CN116590312A - 基因OsRPP13-L和OsRP1在提高水稻种子萌发盐胁迫耐性中的应用 - Google Patents
基因OsRPP13-L和OsRP1在提高水稻种子萌发盐胁迫耐性中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116590312A CN116590312A CN202310647350.6A CN202310647350A CN116590312A CN 116590312 A CN116590312 A CN 116590312A CN 202310647350 A CN202310647350 A CN 202310647350A CN 116590312 A CN116590312 A CN 116590312A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rice
- osrp1
- gene
- osrpp13
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 93
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 93
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 43
- 230000035784 germination Effects 0.000 title abstract description 17
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 114
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 29
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 9
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 16
- 239000002585 base Substances 0.000 description 16
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 7
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 7
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 241000746966 Zizania Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000981790 Oryza sativa subsp. japonica Transcription factor MYB2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 description 2
- 239000006661 aam medium Substances 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 2
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N (3aR,4R,9bS)-golgicide A Chemical compound C1([C@@H]2NC3=C(F)C=C(C=C3[C@H]3C=CC[C@H]32)F)=CC=CN=C1 NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)[14CH2]OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000037862 Ion Transporter Human genes 0.000 description 1
- 108091006671 Ion Transporter Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 108050006056 Myb domains Proteins 0.000 description 1
- 102000016538 Myb domains Human genes 0.000 description 1
- 101710111451 NAC domain-containing protein 23 Proteins 0.000 description 1
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101000880796 Oryza sativa subsp. japonica Dehydration-responsive element-binding protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101100403798 Oryza sativa subsp. japonica NAC002 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001017270 Oryza sativa subsp. japonica Transcription factor MYB3R-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000898820 Oryza sativa subsp. japonica bZIP transcription factor 23 Proteins 0.000 description 1
- 101000898809 Oryza sativa subsp. japonica bZIP transcription factor 46 Proteins 0.000 description 1
