CN116539691A - 一种耐弯折的柔性电化学生物活性物质检测传感器用工作电极 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐弯折的柔性电化学生物活性物质检测传感器用工作电极，包括柔性基底及位于柔性基上的石墨烯电极层，石墨烯电极层上沉积贵金属纳米颗粒层，贵金属纳米颗粒层上覆盖化学交联氧化酶固定层，化学交联氧化酶固定层上覆盖传质限制层；所述氧化酶为葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。本发明检测准确性好，性能稳定，耐弯折性能好。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器生产技术领域，特别涉及一种耐弯折的柔性电化学生物活性物质检测传感器用工作电极。
背景技术
如葡萄糖、乳酸等生物活性物质对于人体最佳健康状态的维持起着重要作用，通过对糖尿病患者血糖含量进行连续监测，可以有效降低相关并发症的发生，提高患者生活质量。
目前医院对糖尿病患者的血糖检测仍主要通过抽取患者静脉血或者指尖血进行测定，而由于糖尿病本身的特点，患者往往需要通过一天多次进行血糖的测定来监控自身血糖的变化。多次刺破手指甚至抽取静脉血给患者带来了较大的痛苦，产生了不必要的精神压力与心理负担，也增加了交叉感染的风险。市面上流行的家用血糖检测设备往往采用以不锈钢针为代表的刚性基底，在生物相容性上有一定的缺陷，炎症与异物反应导致生物组织堆积，降低了传感器的实际性能而且患者本人感受不适，不利于在体长期植入。
以柔性材料为基底的传感器近年来迅速发展，采用的技术包括真空磁镀溅射、光刻、丝网印刷等，但这些技术往往存在或是与基底附着力低容易脱落，或是制备过程复杂繁琐，或是材料浪费等不足之处。最近，LIG(Laser-induced Graphene，激光诱导石墨烯)技术提供了一个新的方向，其通过长波长和相对长脉冲的激光的光热效应，提供了极高的局部温度，这种高温很容易破坏柔性聚合物薄膜上的C-O，C = O和N-C键，这些原子将重新组合并作为气体释放。然后将芳香化合物重新排列以形成石墨结构。通过这种技术产生的具有三维多孔结构的石墨烯，表现出大的比表面积和高的导电性，制备过程无需高温和溶剂。但是该石墨烯电极不耐弯折，容易与柔性基底脱开而导致断路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐弯折的柔性电化学生物活性物质检测传感器用工作电极，检测准确性好，性能稳定，耐弯折性能好。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种耐弯折的柔性电化学生物活性物质检测传感器用工作电极，包括柔性基底及位于柔性基上的石墨烯电极层，石墨烯电极层上沉积贵金属纳米颗粒层，贵金属纳米颗粒层上覆盖化学交联氧化酶固定层，化学交联氧化酶固定层上覆盖传质限制层；所述氧化酶为葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。本发明用于检测葡萄糖或乳酸。
作为优选，所述柔性基底为PI膜或是PEI膜。
作为优选，所述石墨烯电极层是在柔性基底通过激光雕刻加工而成，激光雕刻的激光雕刻机参数设置为：雕刻模式，强度3-9W，速度为100-500mm/s。
作为优选，对石墨烯电极层乙酸处理后再沉积贵金属纳米颗粒层，乙酸处理具体为：先用去离子水清洗石墨烯电极层，然后浸没在体积浓度1-2%的乙酸溶液中，室温下静置1-4小时。乙酸处理能提高C-C健的含量，增加电极的电性能。
作为优选，所述贵金属纳米颗粒层是将石墨烯电极层在贵金属镀液中，采用恒电位法沉积形成，恒电位法电压为-1.5～-2.5V，通电时间为100-300s。
作为优选，所述贵金属镀液按质量百分比计组成为：氯铂酸3%，乙酸铅0.25%，盐酸溶液余量；盐酸溶液浓度为0.5mol/L。
作为优选，所述化学交联氧化酶固定层的加工方法为：将氧化酶的壳聚糖溶液滴涂在贵金属纳米颗粒层上，待干燥固化成膜后，在京尼平溶液中浸泡0.5-4小时。
