CN116555297A - 一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯形成的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

发明提供一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯形成的基因及其应用，所述基因为糖基转移酶PpUGT74F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。经验证，PpUGT74F2基因蛋白可在体外将水杨酸甲酯转化为结合态形式。在桃和番茄果实中过表达PpUGT74F2后，结合态水杨酸甲酯含量显著增加。同时所述基因PpUGT74F2可通过平衡植物体内水杨酸甲酯含量调节植物抗性。经过验证，水杨酸甲酯处理接种果生链核盘菌的桃果实后，其发病明显延缓。而过表达PpUGT74F2的番茄在接种病原菌后，水杨酸甲酯含量显著下降，发病更严重。因此，本发明的PpUGT74F2可通过改变水杨酸甲酯含量，对植物抗病性起负调控作用。

Description

一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯形成的基因及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯形成的基因及其应用。
背景技术
植物在受到微生物感染时会做出一系列反应以抵御胁迫。水杨酸甲酯作为一种植物抗病反应过程中的重要信号分子，在植物受到病原菌感染时会转移到植物未感染部位，从而引发植物的系统获得性抗性反应(SAR)。水杨酸甲酯在植物中包含两种形式，一种是游离态(具有挥发性)，一种是结合态(不具有挥发性)，两者之间的相互转换在植物抗病方面可能存在重要作用。桃果实中水杨酸甲酯以结合态居多，因此鉴别可以糖基化水杨酸甲酯调节其在体内平衡的基因具有重要应用价值。
糖基转移酶是一种可以催化小分子化合物与糖基相连形成糖苷或糖脂的蛋白酶。目前已经在桃、草莓、番茄、拟南芥、茶树等植物中报道。由于糖基转移酶的底物比较广泛，包括黄酮醇、芳香物质、植物激素等。因此其在果实营养价值、风味以及植物生长和抗病等方面发挥重要作用。目前虽然在拟南芥和茶树中发现与抗病相关的糖基转移酶，但果实中的相关糖基转移酶尚未见报道，其调控机制仍有待研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯形成的基因，所属基因为糖基转移酶PpUGT74F2。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯形成的基因，所述基因为糖基转移酶基因PpUGT74F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR扩增的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，PCR扩增的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述糖基转移酶基因PpUGT74F2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明的另一个目的是提供所述的糖基转移酶基因PpUGT74F2在调节植物抗病性中的应用。所述糖基转移酶基因PpUGT74F2作为果实开展基因工程与改良育种的重要候选基因，改善植物抗病能力。
本发明的再一个目的是提供所述糖基转移酶基因PpUGT74F2在将水杨酸甲酯糖基化，形成结合态水杨酸甲酯中应用，本发明所述PpUGT74F2可以糖基化水杨酸甲酯，形成不具挥发性的结合态水杨酸甲酯，能调节水杨酸甲酯含量，从而调节植物抗性。
本发明的有益效果：本发明提供了一个可以糖基化水杨酸甲酯的糖基转移酶基因PpUGT74F2，属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，所述基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明中，所述糖基转移酶基因能够糖基化水杨酸甲酯。该基因表达与结合态水杨酸甲酯含量呈正相关关系。重组蛋白能够在体外糖基化水杨酸甲酯，变成不具挥发性的结合态水杨酸甲酯。采用遗传转化技术过量表达该基因，显著增加了桃和番茄果实中结合态水杨酸甲酯的含量。
