CN116585251A - 包括乳杆菌菌株混合物作为有效成分的皮肤保护用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种皮肤保护用组合物，其对由于微尘、紫外线、有害病原菌和干燥环境引起的皮肤损伤的改善具有优异的效果。

Description

包括乳杆菌菌株混合物作为有效成分的皮肤保护用组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年02月11日提交的韩国专利申请No.10-2022-0018321的优先权和权益，其通过引用合并于此用于所有目的，如同在此完全阐述一样。
技术领域
本发明涉及一种皮肤保护用组合物。
背景技术
微尘和黄沙等不仅对呼吸道还对敏感性皮肤引起越来越频繁的刺激性反应。从具有敏感性皮肤的人中观察到红潮、沉着的肤色和变得粗造的皮肤等。但是，故意损伤皮肤来赋予再生效果以解决皮肤表面上的问题的施术可能损坏皮肤固有的恢复能力，因此需要注意。
因此，需要开发一种新型的材料，其不但能够缓和对皮肤的刺激并改善功能以恢复由于各种外部环境因素而疲劳的皮肤的基本健康和弹力而且阻断对人体有害的物质。
发明内容
一方面提供一种皮肤保护用组合物，其包括乳杆菌菌株混合物作为有效成分。
一方面提供一种组合物，其包括两种乳杆菌属(Lactobacillus sp.)菌株混合物、其干物、裂解物、培养液、培养液提取物、溶解物、发酵物，或其混合物。
根据一具体实施例，所述乳杆菌属菌株可以为沙克乳酸杆菌(LactobacillusSakei)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus-Pentosus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarium)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、辛奇乳杆菌(Lactobacillus kimchi)，以及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)等。
在另一具体实施例中，所述乳杆菌属菌株可以为沙克乳酸杆菌(LactobacillusSakei)AMP 5104菌株(KCTC14319BP)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus Pentosus)HB-8023菌株(KCTC13322BP)的混合物。
本说明书中的术语“培养液”可以被与“培养上清液”、“条件培养液”或“调整培养基”互换使用，且可以是指整个培养基，所述整个培养基包括通过在培养基中培养乳杆菌属菌株一定期间而获得的所述菌株、其代谢产物、余量的营养成分等。所述培养基能够提供营养成分以使所述菌株能够在试管中生长并生存。并且，所述培养液可以是指从通过培养菌株而获得的菌体培养液中除去菌体而获得的培养液。将从所述培养液中除去菌体而获得的液体被称为“上清液”，可以通过静置培养液一定时间来仅取出除了沉淀在下层的部分之外的上层的液体、通过过滤除去菌体、或对培养液进行离心分离来除去下部的沉淀并仅取出上部的液体来获得所述上清液。所述“菌体”是指本发明中的菌株本身，且包括从皮肤样本等中分离并筛选的菌株本身或通过培养所述菌株来从培养液中分离出的菌株。所述菌体是可以通过对培养液进行离心分离并取出下层的沉淀部分来获得的，或者是可以将培养液静置一定时间后除去上部的液体来获得的，因为菌体由于重力向培养液的下层沉淀。
所述培养液可以包括通过培养菌株而获得的培养液本身、所述培养液的浓缩产物、或冻干物、或从培养液中除去菌株而获得的培养上清液、所述培养上清液的浓缩产物或冻干物。
所述培养液可以是通过将乳杆菌属菌株在培养基(例如，液态的乳酸菌(Lactobacilli)MRS肉汤(broth)培养基，排除乳酸菌培养基)中、在高于10℃或低于40℃的任意温度下培养一定时间，例如4小时至72小时来获得的。
根据一具体实施例，可以通过对菌株培养液进行离心分离或过滤来除去菌株的步骤来获得菌株的培养上清液。
根据另一具体实施例，可以通过浓缩对所述菌株培养液本身或所述培养液使用离心分离或过滤器来过滤后而获得的上清液的步骤获得浓缩产物。
本领域普通技术人员可以适当选择或修改并利用用于培养所述乳杆菌属菌株的培养用培养基和培养条件。