作为优选，所述氧化酶的壳聚糖溶液由氧化酶和壳聚糖溶液混合而成，其中氧化酶的浓度为1-50g/L；所述壳聚糖溶液由壳聚糖和体积浓度0.5%-10%的冰醋酸水溶液混合而成，其中壳聚糖浓度为10-50g/L。氧化酶的浓度优选10-20g/L。壳聚糖浓度优选10-20g/L。
作为优选，所述京尼平溶液由京尼平和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合而成，其中京尼平的浓度为10-100g/L，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度0.1M，pH为4-5。京尼平的浓度优选10-30g/L。
作为优选，所述传质限制层是将化学交联氧化酶固定层在碳纳米管的Nafion分散液中，采用恒电位法沉积形成，恒电位法电压为1V，通电时间为90s，碳纳米管的Nafion分散液是质量分数7.5%的碳纳米管水分散液和质量分数为5%的Nafion溶液以1：4-4：1的体积比混合而成。
本发明的有益效果是：
（1）使用激光诱导石墨烯技术，操作方便步骤简单，一步法直接制备石墨烯电极，以较低的成本实现微型电极图案的批量制造；
（2）制备的柔性石墨烯电极既具有电子转移速率高、比表面积大的特点，而且柔性基底在植入时可有效降低患者痛苦；
（3）贵金属纳米颗粒在石墨烯电极上的沉积，在增大电极比表面积的同时，既能提高电极导电能力，同时对葡萄糖的氧化分解起到很好的催化作用，提高传感器性能；
（4）通过化学交联法将酶固定在电极上，有效降低酶的脱落现象，使传感器性能稳定，寿命延长；同时采用滴涂法，极大程度地减少了酶的浪费；
（5）利用京尼平和壳聚糖共同交联形成水凝胶层，一方面作为生物成分对酶进行固定，相对于传统的戊二醛等成分，大大降低了生物毒性，为植入式传感器的长期稳定性提供了良好的基础；另一方面水凝胶层对石墨烯与基底起到了良好的固定作用，解决了激光诱导石墨烯固有的易脱落的问题；
（6）利用Nafion和碳纳米管构成传质限制层，一方面降低了葡萄糖的扩散，变相提高了电极区域氧气的占比，扩宽了传感器的检测范围；另一方面屏蔽了其他干扰物质对葡萄糖氧化的干扰，保证了传感器响应的准确性。
附图说明
图1是本发明实施例1工作电极形成的传感器的i-t图像；
图2是本发明实施例2工作电极形成的传感器的i-t图像；
图3是本发明验证例1工作电极形成的传感器的i-t图像；
图4是不同处理的电极弯折次数与电极阻值的关系图；
图5是图4的前60次弯折的局部放大图；
图6是本发明实施例2工作电极形成的传感器的实物图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：柔性基上的石墨烯电极加工
（1）加工材料准备
取厚度为0.125mm的聚酰亚胺薄膜，分别使用无水乙醇和去离子水对高分子薄膜表面进行清洗。将聚酰亚胺薄膜裁剪成5cm*5cm的尺寸，尽可能地平铺开，并用绝缘胶带固定在激光雕刻机的基板上，以避免激光烧蚀过程中，因为形变导致薄膜表面不平整，烧蚀不均匀对电极整体性能产生影响。
（2）电极加工
将绘制好的电极图案导入到激光雕刻机中，先将激光雕刻机设置为雕刻模式，功率6w，速度为300mm/s，波长450±5nm，通过激光烧蚀在聚酰亚胺薄膜表面形成一层石墨烯。再将激光雕刻机改为切割模式，将电流强度调整为15%，速度为100mm/s，将已经形成的石墨烯电极区域从聚酰亚胺薄膜沿着外边缘切割下来，得到复合在柔性基上的石墨烯电极。
实施例2：柔性电化学葡萄糖检测传感器用工作电极
制备方法包括以下步骤：
（1）配置1%的乙酸溶液，使用移液枪移取10uL的冰醋酸，滴加到990uL的去离子水中。使用试管震荡器震荡30s，使溶液充分混合，形成体积分数为1%的乙酸溶液。
（2）将实施例1加工的石墨烯电极用去离子水冲洗三次并干燥后，将电极浸入1%乙酸溶液液面以下，使石墨烯电极被乙酸溶液充分浸润，室温下静置2h后用去离子水冲洗三次并干燥。
（3）配置镀铂液（贵金属镀液）：称取适量的氯铂酸和乙酸铅，溶于0.5mol/L的盐酸中，形成镀铂液，其中氯铂酸的质量分数为3%，乙酸铅的质量分数为0.25%。