在桃果实上接种果生链核盘菌后，与未接种的果实相比，接种后的桃果实水杨酸甲酯含量显著增加，抗病相关的PR基因被诱导。在水杨酸甲酯外源熏蒸接种果生链核盘菌的桃果实后，病斑扩散程度显著降低。说明水杨酸甲酯在微生物胁迫过程中被诱导，并且该物质可以有效降低病原菌的蔓延。在过表达转基因番茄的叶片和果实中分别接种DC3000和灰霉菌，转基因株系表现为更感病的症状。转基因的水杨酸甲酯显著低于野生型。由此表明，所述基因可以糖基化水杨酸甲酯，并通过调节水杨酸甲酯在植物中的平衡影响植物的抗病性，具有重要应用价值。
附图说明
图1为桃果实成熟过程中结合态水杨酸甲酯MeSA-Glc及PpUGT74F2表达情况。
图2为PpUGT74F2蛋白的体外酶活测定结果。
图3为过量表达PpUGT74F2基因的桃果肉中PpUGT74F2的相对表达量(*P<0.05)。
图4为过量表达基因PpUGT74F2的桃果肉结合态水杨酸酸甲酯的含量(*P<0.05)。
图5为转基因番茄果实的PpUGT74F2基因表达量。
图6为转基因番茄果实的结合态水杨酸甲酯基因表达量(*P<0.05)。
图7为接种M.fructicola 1d和3d后的桃果实照片。
图8为接种M.fructicola 1d和3d后水杨酸甲酯含量(*P<0.05)。
图9为接种M.fructicola 1d和3d后PpUGT74F2基因表达情况(*P<0.05)。
图10为接种M.fructicola 1d和3d后PR基因表达情况(*P<0.05，**P<0.01)。
图11为水杨酸甲酯处理接种M.fructicola 3d和5d后的桃果实照片。
图12为水杨酸甲酯处理接种M.fructicola 3d和5d后的桃果实菌斑大小统计(**P<0.01)。
图13为转基因番茄叶片Pst DC3000处理后的二甲基联苯胺染色情况(颜色越深代表过氧化氢含量越高，植株受伤害越大)。
图14为转基因番茄叶片Pst DC3000处理后菌量测定结果(*P<0.05，**P<0.01)。
图15为转基因番茄叶片Pst DC3000处理后水杨酸甲酯含量(**P<0.01)。
图16为接种B.cinerea后的转基因番茄果实照片。
图17为接种B.cinerea后的转基因番茄果实菌斑大小统计(**P<0.01)。
图18为接种B.cinerea后的转基因番茄果实水杨酸甲酯含量(*P<0.05)。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例，作进一步的说明。
本发明中，所述PpUGT74F2基因进行PCR扩增时的模板优选为桃果实cDNA；所述桃果实cDNA优选的采用桃果实总RNA逆转录合成；本发明对桃果实cDNA的合成方法没有特殊要求，采用本领域常规的植物cDNA合成方法即可，在本发明具体实施过程中，采用TAKARA试剂盒进行合成；本发明对桃果实总RNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物细胞总RNA提取方法即可。
本发明提供了上述方案所述糖基转移酶基因PpUGT74F2编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述蛋白质含有468个氨基酸。
本发明中，所述双酶切体系优选为：Cutsmart buffer 5μL、载体1μg、内切酶各1μL、水补足50至μL；所述双酶切的体系优选为：37℃酶切3h。
本发明中，所述回收的试剂盒优选采用TAKARA凝胶回收试剂盒进行；所述连接的试剂盒优选采用Vazyme的一步克隆试剂盒进行。
本发明的具体实施过程中，优选的转化步骤为：50μL农杆菌感受态加入5μL重组载体，冰上放置30min，转入Bio-Rad 2mm电击杯，通过Bio-Rad GenePulser Xcell在2.5Kv条件电击转入。
本发明还提供了上述方案所述的糖基转移酶基因PpUGT74F2在桃树育种中的应用；所述应用优选为糖基转移酶基因PpUGT74F2在桃果实抗病性改善的基因工程育种中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一个参与桃结合态水杨酸甲酯糖基化的糖基转移酶基因PpUGT74F2及其在抗病调节上的应用进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：桃PpUGT74F2的表达和结合态水杨酸甲酯含量具有正相关性
