CN116550006B - 一种色谱用组合液的配方、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，具体为一种用于色谱用组合液的配方、制备方法及应用；本发明公开全氟三乙胺在色谱分离技术中的应用，全氟三乙胺在色谱法中作为流动相和冲洗液的成分使用，一是能够减少离子加和峰信号，二是提升峰型及物质分离度，进一步在流动相和冲洗液中进一步加入苯类化合物，苯类化合物的添加，与全氟三乙胺叠加使用后，能够显著减少离子加和峰信号，从十余种离子加和峰，减少到仅余Na的离子加和峰；同时能够显著提升峰型及物质分离度，便于对色谱峰进行数据分析。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体为一种用于色谱用组合液的配方、制备方法及应用。
背景技术
色谱图中拖尾峰的形成是因为在色谱分离时出现了一种以上的保留机制，并且其中一种保留机制是超负荷造成的。
在核酸分析中大多数情况下会使用反相色谱，以常用的C18柱为例，C18是被键合在载体硅胶表面的，而硅胶是由硅和氧聚合而成的，所以它的表面会出现各种形态的硅羟基。虽然理想的状态是流动相中的样品只和固定相C18发生作用。而实际上一半以上的硅胶表面并没有被键合上C18，所以硅胶表面会裸露出大量的硅羟基（Si-OH）。而单独的自由硅羟基会和流动相中的样品发生作用，形成拖尾。行业内致力于生产出高纯度的硅胶载体，由于新型硅胶在无金属离子环境下制造，所以表面不会残留金属离子也会减少拖尾，另外，硅胶表面尽可能减少自由的硅羟基，未与固定相键合的硅羟基尽可能形成螯合或聚合状态，用来减少拖尾峰的产生。
一方面色谱柱经历过高温、强酸，或者一些极端使用方法导致固定相流失较多后，色谱柱中的自由硅羟基也会变得越来越多，从而更加容易造成拖尾峰。拖尾峰的形成也有可能是因为柱外的死体积较多，导致样品在死体积处发生了滞留和扩散。
另一方面样品中出现了碱性化合物，碱性基团更容易与色谱柱中硅羟基发生作用形成拖尾峰；对于过去的自由硅羟基较多的色谱柱，一般会在流动相中加入三乙胺来抑制拖尾；流动相中加入三乙胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象，三乙胺作为减尾剂或除尾剂而广泛使用。
申请人发现，核酸样品在利用含三乙胺的流动相色谱分离后，部分离子加和峰的峰型还是会有拖尾现象，同时色谱图中离子加和峰较多，会严重干扰主要离子加和峰的数据分析。
发明内容
为了解决现有技术的不足，使得核酸样品在经过色谱分离后，能够减轻峰拖尾的现象；本发明公开了以下方案：
本发明第一个方面公开全氟三乙胺在色谱分离技术中的应用，全氟三乙胺在色谱法中作为流动相和冲洗液的成分使用，一是能够减少离子加和峰信号，二是提升峰型及物质分离度。
本发明第二个方面公开了在上述流动相和冲洗液中进一步加入苯类化合物，所述苯类化合物为苯、甲苯、乙苯或苯酚中的一种或多种的组合。
苯类化合物的添加，与全氟三乙胺叠加使用后，能够显著减少离子加和峰信号，从十余种离子加和峰，减少到仅余Na的离子加和峰；同时能够显著提升峰型及物质分离度，便于对色谱峰进行数据分析。
本发明第三个方面公开了上述流动相的配方；所述流动相的配方包括A相和B相：
所述A相为0.5-1.5%六氟异丙醇、0.05-0.15%全氟三乙胺和0.05-0.15%苯类化合物，其余为水溶液；
所述B相为0.4-0.6%六氟异丙醇、0.04-0.06%全氟三乙胺、0.04-0.06%苯类化合物，其余为乙醇水溶液。
优选地，所述A相为1%六氟异丙醇、0.1%全氟三乙胺和0.1%苯类化合物，其余为水溶液。
全氟三乙胺作为离子对试剂，可以更好的与六氟异丙醇相结合，从而使得核酸样品在色谱柱中产生更好的色谱保留行为；提高方法灵敏度。流动相中进一步加入苯后，有利于全氟三乙胺在水、乙腈、甲醇等溶剂中的溶解性，保证全氟三乙胺均匀分散在溶液中，使得配制的全氟三乙胺溶液在使用时，能够使得核酸样品在色谱柱中产生更好的色谱保留行为；提高方法稳定性。
优选地，所述B相为0.5%六氟异丙醇、0.05%全氟三乙胺、0.05%苯类化合物，其余为乙醇水溶液。
