CN116589537A

CN116589537A - 一种激活npff2受体的多肽及其应用

Info

Publication number: CN116589537A
Application number: CN202310680938.1A
Authority: CN
Inventors: 王登; 刘惠清; 王芹芹; 王新波; 陈艳; 董须丰; 李向群
Original assignee: Hohai University HHU
Current assignee: Hohai University HHU
Priority date: 2023-06-09
Filing date: 2023-06-09
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2043-06-09
Also published as: CN116589537B

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种激活NPFF2受体的多肽及其应用。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1的第1个氨基酸和第80个氨基酸通过肽键成环。SEQ ID NO.1所示的环肽能进一步通过解压缩技术得到一系列衍生的环肽和线性肽。本发明提供的多肽能激活NPFF2受体，可以用于缓解和/或治疗各类疼痛。

Description

一种激活NPFF2受体的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种激活NPFFR2受体的多肽及其应用。

背景技术

RF-amide是广泛存在于动物种群中的一类多肽。该家族因其成员C末端均带有Arg-Phe-NH2结构而得名，主要包括神经肽FF(neuropeptide FF，NPFF)、26RFa(pyroglutamylated RF-amide peptide，QRFP)、催乳素释放肽(prolactin-releasingpeptide，PrRP)、RF-NH2相关肽(RF-amide related peptide,RFRP)以及Kiss肽(Metastin/Kisspeptin)。

神经肽FF(neuropeptide FF，NPFF)是1985年从牛丘脑分离纯化而来，是一种C末端酰胺化的八肽，其氨基酸序列为H-Phe-Leu-Phe-Glu-Pro-Glu-Arg-Phe-NH2(FLFQPQRF-NH₂)。发现之初因其具有阿片镇痛调节作用而一度被认为是阿片调节肽，除此之外，NPFF还具备调节包括痛觉、心血管活动、神经内分泌、胃肠运动、炎症等在内的生理活性。NPFF具有合成简单、生物功能丰富、易于改造等特点，因此NPFF在生理、药理学及多肽药物的研发等方面具有重要的研究价值。

NPFF系统包括两个前体(pro-NPFFA、pro-NPFF B)、两个受体(NPFF1、NPFF2)，两个受体都属G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCR)两种受体由不同的基因编码，并且具有大约59％的氨基酸序列同源性。两种受体与NPFF都有着较高的亲和力，普遍认为神经肽FF的受体为NPFF2。有关研究认为，NPFF均可有效激活两种受体，但NPFF相关肽(pro-NPFFA衍生肽)对NPFF2受体亲和性较高，NPAF相关肽(pro-NPFFB肽)对NPFF 1受体的亲和性是NPFF2的28倍。

NPFF免疫反应活性物质主要分布于中枢神经系统部分区域，在大鼠的肾上腺及一些哺乳动物的血浆等外周组织中也有分布。NPFF在脊髓、下丘脑、桥脑、延脑及垂体后叶等脑区含量较高，其中下丘脑表达量最高；在皮层和海马等区域则浓度较低。随着对NPFF受体研究的不断深入，研究人员通过受体mRNA表达位点检测的方法发现，NPFF1受体主要存在于下丘脑和前脑，脊髓中没有分布；NPFF2受体主要分布在丘脑束旁核、脊髓、内脏自主神经核团等区域。

与所述NPFF2受体结合的化合物可作为抗伤害性疼痛化合物深入研究的首选。NPFF2受体激动剂可用于治疗急性疼痛和慢性疼痛，所述疼痛是由创伤，由诸如糖尿病、带状疱疹、肠应激综合征或晚期癌症的疾病或由化学伤害引起的，如包括抗病毒药物的药物治疗的无意识后果。

专利CN1875271A公开了一种对NPFF2受体具有选择性的化合物及筛选能够影响NPFF2受体的一种或多种活性的化合物的方法。专利CN102206285A、CN102850431A、CN106084001A公开了一类同时激活阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽及其制备方法。专利CN115073556A公开了一类阿片/神经肽FF受体多靶点环肽分子及其制备和应用。

