CN116536256A - 牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及应用。制备方法：取牙髓间充质干细胞，经超速离心后，去除上清液，即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。本发明还提出根据上述方法制得的牙髓间充质干细胞外泌体；该牙髓间充质干细胞外泌体在制备治疗过敏性鼻炎产品中的应用；以及一种用于治疗过敏性鼻炎的药物。本发明的制备方法能高效制备牙髓间充质干细胞外泌体，制得的外泌体可有效治疗过敏性鼻炎。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及应用。
背景技术
变应性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是一种由特异性IgE介导的Ⅰ型变态反应，主要以阵发性喷嚏、清水涕、鼻塞、鼻痒等鼻过敏症状为特征，严重影响人类的生活质量。据统计，在世界范围内变应性鼻炎总发病率已达25％，部分地区高达40％，世界卫生组织(WTO)将其列为“21世纪重点研究和防治的三大疾病之一”。目前推荐的AR疗法包括：尽量避免接触过敏原、药物治疗和特异性免疫治疗，但后两种治疗方法均有明显的缺陷，不能满足广大患者的需求。其中，药物治疗主要是采用糖皮质激素、抗组胺类药、减充血剂、抗胆碱药和肥大细胞膜稳定剂等药物进行治疗。抗组胺类药对鼻痒、喷嚏、流清涕有较好效果，但对鼻塞效果不明显；减充血剂能有效地缓解鼻粘膜充血，但对其它症状无效；抗胆碱药对缓解流清涕效果好，但对鼻塞、喷嚏症状无效，还有导致鼻腔干涩和出血的副作用；肥大细胞膜稳定剂具有较好的预防过敏性鼻炎的效果，对于已经产生的过敏介质不具有拮抗作用，对过敏性鼻炎的急性发作疗效不佳；糖皮质激素可从多个环节阻断鼻黏膜的过敏性炎症反应，能有效预防和治疗过敏性鼻炎的症状，为目前治疗过敏性鼻炎最有效的一线药物，但其起效缓慢，在用药数日或数周后起效，具有局部刺激的副作用，且糖皮质激素长期局部应用的副作用和远期疗效仍需循证医学的评价。特异性免疫治疗过程繁琐，治疗周期长(往往需3年左右)，见效慢，费用高，且治疗的安全性仍存在不确定性。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是具有自我更新能力的多潜能祖细胞。MSC来源广泛，能够分化为人体内所有主要的细胞，其中骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞都属于间充质干细胞，是目前最为广泛的干细胞。大量研究证实MSC对多种疾病具有治疗作用，其中包括变应性鼻炎、结膜炎、哮喘等。但是直接移植具有致瘤、栓塞、异常分化、免疫调节不可控等风险，对其应用造成限制。
因此，基于间充质干细胞进一步寻找治疗过敏性鼻炎的方法具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，能够高效地制备牙髓间充质干细胞外泌体。
本发明还提出根据所述制备方法制得的牙髓间充质干细胞外泌体。
本发明还提出所述牙髓间充质干细胞外泌体在制备治疗过敏性鼻炎产品中的应用。
本发明还提出一种用于治疗过敏性鼻炎的药物。
根据本发明的一个方面，提出了牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：取牙髓间充质干细胞，经超速离心后，去除上清液，即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明制备牙髓间充质干细胞来源的外泌体，牙髓间充质干细胞属于成体干细胞，来源广泛(可来源于儿童脱落乳牙、阻生牙、成人智齿、正畸需拔除的牙齿等)，提取方便，所述涉及的伦理问题更少。本发明采用超速离心法制备牙髓间充质干细胞外泌体，方法简便，超速离心法可以高效地分离外泌体，由于外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，通过高转速的离心可以将其他细胞器及杂蛋白分离出去，只留下外泌体，使用该方法分离的外泌体纯度较高，对治疗多种疾病的效果显著。
具体地，牙髓间充质干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一类具有良好增殖、分化能力和免疫调节性能的牙源性间充质干细胞。外泌体是细胞分泌的微小囊泡，通过携带母体细胞特征性生物信息分子(如脂质、蛋白质、DNA、mRNA、miRNA等)，作为细胞间运输载体将这些生物信息分子传递给其他细胞，是细胞间通信的重要介质，并参与维持组织内稳态。牙髓间充质干细胞外泌体(DPSC-exosomes)不仅能够作为仿生物载体运载前体药物进入肿瘤细胞发挥治疗作用，还拥有类似于间充质干细胞的诸多功能，如促进受损组织再生、调节机体免疫功能等。
在本发明的一些实施方式中，所述牙髓间充质干细胞的获取方法包括以下步骤：提取牙齿中的牙髓，清洗后将所述牙髓剪碎形成组织块，对所述组织块进行消化，得牙髓悬液；离心所述牙髓悬液，重悬离心后的细胞沉淀，培养得所述牙髓间充质干细胞。
具体地，所述牙齿选自脱落乳牙、智齿、多生牙、无治疗价值的牙周炎患牙、正畸需拔除的牙齿中的至少一种。
具体地，使用含青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液进行所述清洗。
