CN116555191B - 编码白细胞介素24和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的新城疫病毒在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了编码人白细胞介素24(IL24)和人粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)的新城疫病毒rClone30‑IL24‑GM‑CSF在肿瘤治疗制剂中的应用。本发明提供的新城疫重组病毒中的IL24如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1自N末端第1‑206位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质；新城疫重组病毒中GM‑CSF为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列3自N末端第1‑144位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质；本发明提供的新城疫重组病毒具有抑制肿瘤细胞、抑制H22荷瘤小鼠肿瘤组织生长等优点，为肿瘤临床治疗提供一种新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及编码白细胞介素24和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的新城疫病毒在肿瘤治疗中的应用
背景技术
自20世纪以来，随着生活水平提高，全球老龄化水平随之增高，加之不健康、不规律的生活习惯，癌症已经成为了继心脑血管疾病之后的第二大人类死因。到2020年，癌症导致近1 000万人死亡，至今仍是主要死亡诱因。世界卫生组织预测，未来20年癌症发病率和死亡率将继续上升。因此，寻找更好的治疗措施成为当前肿瘤治疗的迫切需求，同时提高癌症患者的生存质量和生存期也成为日益紧迫的研究课题。近年来，溶瘤病毒疗法成为了肿瘤临床治疗的新热点。
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属。是一种负义单链RNA溶瘤病毒。基因组约有15 200个核苷酸，共编码六种结构蛋白(3’-NP-P-M-F-HN-L-5’)。NDV的溶瘤机制可分为两种，直接和间接溶瘤作用。直接溶瘤是指病毒在肿瘤细胞中的大量复制，阻断了肿瘤细胞的转录和翻译过程，导致肿瘤细胞代谢异常并融合成合胞体，从而导致肿瘤细胞迅速、大量死亡。例如NDV通过活化肿瘤细胞内部线粒体途径，激活Caspase3和Caspase12而直接导致肿瘤细胞凋亡。间接溶瘤作用指NDV通过感染肿瘤细胞引发许多机体的细胞和体液抗肿瘤免疫反应，并诱导宿主细胞产生细胞因子，间接导致肿瘤细胞死亡。研究发现，NDV活化的免疫细胞(如杀伤性NK细胞)能够抑制肿瘤。NK细胞与溶瘤病毒可以协同抗肿瘤，如在Panc02肿瘤中大量活化的NK细胞抑制了肿瘤细胞的生长。
黑色素瘤分化相关基因(Melanoma differentiation-associated genes-7，MDA-7)是在分化人黑色素瘤细胞的研究中，通过消减法杂交鉴定出来的，如今根据其保守结构、染色体位置和细胞因子样特性命名为白细胞介素24(Interleukin24，IL24)。在低浓度下，IL24主要起细胞因子的作用。IL24通常仅在正常组织中表达，如：胸腺、脾脏和外周血白细胞。据观察，与正常组织相比，癌细胞中几乎不表达IL24，进一步研究表明，IL24在肿瘤抑制中起着关键作用，其主要是通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长；抑制肿瘤血管生成；抑制肿瘤细胞转移几个方面达到抗肿瘤作用。自此，在肿瘤方面对IL24进行的大量工作揭示了其作为抗癌基因的功能的一些线索。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，GM-CSF)是一种能由多种免疫细胞分泌的免疫调节细胞因子，能促进粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞前体细胞的分化，及DC细胞的刺激和募集，在炎症反应级联中有着很重要作用。同时，GM-CSF还能提高T细胞表面IL-2受体的表达，是发挥远距离抗肿瘤作用的最有效的细胞因子之一。
在过去，肿瘤治疗的手段主要包括手术切除、放射线治疗和可抑制或破坏肿瘤细胞DNA合成的化疗药物三种。但前两种手段通常无法彻底根除肿瘤，从而导致病情复发；化疗药物虽然能有效抑制肿瘤生长，但会对人体造成无法修复的伤害。近年来，一种特异性的高效抗肿瘤疗法逐渐成为热点，即肿瘤免疫疗法。其主要包括免疫细胞治疗、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒疗法、肿瘤疫苗以及细胞因子疗法等。目前较为有效的是免疫检查点抑制剂疗法和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法：前者主要治疗黑色素瘤、晚期非小细胞肺癌和胃癌等；后者主要针对造血系统恶性肿瘤，但在实体瘤的治疗上存在局限。近些年，随着手段的发展，溶瘤病毒疗法逐渐进入主流。它是指通过将天然或修饰获得的溶瘤病毒靶向作用肿瘤细胞从而杀伤肿瘤细胞的一种治疗手段。NDV作为在溶瘤病毒疗法中的热点病毒，具有天然的优势。
本发明通过在新城疫病毒基因组不同位点中引入IL24和CM-CSF基因，可以有效提高NDV的的抗肿瘤效果，延长荷瘤小鼠的生存期，同时选择的插入位点不影响NDV的增殖能力，即不会影响后续的工业生产性能。
发明内容
本发明的目的之一：提供编码人白细胞介素24(IL24)和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)(将IL24基因和GM-CSF这种生物佐剂以IL24-IRES-GM-CSF的方式插入到新城疫弱毒株Lasota的P和M基因之间)和rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)(将IL24基因插入到新城疫弱毒株Lasota的NP基因和GM-CSF这种生物佐剂插入到新城疫弱毒株Lasota的P和M基因之间)。
本发明的目的之二：提供了不同位点的重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF在肿瘤临床治疗中的应用。重组病毒在治疗荷瘤小鼠后，可以增强NDV抑制肿瘤组织生长的能力，并且增强了机体的抗肿瘤免疫反应，从而有效延长了荷瘤小鼠的生存期，提高存活率。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF及其基因组核苷酸序列、蛋白质序列和IL24基因、GM-CSF基因插入新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF的方式，以及其产品在肿瘤的临床治疗均为本发明的保护范围。