本说明书中的术语“裂解物”可以是指通过对菌株本身使用化学性或物理性的力裂解菌株的细胞壁来获得的产物，且可以被与“溶解物”混用。
本说明书中的术语“培养液提取物”是指从所述培养液或其浓缩液提取的，且可以包括提取液、提取液的稀释液或浓缩液、通过干燥提取液而获得的干物，或其粗精华产物或精华产物、通过对其进行分馏而获得的分馏产物。
本说明书中的术语“发酵物”可以是指通过对包括需要增大其有效成分的天然材料的基质接种所述一种或更多种乳杆菌属菌株并进行培养而获得的产物，根据一具体实施例，所述发酵物可以是花椰菜发酵物、花椰菜芽发酵物等。所述花椰菜是一种属于作为白菜属的一种的花椰菜的菜蔬，并且，所述花椰菜芽可以是发芽3至4天后的花椰菜芽。
在一个实施例中已确认，沙克乳酸杆菌(Lactobacillus Sakei)AMP 5014菌株(KCTC 14319BP)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus Pentosus)HB-8023菌株(KCTC13322BP)的混合溶解物或通过所述菌株的混合物发酵的花椰菜芽发酵物与所述菌株中每一个的溶解物或花椰菜芽提取物相比，对起因于紫外线的光毒性的抑制效果、由于病原性细菌的细胞保护、对抗菌、抗炎、瘙痒症抑制效果、防止起因于微尘的污染、美白、炎症改善效果、皮肤保湿、皮肤屏障改善、美白效果更优异。因此，所述组合物可以对改善从由于紫外线、病原菌、微尘、干燥等外部环境造成的皮肤状态具有上升效果。并且，所述组合物可以对皮肤炎症疾病的预防或治疗具有上升效果。
所述皮肤状态改善可以是抑制或改善皮肤老化、防止皱纹、强化皮肤屏障、改善皮肤弹力或皮肤保湿。所述皮肤炎症疾病例如可以是皮肤伤口、皮炎、特应性皮炎、瘙痒症、湿疹性皮肤疾病、干性湿疹、红斑、荨麻疹、牛皮藓、药疹、粉刺等。
本发明中的术语“皮肤老化”是对随着年龄增加出现在皮肤的有形和无形的变化的统称，例如是指表皮厚度减小的现象、真皮的细胞数或血管数、修复DNA损伤的能力、细胞替换周期、修复伤口、皮肤屏障功能、维持表皮水分、汗分泌、皮脂分泌、维生素D产生、对物理损伤的防御、对化学物质的除去能力、免疫反应、感觉功能、体温调节能力的降低。
所述组合物可以用于改善由于外在因素和内源因素引起的皮肤老化。所述外在因素是指各种外部因素，例如紫外线(光)，内在因素还被称作慢性因素，主要是指由于时间经过而发生的因素。也就是说，所述皮肤老化是具体地包括由于紫外线、公害、香烟的燃气、微尘、化学物质等外部刺激诱导的早期老化症状，也包括由于年龄增加导致的皮肤细胞增殖的减少而发生的自然老化现象，且包括皱纹、弹力减少、皮肤松弛和干燥现象等的概念。并且，皱纹包括由于内部、外部因素的变化而引起的刺激改变组成皮肤组织的成分而诱发的皱纹。所述老化可以是光老化。术语“光老化(Photoaging)”是由于外部环境因素引起的现象，其中具有代表性的因素是紫外线。紫外线导致蛋白水解酶的激化、基质蛋白的链断裂和异常交叉结合等活体组成成分的损伤，这种机制的反复在外观上也会引起明显的皮肤老化。
本说明书中的术语“皱纹”可以是指皮肤因丧失其弹力而变得松弛的状态，例如可以是指皮肤折叠。所述“预防或改善皮肤皱纹”可以是指通过抑制皱纹相关因子的表达来防止或改善皱纹或增加胶原蛋白总量的所有作用。
所述“皮肤屏障强化”可以是指位于皮肤最外侧以防止水分损失和营养损失的皮肤屏障的功能得以提高的所有作用。皮肤屏障功能损伤可以是指由于皮肤屏障功能的降低或损伤出现在皮肤的所有变化。例如，可以包括皮肤皱纹增加、干燥、皮炎、特应性皮炎、过敏性皮炎、粉刺等。
所述“皮肤保湿”可以是指保持皮肤水分或防止水分损失的所有作用。
所述组合物可以是化妆品组合物。
所述化妆品组合物例如可以具有柔软化妆水、营养化妆水、按摩霜、营养霜、精华素、面膜、凝胶、安瓿或皮肤粘合类型的化妆品剂型。
包括在所述化妆品组合物中的成分可以包括所述组合物之外的通常使用于化妆品组合物的成分作为有效成分，例如可以包括诸如稳定剂、溶剂、维生素、颜料和香料等通常的助剂和载体。
并且，所述组合物可以是用于皮肤外用剂的组合物。
所述皮肤外用剂可以是乳膏、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤悬浮液、经皮传递性贴片、含药绷带、乳液或其组合。所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用于化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂以及各种皮肤营养剂或其组合。所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖类。