本发明第四个方面公开了制备上述的流动相的方法，流动相成分在塑料PET材料容器中配制，将流动相混匀后超声，装瓶后充氮保存。
优选地，所述超声的条件为：冰水浴超声10-30小时。
本发明第五个方面公开了上述冲洗液的配方，所述冲洗液的配方为20-30%甲醇、20-30%乙腈、20-30%异丙醇、20-30%水、0.05-0.15%全氟三乙胺和0.05-0.15%苯，以及8-12mM的EDTA。
高效液相色谱是一种非常有效的吸附过滤器，样品在多次吸附过程中，需要保证保留时间的稳定，防止保留时间的漂移，相对稳定的保留时间是色谱分析的基础；如果样品被保留在有较强成分的色谱柱上，会导致保留时间前延，流动相缓冲盐因挥发或沉淀导致pH值变化，如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显；因此每次吸附后需要利用大量的水对色谱柱进行冲洗；常规的水溶液在冲洗时，对于吸附性能强的色谱污染物的去除不彻底，色谱污染物的遗留导致下次吸附的保留时间漂移。
为了解决上述问题，本发明利用全氟三乙胺和苯配制了一种高效的冲洗液，可以有效地对色谱柱进行冲洗，高效彻底地去除色谱柱上残留的吸附物；对样品的多次吸附的保留时间的偏差在1%以内
优选地，所述高效冲洗液的配方为25%甲醇、25%乙腈、25%异丙醇、24.8%水、0.1%全氟三乙胺和0.1%苯，以及10mM的EDTA。
优选地，冲洗液全程在塑料PET材料容器配制，将冲洗液配方组分装瓶后充氮保存。
与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：
本发明以上流动相和冲洗液成分以及配比是首创，此前未见有文献报道；本发明利用全氟三乙胺配制的色谱类流动相，在用于核酸的色谱分离时，相较于三乙胺，减少离子加和峰信号，提升峰型及物质分离度；
进一步地，在全氟三乙胺流动相中，进一步添加苯等类似物，二者的复配使用，一是能够显著减少离子加和峰信号，从十余种离子加和峰，减少到仅余Na的离子加和峰；二是显著提升峰型及物质分离度。
附图说明
图1是使用的是常规的六氟异丙醇+三乙胺体系的样品TIC谱图。
图2是使用的是常规的六氟异丙醇+三乙胺体系的样品质谱图。
图3是使用的是六氟异丙醇+全氟三乙胺体系的样品TIC谱图。
图4是使用的是六氟异丙醇+全氟三乙胺体系的样品质谱图。
图5是使用的是六氟异丙醇+全氟三乙胺+苯体系的样品TIC谱图。
图6是使用的是六氟异丙醇+全氟三乙胺+苯体系的样品质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
对比例1（配制三乙胺流动相体系）
本对比例的主要方法流程为：首先进行样品前处理，然后使用本专利中色谱用组合液的冲洗液冲洗LC-MS系统，最后使用本专利中色谱用组合液的流动相对处理好的样品进行LC-MS检测。
一、样本前处理
1.探针退火
a. 按照如下比例进行退火体系配制
| 组分 | 体积 |
| 定制化探针（100 μM） | 5 μL |
| 10x Rnase H reaction buffer | 10 μL |
| RNA | 100 pmol |
| 无核酶水 | 补至100 μL |
b.按如下温度进行退火
| 条件（℃） | 时长（min） |
| 95 | 5 |
| 65 | 2 |
| 55 | 2 |
| 40 | 2 |
| 22 | hold |
2.磁珠结合
a. 预处理磁珠
将海狸2.8 μm SA磁珠平衡至室温，震荡混匀，取100 μL/反应到离心管内，放置在磁力架上，去除储存液。然后用等量的buffer（0.1 M NaOH，0.05 M NaCl）重悬混匀。放置在磁力架上，去除上清液。加入1 mL的0.1 MNaCl溶液，上下颠倒，掌上离心，继续清洗至上清液为中性。
b. 孵育
将重悬的磁珠按照100 μL/反应分到离心管内，放置在磁力架上，去除上清液。之后加入100 μL退火体系，用移液枪吹匀，在混旋仪上1000 rpm 37 ℃孵育30 min.