（4）将步骤（2）处理后的LIG（石墨烯）电极与辰华660A电化学工作站相连，使用铂网电极作为参比电极和对电极，将LIG电极置于步骤（3）中配置的镀铂液中，使得电极浸入液面以下的深度约为10mm。使用-2.0V的电压，在LIG电极上沉积纳米铂颗粒，沉积时间为300s。
（5）将镀完铂的LIG电极用去离子水冲洗后，浸入0.01mol/L的PBS溶液中静置30分钟。本步骤仅是为了测试时候使用，可以有效减少电极在测试时的跑平时间，降低基线电流。
（6）配置壳聚糖溶液：取适量壳聚糖溶于体积分数为1%的冰醋酸溶液，并使得壳聚糖溶液的浓度为10g/L，将磁力搅拌子加入装有壳聚糖溶液的离心管中，并将壳聚糖溶液置于国华HJ-2磁力搅拌器上进行搅拌，使得壳聚糖充分溶解无悬浊。
（7）配置壳聚糖-葡萄糖氧化酶混合溶液。取适量葡萄糖氧化酶溶于步骤（6）配置的壳聚糖溶液中，使得葡萄糖氧化酶在溶液中的浓度为10g/L。
（8）配置京尼平溶液：取浓度0.1M，pH为4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再取适量京尼平溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使得京尼平的浓度为10g/L。
（9）将步骤（7）中配置的呈凝胶状的壳聚糖-葡萄糖氧化酶混合溶液滴涂在步骤（5）处理后的石墨烯电极上，并置于烘箱中以50℃中干燥半小时，在电极表面形成固体膜后，再浸入步骤（8）配置的京尼平溶液2小时。
（10）配置碳纳米管的Nafion分散液：将质量分数7.5%的CNT的水分散液和质量分数为5%的Nafion溶液以1：4的体积比混合而成。将电极与辰华660A电化学工作站相连，使用铂网电极作为参比电极和对电极，并使得电极浸入碳纳米管的Nafion分散液中，使用恒电位法，设定工作电压为1.0V，工作时间90s，在电极上电泳吸附一层传质限制层，形成柔性电化学葡萄糖检测传感器用工作电极。
（11）将步骤（10）得到的工作电极连接至电化学工作站，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂网电极为对电极（图6），使用电化学工作站中的计时安培法。设定初始电位为0.55V，向0.01mol/L的PBS溶液中每隔300s滴加400mol/L的葡萄糖，.得到i-t图像如图1所示，可以看到，制备的传感器对葡萄糖有很好的线性响应，在浓度范围0-20mmol/L中具有3.922 uA/mmol的灵敏度（R2=0.99）。
实施例3：柔性电化学乳酸检测传感器用工作电极
制备方法包括以下步骤：
（1）配置1%的冰醋酸溶液，使用移液枪移取10uL的冰醋酸，滴加到990uL的去离子水中。使用试管震荡器震荡30s，使溶液充分混合，形成体积浓度为1%的冰醋酸溶液。
（2）将实施例1加工的石墨烯电极用去离子水冲洗三次并干燥后，将电极浸入步骤1中配置的1%冰醋酸溶液液面以下，使LIG电极被冰醋酸溶液充分浸润。静置2h后用去离子水冲洗三次并干燥。
（3）配置镀铂液（贵金属镀液）：称取适量的氯铂酸和乙酸铅，溶于0.5mol/L的盐酸中，形成镀铂液，其中氯铂酸的质量分数为3%，乙酸铅的质量分数为0.25%。
（4）将步骤（2）处理后的LIG（石墨烯）电极与辰华660A电化学工作站相连，使用铂网电极作为参比电极和对电极，将LIG电极置于步骤（3）中配置的镀铂液中，使得电极浸入液面以下的深度约为10mm。使用-2.0V的电压，在LIG电极上沉积纳米铂颗粒，沉积时间为300s。
（5）将镀完铂的LIG电极用去离子水冲洗后，将其镀铂部分浸入0.01mol/L的PBS溶液中并静置30分钟。本步骤仅是为了测试时候使用，可以有效减少电极在测试时的跑平时间，降低基线电流。
（6）配置壳聚糖溶液：取适量壳聚糖溶于体积分数为1%的冰醋酸溶液，并使得壳聚糖溶液的浓度为10g/L，将磁力搅拌子加入装有壳聚糖溶液的离心管中，并将壳聚糖溶液置于国华HJ-2磁力搅拌器上进行搅拌，使得壳聚糖充分溶解无悬浊。
（7）配置壳聚糖-乳酸氧化酶混合溶液：取适量乳酸氧化酶溶于步骤（6）中配置的壳聚糖溶液中，使得乳酸氧化酶在溶液中的浓度为10g/L。