- 101000724249 Oryza sativa subsp. japonica bZIP transcription factor ABI5 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000574138 Ozothamnus diosmifolius Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101000613883 Streptomyces lividans pH-gated potassium channel KcsA Proteins 0.000 description 1
- 108091007916 Zinc finger transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 102000038627 Zinc finger transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了基因OsRPP13‑L和OsRP1在提高水稻种子萌发盐胁迫耐性中的应用。本发明通过PCR方法，扩增出水稻OsRPP13‑L和OsRP1全长编码区(OsRPP13‑L基因的ORF区有3822个碱基，OsRP1基因有两个转录本，其ORF区分别有3984和3867个碱基)，将两基因的三个转录本正向转入水稻中，提高基因的表达水平，分别得到水稻OsRPP13‑L和OsRP1基因表达提高的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株纯合株系中发现，盐胁迫下阳性水稻植株种子萌发的耐性明显高于对照植株。
Description
技术领域
本发明涉及农业科学领域，具体而言，本发明涉及通过提高水稻OsRPP13-L和OsRP1基因的表达来提高水稻种子萌发的盐胁迫耐性。
背景技术
水稻是盐敏感植物，盐对水稻幼苗建成、生长发育、产量都有严重影响。随着水稻抗逆机制研究的不断深入，利用基因工程培育耐盐水稻新品系是解决盐碱问题的最有效途径之一。与移栽水稻相比，水稻直播可节省大量劳力、缓解劳力季节性紧张的矛盾，对实现水稻生产的轻型化、专业化、规模化有着重要的意义。但与移栽水稻相比，直播水稻要求种子具有较高的萌发率和整齐度，因此种子萌发期耐盐特性对利用盐碱地增加水稻产量具有重大的应用价值。
植物对盐的耐性是个典型的数量性状，由多基因控制，涉及分子、生理、生化等多方面机制(Gain等，2019,Theor Appl Genet,2019,132,(4),851-870)。目前对这种数量性状的研究多采用遗传连锁图谱结合表型的QTL定位方法(Quantitative trait locimapping)。到目前为止，水稻中已定位的耐盐QTL多达几百个，但相比水稻其他发育时期，种子萌发期的耐盐QTL报道较少(Shi等，2017，BMC Plant Biol,17,(1),92)。由于大多数的耐盐QTL表型贡献率较小，精细定位和克隆难度较大，所以相关研究进展一直较慢。目前通过图位克隆方式定位的QTL只有1号染色体的SKC1(Ren等，2005，Nat Genet，37，(10)，1141-1146)。该基因编码一个HKT(High-affinity K+transporter)家族的离子转运蛋白，可以将Na+运出木质部，经过其他转运体的作用将Na+从韧皮部运回至根部并排除体外，从而降低地上部Na+含量，调节地上部Na+/K+平衡，提高水稻耐盐性。
目前在水稻中已报道的与盐胁迫反应有关的转录因子，部分转录因子已经用于耐盐基因工程改良中，主要包括以下几类：第一，DREB1/CBF调控子：水稻基因组包括至少10个DREB1(Dehydration-responsive element binding protein 1)型基因，过量表达OsDREB1A和OsDREB1F的转基因水稻植株对高盐抗性均增强，同时转基因水稻植株积累了较高含量的渗透调节物质，如脯氨酸和各种可溶性糖(Ito et al.,2006；Wang et al.,2008)。第二，AREB调控子，ABA是植物非生物胁迫反应中的一个关键信号分子。AREB基因编码bZIP-型转录因子，目前有几个bZIP型转录因子在盐胁迫反应中的功能已有报道。OsABF2基因的T-DNA插入突变体(Osabf2)对高盐的敏感性增强(Hossain et al.,2010)。过量表达OsABI5的转基因水稻对盐胁迫较为敏感(Zou et al.,2008)。OsbZIP23基因的过表达转基因水稻的耐盐性提高，而该基因的功能缺失突变体对盐的抗性降低。第三，MYB转录因子包含一个保守的DNA结合结构域(52个氨基酸的MYB结构域)。OsMYB3R-2过表达增强了拟南芥的盐胁迫耐性(Dai et al.,Plant Phyisol,2007,143:1739-1751)。过表达OsMYB2基因的水稻植株对盐的耐性增强，但并不影响植株的生长。在该基因过表达水稻中，其下游基因OsLEA3、OsRab16A和OsDREB2A表达上调(Yang et al.,J Exp Bot,2012,63:2541-2556)。这表明，OsMYB2可能是调控水稻胁迫反应的主要开关。第四，NAC型转录因子，也是通过ABA依赖途径调控水稻盐胁迫反应。高盐胁迫诱导多个水稻NAC基因的表达。SNAC1和OsNAC6过表达水稻植株的盐胁迫耐性提高(Hu et al.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:12987–12992；Nakashima etal.，Plant J.,2007,51:617-630)。第五，锌指转录因子也参与水稻的盐胁迫耐性，如TFIIIA-型的ZFP252基因过表达水稻植株盐胁迫耐性显著提高(Xu etal.FEBS lett,2008,582:1037-1043)。
本发明从水稻中花11中分离克隆到两个含有NB-ARC结构域的抗病基因OsRPP13-L和OsRP1，上述基因的功能未见报道。
发明内容
本发明申请人在盐处理中花11水稻幼苗发现两个盐响应基因OsRPP13-L和OsRP1，分别编码抗病基因disease resistance RPP13-like protein 1和rp1，基因ID分别为LOC_Os01g57270和LOC_Os01g57280。水稻OsRPP13-L基因的ORF区有3822个碱基对，编码1274个氨基酸和1个终止密码子；OsRP1基因有两个转录本，其ORF区分别有3984和3867个碱基对，分别编码1328和1289个氨基酸及1个终止密码子。本发明通过PCR方法，扩增出水稻OsRPP13-L和OsRP1全长编码区(前者包含3822个碱基，后者包含3984和3867个碱基)，将两基因的三个转录本正向转入水稻中，提高基因的表达水平，得到水稻OsRPP13-L和OsRP1基因表达提高的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株纯合株系中发现，盐胁迫下阳性水稻植株种子萌发的耐性明显高于对照植株。