具体地，所述组织块的体积为0.1～1.0mm3。
具体地，对所述组织块进行消化使用的消化液为含Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的培养基。
具体地，所述离心的转速为1000～1200r/min，时间为5～8min。
更具体地，所述离心的转速为1000r/min，时间为5min。
具体地，经所述离心后，去除上清液，留下所述细胞沉淀。
具体地，重悬离心后的所述细胞沉淀，培养4～8代得所述牙髓间充质干细胞。
在本发明的一些实施方式中，在得到所述牙髓间充质干细胞后，先将所述牙髓间充质干细胞于4～6℃，300～500g条件下离心10～12min，去除未贴壁细胞，收集第一上清液；再将所述第一上清液于4～6℃，1400～1700g条件下离心30～35min，去除死细胞和杂质，收集第二上清液。
在本发明的一些优选的实施方式中，先将所述牙髓间充质干细胞于4℃，300g条件下离心10min，去除未贴壁细胞，收集第一上清液；再将所述第一上清液于4℃，1500g条件下30min，去除死细胞和杂质，收集第二上清液。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括将所述第二上清液于4～6℃，10000～11000g条件下超速离心55～65min，去除细胞碎片，收集第三上清液；再将所述第三上清液于4～6℃，100000～110000g条件下超速离心60～70min，去除上清液，将沉淀重悬即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述制备方法还包括将所述第二上清液于4℃，10000g条件下超速离心60min，去除细胞碎片，收集第三上清液；再将所述第三上清液于4℃，100000g条件下离心60min，去除上清液，将沉淀重悬即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。
在本发明的一些实施方式中，在制备好所述牙髓间充质干细胞外泌体后，还需对其进行鉴定，鉴定方法包括：透射电子显微镜观察所述牙髓间充质干细胞外泌体的形态，纳米粒子跟踪分析技术检测所述牙髓间充质干细胞外泌体的粒径，蛋白质印迹分析检测所述牙髓间充质干细胞外泌体标志性蛋白的表达。
在本发明的一些实施方式中，在所述透射电子显微镜下观察到所述牙髓间充质干细胞外泌体为微囊小体结构，圆形或椭圆形。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米粒子跟踪分析技术检测发现所述牙髓间充质干细胞外泌体的粒径为30～250nm，平均粒径为138nm。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白质印迹分析检测发现CD9和CD81是所述牙髓间充质干细胞外泌体的表面标志物。
根据本发明的第二个方面，提出了根据所述制备方法制得的牙髓间充质干细胞外泌体。
根据本发明的第三个方面，提出了所述牙髓间充质干细胞外泌体在制备治疗过敏性鼻炎产品中的应用。
根据本发明的第四个方面，提出了一种用于治疗过敏性鼻炎的药物，包括所述牙髓间充质干细胞外泌体。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括喷剂、注射剂、溶液剂、洗剂、气雾剂、粉雾剂中的任一种。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中牙髓间充质干细胞的光学显微成像图；标尺为100μm；
图2为本发明实施例1中流式细胞仪检测结果图；
图3为本发明实施例1中茜素红S染色结果图；标尺为100μm；
图4为本发明实施例1中油红O染色结果图；标尺为100μm；
图5为本发明实施例2中牙髓间充质干细胞外泌体的透射电镜成像图；
图6为本发明实施例2中牙髓间充质干细胞外泌体的粒径分析结果图；
图7为本发明实施例2中的Western blotting检测结果图；
图8为本发明实施例3中AR小鼠模型的构建以及注射PBS或DPSC-EX的流程图；其中，i.p.-腹腔内注射；n.d.-鼻腔滴注；i.v.-静脉注射；
图9为本发明实施例3中小鼠AR临床表现和鼻粘膜组织病理学检测结果图；A为AR临床表现；B为鼻粘膜组织病理学检测结果图，标尺为200μm；C为B中方框圈出部分的放大图，标尺为100μm；Control代表正常对照组，PBS代表注射PBS组，DPSC-EX代表注射牙髓间充质干细胞外泌体组；
图10为本发明实施例3中血清IgE抗体表达水平的检测结果图；
图11为本发明实施例3中血清Th2细胞因子IL-4表达水平的检测结果图；
图12为本发明实施例3中血清INF-γ表达水平的检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，培养、离心等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例对人牙髓间充质干细胞进行培养并鉴定，具体过程为：