（8）配置京尼平溶液：取浓度0.1M，pH为4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再取适量京尼平溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使得京尼平的浓度为10g/L。
（9）将步骤（7）中配置的呈凝胶状的壳聚糖-乳酸氧化酶混合溶液滴涂在步骤（5）处理后的石墨烯电极上，并置于烘箱中以50℃中干燥半小时，在电极表面形成固体膜后，再浸入步骤（8）配置的京尼平溶液2小时。
（10）配置碳纳米管的Nafion分散液：将质量分数7.5%的CNT的水分散液和质量分数为5%的Nafion溶液以1：4的体积比混合而成。将电极与辰华660A电化学工作站相连，使用铂网电极作为参比电极和对电极，并使得电极浸入碳纳米管的Nafion分散液中，使用恒电位法，设定工作电压为1.0V，工作时间90s，在电极上电泳吸附一层传质限制层，形成柔性电化学乳酸检测传感器用工作电极。
（11）将步骤（10）中得到的乳酸传感器用工作电极连接至电化学工作站，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂网电极为对电极，使用电化学工作站中的计时安培法。设定初始电位为0.55V，向0.01mol/L的PBS溶液中每隔300s滴加40mol/L的乳酸.得到i-t图像如图2所示，可以看到，制备的传感器对乳酸有很好的线性响应，在在浓度范围0-1.2mmol/L中具有2.431 uA/mmol的灵敏度（R2=0.98）。
验证例1：过氧化氢传感器
制备方法包括以下步骤：
（1）配置1%的冰醋酸溶液，使用移液枪移取10uL的冰醋酸，滴加到990uL的去离子水中。使用试管震荡器震荡30s，使溶液充分混合，形成体积浓度为1%的冰醋酸溶液。
（2）将实施例1加工的石墨烯电极用去离子水冲洗三次并干燥后，将电极浸入步骤1中配置的1%冰醋酸溶液液面以下，使LIG电极被冰醋酸溶液充分浸润。静置2h后用去离子水冲洗三次并干燥。
（3）配置镀铂液（贵金属镀液）：称取适量的氯铂酸和乙酸铅，溶于0.5mol/L的盐酸中，形成镀铂液，其中氯铂酸的质量分数为3%，乙酸铅的质量分数为0.25%。
（4）将步骤（2）处理后的LIG（石墨烯）电极与辰华660A电化学工作站相连，使用铂网电极作为参比电极和对电极，将LIG电极置于步骤（3）中配置的镀铂液中，使得电极浸入液面以下的深度约为10mm。使用-2.0V的电压，在LIG电极上沉积纳米铂颗粒，沉积时间为300s。
（5）将镀完铂的LIG电极用去离子水冲洗后，将其镀铂部分浸入0.01mol/L的PBS溶液中并静置30分钟，取出后干燥即可得到过氧化氢传感器用工作电极。
（6）将步骤（5）中得到的过氧化氢传感器用工作电极连接至电化学工作站，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂网电极为对电极，使用电化学工作站中的计时安培法。设定初始电位为0.55V，向0.01mol/L的PBS溶液中每隔300s滴加400mol/L的过氧化氢.得到i-t图像如图3所示，可以看到，制备的传感器对过氧化氢有很好的线性响应，在浓度范围0-8mmol/L中具有3.492 mA/mmol的灵敏度（R2=0.99）,在浓度范围8-20 mmol/L中具有1.673 mA/mmol的灵敏度（R2=0.97）。本验证例表明本发明上述工作电极的方案是可行的。
比较例
本例提供壳聚糖交联后的LIG电极脱落显著改善对照：
取4个实施例1加工的石墨烯电极，用去离子水冲洗三次并干燥后，将电极浸入1%冰醋酸溶液液面以下，使LIG电极被冰醋酸溶液充分浸润，静置2h后用去离子水冲洗三次并干燥。分别记为1，2，3，4号。
1号电极不进行任何操作，2/3/4号电极使用实施例2 中的方法进行镀铂。其中4号电极在镀完铂后采用实施例2中的方法，使用壳聚糖-京尼平进行交联。3号电极按照实施例2中的方法，是将壳聚糖+京尼平交联换成5wt%戊二醛溶液作为替代进行交联。
上述操作完成后，对4个电极使用万用表测量电极两端的阻值，可以看到4个电阻阻值相差不大，在400~600Ω之间。