本发明基因OsRPP13-L的转录本的cDNA序列(LOC_Os01g57270)如SEQ No：1所示，编码的氨基酸，序列如SEQ No：2所示。
本发明基因OsRP1有两个转录本，其中转录本1(LOC_Os01g57280.1)的cDNA序列如SEQ No：3所示，编码的氨基酸序列如SEQ No：5所示；转录本2(LOC_Os01g57280.2)的cDNA序列如SEQ No：4所示。
本发明还涉及基因OsRPP13-L和OsRP1在提高水稻盐胁迫耐性中的应用，该应用是通过提高水稻OsRPP13-L和OsRP1基因的表达来实现。具体方法如下：它首先通过PCR方法分别扩增水稻OsRPP13-L、OsRP1基因(OsRP1转录本1或者OsRP1转录本2)的全长编码区cDNA，然后在PCR产物末端加A，再连接到pMD18-T载体；然后将克隆在pMD18-T载体上的基因cDNA片段利用BamHI和SpeI酶切，插入pCAMBIA1390-Ubi植物表达载体的BamHI和SpeI之间，获得植物表达载体pCAMBIA1390-Ubi-OsRPP13-L和pCAMBIA1390-Ubi-OsRP1；再利用农杆菌介导的遗传转化方法将植物过表达载体分别转化至水稻品种中花11中，提高两基因的表达，分别得到水稻OsRPP13-L和OsRP1基因表达提高的转基因水稻植株。
其中，植物表达载体pCAMBIA1390-Ubi是将克隆在pMD18-T载体上的玉米泛素启动子Ubi利用HindIII和BamHI双酶切，插入pCAMBIA1390植物表达载体上HindIII和BamHI之间，改造得到的植物表达载体。
本发明利用水稻品种中花11的OsRPP13-L和OsRP1基因的cDNA片段作为应用基因，将二者基因分别正向转入水稻提高其表达水平，二者的转基因阳性水稻植株种子萌发期耐盐性增强，这为培育耐盐水稻品种提供了新的基因资源和新途径，具有一定的经济意义。
本发明的优点在于：
(1)申请人在水稻中分别过量表达OsRPP13-L和OsRP1基因后，发现二者的转基因水稻种子萌发期耐盐性增强。
(2)本发明首次发现过量表达OsRPP13-L和OsRP1基因可以提高水稻种子萌发期的耐盐性，为培育耐盐水稻品种提供了新思路，也为其它作物利用异源基因技术提高产量提供了理论依据。
附图说明
图1为本发明的OsRPP13-L和OsRP1基因表达载体的构建示意图；将克隆在pMD18-T载体上的OsRPP13-L和OsRP1基因cDNA片段利用BamHI和SpeI酶切，插入pCAMBIA1390-Ubi(1390-Ubi)植物表达载体上BamHI和SpeI之间，这样OsRPP13-L和OsRP1基因的cDNA就正向插入玉米泛素启动子(Ubi)后，即构建成了pCAMBIA1390-Ubi-OsRPP13-L植物表达载体(1390-Ubi-OsRPP13-L)及pCAMBIA1390-Ubi-OsRP1植物表达载体(1390-Ubi-OsRP1)；其中，A.pCAMBIA1390-Ubi植物表达载体结构示意图；B.pCAMBIA1390-Ubi-OsRPP13-L植物表达载体结构示意图；C.pCAMBIA1390-Ubi-OsRP1植物表达载体结构示意图。
图2为检测T0代转基因水稻基因转录本表达水平及拷贝数鉴定结果图；其中，A.OsRPP13-L转基因水稻株系的表达水平，#1、#2、#3、#4、#7、#9、#11、#12代表不同阳性转基因株系，WT代表野生型水稻植株；B.OsRP1转基因水稻株系的表达水平，57280.1和57280.2分别代表OsRP1的两个转录本，#1、#3、#6、#11、#14和#21代表OsRP1转录本1(57280.1)不同阳性转基因株系；#1、#2、#5、#8、#13和#23代表OsRP1转录本2(57280.2)不同阳性转基因株系，WT代表野生型水稻植株；C.OsRPP13-L转基因水稻株系拷贝数鉴定，#1、#2、#3、#4、#7、#9、#11、#12代表不同阳性转基因株系，WT代表野生型水稻植株，M代表marker；D.OsRP1转基因水稻株系拷贝数鉴定。#1、#3、#6、#11、#14和#21代表OsRP1转录本1(57280.1)不同阳性转基因株系；#1、#2、#5、#8、#13和#23代表OsRP1转录本2(57280.2)不同阳性转基因株系，WT代表野生型水稻植株，M代表marker。
图3为OsRPP13-L和OsRP1转基因水稻种子和野生型水稻种子在盐度为2％条件下萌发率统计图；其中，ZH11代表野生型水稻植株中花11，OsRPP13-L-OX#3、OsRPP13-L-OX#11代表OsRPP13-L转基因的阳性株系，57280.1-OX#1、57280.1-OX#14代表OsRP1转录本1转基因的阳性株系，57280.2-OX#1、57280.2-OX#5、57280.2-OX#8代表OsRP1转录本2转基因的阳性株系。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆用于构建OsRPP13-L和OsRP1基因植物表达载体的DNA片段，以及验证功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用于不同的用途和条件。
本发明申请人在盐处理中花11水稻幼苗发现两个盐响应基因OsRPP13-L和OsRP1，分别编码抗病基因disease resistance RPP13-like protein 1和rp1，基因ID分别为LOC_Os01g57270和LOC_Os01g57280。水稻OsRPP13-L基因的ORF区有3822个碱基对，编码1274个氨基酸和1个终止密码子；OsRP1基因有两个转录本，其ORF区分别有3984和3867个碱基对，分别编码1328和1289个氨基酸及1个终止密码子。本发明通过PCR方法，扩增出水稻OsRPP13-L和OsRP1全长编码区(前者包含3822个碱基，后者包含3984和3867个碱基)，将两基因的三个转录本正向转入水稻中，提高基因的表达水平，得到水稻OsRPP13-L和OsRP1基因表达提高的转基因水稻植株。