并且，所述组合物可以是药物组合物。
所述药物组合物可以进一步包括药学上可接受的稀释剂或载体。所述稀释剂可以是乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素，或甘露醇，润滑剂可以是硬脂酸镁、滑石粉，或其组合。所述载体可以是赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂，或其组合。所述赋形剂可以是微晶纤维素、乳糖、低取代羟基纤维素，或其组合。所述崩解剂可以是羧甲基纤维素钙、羟基乙酸淀粉钠、无水磷酸一氢钙或其组合。所述结合剂可以是聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羟丙基纤维素，或其组合。所述润滑剂可以是硬脂酸镁、二氧化硅、滑石粉，或其组合。
所述药物组合物可以配制成经口或肠胃外施用剂型。经口施用剂型可以是颗粒剂、散剂、液剂、锭剂、胶囊剂、干燥浆液、或其组合。肠胃外施用剂型可以是注射剂。
并且，所述组合物可以是健康功能食品组合物。
所述健康功能食品组合物可以单独或与其它食品或食品成分一起使用，且可以根据常规的方法适当地使用。可以根据使用目的(预防、健康或治疗性处理)合适确定有效成分的混合量。通常，在制备食品或饮料时，基于原料，本说明书的组合物的添加量可以等于或少于15重量份。所述健康功能食品的种类不受特别限制。在健康功能食品的种类中，饮料组合物如通常的饮料含有各种香味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。所述天然碳水化合物为诸如葡萄糖、果糖的单糖、诸如麦芽糖、蔗糖的二糖、诸如糊精、环糊精的聚糖、木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等糖醇。可以使用索马甜、甜叶菊提取物等天然甜味剂，或诸如糖精、阿斯巴甜的合成甜味剂等。所述健康食品组合物还可以包括营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸和其盐、海藻酸和其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂，或其组合。所述健康功能食品组合物可以进一步包括用于制备天然果汁、果汁饮料、蔬菜饮料的果肉，或其组合。
另一方面提供一种预防、改善、或治疗个体状态的方法，其包括将有效量的所述组合物处理或施用于需要所述组合物的个体。
所述个体的状态可以是指与皮肤有关的状态。
如本文所用，术语“施用”、“导入”和“移植”可互换使用，并且可以是指将根据一实施例的组合物至少部分地定位到所需部位的方法，或通过施用途径将根据一实施例的组合物放置到个体。
可以根据本领域公知的方法进行施用。例如可以通过静脉内、肌肉内、口服、经皮(transdermal)、粘膜、鼻腔内(intranasal)、气管内(intratracheal)，或皮下施用的途径等由任意手段直接进行施用。可以对全身或局部进行所述施用。
所述个体可以是哺乳动物，例如，人、牛、马、猪、狗、羊、山羊，或猫。所述个体可以是需要皮肤状态改善，例如皮肤保湿、皮肤屏障强化、皮肤伤口治疗、皮肤皱纹改善效果的个体。
所述施用可以是指将根据一具体实施例的组合物对每个个体每天施用0.1mg至1,000mg，例如，0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1,000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1,000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1,000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg，或10mg至25mg。然而，可以根据制剂化方法、施用方式、患者年龄、体重、性别、病状、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和对药物的反应敏感性等因素以各种方式处方施用量，并且，本领域普通技术人员能够考虑这些因素适当地调节施用量。对于施用次数而言，可以是每天一次，或者在临床上可接受的副作用范围内施用两次或更多次。对施用部位而言，可以施用于一处或至少两处，并且，以每天或两天至5天间隔，每次治疗时的总施用天数可以是1天至30天。若有需要，可以在适当时期以后反复相同的治疗。对除人之外的动物而言，对每kg给予与人相同的施用量，或者可以给予例如通过用目标动物和人的器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)等换算所述施用量而获得的量。
附图说明
图1为图示由于根据一方面的组合物导致的皮肤保护效果。
具体实施方式
以下，提出优选实施例以辅助对本发明的理解。然而，以下的实施例仅是为了更容易理解本发明提供的，而不是限制本发明内容。
[准备例]
准备例1.菌株的分离
在将济州岛传统辛奇10g投入100ml的灭菌水中在37℃下静置1小时，并用食盐水稀释。然后，将稀释液在每稀释步骤以100μl接种于乳酸菌(Lactobacilli)MRS肉汤(broth)固体培养基(BD社，288130)中并平面涂布，然后将经涂布的固体培养基在37℃下培养2天。然后，分取所形成的集落，并使用公知的27F、338F、518F、785F、518R、805R、907R和1492R引物实施了16s rRNA基因序列鉴定。在95℃、55℃、75℃下分别实施1分钟、1分钟、1分30秒总共30次循环的PCR扩增，最终在72℃下处理8分钟后在4℃下保存。PCR反应结束后，使用ABI-3730XL(ABI,美国)确定了经分离培养的种的DNA序列。从经分离培养的微生物集落中，对所确定的16S rRNA部位的碱基序列与通过由美国国立生物技术信息中心(NCBI，NationalCenter for Biotechnology Information)网页提供的BLAST程序登录的其它菌株进行了比较分析。仅筛选并使用了同源性等于或低于97％的可靠的种，并其中筛选了同源性等于或低于94％的新型的微生物(以下称作“AMP 5104”)。AMP 5104具有序列号1(complementary DNA)的16s rRNA序列。然后，将所述菌株于2020年09月23日保藏在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures,KCTC)，并接收了保藏号KCTC14319BP。将菌株HB-8023于2017年8月30日保藏在韩国典型培养物保藏中心，并接收了保藏号KCTC 13322BP。
[实施例]
实施例1.乳杆菌菌株溶解物的制备
在共培养两种乳杆菌菌株后，制备了其溶解物。具体地，将从辛奇中分离出来的沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei subsp.Sakei)AMP 5104菌株(KCTC 14319BP)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus Pentosus)HB-8023菌株(KCTC 13322BP)接种于乳酸菌MRS肉汤(BD社，288130)并在35℃至37℃下培养1天至3天。然后，使用均质机(homogenizer)裂解了菌株的细胞壁。
实施例2.使用乳杆菌菌株发酵的花椰菜芽发酵物的制备
制备了使用乳杆菌菌株发酵的花椰菜芽发酵物。具体地，将所述实施例1的沙克乳酸杆菌菌株和戊糖乳杆菌菌株接种于含有1重量％至20重量％的灭菌花椰菜芽干物的培养基中，并在35℃至37℃下培养1天至3天。然后，从培养基中除去了所述菌体。
[比较例]
比较例1.沙克乳酸杆菌菌株溶解物的制备
除了对从辛奇中分离出来的沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei subsp.Sakei)AMP 5104菌株(KCTC 14319BP)进行单独培养之外，通过与所述实施例1相同的方法制备了溶解物。
比较例2.戊糖乳杆菌菌株溶解物的制备
除了对戊糖乳杆菌(Lactobacillus Pentosus)HB-8023菌株(KCTC 13322BP)进行单独培养之外，通过与所述实施例1相同的方法制备了溶解物。
比较例3.花椰菜芽提取物的制备
对基于溶剂总重量的1重量％至20重量％的花椰菜芽干物进行热水提取1小时至4小时，然后，进行过滤来制备了花椰菜芽提取物。
[制备例]
制备例1至2.化妆品组合物的制备
制备了包括以下表1中的成分和含量的化妆品组合物。具体地，混合A相的成分后在70℃下进行加热并保存。然后，将B相的成分添加到A相来进行预乳化，并使用均匀混合器均匀乳化并缓慢冷却来制备了具有乳膏剂型的化妆品组合物。在本说明书中，除非另有记载，含量是指重量％。
[表1]
[比较制备例]
比较制备例1至3：化妆品组合物的制备
除了包括以下表2中的成分和含量之外，通过与所述制备例相同的方法制备了化妆品组合物。
[表2]
[试验例]
细胞毒性确认
确认了乳杆菌菌株溶解物和发酵物的细胞毒性。具体地，将角质形成细胞(keratinocyte cell,HaCaT)以4×104细胞/孔接种于96孔板中并培养24小时。然后，将使用含2％FBS的培养基替代培养基，并根据浓度(0.3％、0.6％、2.5％、5％和10％)对所述实施例1和2以及比较例1至3进行处理并进一步培养24小时。接着，通过MTT ASSAY确认细胞存活，并使用酶标仪测定了565nm处的吸光度。
[表3]
结果，如表3表示，可以确认实施例1和2以及比较例1至3中显示至少80％的细胞存活率，即为没有细胞毒性的安全物质。
光毒性抑制效果确认
由于露出于紫外线的皮肤可能引起炎症，确认了乳杆菌菌株溶解物和发酵物对光毒性的抑制效果。具体地，将角质形成细胞(keratinocyte cell,HaCaT)以1×105细胞/孔接种于96孔板中并培养24小时。然后，用磷酸盐缓冲液(PBS：Phosphate buffered saline)洗涤各孔一次，将PBS投入各孔中，并使用紫外线B(UVB)灯(型号：F15T8，UV B 15W，SankyoDennki社，日本)照射了20mJ/cm2的紫外线。接着，减去PBS并添加DMEM 1ml，其中添加有10％的PBS，并根据浓度(0％、0.1％、0.5％和1％)处理所述实施例1和2和以及比较例3之后培养了24小时。在培养后，除去培养基，并将细胞培养基和MTT溶液投入各孔中并在37℃的CO2培养器中培养2小时。除去培养基，并在酶标仪中测定了565nm处的吸光度。
[表4]
结果，如表4表示，可以确认在实施例1和2以及比较例1至3中，在0.1％至1％的浓度下的细胞存活率浓度依赖性地增加。尤其，相比于使用乳杆菌菌株单独溶解物的比较例1或2，实施例1中的细胞存活率显著增加了。
由此可知，根据一具体实施例的乳杆菌混合溶解物能够抑制由于紫外线引起的细胞损伤，从而具有优异的光损伤防御效果。
对由于病原菌引起的细胞保护效果的确认
确认了由病原菌引起的细胞保护效果。具体地，将皮肤角质细胞(keratinocytecell,HaCaT)以5×104细胞/孔接种于48孔板并培养24小时。然后，在无血清培养基处理实施例1和2以及比较例1至3。在24小时后，添加细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer)并在37℃、CO2培养器中进一步培养了30分钟。然后，将细胞培养液和LDH Working Solution以相同分量添加于96孔板中并在黑暗条件下反应30分钟，并使用酶标仪测定在490nm处的吸光度，并基于在使用金黄色葡萄球菌处理时出现的细胞毒性来计算了测定结果。
[表5]
结果可知，如表5所示，相比于未处理对照组和比较例1至3，在实施例1至2中的细胞毒性显著减少了。并且，细胞保护效果是指在细胞损伤时分泌的LDH的分泌减少，对于实施例1至2而言，可以确认相对于未处理对照组的细胞保护效果比比较例1至3显著增加了。
因此，根据一具体实施例的乳杆菌混合溶解物可以抑制由于病原菌引起的细胞毒性，且具有显著的细胞保护效果，因此可以从包括金黄色葡萄球菌的各种病原菌保护皮肤。
抗菌和抗炎症活性确认
通过由于病原菌引起的抗菌肽生成能力和炎症改善效果来确认了抗菌和抗炎活性。具体地，将皮肤角质细胞(keratinocyte cell,HaCaT)以5×104细胞/孔接种于48孔板并培养24小时。然后，在无血清培养基对实施例1至2以及比较例1至3进行处理。在24小时后，添加细胞裂解缓冲液在37℃、CO2培养器中进一步培养了30分钟。然后，使用RNeasyMini Kit(Hilden,德国)分离出RNA后，使用nanodrop在260nm定量RNA，然后使用各2μg的RNA在扩增仪中合成了cDNA。RT Super Mix Kit(Massachusetts,U.S.A)。以经合成的cDNA为模板，向作为靶基因的抗菌肽因子(LL37、RNase7、HBD-2)和细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-α)将塞博格林(Luna Universal qPCR Master Mix,New EnglandBioLabs,美国)与引物和cDNA一起添加，并使用实时(real-time)PCR(MIC2,昆士兰州)执行了实时聚合酶链反应。通过对RPL13A基因的修改最终分析了基因表达量，并将其结果表示在以下表6中。
[表6]
结果，如表6所示，可以确认相比于未处理对照组和比较例1至3，在实施例1至2中的抗菌肽基因的表达量显著增加了，而细胞因子基因的表达显著减少。
因此，根据一具体实施例的乳杆菌混合溶解物能够减少由于金黄色葡萄球菌而增加的炎症性细胞因子的表达并增加抗菌肽基因的表达，从而显示对病原菌的皮肤抗菌和对由于病原菌引起的炎症的抗炎症活性。
瘙痒症抑制效果确认
TSLP为通过非正常的各种生物学信号传递来诱发免疫不均衡的最高位蛋白，是在与外部抗原或微生物接触时由组成皮肤的角质形成细胞、成纤维细胞或肥大细胞(mastcell)产生的蛋白。在目前表明的各种生物学理由中，TSLP可以是对特应性皮炎的最强烈的高位衍生物。因此，通过测定TSLP表达的减少率来确认了对由于病原菌引起的瘙痒症的抑制效果。具体地，将角质形成细胞(keratinocyte cell,HaCaT)3×105/ml接种于添加由10％的FBS的培养基中培养了24小时。然后，将含有2％FBS的培养基与Poly(I：C)5μg/ml和实施例1至2以及比较例1至3分别稀释后进一步培养了48小时。在培养后，使用RNeasy minikit(Qiagen,Hilden,德国)进行总RNA提取，并使用经合成的cDNA 1μg实施了PCR。使用图像分析仪(image analyzer)(Davinch k.Korea)确认了通过PCR生成的产物。
[表7]
结果，如表7所示，可以确认将使用金黄色葡萄球菌0.5％进行处理的实施例与未处理对照组相比，TSLP的表达量显著增加，并且，与实施例1至2或比较例1至3的处理相比，TSLP的表达量减少了。具体地，对实施例1和实施例2进行处理时，TSLP分别减少至85.27％和78.59％，与比较例1至3相比显著减少了。
因此，根据一个具体实施例的乳杆菌混合溶解物显著减少TSPL的表达，从而对特应性皮炎的预防、治疗或改善显示优异的效果。
确认抗污染(Anti-pollution)活性
萝卜硫素是一种公知的抗污染(Anti-pollution)效能成分，且存在于天然物中的十字花科(Brassica Brassica-seae)中，且是通过由黑芥子酶(myrosinase)酶水解芥子油甘(glucosinolates)来生成的异硫氰酸盐(isothiocyanates)物质。已知，通过这种方式生成的化合物以对草食动物和病原菌防御植物的作用，对人是用于预防癌症的重要物质之一。在十字花科作物中以抗癌和抗炎天然物众所周知的花椰菜科花椰菜芽含有多量的萝卜硫素。花椰菜含有萝卜硫苷(glucoraphanin)作为芥子油甘成分，其由黑芥子酶成为异硫氰酸盐类的萝卜硫素。因此，确认了对使用两种不同乳杆菌菌株进行发酵而获得的花椰菜芽发酵物和花椰菜芽提取物根据萝卜硫苷和萝卜硫素含量变化的抗污染活性。具体地，使用HPLC(Waters 2695 Alliance separation module(waters,米尔福德，马萨诸塞州))和Photo Diode Array 2998(Waters,米尔福德，马萨诸塞州)测定了实施例1至2以及比较例1至3内萝卜硫苷和萝卜硫素的含量。
[表8]
萝卜硫苷(PPM) 萝卜硫素(PPM)
实施例1 15231 0
实施例2 24345 450
比较例1 13112 0
比较例2 12601 0
比较例3 14573 110
结果，可以确认，如表8所示，相比于比较例3的花椰菜提取物，在实施例2的花椰菜提取物中萝卜硫苷和萝卜硫素的含量显著增加。
因此，根据一具体实施例的乳杆菌菌株的花椰菜芽可以通过增加萝卜硫苷和萝卜硫素的含量来防止和缓和诸如各种排气、烟草燃气、黄沙、微尘等污染物质对皮肤的附着，且可以从由于污染物质引起的损伤保护皮肤。
美白活性确认