本发明构建的新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota弱毒株，在其P基因和M基因之间插入IL24-IRES-GM-CSF基因(如图5A)；构建的新城疫重组病毒rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota弱毒株，在其NP基因插入IRES-IL24基因和其P基因和M基因之间插入GM-CSF基因(如图5B)。所述新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF中IL24为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-206位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的重组病毒均在本发明的保护范围内；所述新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF中GM-CSF为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列3自N末端第1-144位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的重组病毒均在本发明的保护范围内；
编码所述新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF的人IL24和GM-CSF基因也属于本发明的保护范围。
所述基因中，编码所述IL24的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列2自5’末端第1-621位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
编码所述GM-CSF的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列4自5’末端第1-435位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％ SDS和1×SSC、0.1％ SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组病毒均属于本发明的保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF的相关制剂为本发明保护的范围。
本发明构建的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF可视为基因工程改造后的弱毒株，其相应制剂，如：冻干粉针制剂、液体生物制剂等，均属本专利保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF及其基因组核苷酸序列和蛋白质序列为本发明的保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF在肿瘤临床治疗方面的应用为本发明保护范围。
所述的新城疫重组病毒rClone30-IL24和rClone30-GM-CSF在治疗其他疾病方面的应用为本发明保护范围。
本发明提供了编码人白细胞介素24基因(IL24)和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的新城疫重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF，连续治疗7天后，rClone30-IL24-GM-CSF、rClone30-IL24和rClone30-GM-CSF组对荷瘤小鼠肿瘤组织的生长抑制能力和刺激产生抗肿瘤免疫细胞的能力高于对照组rClone30组和对照组。表明rClone30-IL24-GM-CSF治疗能提高rClone30的溶瘤能力并同时增强了抗肿瘤免疫反应，提高了荷瘤小鼠的生存率。
附图说明
图1为反向遗传操作系统拯救出的不同位点的rClone30-IL24-GM-CSF病毒血凝(HA)。图2为利用RT-PCR方法鉴定不同位点的rClone30-IL24-GM-CSF外源基因IL24和GM-CSF的表达。图A为rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)的IL24和GM-CSF基因片段；图B为rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)的IL24和GM-CSF基因片段。图3为利用ELISA试剂盒检测不同位点的rClone30-IL24-GM-CSF感染MDA-MB-231、HepG2和A549细胞后的细胞上清中的外源蛋白的表达。rClone30为rClone30感染细胞对照组，Control为空白细胞对照组。图A为IL24蛋白表达水平，图B为GM-CSF蛋白表达水平。
图4为实验SPF荷瘤小鼠分别用空尿囊液、rClone30、rClone30-IL24、rClone30-GM-CSF、rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)和rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)连续治疗7天后各组荷瘤小鼠肿瘤体积变化和瘤重。图A为荷瘤小鼠治疗期间的肿瘤体积变化；图B是治疗结束后荷瘤小鼠的瘤重。
图5为构建的不同位点的重组病毒rClone30-IL24-GM-CSF结构示意图。图A为rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)结构示意图；图B为rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)结构示意图。
具体实施方案
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：不同位点的pBrClone30-IL24-GM-CSF的构建和鉴定
1.1pBrClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)的构建和鉴定
利用overlap PCR将IL24、IRES与GM-CSF基因连接在一起，采用凝胶回收试剂盒回收片段，与T载体连接，构建重组质粒IL24-IRES-GM-CSF-T。利用Sac II和Pme I对IL24-IRES-GM-CSF-T和pBrClone30进行双酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将IL24-IRES-GM-CSF片段与pBrClone30载体相连，构建重组质粒pBrClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)。
1.2pBrClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)的构建和鉴定
利用Sac II和Pme I对pUC18-GM-CSF和pBrClone30进行双酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将GM-CSF片段与pBrClone30载体相连，构建重组质粒pBrClone30-GM-CSF。
PCR IRES-IL24基因和利用Aat II和Apa I对pBrClone30-GM-CSF进行酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将IRES-IL24片段与pBrClone30-GM-CSF载体利用同源重组试剂盒相连，构建重组质粒pBrClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)。