实施例1：分离克隆用于构建OsRPP13-L和OsRP1基因植物表达载体的cDNA片段
为了分析OsRPP13-L和OsRP1基因的功能，我们构建了OsRPP13-L和OsRP1基因cDNA的过表达载体，具体步骤如下。
采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从水稻品种中花11(公开报道的一个品种)的叶片中提取总RNA。具体步骤如下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1ml Trizol(Invitrogen)颠倒混匀，室温静置5分钟。在4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇动15秒钟，室温静置2-3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，250μl高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75％乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水(一般为60μl)溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。
利用反转录酶SuperScript II(Invitrogen)将其反转录成cDNA，具体步骤如下：依次加入1μl 500μg/ml oligo(dT)12-18、2μg总RNA、1μl 10mM dNTP混合物和DEPC水至12μl，在65℃水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心收集样品于管底。然后依次加入4μl 5×第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT和1μl RNaseOUT(40U/μl)，42℃，2分钟。然后加入1μlSuperScript II，轻微混合均匀，42℃反应50分钟，然后70℃水浴15分钟使酶失活，这样就合成了第一链cDNA。
OsRPP13-L cDNA片段扩增用带有酶切位点的上游引物OsRPP13F1(5’-TTG GAT CCATG GTG TGT GAG CTC CAA GAA C-3’，序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基)和下游引物OsRPP13R1(5’-TTA CTA GT CTA ACC AAG CAA CCA ACG CAA -3’，序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基)；OsRP1转录本1(LOC_Os01g57280.1)cDNA片段扩增用带有酶切位点的上游引物OsRP1F1(5’-TTG GAT CC ATG TGT TTT TCT TTC ATT GTG-3’，序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基)和下游引物OsRP1R1(5’-TTA CTA GT TCA TCT GAATTC CTT CCA GC-3’，序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基)；OsRP1转录本2(LOC_Os01g57280.2)cDNA片段扩增用带有酶切位点的上游引物OsRP1F2(5’-TTG GAT CC ATGGCG GAG GTG GTG TTG GCA -3’，序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基)和下游引物OsRP1R2(5’-TTA CTA GT TCA TCT GAA TTC CTT CCA GC-3’，序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基)。利用PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer(TaKaRa)进行扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性1分钟；98℃10秒，68℃4分钟，30个循环。利用TArget Clone TM-Plus试剂盒(TOYOBO)在PCR产物末端加A。然后连接到pMD18-T载体(TaKaRa)。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段。
实施例2：OsRPP13-L和OsRP1(包括两个转录本)基因植物表达载体的构建和遗传转化
为了能更好地分析OsRPP13-L和OsRP1基因的功能，申请人通过过量表达技术使OsRPP13-L和OsRP1基因的cDNA序列在水稻品种中花11中表达水平提高。根据转基因植株的表型和生理特征研究该基因的功能。
为了构建OsRPP13-L和OsRP1基因植物表达载体，本申请首先构建了pCAMBIA1390-Ubi的植物表达载体。首先利用下列方法提取玉米基因组DNA，从玉米品种鲁单981(公开报道的一个品种)的叶片中提取总DNA。具体步骤如下：取少量叶片(2-3cm长)，放入1.5ml离心管中，液氮速冻，快速研磨。加入200μl DNA Extraction buffer(20mM Tris-HCl pH＝7.5；250mM NaCl；25mM EDTA；0.5％ SDS；0.2mg/ml蛋白酶K)，在涡旋器上混匀，放入65℃水浴中保温2h。随后12000rpm离心10min，将上清液移至新的1.5ml离心管中，加入等体积氯仿混合，上下颠倒数次，静止数分钟至液面分层，重复两次。取上层液相移入新1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀后，12000rpm离心10min，倒净上清液，加入200μl的70％乙醇，12000rpm离心5min。室温下干燥DNA，用25μl TE-RNaseA buffer重悬基因组DNA。