c.RNase H切割
向孵育的的混合体系内加入RNase H（50unit），用移液枪吹匀，37 ℃孵育3 h。
d.清洗
将孵育的混合体系放置在磁力架上，使用100 μL的wash buffer（5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，60 mM NaCl，pH7.5）洗3次，然后使用无核酶水再次洗3次。
3.解离洗脱
加入50 μL已经预先加热至80 ℃的解离液（1%甲醇/水溶液，100 μΜ EDTA），然后混旋仪上1000 rpm 80 ℃孵育3 min，立刻转移至磁力架上吸附约1 min，快速吸取上清液转移至新的离心管内，离心，吸取上清40 μL至样品瓶中。
二、LC-MS系统冲洗
使用25%甲醇，25%乙腈，25%异丙醇，24.9%水，0.1%三乙胺，10 mM EDTA冲洗LC-MS系统，0.2mL/min流速，冲洗12h。
三、LC-MS分析
流动相A：加入494.5 mL超纯水（塑料量筒），5 mL 六氟异丙醇，0.5mL 三乙胺；流动相B：2.5 mL六氟异丙醇，0.25 mL三乙胺，325mL乙醇（玻璃量筒）+172.25 mL超纯水（塑料量筒）。摇晃混匀后，冰浴超声6 h。
仪器参数
注意事项：（1）前处理使用的枪头、离心管、样品瓶均为低吸附，Rnase free。使用试剂为sigma。（2）系统冲洗，利用冲洗液（25%甲醇，25%乙腈，25%异丙醇，24.9%水，0.1%三乙胺，10 mM EDTA）冲洗LC-MS系统12 h。更换上流动相后，purge，并冲洗系统0.5 h后再接入色谱柱。（3）流动相瓶使用安捷伦专用PET流动相瓶。
样品TIC谱图见图1。可以看到，色谱谱峰分离度低，峰拖尾严重。
样品质谱图见图2。可以看到，谱图中有大量离子加和峰。
实施例1（配制全氟三乙胺流动相体系）
本实施例的主要方法流程为：首先进行样品前处理，然后使用本专利中色谱用组合液的冲洗液冲洗LC-MS系统，最后使用本专利中色谱用组合液的流动相对处理好的样品进行LC-MS检测。
一、样本前处理
1.探针退火
c.按照如下比例进行退火体系配制
| 组分 | 体积 |
| 定制化探针（100 μM） | 5 μL |
| 10x Rnase H reaction buffer | 10 μL |
| RNA | 100 pmol |
| 无核酶水 | 补至100μL |
d.按如下温度进行退火
| 条件（℃） | 时长（min） |
| 95 | 5 |
| 65 | 2 |
| 55 | 2 |
| 40 | 2 |
| 22 | hold |
2.磁珠结合
e.预处理磁珠
将海狸2.8 μm SA磁珠平衡至室温，震荡混匀，取100 μL/反应到离心管内，放置在磁力架上，去除储存液。然后用等量的buffer（0.1 M NaOH，0.05 M NaCl）重悬混匀。放置在磁力架上，去除上清液。加入1 mL的0.1 MNaCl溶液，上下颠倒，掌上离心，继续清洗至上清液为中性。
f. 孵育
将重悬的磁珠按照100 μL/反应分到离心管内，放置在磁力架上，去除上清液。之后加入100 μL退火体系，用移液枪吹匀，在混旋仪上1000 rpm 37 ℃孵育30 min.
g.RNase H切割
向孵育的的混合体系内加入RNase H（50unit），用移液枪吹匀，37 ℃孵育3 h。
h. 清洗
将孵育的混合体系放置在磁力架上，使用100 μL的wash buffer（5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，60 mM NaCl，pH7.5）洗3次，然后使用无核酶水再次洗3次。
3.解离洗脱
加入50 μL已经预先加热至80 ℃的解离液（1%甲醇/水溶液，100 μΜ EDTA），然后混旋仪上1000 rpm 80 ℃孵育3 min，立刻转移至磁力架上吸附约1 min，快速吸取上清液转移至新的离心管内，离心，吸取上清40 μL至样品瓶中。
二、LC-MS系统冲洗
使用25%甲醇，25%乙腈，25%异丙醇，24.9%水，0.1%全氟三乙胺，10 mM EDTA冲洗LC-MS系统，0.2mL/min流速，冲洗12h。
三、LC-MS分析
流动相A：加入494.5 mL超纯水（塑料量筒），5 mL 六氟异丙醇，0.5mL 全氟三乙胺；流动相B：2.5 mL六氟异丙醇，0.25 mL全氟三乙胺，325mL乙醇（玻璃量筒）+172.25 mL超纯水（塑料量筒）。摇晃混匀后，冰浴超声6 h。
仪器参数
注意事项：（1）前处理使用的枪头、离心管、样品瓶均为低吸附，Rnase free。使用试剂为sigma。（2）系统冲洗，利用冲洗液（25%甲醇，25%乙腈，25%异丙醇，24.9%水，0.1%全氟三乙胺，10 mM EDTA）冲洗LC-MS系统12 h。更换上流动相后，purge，并冲洗系统0.5 h后再接入色谱柱。（3）流动相瓶使用安捷伦专用PET流动相瓶。
样品TIC谱图见图3。可以看到，色谱谱峰与图1相比，拖尾有所改善。
样品质谱图见图4。可以看到，谱图中含有少量的Na离子的加和峰。
实施例2（配制全氟三乙胺+苯流动相体系）
本实施例的主要方法流程为：首先进行样品前处理，然后使用本专利中色谱用组合液的冲洗液冲洗LC-MS系统，最后使用本专利中色谱用组合液的流动相对处理好的样品进行LC-MS检测。
一、样本前处理
1.探针退火
e. 按照如下比例进行退火体系配制
| 组分 | 体积 |
| 定制化探针（100 μM） | 5 μL |
| 10x Rnase H reaction buffer | 10 μL |
| RNA | 100 pmol |
| 无核酶水 | 补至100 μL |
f. 按如下温度进行退火
| 条件（℃） | 时长（min） |
| 95 | 5 |
| 65 | 2 |
| 55 | 2 |
| 40 | 2 |
| 22 | hold |
2.磁珠结合
i. 预处理磁珠
将海狸2.8 μm SA磁珠平衡至室温，震荡混匀，取100 μL/反应到离心管内，放置在磁力架上，去除储存液。然后用等量的buffer（0.1 M NaOH，0.05 M NaCl）重悬混匀。放置在磁力架上，去除上清液。加入1 mL的0.1 MNaCl溶液，上下颠倒，掌上离心，继续清洗至上清液为中性。
j. 孵育
将重悬的磁珠按照100 μL/反应分到离心管内，放置在磁力架上，去除上清液。之后加入100 μL退火体系，用移液枪吹匀，在混旋仪上1000 rpm 37 ℃孵育30 min.