(一)实验方法
1.桃果实材料
以水蜜桃品种‘湖景蜜露’(Prunus persica L.Batsch cv.Hujingmilu)为材料，其果实采自浙江省奉化市水蜜桃研究所。桃果实在快速生长期(34DAB)、硬核期(71DAB)、成熟期(108DAB)采收。成熟果实置于20℃分别贮藏3d、6d至完熟。每个时间点设置3个生物学重复，每个重复5个果实，样品在液氮速冻后于-80℃保存待用。
2.RNA提取和cDNA合成
利用CTAB法提取桃果实总RNA，送由百迈克生物科技有限公司进行转录组测序分析。
3.桃果实结合态香气物质含量分析
取磨碎后的果肉样品10g，溶于20mL 34％的硫酸按溶液中，超声5min。13000g离心15min，过定性滤纸后搜集上清液。LC-18SPE小柱(6mL CNW，杜塞尔多夫，德国)用6mL甲醇与6mL蒸馏水活化后，过上述所得上清，用等体积蒸馏水洗去可溶性糖酸，再用25mL二氯甲烷洗去游离态香气，最后用14mL甲醇将结合态香气洗脱。收集的洗脱物，用氮吹仪去除大部分甲醇后45℃旋转蒸发至干，残余物中加入600μL(0.2M pH＝5)柠檬酸-磷酸钠缓冲液溶解，再用二氯甲烷进行多次洗脱，取上清液于4mL顶空瓶中，加入400μL酶(AR2000，2mg)，37℃水浴酶解24h后，加入10μL内标(0.8mg mL-1 2-辛醇)涡旋混匀，以HS-SPME方法进行萃取。恒温平衡30min后，使用萃取头65μm PDMS/DVB，Stableflex(pink)(SUPELCO)吸附30min。毛细管柱型号为DB-WAX(30m*0.25mm*0.25mm)，较强极性，柱子最高耐受温度为250℃。柱箱升温程序：40℃保持2min，3℃/min升温到100℃，5℃/min升温到245℃，进样口温度为240℃，检测器温度250℃，载气为氦气，流速为1ml/min，不分流进样，恒定流量模式。
实验结果参见图1，桃果实成熟过程中结合态水杨酸甲酯MeSA-Glc及PpUGT74F2表达情况。
(二)实验结果
根据转录组测序和芳香物质的含量测定结果显示，桃果实成熟过程中结合态水杨酸甲酯MeSA-Glc含量的持续增加，伴随着PpUGT74F2表达的持续增强。
实施例2：原核表达PpUGT74F2重组蛋白催化结合态水杨酸甲酯的形成
(一)实验方法
1.重组载体构建和大肠杆菌转化
根据PpUGT74F2在桃基因组数据库Peach Genome V2.0中的参考序列，利用PCR技术，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增获得PpUGT74F2全长SEQ ID NO.1。PCR反应体系为50μL，成分分别为：25μL PrimeSTAR Max Premix(2x)酶(TAKARA)，上下游引物(10μM)各1μL，1μL桃果实cDNA，22μL H2O。PCR反应程序为：98℃10s；60℃15s，72℃40s，35个循环。PCR产物与目标载体(pET6xHN-N，Clonetch，Takara)用限制性内切酶SalI和HindIII酶切后连接，用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的质粒用热激法转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)pLysS(Promega)，挑取阳性菌落PCR检测验证。
2.诱导表达
挑选转化后的大肠杆菌单菌落，加入20mL含有氨苄抗生素的LB中，37℃过夜培养。过夜培养后的菌液按照1:50的比例转入500mL含有氨苄抗生素的LB中，培养至OD600＝0.5-0.6。加入1mM的IPTG于16℃过夜诱导至0D600＝1.8-2.0。4000g，15min离心获得沉淀，以约20mL的1×PBS溶液重新悬浮，于-80℃超低温冰箱冻存24h后转至30℃水浴融解破碎。
3.蛋白纯化
破碎后的菌液进行离心(4℃，10000rpm,30min)，上清液以HV除菌膜(0.45μm,diameter 33mm,Millipore USA)过滤后，使用HisTALONTM(Clontech,Takara)重力柱纯化得到蛋白。蛋白液用脱盐柱PD-10((GE Healthcare UK)进行脱盐，并将蛋白置换到Tris-HCI缓冲液(100mM Tris,2mM DTT,PH 7.5)，加入10％甘油将蛋白储存在超低温冰箱。
4.体外酶活测定
反应在Tris-HCl缓冲液(100mM Tris，pH7.5，2.0mM DTT)中进行，200μl反应体系中加入1μg纯化蛋白，1mM UDP-葡萄糖和1mM底物。在30℃下孵育16小时后，通过加入10μl24％(v/v)TCA终止反应，用乙酸乙酯萃取，然后蒸发至干。将糖苷化合物溶解在甲醇中，通过LC-MS分析产物。使用仪器为Agilent 1290Infinity LC System(AgilentTechnologies，USA)，色谱柱为SunFire C18分析柱(5μm，4.6×250mm；Waters，USA)，检测波长为200-400nm。色谱条件以0.1％甲酸作为溶剂A和100％乙腈(加入0.1％甲酸)作为溶剂B，1mL/min的流速进行检测。质谱由装有ESI源的Agilent6460三重四极杆质谱仪(AgilentTechnologies，USA)，以负离子模式分析。扫描范围为100-1000m/z，雾化器压力设定为45psi。MeSA-Glc的检测波长为210nm，m/z值为337[M+Na]+。实验结果参见图2，PpUGT74F2蛋白的体外酶活测定结果。
(二)实验结果
在大肠杆菌中诱导的重组蛋白PpUGT74F2，能够以水杨酸甲酯为底物，UDP-葡萄糖为糖供体，催化结合态水杨酸甲酯的合成。
实施例3：桃果实瞬时过量表达PpUGT74F2基因，增加了果实结合态水杨酸甲酯的含量
(一)实验方法
1.载体构建
结合引物对SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5扩增获得PpUGT74F2全长SEQ ID NO.1。PCR反应体系和程序同实施例2。选择BamH I和Sal I作为酶切位点，将PCR产物与酶切后的载体(pGreen II 002962-SK)连接，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpUGT74F2-pGreen II 002962-SK载体利用电击转化法，转入农杆菌GV3101::pSoup中，并挑取阳性克隆保存。
2.侵染桃果实
将含有PpUGT74F2-pGreen II 002962-SK载体的GV3101农杆菌在含卡那霉素(50mg/L)及庆大霉素(25mg/L)的固体培养基上划线，于28℃培养2d后，挑取单克隆菌株并转入含卡那霉素与庆大霉素的LB中，培养至OD600＝0.8～1.0。4℃，5000g，离心10min收集菌体。用等体积渗透液(10mM MES，10mM MgCl2，150mM乙酰丁香酮，0.04％TritonRX-100，pH5.6)重悬，常温放置2h，待用。含空载SK载体的农杆菌作为对照以同样方法准备。
选择大小一致、无损伤的转色期果实，洗净并消毒后，于超净工作台去除表皮，选取中部果肉切成厚度约为1cm，面积为4-8cm2的小块，每个果实选取非缝合线位置的赤道面及其对位的面，切取2片。500ml渗透液经过2h诱导后，倒入提前消毒过的真空渗透装置中，将切片放入渗透液进行抽真空渗透。每个果实切取的2片一半用来渗透含有重组载体PpUGT74F2-SK的菌液，一半用来渗透只含SK空载的菌液。真空压力抽至-70Kpa进行真空渗透，让侵染液能够渗入果肉组织。侵染后的果肉组织用无菌水漂洗3-5次，用无菌滤纸将水吸干，转入新配置的MS固体培养基，在25℃环境培养2d后用液氮迅速冷冻果肉组织并储藏在-80℃冰箱。
3.桃果实PpUGT74F2基因表达及芳香物质检测
桃果实样品用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提供的方法提取总RNA，取1.0μgRNA按(Vazyme)试剂说明书操作合成cDNA。qPCR以桃PpTEF2(SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7)为内参基因，PpUGT74F2引物序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。qPCR反应体系包括10μLHiScriptⅡQ RT SuperMix(+gDNA wiper)，上下游引物(10μM)各0.4μL，2μLcDNA，7.2μLH2O。PCR程序为：95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪。
取研磨后的果实组织10g用于提取结合态芳香物质，酶解后用GC-MS分析结合态水杨酸甲酯含量。方法参照实施例1。实验结果参见图3和图4，图3表示过量表达PpUGT74F2基因的桃果肉中PpUGT74F2的相对表达量(*P<0.05)；图4表示过量表达基因PpUGT74F2的桃果肉结合态水杨酸酸甲酯的含量(*P<0.05)。
(二)实验结果
在桃果实中过量表达PpUGT74F2后，果实中结合态水杨酸甲酯显著增加。因此PpUGT74F2在桃果实中可以将游离态的水杨酸甲酯糖基化为结合态水杨酸甲酯。
实施例4：番茄中过表达PpUGT74F2基因可以增加结合态水杨酸甲酯的含量
(一)实验方法
1.过表达转基因番茄材料的获得
结合引物对SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，以桃果实cDNA为模板，利用PCR技术扩增PpUGT74F2基因的CDs全长SEQ ID NO.1，选择Xba I和Bamh I酶切位点，利用同源重组方法构建于pBI121表达载体，经测序确认后的重组载体通过电击法转化入EHA105农杆菌。挑选阳性单菌落，加入含有卡那霉素(25μg/mL)和利福平(10μg/mL)抗生素的LB液体培养基中，于28℃培养至OD600＝0.5～0.6，离心收集菌体，加入等体积无菌的KCMS培养液重悬菌体。
在无菌条件下生长6d的番茄(Ailsa Craig，AC)子叶，切去叶尖和叶基，放置于KCMS固体培养基暗培养1d。子叶用含目标基因的农杆菌侵染10min，用滤纸吸去多余农杆菌，置于KCMS固体培养基，暗培养2d。转移至含50μg/mL美罗培南和50μg/mL卡那霉素的2Z培养基上，于25℃，16h/8h光暗周期条件下培养。每隔2周转入新的培养基继代，直至外植体发芽完全。将分化出的不定芽切下，转移至生根培养基生根。生根2周后，提取叶片DNA，结合引物对SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11进行阳性植株检测。
2.转基因番茄材料的种植及其结合态水杨酸甲酯的测定
经鉴定过的转基因与野生型番茄种植于浙江大学人工气候室(25℃，16h/8h光周期)。对转色期的果实进行采收并经过液氮速冻后贮藏于80℃待用。每个株系包含3个生物学重复，每个重复包含5个果实。番茄ACTIN(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)作为内参基因，PpUGT74F2的引物序列为ID NO.8和SEQ ID NO.9。qPCR体系及程序参见实施例3，结合态水杨酸甲酯检测方法见实施例1。
实验结果参见图5和图6。图5为转基因番茄果实的PpUGT74F2基因表达量；图6为转基因番茄果实的结合态水杨酸甲酯基因表达量(*P<0.05)。
(二)实验结果
在番茄中过量表达PpUGT74F2后，与野生型相比，果实中结合态水杨酸甲酯至少增加了38％，最多增加了74％。因此PpUGT74F可以在番茄果实中糖基化水杨酸甲酯增加其在果实中的积累。
实施例5：病原菌入侵桃果实抑制了PpUGT74F2的表达，同时诱导了水杨酸甲酯的积累以及抗病基因的表达
(一)实验方法
1.病原菌的培养
所用菌株为果生链核盘菌(M.fructicola)，取自自然生褐腐病的桃果实，经实验室分离、纯化、鉴定后保存备用，本案例所用菌株均保存四代以内。(保藏号为CCTCC M20221349)。
取340mL(1瓶)V8蔬菜汁，加入1.89g碳酸钙、18.9g琼脂粉以及605mL去离子水，随后灭菌，倒板(培养皿为90mm*60mm)，以供后续使用。取菌饼在超净台中放至在V8培养基中央，于25℃、75％相对湿度环境下培养5d。用0.9％的生理盐水重悬浮菌体，孢子浓度为5×105个孢子mL-1。
2.桃果实的接种、取样及基因表达和水杨酸甲酯含量检测分析
选择大小、成熟度一致，无病害症状、无机械损伤的果实进行实验，所用果实材料为‘湖景蜜露’(Prunus persica L.Batsch cv.Hujingmilu)。用0.05％的次氯酸钠侵泡桃果实2min，随后用清水清洗1-2次，晾干备用。使用统一制作的道具在桃果实赤道面戳一个2mm宽的洞，洞口朝上静置30-60min。待洞口处晾干后每个果实加入5μL重悬浮的孢子液，待孢子液完全吸收后，置于20℃的保湿环境贮藏，并在接种1d和3d后进行拍照记录并取样(对病斑周围1cm的果肉进行取样)。实验包含3个生物学重复，每个重复包含5个果实。桃PpTEF2(SEQID NO.6和SEQ ID NO.7)为内参基因，PpUGT74F2引物序列为SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9，PpPR2引物序列为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，PpPR4引物序列为SEQ ID NO.16和SEQID NO.17，PpPR5引物序列为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。qPCR体系及程序参见实施例3，
称取桃果实样品2.5g，加入2mL 200mM EDTA溶液、2mL 20％CaCl2溶液及10μL的内标2-辛醇(0.8mg mL-1)密封后混合均匀。恒温平衡30min后，使用萃取头65μmPDMS/DVB，Stableflex(pink)(SUPELCO)吸附30min。毛细管柱型号为DB-WAX(30m*0.25mm*0.25mm)，较强极性，柱子最高耐受温度为250℃。柱箱升温程序见实施例1。
实验结果参见图7、图8、图9和图10。图7为接种M.fructicola 1d和3d后的桃果实照片；图8为接种M.fructicola 1d和3d后水杨酸甲酯含量(*P<0.05)；图9为接种M.fructicola1d和3d后PpUGT74F2基因表达情况(*P<0.05)；11为接种M.fructicola 1d和3d后PR基因表达情况(*P<0.05，**P<0.01)。
(二)实验结果
在接种1d后，果实还未有明显的感病症状，各方面指标包括水杨酸甲酯含量、PpUGT74F2以及抗病相关的PR基因均没有出现显著变化。在果实接种3d后，可以看见明显的病斑，此时的PpUGT74F2被显著抑制，水杨酸甲酯和病原菌相关的PR基因被显著诱导。因此，在桃果实感病过程中，水杨酸甲酯作为重要的信号分子被诱导，同时伴随着抗病相关的PR基因的激活。为了更多的积累水杨酸甲酯，PpUGT74F2被抑制。
实施例6：水杨酸甲酯处理可以有效阻止桃果实褐腐病的蔓延
(一)实验方法
1.病原菌的培养
同实施例5。
2.桃果实的接种及水杨酸甲酯处理
果实预处理和接种方法参见实施例5。在果实接种后，将果实的洞口朝上，放入密闭容器中。在密闭容器中放入滤纸，并在滤纸上加入终浓度为0.1mM的水杨酸甲酯(0.05％吐温80溶解)，以0mM的水杨酸甲酯作为对照。迅速盖好盖子，置于20℃条件熏蒸12h。熏蒸结束后将将果实放入保湿环境，20℃条件贮藏，于接种后3d和5d进行拍照及菌斑大小统计。
实验结果参见图11和图12。图11为水杨酸甲酯处理接种M.fructicola 3d和5d后的桃果实照片；图12为水杨酸甲酯处理接种M.fructicola 3d和5d后的桃果实菌斑大小统计(**P<0.01)。
(二)实验结果
水杨酸甲酯处理后的桃果实病斑面积显著低于对照组，说明水杨酸甲酯可以有效阻止桃果实的褐腐病发生。
实施例7：过表达转基因番茄植株对Pst DC3000的入侵更敏感
(一)实验方法
1.病原菌的培养
所用菌株为Pst DC3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)。将实验室保存的菌株在King’B固体培养基上划线，挑取单菌落于10mL的King’B液体培养基中，培养至OD600为0.8左右。离心收集菌体，用10mM的氯化镁溶液重悬浮。OD600调节至0.002的菌液，加入0.004％的silwet-77待用。200mL的King’B液体培养基由4g蛋白胨、4mL 50％甘油、0.3g磷酸氢二钾、1M硫酸镁和20μg mL-1利福平组成，PH为7.2。同体积的King’B固体培养基是在液体培养基的基础上加入3g琼脂粉。
2.转基因番茄植株的接种处理
转基因番茄苗在培养4周后，选择大小一致且健康的植株进行侵染实验。将整颗植株置于上述菌液中，进行真空渗透操作。待菌液渗入叶片后，将植株晾干，置于密闭的保湿环境，温度设置为22℃。每个株系包含三个生物学重复，每个重复一棵植株。
3.转基因番茄植株接种后的二甲基联苯胺染色处理
接种3d后收集叶片进行二甲基联苯胺(DAB)染色。收集的叶片浸没在1mg ml-1的二甲基联苯胺溶液中，室温避光染色8h后，在95％的酒精中煮沸至完全脱去叶片的叶绿素，保存在60％的酒精溶液中。拍照记录并比对叶片颜色差异，颜色越深代表植物过氧化氢含量越多，受伤害越大。