利用玉米基因组DNA作为模板，利用上游引物UbiHindF1(5’-ATA AGC TTG CATGCC TGC AGT GCA GCG-3’，序列特异引物外加HindIII位点和两个保护碱基)和下游引物UbiBamHR1(5’-AAG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGA AG-3’，序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基)进行扩增。扩增产物克隆在pMD18-T载体，筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段，即为Ubi启动区，将该克隆命名为pMD18-Ubi。将上述克隆用HindIII和BamHI双酶切，回收插入片段；同样，用同样的方法酶切pCAMBIA1390载体(国际常用的植物遗传转化载体)，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接，转化大肠杆菌XL1-Blue，通过酶切筛选阳性克隆，即获得了pCAMBIA1390-Ubi植物表达载体(见图1)。
将实施例1中得到的阳性克隆用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；同样，用同样的方法酶切pCAMBIA1390-Ubi(1390-Ubi)的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌XL1-Blue。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，分别命名为1390-Ubi-OsRPP13-L和1390-Ubi-OsRP1(见图1)。将1390-Ubi-OsRPP13-L和1390-Ubi-OsRP1转化至EHA105宿主菌。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上改良进行(Hiei et al.,1994,PlantJ,6:271-282)。转化分别获得8株和11株独立的转基因水稻植株。
具体步骤如下：
(1)愈伤诱导：去壳的野生型中花11水稻种子，用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基(成分见后)上诱导愈伤组织，于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。
(2)愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。
(3)农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中(含有50mg/L的卡那霉素)，28℃，220rpm，培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液按1％接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)；28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右(培养5-6小时)。
(4)农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把步骤(2)的中花11胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，26℃，黑暗共培养2-3天。
(5)愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。
(6)分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。
(7)壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。
试剂配方：
(1)试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb(Cabenicillin,羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；2,4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)。
(2)用于水稻遗传转化的培养基配方：
1)YEP液体培养基：2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1g NaCl，加水定容至200mL，用5NNaOH调pH至7.0。
2)愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。
3)AB液体培养基：3g/L K2HPO4，1g/L NaH2PO4，1g/L NH4Cl，300mg/L MgSO4·7H2O，150mg/L KCl，10mg/L CaCl2·2H2O，2.5mg/L FeSO4·7H2O，5g/L葡萄糖，pH 7.0。
4)AAM培养基：AA大量，AA微量，0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/L AS，pH 5.2。
5)共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，20mg/L AS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。
6)固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。
7)分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，2mg/L KT，0.2mg/L NAA，pH 5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素。
8)1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/L Gelrite，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH 5.8.