多肽类药物是一类市场增长极快的药物，多肽药物市场具有巨大增长空间。与小分子化药和生物制剂相比，多肽药物显示出独特的成药优势且副作用较低等优势，多肽药物通常具有较高的靶标亲和力，因此，开发更多的靶向NPFF2受体多肽类药物是非常有必要的。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明提供了一种激活NPFF2受体的多肽及其应用。

一方面，本发明提供一种激活NPFF2受体的多肽或者其药学上可接受的盐，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体氨基酸序列如表1所示，其中，SEQ ID NO.1的第1个氨基酸和第80个氨基酸通过肽键成环。

其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的80环肽为从多肽库中，通过高通量筛选技术，检测多肽对NPFF2受体激活作用得到的80环肽，该环肽的发现包括多肽库溶解及稀释，利用FLIPR高通量实时荧光成像分析筛选方法根据多肽激活HEK293/NPFFR2细胞引起的钙流变化从多肽库中筛选。

表1本发明氨基酸序列

另一方面，本发明提供一种激活NPFF2受体的多肽或者其药学上可接受的盐，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽或线性肽。对80环肽SEQ ID NO.1进行氨基酸的序列进行分析和拆解工作，能够设计出5～80个不同氨基酸序列的线性肽或者环肽。

优选地，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽或线性肽，具有25～35个氨基酸。

进一步优选地，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽或线性肽，具有30个氨基酸。

优选地，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽。

优选地，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的线性肽。

进一步优选地，所述线性肽的氨基酸序列可选自如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4所示的线性肽，SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4具体氨基酸序列如表1所示。

另一方面，本发明提供一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含能够编码上述的多肽分子的一个或两个的多核苷酸。

优选地，本发明提供一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含能够编码上述SEQID NO.1～SEQ ID NO.4所示多肽的多核苷酸。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含安全有效量范围内的本发明的环肽分子或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本发明还提供了所述的本发明的环肽分子或其药学上可接受的盐和药物组合物用于制备治疗与NPFF2受体相关的疾病的药物上的应用。

本发明还提供了所述的本发明的环肽分子或其药学上可接受的盐和药物组合物用于制备镇痛的药物的用途。

优选地，用于制备高效、低副作用的镇痛药物。

优选地，用于缓解和治疗包括急性疼痛和病理性疼痛在内的各类疼痛。

优选地，所述疼痛是由创伤，由诸如糖尿病、带状疱疹、肠应激综合征或晚期癌症的疾病或由化学伤害引起的，如包括抗病毒药物的药物治疗的无意识后果。

术语

除非本文中另外定义，否则本专利申请中所用的科学及技术术语应具有一般本领域技术人员通常所理解的含义。

本文所用“多肽库”是湖南中晟全肽生化有限公司利用PICT(PeptideInformation Compression Technology)专利技术，该技术利用生物学手段对多肽信息进行压缩，可将多个多肽的信息集成进一个多肽，从而实现以相对较小的库容包含较大的多肽信息量；通过PICT技术构建含有近73000条80个氨基酸的环肽库。其具体构建方法可以参见专利CN201580081102.3和专利CN201780089941.9。

本文中使用的术语“神经肽”是指包含或者是RF酰胺例如PrRP家族、NPFF家族、RFRP家族、KiSS-1家族和QRFP家族的多肽。所述神经肽在末端包含PQRF或PLRF的氨基酸序列。NPFF家族包括NPFF、NPAF、NPSF或NPVF。NPVF是包含X1PX2LPQRF的氨基酸序列的多肽，X1是V或F，X2是N或S。NPVF是包含VPNLPQRF的氨基酸序列的多肽。所述神经肽可以是内源的并且源自于哺乳动物，优选地，所述哺乳动物包括人类、大鼠、小鼠和牛。所述神经肽可以是人造的，并包含与内源神经肽例如NPVF具有至少约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更高的同一性，并且在末端包含PQRF的氨基酸序列；或与之相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或替换的氨基酸序列。所述神经肽还包括衍生物。