确认了对由于微尘引起的色素沉着的改善效果。具体地，将黑色素形成细胞株以1×105细胞/孔接种于6孔板。使细胞贴附于培养板底面24小时，并将角质形成细胞株(keratinocyte cell,HaCaT)以3×105细胞/ml接种于Trans well insert，然后与黑色素形成细胞共培养24小时。在培养后，将生长补充剂(growth supplements)、PM2.5 50PPM、实施例1至2以及比较例1至3分别添加于角质细胞无血清培养(Keratinocyte serum free；KFM)而获得的培养基仅投入包括角质形成细胞的Trans well insert,并将Medium254培养基投入包括黑色素形成细胞的孔板中并将Trans well insert安装于孔板。在共培养72小时后，回收培养黑色素形成细胞、角质形成细胞的培养基并执行黑色素测定(Melaninassay)，并使用酶标仪测定来测定黑色素含量。将5μM的萝卜硫素用作阳性对照组。
[表9]
结果，可以确认，如表9所示，黑色素含量由于PM2.5 50PPM处理增加，并且，所增加的黑色素含量通过实施例1至2以及比较例1至3的处理而减少。具体地，根据对实施例1至2进行处理的结果，可知黑色素含量相比于比较例1至3显着减少。
因此，根据一个具体实施例的乳杆菌混合溶解物和乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物可以显示对由于微尘引起的黑色素形成的抑制效果。
炎症改善确认
确认了对由于微尘引起的炎症的改善效果。具体地，使用RNeasy Mini Kit(Hilden,德国)来分离从所述实验例中回收的角质形成细胞的RNA。然后，使用nanodrop在260nm定量RNA后，分别使用2μm的RNA在扩增仪中合成了cDNA。RT Super MixKit(马萨诸塞州，美国)。以经合成的cDNA为模板，将塞博格林(Luna Universal qPCRMaster Mix,New England BioLabs,美国)与引物和cDNA一起添加于作为靶基因的细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)，并在实时PCR(MIC2,昆士兰州)中执行了实时聚合酶链反应。通过对RPL13A基因的修改最终分析了基因表达量，并将其结果表示在以下表10中。
[表10]
结果，可以确认，如表10所示，炎症性细胞因子的表达通过PM2.5 50PPM增加，并且，所增加的细胞因子表达通过实施例1至2以及比较例1至3的处理减少。具体地，可确认，相比于各乳杆菌菌株溶解物即比较例1比较例2，在菌株混合溶解物即实施例1中的细胞因子的表达显著减少。并且可确认，相比于花椰菜芽提取物即比较例3，在乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物即实施例2中细胞因子的表达显著减少。
因此，根据一个具体实施例的乳杆菌混合溶解物和乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物抑制由于微尘引起的细胞因子表达的增加，从而对炎症改善具有优异的效果。
皮肤保湿改善效果确认
确认了化妆品组合物的皮肤保湿改善效果。所述化妆品组合物包括根据一个具体实施例的乳杆菌混合溶解物和乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物作为有效成分。具体地，以20代至40代女性20名为对象确定两个测定部位，并分别测定皮肤水分量三次。然后，将制备例1至2以及比较制备例1至3在测定部位上适量涂布，并使用皮肤水分含量测试仪(Corneometer)(CM825,C+K，德国)测定了根据时间(涂布30分钟后、60分钟后、90分钟后以及120分钟)的皮肤水分量。
[表11]
结果，可以确认，如表11所示，制备例1和2中的初期水分量高于比较制备例1至3中的初期水分量。还可以确认涂布2小时后的皮肤水分量保持为至少一定含量。
因此，根据一具体实施例的乳杆菌混合溶解物和乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物显著提高涂布后的皮肤水分量，且具有优异的保湿持续能力，因此具有优异的皮肤保湿改善效果。
皮肤屏障改善效果确认
为了确认化妆品组合物的皮肤屏障改善效果测定了经皮水分散失(TEWL：TransEpidermal Water Loss)。所述化妆品组合物包括根据一个具体实施例的乳杆菌混合溶解物和乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物作为有效成分。具体地，以20代至40代女性20名为对象确定两个测定部位，并在测定部位涂布适量的制备例1至2和比较例1至3。然后，将TEWL探针放置于受试者的测定部位并在1分钟至3分钟后测定了变得一定的值。