(3)主要溶液配方：
1)N6大量元素(10×)
2)N6微量(1000×)：
3)N6维生素(1000×)
3)MS大量元素(10×)
4)MS微量(1000×)：
5)MS维生素(1000×)
6)铁盐(200×)
FeSO4.7H2O 5.56gNa2EDTA.2H2O 7.46g
7)AA大量(200×)
8)AA微量(1000×)
9)2,4-D储存液(2mg/ml)
称取2，4-D 100mg,溶于1ml DMSO，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH，至完全溶解，于-20℃保存。
10)Kinetin储存液(0.2mg/ml)
称取Kinetin 10mg，溶于1ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
11)NAA储存液(0.2mg/ml)
称取NAA 10mg，溶于0.5ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
12)乙酰丁香酮(100mg/ml)
称取乙酰丁香酮100mg，溶于1ml DMSO，于-20℃保存。
13)卡那霉素(50mg/ml)
称取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。
实施例3：检测转基因水稻植株和野生型水稻中OsRPP13-L和OsRP1基因的转录本水平
以水稻野生型中花11、8个独立的OsRPP13-L-OX和11个OsRP1-OX的T0代转基因水稻植株为材料，提取2叶期水稻叶片的RNA，利用荧光定量RT-PCR检测水稻叶片中OsRPP13-L和OsRP1基因的转录本水平。具体方法如下：根据实施例1提取总RNA，合成cDNA第一链，利用SYBR Premix Ex TaqTM PCR试剂盒(TaKaRa)进行荧光定量PCR反应。具体步骤如下：依次加入10μl 2×SYBR Premix Ex TaqTM、2.0μl cDNA模板、0.2μM基因特异性引物对，用RNase-free H2O补足反应体系为20μl。OsRPP13-L基因特异性引物对上游引物OsRPP13qF2(5’-CAGAAG GTC TCA CAA GCC TAT C-3’)和下游引物OsRPP13qR2(5’-AGG TGA TCC GTC CTC ATAGAA -3’)；OsRP1基因特异性引物对上游引物OsRP1qF2(5’-CGA GCC CAT GAA AGC TCTATT-3’)和下游引物OsRP1qR2(5’-CTA CCC AAA GGT CAA CCATCT C-3’)。同时用水稻内源翻译延伸因子基因(OsEF-1a)作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为OsEF-1aF(5’-TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT-3’)，特异下游引物为OsEF-1aR(5’-GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA-3’)。PCR反应条件是：95℃预变性30秒；95℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过2-△△Ct法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。如图2A和2B所示，8个转基因株系中OsRPP13-L、11个转基因株系中OsRP1基因的转录本水平明显高于野生型，证明外源OsRPP13-L和OsRP1基因已在转基因水稻中大量表达。
实施例4：检测转基因水稻植物中OsRPP13-L和OsRP1基因的插入位点
以水稻品种中花11和8个OsRPP13-L及11个OsRP1转基因水稻株系为材料，进行Southern杂交，具体步骤如下：通过CTAB法提取基因组DNA，具体步骤参考Murray andThompson,Nucl.Acids Res,1980,8:4321-4325。取100μg基因组DNA利用HindШ进行酶切，随后用0.8％琼脂糖胶电泳分离DNA。将DNA转移至尼龙膜Hybond-N+(AmershamCo.Ltd.,NJ,USA)。因为外源基因OsRPP13-L/OsRP1和抗性选择标记基因HPTII在同一个T-DNA区域内，因此我们用HPTII基因作为探针鉴定基因的插入位点。以pCAMBIA1390-Ubi质粒为模板，用HPTII基因的上游引物HPTIIF1(5’-TTC AGC TTC GAT GTA GGA GG-3’)和下游引物HPTIIR1(5’-TAC ACA GCC ATC GGT CCA GA-3’)，利用PrimerSTAR HS DNA polymerase with GCbuffer(TaKaRa)进行扩增目的片段，PCR反应条件是98℃预变性2分钟；94℃10秒，53℃30s，68℃1分钟，35个循环。PCR产物(扩增片段长度为858bp)利用Wizard SV gel和PCR clean-up system(Promega,USA)进行纯化(按照试剂盒说明书实施)。按照DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter KitI试剂盒说明书将纯化后的PCR片段进行DIG标记、杂交。结果如图2C和2D所示，8个OsRPP13-L转基因株系中外源基因均已整合到水稻基因组中，其中#1、#3、#11是单拷贝且插入位点不同，是三个独立的转基因株系；11个OsRP1转基因株系中外源基因均已整合到水稻基因组中，其中转录本1(LOC_Os01g57280.1)只有#21为单拷贝，#1、#14为双拷贝；转录本2(LOC_Os01g57280.2)的#1、#5、#8为单拷贝且插入位点不同，为3个独立转基因株系。