本文中使用的术语“治疗”是指逆转、改善或抑制应用该术语的疾病或所述疾病的一种或多种症状的进展。当在本文中使用时，取决于患者的状况，该术语还包括预防疾病，其包括在疾病发作之前预防疾病或与其相关的任何症状的发作，以及改善症状或降低任何病症的严重程度。

术语“药学或药理学上可接受的”包括当酌情给药到动物或人类时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的用途均被设想。补充性活性成分也可以并入到所述组合物中。

本发明的药物组合物被配制成与其目标给药途径相容。给药途径的实例包括局部注射例如静脉内(例如外周静脉，例如存在于四肢中的外周静脉)、腹膜内、真皮内、皮下、真皮下、口服、鼻内、气溶胶(例如吸入)、透皮(即局部)、经黏膜、阴道、子宫内和直肠(例如栓剂)给药。含有本发明的活性神经肽或重组蛋白的注射液可以给药到血管(例如主动脉或颈静脉)的血管腔，或局部给药到骨缺损或骨疾病处。或者，本发明的活性神经肽或重组蛋白可通过浸渍或涂层有所述活性神经肽或重组蛋白的装置例如支架或导管来给药。

本发明的药物组合物可以单独给药，或者与其他镇痛药物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的多肽或其药学上可接受的盐施用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中本发明药物组合物的剂量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素，如根据疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。

本文所用的“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明所用多肽库比传统化学合成多肽库信息量大得多的多肽化合物氨基酸序列，库内各化合物均为独立生产，均经过质谱鉴定和精确称量，保证了筛检的准确和稳定，避免了传统的噬菌体库等混合化合物库的失真(实际库容远低于理论值)问题。

(2)本发明提供了一系列具有NPFFR2受体激活作用的多肽。本发明的多肽可激活NPFFR2受体，用于缓解和/或治疗各类疼痛。可用于缓解和治疗包括急性疼痛和病理性疼痛在内的各类疼痛。

附图说明

图1为实施例1SEQ ID NO.1浓度响应曲线结果；

图2为实施例2SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.4浓度响应曲线结果。

具体实施例

实施例180环肽筛选

1.关键试剂：多肽库(自制)、过表达OPRM1的HEK293细胞系，简写为HEK293/NPFFR2细胞、Calcium5 Assay Kit。

2.高通量筛选过程

2.1.HEK293/NPFFR2细胞的培养

2.1.1.细胞复苏：从液氮罐中取出细胞，在37℃水浴锅中快速解冻细胞。将细胞移至15mL离心管中，缓慢加入9mL预热的解冻培养基，800转离心5分钟，移除上清培养基。用5mL解冻培养基重悬细胞，转移至T25培养瓶中，放于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。细胞复苏第二天更换培养液为生长培养基。

2.1.2.细胞传代：当细胞长满培养瓶80-90％，先用DPBS润洗细胞，再重新加入DPBS轻拍细胞瓶实习报告从瓶壁上脱落；收集细胞悬液至离心管中，800转离心5分钟，移除上清培养基；加入6-8mL新鲜生长培养基，重悬细胞，按照1：3～1：10的比列进行传代，放于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。传代后每2-3天进行换液。

2.1.3.细胞冻存：当细胞长满培养皿80-90％，先用DPBS润洗细胞，再重新加入DPBS轻拍细胞瓶实习报告从瓶壁上脱落；收集细胞悬液至离心管中，800转离心5分钟，移除上清培养基；用冻存培养基重悬细胞，进行细胞计数，将细胞稀释到2～3×106/mL。每个冻存管分装1mL细胞冻存悬液。将分装好细胞的冻存管放入冻存盒中，将冻存盒放入-80℃冰箱过夜保存后，将冻存管转移到液氮罐中。

2.2.HEK293/NPFFR2细胞铺板

测试前24小时，将培养瓶中的HEK293/NPFFR2细胞经过0.25％胰酶消化处理并悬浮于细胞培养液中，以每孔8000个细胞的密度使用分液仪加至黑色透明底384孔板中培养，每孔25μL，37℃，5％CO₂过夜培养。