分别将四个电阻固定住一端，并将电阻向外弯折90°左右，每弯折五次进行一次电阻测量并记录，直至电极某处断裂脱落使得阻值大到无法测量。
将得到的数据作图可以看到（图4-5），壳聚糖交联的电极显著地改善了LIG电极固有的易脱落性，未经过任何处理的LIG电极在弯折20次以后就出现了大规模的脱落使得电极发生断路。其他经过处理的电极性能稍有改善，在50次弯折后才发生断路现象。而经过壳聚糖交联的电极在经历了150次以上的弯折时，电阻虽然增大了很多，但仍然保持通路状态，没有彻底断裂。且在140次弯折以前电阻增大的幅度相对来说不是很大。在50次弯折以内，同样次数的弯折，经过壳聚糖交联的电极阻值仍然明显小于经过戊二醛交联的电极。因此，可以说明使用壳聚糖交联显著地改善了LIG电极的易脱落性。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (10)
1.一种耐弯折的柔性电化学生物活性物质检测传感器用工作电极，其特征在于，包括柔性基底及位于柔性基上的石墨烯电极层，石墨烯电极层上沉积贵金属纳米颗粒层，贵金属纳米颗粒层上覆盖化学交联氧化酶固定层，化学交联氧化酶固定层上覆盖传质限制层；所述氧化酶为葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
2.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述柔性基底为PI膜或是PEI膜。
3.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述石墨烯电极层是在柔性基底通过激光雕刻加工而成，激光雕刻的激光雕刻机参数设置为：雕刻模式，强度3-9W，速度为100-500mm/s。
4.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，对石墨烯电极层乙酸处理后再沉积贵金属纳米颗粒层，乙酸处理具体为：先用去离子水清洗石墨烯电极层，然后浸没在体积浓度1-2%的乙酸溶液中，室温下静置1-4小时。
5.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述贵金属纳米颗粒层是将石墨烯电极层在贵金属镀液中，采用恒电位法沉积形成，恒电位法电压为-1.5～-2.5V，通电时间为100-300s。
6.根据权利要求5所述的工作电极，其特征在于，所述贵金属镀液按质量百分比计组成为：氯铂酸3%，乙酸铅0.25%，盐酸溶液余量；盐酸溶液浓度为0.5mol/L。
7.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述化学交联氧化酶固定层的加工方法为：将氧化酶的壳聚糖溶液滴涂在贵金属纳米颗粒层上，待干燥固化成膜后，在京尼平溶液中浸泡0.5-4小时。
8.根据权利要求7所述的工作电极，其特征在于，所述氧化酶的壳聚糖溶液由氧化酶和壳聚糖溶液混合而成，其中氧化酶的浓度为1-50g/L；所述壳聚糖溶液由壳聚糖和体积浓度0.5%-10%的冰醋酸水溶液混合而成，其中壳聚糖浓度为10-50g/L。
9.根据权利要求7所述的工作电极，其特征在于，所述京尼平溶液由京尼平和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合而成，其中京尼平的浓度为10-100g/L，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度0.1M，pH为4-5。
10.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述传质限制层是将化学交联氧化酶固定层在碳纳米管的Nafion分散液中，采用恒电位法沉积形成，恒电位法电压为1V，通电时间为90s，碳纳米管的Nafion分散液是质量分数7.5%的碳纳米管水分散液和质量分数为5%的Nafion溶液以1：4-4：1的体积比混合而成。
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