实施例5：转OsRPP13-L和OsRP1基因的水稻种子具有强的盐胁迫耐性
由于OsRPP13-L转基因株系中#1、OsRP1转录本1(LOC_Os01g57280.1)的#21未收获到种子，因此我们将以OsRPP13-L转基因株系中#3和#11、OsRP1转录本1(LOC_Os01g57280.1)转基因株系中#1和#14、OsRP1转录本2(LOC_Os01g57280.2)转基因株系#1和#5和#8收获的T3代纯合株系种子为材料。首先，将种子在42℃的烘箱放置七天打破休眠，然后选取饱满、大小一致的种子，每个材料做三个重复，每个重复50粒，放到铺有两层滤纸的玻璃平皿中，以淡水为对照，实验组用2％ NaCl溶液进行处理。第一天每个玻璃平皿加入20mL NaCl溶液进行处理，30℃暗培养。每天更换盐溶液，连续处理10天，第11天统计盐胁迫下种子萌发数，计算萌发率。萌发率计算公式为：盐胁迫下种子萌发数/供试种子数×100。结果表明，野生型种子萌发率约为9.0％，转基因水稻株系的种子萌发率约为19％～41％，是对照的2.1～4.5倍(图3)，因此OsRPP13-L和OsRP1基因表达水平提高的转基因水稻株系种子具有较强的盐胁迫耐性。
Claims (6)
1.基因OsRPP13-L在提高水稻盐胁迫耐性中的应用，所述基因OsRPP13-L的转录本的cDNA序列如SEQ No：1所示。
2.基因OsRP1在提高水稻盐胁迫耐性中的应用，其中基因OsRP1有两个转录本，转录本1的cDNA序列如SEQ No：3所示，转录本2的cDNA序列如SEQ No：4所示。
3.采用权利要求1中的基因OsRPP13-L或者权利要求2中的基因OsRP1提高水稻盐胁迫耐性的方法，其特征是，提高水稻基因OsRPP13-L或者OsRP1的表达。
4.如权利要求3所述的提高水稻盐胁迫耐性的方法，它首先通过PCR方法扩增水稻OsRPP13-L的全长编码区cDNA，然后在PCR产物末端加A，再连接到pMD18-T载体；然后将克隆在pMD18-T载体上的基因cDNA片段利用BamHI和SpeI酶切，插入pCAMBIA1390-Ubi植物表达载体的BamHI和SpeI之间，获得植物表达载体pCAMBIA1390-Ubi-OsRPP13-L；再利用农杆菌介导的遗传转化方法将植物过表达载体转化至水稻品种中花11中，得到水稻OsRPP13-L基因表达提高的转基因水稻植株。
5.如权利要求3所述的提高水稻盐胁迫耐性的方法，它首先通过PCR方法扩增水稻OsRP1基因的转录本1的全长编码区cDNA，然后在PCR产物末端加A，再连接到pMD18-T载体；然后将克隆在pMD18-T载体上的基因cDNA片段利用BamHI和SpeI酶切，插入pCAMBIA1390-Ubi植物表达载体的BamHI和SpeI之间，获得植物表达载体pCAMBIA1390-Ubi-OsRP1；再利用农杆菌介导的遗传转化方法将植物过表达载体转化至水稻品种中花11中，得到水稻OsRP1基因表达提高的转基因水稻植株。
6.如权利要求3所述的提高水稻盐胁迫耐性的方法，它首先通过PCR方法扩增水稻OsRP1基因的转录本2的全长编码区cDNA，然后在PCR产物末端加A，再连接到pMD18-T载体；然后将克隆在pMD18-T载体上的基因cDNA片段利用BamHI和SpeI酶切，插入pCAMBIA1390-Ubi植物表达载体的BamHI和SpeI之间，获得植物表达载体pCAMBIA1390-Ubi-OsRP1；再利用农杆菌介导的遗传转化方法将植物过表达载体转化至水稻品种中花11中，得到水稻OsRP1基因表达提高的转基因水稻植株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310647350.6A CN116590312A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 基因OsRPP13-L和OsRP1在提高水稻种子萌发盐胁迫耐性中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310647350.6A CN116590312A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 基因OsRPP13-L和OsRP1在提高水稻种子萌发盐胁迫耐性中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116590312A true CN116590312A (zh) | 2023-08-15 |
Family