2.3.Calcium5 assay kit找工作液准备

测试当日，将Calcium5试剂盒中的组分A溶解于钙染料缓冲液(Loading buffer)并加入250mM丙磺舒配制成含有5mM丙磺舒的钙染料溶液。

吸掉培养基后，在细胞培养板中每孔加入50μL钙染料溶液，放置于室温孵育2小时。

2.4.多肽库溶解及稀释

2.4.1.多肽库溶解

2.4.2.将多肽库96孔深孔板放于离心机4000rpm离心2-3分钟。用自动分液仪向96孔深孔板中加入200μL/孔超纯水中。用硅胶盖密封，放置95℃水浴5分钟。注：此时多肽浓度约为：50μM。

2.4.3.溶解后的96深孔板多肽放于离心机4000rpm离心2-3分钟。

2.5.多肽库稀释

将溶解后用工作站转移至384孔板中，用loadingbuffer稀释至10μM。

2.6.FLIPR检测

细胞加入Calcium 5染料2小时后，将细胞培养板取出并避光放置于室温10分钟，然后和多肽溶液板一起放入FLIPR仪器，进行检测。设置NPFF为激动剂阳性对照。

3.不同80环肽的确认

3.1.按照步骤2的过程对初筛到的多肽进行确认。

3.2.按照步骤2的过程检测活性多肽的EC₅₀值

检测当天，将将活性多肽母液用1×Loading buffer(含20mM HEPES)(pH:7.4)稀释到100μM(5×浓度)，再以倍比稀释8-10个梯度，每个浓度做复孔，测试活性多肽的EC₅₀值。

4.1实验结果

通过高通量筛选，从近7.3万条80环肽中找1条能够在细胞水平激活NPFFR2受体的多肽，即SEQ ID NO.1，后测试其对NPFFR2受体激活作用的浓度响应曲线，实验结果如图1、表2所示，EC₅₀值为2.7μM。

表2 80环肽SEQ ID NO.1的浓度响应结果

SEQ ID NO.	EC₅₀(μM)
		1	2.7

实施例2衍生肽的筛选

1.SEQ ID NO.1衍生多肽筛选及确认

应用内部解压缩技术，对80环肽(SEQ ID NO.1)进行氨基酸的解压缩，设计出5-80不同氨基酸序列的环肽或者线性肽。

按照实施例1中步骤2筛选过程进行筛选，并根据实施例1中步骤3.2对筛选到的解压缩活性多肽进行EC₅₀验证。

2.实验结果

解压缩筛选获得3条就有激动活性的多肽：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4。测试其分别对NPFFR2受体激活作用的浓度响应曲线，实验结果如图2、表3所示，SEQID NO.2～4的EC₅₀值分别为6.76μM、10.70μM、10.53μM。

表3 SEQ ID NO.2～4的浓度响应结果

SEQIDNO.	EC₅₀(μM)
		2	6.76
3	10.70
		4	10.53

应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种激活NPFF2受体的多肽或者其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1的第1个氨基酸和第80个氨基酸通过肽键成环。

2.一类激活NPFF2受体的多肽或者其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽或线性肽。

3.根据权利要求2所述的多肽或者其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽或线性肽，具有25~35个氨基酸。

4.根据权利要求2所述的多肽或者其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽。

5.根据权利要求2所述的多肽或者其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的线性肽。

6.根据权利要求5所述的多肽或者其药学上可接受的盐，其特征在于，所述线性肽的氨基酸序列可选自如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.4所示的线性肽。

7.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子包含能够编码权利要求1~6任意一项所述的多肽分子的一个或两个的多核苷酸。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含安全有效量范围内的权利要求1~6任意一项所述的多肽分子或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

9.权利要求1~6任意一项所述的多肽分子、权利要求7所述的多核苷酸分子或权利要求8所述的药物组合物在制备治疗与NPFF2受体相关的疾病的药物上的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物用于缓解和/或治疗各类疼痛。