实施例2：不同位点的rClone30-IL24-GM-CSF的拯救、HA检测以及RT-PCR鉴定
2.1rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)的拯救：将重组NDV rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)与三种辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L共转染BHK-21细胞。转染72h后，收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。恒温培养72h后，收获鸡胚尿囊液，离心后进行鸡血红细胞凝集(HA)。取结果呈阳性的尿囊液连续用SPF级鸡胚传代3次后混合。
经HA检测，结果显示，图1：HA效价为256。将成功拯救重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)。
RT-PCR鉴定：以尿囊液提取RNA反转录的cDNA为模板，使用PCR的方法扩增IL24和GM-CSF基因片段。结果如图2A所示，扩增片段大小约为650bp和450bp，与预期相符。证明从cDNA克隆成功拯救出具感染性的NDV病毒为rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)。
2.2rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CFS(P/M)的拯救：将重组NDV rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CFS(P/M)与三种辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L共转染BHK-21细胞。转染72h后，收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。恒温培养72h后，收获鸡胚尿囊液，离心后进行鸡血红细胞凝集(HA)。取结果呈阳性的尿囊液连续用SPF级鸡胚传代3次后混合。
经HA检测，结果显示，图1：HA效价为256。将成功拯救重组病毒rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CFS(P/M)。
RT-PCR鉴定：以尿囊液提取RNA反转录的cDNA为模板，使用PCR的方法扩增IL24和GM-CSF基因片段。结果如图2B所示，扩增片段大小约为650bp和450bp，与预期相符。证明从cDNA克隆成功拯救出具感染性的NDV病毒为rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CFS(P/M)。
实施例3：ELISA试剂盒检测外源基因IL24和GM-CSF的表达量
将0.1MOI rClone30、rClone30-IL24(P/M)、rClone30-GM-CSF(P/M)、rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)和rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)分别感染MDA-MB-231、HepG2和A549细胞，并设置未经病毒感染的肿瘤细胞作为对照，于5％CO2，37℃中培养48h。48h后反复冻融3次，取细胞上清利用ELISA试剂盒检测外源基因IL24和GM-CSF的表达量。
结果如图3所示，ELISA结果表明rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)和rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)能够表达IL24和GM-CSF外源蛋白。
实施例4：不同位点的rClone30-IL24-GM-CSF治疗荷瘤小鼠后肿瘤体积变化及瘤重的测定
将造膜成功的荷瘤小鼠随机分为7组，每组16只。实验组分别瘤内注射150μL(107pfu)的病毒rClone30、rClone30-IL24(P/M)、rClone30-GM-CSF(P/M)、rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)和rClone30-IRES-IL24(NP)-GM-CSF(P/M)，尿囊液对照组注射150μL的鸡胚尿囊液。每天瘤内注射一次，隔一天测量一次肿瘤长径与短径(各重复测三次)，直至第7天治疗结束后隔天再测一次。根据肿瘤体积绘制肿瘤增长曲线，如图4A。并在治疗结束后称取各组荷瘤小鼠瘤重，绘制瘤重图，如图4B。
Claims (5)
1.新城疫重组病毒，为rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)，新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其P基因和M基因之间插入IL24-IRES-GM-CSF基因，利用Sac II和Pme I双酶切pBrClone30载体后插入IL24-IRES-GM-CSF基因构建重组质粒pBrClone30-IL24-IRES-chGM-CSF(P/M)，利用反向遗传操作将其拯救成新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)；
所述新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)中IL24为如下（a）：（a）由序列表中序列1自N末端第1-206位氨基酸残基组成的蛋白质；所述新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)中GM-CSF为如下（b）：（b）由序列表中序列3自N末端第1-144位氨基酸残基组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述新城疫重组病毒的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因中，编码所述新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)中IL24的DNA分子为如下（1）：（1）序列表的序列2自5’末端第1-621位核苷酸所示的DNA分子；
所述基因中，编码所述新城疫重组病毒rClone30-IL24-IRES-GM-CSF(P/M)中GM-CSF的DNA分子为如下（2）：（2）序列表的序列4自5’末端第1-435位核苷酸所示的DNA分子。
4.含有权利要求2-3任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组病毒。
5.权利要求1所述新城疫重组病毒或权利要求2所述新城疫重组病毒的基因在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（Ⅰ）：（Ⅰ）作为肿瘤临床治疗的生物制剂。
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