ID=87606199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310647350.6A Pending CN116590312A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 基因OsRPP13-L和OsRP1在提高水稻种子萌发盐胁迫耐性中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116590312A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117965557A (zh) * | 2024-01-05 | 2024-05-03 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 一种水稻株高基因的应用及其制备方法 |
-
2023
- 2023-06-02 CN CN202310647350.6A patent/CN116590312A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117965557A (zh) * | 2024-01-05 | 2024-05-03 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 一种水稻株高基因的应用及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107541520B (zh) | 与水稻根发育和抗逆性相关OsSAUR11基因及编码蛋白与应用 | |
| CN110128514B (zh) | 水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4b及编码基因与应用 | |
| US10704054B2 (en) | Modulation of seed vigor | |
| CN116590312A (zh) | 基因OsRPP13-L和OsRP1在提高水稻种子萌发盐胁迫耐性中的应用 | |
| US20150218581A1 (en) | Use of OXHS4 Gene in Controlling Rice Drought Resistance | |
| CN105002212B (zh) | 基因OsPIL13在提高水稻盐胁迫耐性中的应用 | |
| CN105018522B (zh) | 基因OsPIL16在同时提高水稻的干旱和盐胁迫耐性中的应用 | |
| WO2013056677A1 (en) | USE OF OsPP18 GENE IN CONTROLLING RICE DROUGHT RESISTANCE | |
| CN104328127A (zh) | 茎瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用 | |
| JP5164093B2 (ja) | イネの病原菌に対する抵抗性を高める方法及び病原菌耐性イネ形質転換体 | |
| CN108948162B (zh) | 一种花生逆境胁迫基因AhDOG1L及其应用 | |
| CN109956996B (zh) | 一种谷子产量相关蛋白SiAMP1及其编码基因与应用 | |
| CN104531716A (zh) | 基因OsABAR1及其在提高水稻干旱和盐胁迫耐性中的应用 | |
| Liu et al. | Characterization of GhSERK2 and its expression associated with somatic embryogenesis and hormones level in Upland cotton | |
| CN116769797B (zh) | 一种茉莉酸甲酯及PpyMYC2基因在萌芽中的应用 | |
| WO2006126294A1 (ja) | ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子 | |
| CN115011631B (zh) | 调控玉米苗期抗旱性的蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN110747203B (zh) | 基因OsBBX14在提高水稻白叶枯病抗性中的应用 | |
| KR101677482B1 (ko) | 벼 유래의 고친화성 인산운반체 OsPT4 유전자가 과발현된 항생제 마커프리 형질전환 벼 | |
| WO2014029309A1 (zh) | 控制大白菜生长的BrTCP24基因及其应用 | |
| CN110157716B (zh) | 一种通过模拟小rna结合位点培育大粒、高产水稻的方法 | |
| CN110499326B (zh) | Rgga在调控作物农艺性状中的应用 | |
| CN112626106B (zh) | 水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4的应用 | |
| CN111334514B (zh) | 应用花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的方法 | |
| CN114480487A (zh) | 水稻转录因子OsMADS61及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |