的应用。
2.一种检测孤独症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性与β-甲氨基-L-丙氨酸结合的ELISA试剂。
3.根据权利要求2所述的一种检测孤独症的试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂包括山羊抗兔抗体的磷酸盐缓冲液、冻干BMAA校准品/标准品、兔抗BMAA的抗体溶液、HRP标记的BMAA溶液、洗涤液、TMB显色液和终止液。
4.一种以权利要求3的试剂盒进行孤独症检测的方法，其特征在于，过程包括：
步骤一：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16h；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
步骤二：将冻干的BMAA校准品/标准品用纯化水溶解，稀释BMAA校准品/标准品的浓度分别为0ppb、5ppb、25ppb、100ppb、250ppb、500ppb；
步骤三：在包被好的ELISA板孔中加入下述溶液：100μlBMAA参考品/标准溶液或100μl样品溶液，50μlBMAA-HRP结合液，50μlBMAA抗体溶液；每个BMAA参考品/标准溶液或样品至少做2个重复孔；
步骤四：混匀30秒后，室温下避光孵育90min；
步骤五：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
步骤六：于终止反应后15min内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值；
步骤七：绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品BMAA的浓度；
步骤八：根据样品的BMAA的浓度，进行孤独症严重程度的分级评定。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CA2535663C (en) * 2003-08-12 2011-02-08 Paul Alan Cox Neurotoxic amino acid or neurotoxic derivative thereof associated with neurological disorders
CN103308639B (zh) * 2013-05-17 2015-01-14 南京大学 一种水产品中蓝藻毒素β-甲氨基-L-丙氨酸含量的检测方法
KR102359013B1 (ko) * 2017-03-21 2022-02-04 콰드런트 바이오사이언시즈 인코포레이티드 자폐 스펙트럼 장애의 분석
CN107167610B (zh) * 2017-05-04 2019-12-06 深圳市英马诺生物科技有限公司 自闭症生物标志物及其检测试剂盒
CN107058560A (zh) * 2017-05-04 2017-08-18 深圳市英马诺生物科技有限公司 自闭症生物标志物及其检测试剂盒、应用
AU2020395776A1 (en) * 2019-12-02 2022-06-23 The Institute for Ethnomedicine dba Brain Chemistry Labs Methods of detection and analysis of nucleic acid in neural-derived exosomes

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