[表12]
结果，可以确认，如表12所示，制备例1至2中的涂布前后的经皮水分散失的减少显著少于比较制备例1至3中的涂布前后的经皮水分散失的减少。
因此，根据一个具体实施例的乳杆菌混合溶解物和乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物可以通过抑制经皮水分散失来显示皮肤屏障改善效果。
皮肤美白效果确认
确认了化妆品组合物的皮肤屏障改善效果。所述化妆品组合物包括根据一个具体实施例的乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物作为有效成分。具体地，以20岁至35岁的女性20名为对象将制备例2和比较制备例3涂布在脸部左右两侧每天两次、持续两个月。两个月后，使用图像分析仪和色度计(Minolta CR300)测定色亮度(L)的变化，并通过实时由复数个熟练人员的客观性肉眼观察和由受试者的主观性肉眼观察，并根据下面的等级分馏测定了其效果。
*-3：非常恶化、-2：恶化、-1：略有恶化、0：没有变化、1：略有改善、2：改善、3：显著改善
[表13]
结果如表13所示，对于制备例2而言，可以确认相比于比较制备例3显示皮肤亮度的显著变化，且根据肉眼观察的结果也可确认皮肤亮度有所改善。
因此，根据一具体实施例的乳杆菌混合菌株的花椰菜芽发酵物具有对抗有害的外部环境而改善皮肤美白的效果。
根据一方面的组合物包括乳杆菌菌株混合物作为有效成分，因此对改善由微尘、紫外线、有害病原菌以及干燥的环境损伤的皮肤有优异的效果。
本发明的上述说明仅用于提供示例，本发明所述领域的普通技术人员应当理解在不改变本发明的技术思想或必须特征也可以将本发明容易变更为其它具体形式。因此，应当理解上文中描述的记载在所有方面仅是示例性的，而不是限制性的。

Claims (9)

1.一种化妆品组合物，其包括两种乳杆菌属菌株混合物、其干物、裂解物、培养液、培养液提取物、溶解物、发酵物，或其混合物。
2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述发酵物是花椰菜发酵物、花椰菜芽发酵物，或其混合物。
3.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述乳杆菌属菌株选自由沙克乳酸杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、旧金山乳杆菌、格氏乳杆菌、辛奇乳杆菌，以及罗伊氏乳杆菌组成的组。
4.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述乳杆菌属菌株为沙克乳酸杆菌AMP5104菌株(KCTC14319BP)和戊糖乳杆菌HB-8023菌株(KCTC13322BP)。
5.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其用于改善皮肤皱纹、皮肤弹力、皮肤保湿、皮肤老化、皮肤抗菌、皮肤炎症、皮肤免疫、皮肤美白，或皮肤屏障。
6.一种用于改善皮肤皱纹、皮肤弹力、皮肤保湿、皮肤老化、皮肤抗菌、皮肤炎症、皮肤免疫、皮肤美白或皮肤屏障的皮肤外用剂组合物，其包括两种乳杆菌属菌株混合物、其干物、裂解物、培养液、培养液提取物、溶解物、发酵物、或其混合物。
7.一种用于改善皮肤皱纹、皮肤弹力、皮肤保湿、皮肤老化、皮肤抗菌、皮肤炎症、皮肤免疫、皮肤美白或皮肤屏障的食品组合物，其包括两种乳杆菌属菌株混合物、其干物、裂解物、培养液、培养液提取物、溶解物、发酵物，或其混合物。
8.一种用于预防或治疗皮肤炎症疾病的药物组合物，其包括两种乳杆菌属菌株混合物、其干物、裂解物、培养液、培养液提取物、溶解物、发酵物，或其混合物。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述皮肤炎症疾病为选自由皮肤伤口、皮炎、特应性皮炎、瘙痒症、湿疹性皮肤疾病、干性湿疹、红斑、荨麻疹、牛皮藓、药疹，以及粉刺组成的组中的至少一种。
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