k. RNase H切割
向孵育的的混合体系内加入RNase H（50unit），用移液枪吹匀，37 ℃孵育3 h。
l. 清洗
将孵育的混合体系放置在磁力架上，使用100 μL的wash buffer（5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，60 mM NaCl，pH7.5）洗3次，然后使用无核酶水再次洗3次。
3.解离洗脱
加入50 μL已经预先加热至80 ℃的解离液（1%甲醇/水溶液，100 μΜ EDTA），然后混旋仪上1000 rpm 80 ℃孵育3 min，立刻转移至磁力架上吸附约1 min，快速吸取上清液转移至新的离心管内，离心，吸取上清40 μL至样品瓶中。
二、LC-MS系统冲洗
使用25%甲醇，25%乙腈，25%异丙醇，24.8%水，0.1%全氟三乙胺+0.1%苯，10 mMEDTA冲洗LC-MS系统，0.2mL/min流速，冲洗12h。
三、LC-MS分析
流动相A：加入494 mL超纯水（塑料量筒），5 mL 六氟异丙醇，0.5mL 全氟三乙胺，0.5 mL苯；流动相B：2.5 mL六氟异丙醇，0.25 mL全氟三乙胺，0.25 mL苯+325 mL乙醇（玻璃量筒）+172 mL超纯水（塑料量筒）。摇晃混匀后，冰浴超声6 h。
仪器参数
注意事项：（1）前处理使用的枪头、离心管、样品瓶均为低吸附，Rnase free。使用试剂为sigma。（2）系统冲洗，利用冲洗液（25%甲醇，25%乙腈，25%异丙醇，24.8%水，0.1%全氟三乙胺，0.1%苯，10 mM EDTA）冲洗LC-MS系统12 h。更换上流动相后，purge，并冲洗系统0.5h后再接入色谱柱。（3）流动相瓶使用安捷伦专用PET流动相瓶。
样品TIC谱图见图5。可以看到，色谱谱峰峰型良好，不拖尾。
样品质谱图见图6。可以看到，谱图中仅剩余少量的加钠峰。
有上述对比例和实施例的内容可得，在对核酸样品进行色谱分离的过程中，与现有技术利用三乙胺相比，本发明的技术方案的实施例1，利用的全氟三乙胺可以实现更好的色谱保留行为，拖尾现有有所改善，离子加和峰显著减少；实施例2利用全氟三乙胺+苯的流动相体系，更进一步改善色谱峰的峰型拖尾现象，减少到仅余Na的离子加和峰；同时能够显著提升峰型及物质分离度，便于对色谱峰进行数据分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种色谱用流动相，其特征在于，所述流动相包括全氟三乙胺；流动相中还包括苯类化合物，所述苯类化合物为苯、甲苯、乙苯或苯酚中的一种或多种的组合；
所述流动相的配方包括A相和B相：
所述A相为0.5-1.5%六氟异丙醇、0.05-0.15%全氟三乙胺和0.05-0.15%苯类化合物，其余为水溶液；
所述B相为0.4-0.6%六氟异丙醇、0.04-0.06%全氟三乙胺、0.04-0.06%苯类化合物，其余为乙醇水溶液。
2.根据权利要求1所述的流动相在色谱分离技术中的应用，其特征在于，所述A相为1%六氟异丙醇、0.1%全氟三乙胺和0.1%苯类化合物，其余为水溶液。
3.根据权利要求2所述的流动相在色谱分离技术中的应用，其特征在于，所述B相为0.5%六氟异丙醇、0.05%全氟三乙胺、0.05%苯类化合物、65%乙醇、34.4%水溶液。
4.根据权利要求3所述的流动相在色谱分离技术中的应用，其特征在于，流动相的成分在塑料PET材料容器配制，混匀后冰水浴超声，装瓶后充氮保存。
5.根据权利要求4所述的流动相在色谱分离技术中的应用，其特征在于，所述超声的条件为：冰水浴超声10-30小时。
6.一种色谱用冲洗液在色谱分离技术中的应用，其特征在于，所述冲洗液的配方为20-30%甲醇、20-30%乙腈、20-30%异丙醇、20-30%水、0.05-0.15%全氟三乙胺和0.05-0.15%苯，以及8-12mM的EDTA。
7.根据权利要求6所述的冲洗液在色谱分离技术中的应用，其特征在于，所述冲洗液的配方为25%甲醇、25%乙腈、25%异丙醇、24.8%水、0.1%全氟三乙胺和0.1%苯，以及10mM的EDTA。
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