4.转基因番茄植株接种后的菌量测定
每个株系采集9片叶子，利用固定工具避开静脉对叶片打孔，孔径约为0.5cm。每个叶片打孔两次，收集圆片并将它们置于1mL 10mM的氯化镁溶液中，磨碎混匀。将混匀的溶液用10mM氯化镁溶液分别稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6后，吸取5μL滴至King’B固体培养基上。待菌液晾干后于28℃培养2d，记录菌落个数。
5.转基因番茄植株接种后的取样及水杨酸甲酯含量测定
植株接种3d后采集叶片用液氮速冻后，置于-80℃保存待用。称取叶片粉末0.5g，加入1.5mL 200mM EDTA溶液、1.5mL 20％CaCl2溶液及10μL的内标2-辛醇(0.8mg mL-1)密封后混合均匀。检测方法见实施例5。
实验结果参见图13、图14、图15。图13为转基因番茄叶片Pst DC3000处理后的二甲基联苯胺染色情况(颜色越深代表过氧化氢含量越高，植株受伤害越大)；图14为转基因番茄叶片Pst DC3000处理后菌量测定结果(*P<0.05，**P<0.01)；图15为转基因番茄叶片PstDC3000处理后水杨酸甲酯含量(**P<0.01)。
(二)实验结果
转基因番茄植株接种Pst DC3000后，在二甲基联苯胺染色后表现为更高的过氧化氢含量，表明植株受到的伤害更大，转基因植株更加感病。同时，转基因植株叶片的菌量显著高于野生型。样品中的水杨酸含量显著降低，与野生型相比至少降低了75％。因此，说明过表达PpUGT74F2后，影响了植株感染微生物过程中的水杨酸甲酯积累，导致转基因番茄植株的抗性减弱。
实施例8：过表达转基因番茄果实对B.cinerea的入侵更敏感
(一)实验方法
1.病原菌的培养
所用菌株为灰霉菌(Botrytis cinerea)，保存于实验室。培养方法见实施例5。孢子悬浮液是由1g的真菌蛋白胨、4g麦芽糖和100mL水组成。孢子最终浓度为1mL悬浮液包含3×105个孢子。
2.番茄果实的接种及菌斑大小测定
番茄果实的接种方法参见实施例5，在番茄果实赤道面进行。接种后果实置于保湿的环境，温度设置为25℃。接种3d后进行拍照记录并记录菌斑直径。实验共分5次进行，每个株系包含至少12个果子。
3.番茄果实的取样及水杨酸甲酯含量测定
番茄果实接种3d后对菌斑周围1cm的果肉进行取样。称取果肉粉末2g，加入2mL200mM EDTA溶液、2mL 20％CaCl2溶液及10μL的内标2-辛醇(0.8mg mL-1)密封后混合均匀。检测方法见实施例5。
实验结果参见图16、图17、图18。图16为接种B.cinerea后的转基因番茄果实照片；图17为接种B.cinerea后的转基因番茄果实菌斑大小统计(**P<0.01)；图18为接种B.cinerea后的转基因番茄果实水杨酸甲酯含量(*P<0.05)。
(二)实验结果
转基因番茄果实在接种B.cinerea后菌斑扩散的面积明显大于野生型，其水杨酸甲酯含量也显著低于野生型。说明过量表达PpUGT74F2后，转基因番茄的水杨酸甲酯积累在感病过程中被影响，导致转基因番茄果实的抗性减弱。
由以上实施例可知，本发明提供了一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯合成的基因PpUGT74F2及其在植物抗病调节上的应用，PpUGT74F2在桃和番茄中过表达可以增加结合态水杨酸甲酯的含量。水杨酸甲酯可以有效抑制桃果实采后褐腐病的发生。当微生物胁迫发生后，在过表达PpUGT74F2的转基因番茄植株和果实中，水杨酸甲酯积累显著下降，导致番茄植株抗病性以及番茄果实采后抗病性减弱。

Claims (3)

1.一个参与桃果实结合态水杨酸甲酯形成的基因，其特征在于，所述基因为糖基转移酶PpUGT74F2，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.20所示。
2.权利要求1所述的基因在调节植物抗病性中的应用，其特征在于，所述应用是将PpUGT74F2作为果实开展基因工程与改良育种的重要候选基因，改善植物抗病能力。
3.权利要求1所述的基因在将水杨酸甲酯糖基化，形成结合态水杨酸甲酯中应用，其特征在于，形成的不具挥发性的结合态水杨酸甲酯能调节水杨酸甲酯含量，从而调节植物抗性。
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