取正畸需要拔除的牙(通过深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院医学伦理委员会审批)，消毒、劈牙，取牙髓，去除根尖1/3牙髓；用含双抗(青霉素-链霉素)的磷酸盐缓冲液浸洗2次，剪碎成体积为0.1～1.0mm3的组织块，加入10mL含3mg/mL的Ⅰ型胶原酶、4mg/mL中性蛋白酶和20％胎牛血清的α-MEM培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中消化1h，形成牙髓悬液；消化结束后收集牙髓悬液于1.5mL离心管中，置于离心机中以1000r/min的转速于室温下离心5min，去除上清液。用5mL新鲜的含10％胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至直径为10cm的培养皿中，置于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中，培养48h后首次换液，7～10d后细胞融合至100％，进行传代，此时记为P1代，以后每3天更换一次培养液，每次传代时计数，计算细胞倍增代数，同时于倒置显微镜下观察细胞的形态与生长情况，发现细胞以集落方式迅速增殖，呈梭形或多角形贴壁生长。培养到P4代时，即得用于制备外泌体的牙髓间充质干细胞。
对培养得到的牙髓间充质干细胞进行鉴定：
1.倒置显微镜下观察细胞生长状况：将上述培养到P4代的细胞置于倒置显微镜下观察，结果如图1所示。图1显示，细胞增殖明显，高度融合，呈漩涡状或辐射状排列。
2.流式细胞术检测牙髓间充质干细胞表面的标志物：采用胰酶消化原代培养的牙髓间充质干细胞，以1000r/min的转速于室温下离心5min，去除上清液，用PBS漂洗细胞沉淀1次，离心。离心后吸弃PBS，加400μL的2％牛血清白蛋白(BSA)，快速混匀，4℃封闭30min，加入流式抗体(CD73、CD90、CD45)，稀释比例为1：200；4℃避光孵育1h，室温下离心3min(转速为1500r/min)，去除上清液，用PBS洗涤3次后，用400μL的PBS重悬，于流式细胞仪中检测，结果如图2所示。图2显示，牙髓间充质干细胞表面标记物的表达分别为CD73(94.6％)，CD90(99.9％)，CD45(1.12％)，表明所培养的细胞全部为CD73+CD90+CD45+牙髓间充质干细胞，符合间充质干细胞特性，培养成功。
3.鉴定骨髓间充质干细胞的多向分化能力(成骨和成脂诱导)：取培养到P3代的细胞，加入成骨诱导培养基(α-MEM完全培养基，含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素，并补充有10mM的β-甘油磷酸酯，100nM地塞米松和50μg/mL的L-抗坏血酸)进行诱导成骨。诱导3周后，将细胞在4％多聚甲醛中固定30min，用2％茜素红S染色液在室温下对固定细胞染色20min，于光学显微镜下观察染色结果，如图3所示。图3中可观察到红色，表明有钙结节形成，即成骨诱导成功；
取培养到P3代的细胞，加入成脂诱导培养基(α-MEM完全培养基，含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素，并补充有100μM吲哚美辛，500μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，1mM地塞米松和50μg/mL的L-抗坏血酸)进行成脂诱导。诱导3周后，将细胞在4℃下用4％多聚甲醛固定10min，然后用0.2％油红O染色液在室温下对固定细胞染色20min，于光学显微镜下观察染色结果，如图4所示。图4中，细胞的胞浆中的部分油滴被染成红色，表明诱导成功，即有部分细胞分化为脂肪细胞。
以上结果表明，上述培养得到的牙髓间充质干细胞有分化成骨和脂肪细胞的潜能。
实施例2
本实施例制备了牙髓间充质干细胞外泌体并对其进行鉴定，具体过程为：
将实施例1培养得到的P4代牙髓间充质干细胞无血清培养过夜，收集培养液，于4℃，300g条件下离心10min，以去除未贴壁细胞，收集第一上清液；再将第一上清液于4℃，1500g条件下离心30min，以去除死细胞和杂质，收集第二上清液。将第二上清液置于超速离心机中，于4℃，10000g条件下超速离心60min，以去除细胞碎片，收集第三上清液；再将第三上清液于4℃，100000g条件下超速离心60min，去除上清液，此时外泌体位于离心管底部，肉眼不可见。用PBS重悬沉淀，调整浓度为100μg/mL，即得牙髓间充质干细胞外泌体。
鉴定牙髓间充质干细胞外泌体：
1.透射电子显微镜观察外泌体的形态：将制备好的牙髓间充质干细胞外泌体置于透射电子显微镜下观察，结果如图5所示。图5显示，牙髓间充质干细胞外泌体为微囊小体结构，圆形或椭圆形，直径在80～150nm，大小均一，符合文献报道的外泌体的形态特点。
2.纳米粒子跟踪分析(NTA)技术检测外泌体的粒径和浓度：将制备好的牙髓间充质干细胞外泌体加在纳米粒度分析仪的特定样品槽内，放入检测器进行检测，检测结果如图6所示。图6显示，牙髓间充质干细胞外泌体的粒径分布范围为30～250nm，平均粒径为138nm，原始浓度为2.9×109个/mL。
3.Western blotting检测外泌体表面标志物的表达：提取制备好的牙髓间充质干细胞外泌体的总蛋白，进行Western blotting检测(其中加入抗CD9和CD81的第一抗体进行孵育)，结果如图7所示。图7显示，与对照组(空白培养基)相比，牙髓间充质干细胞外泌体中明显有CD9和CD81的表达。
实施例3
本实施例进行了牙髓间充质干细胞外泌体(DPSC-EX)对过敏性鼻炎模型小鼠的疗效评价：
为评估DPSC-EX对过敏性鼻炎(AR)的治疗干预效果，以卵白蛋白(OVA)为特异性抗原建立了AR小鼠模型(初始致敏时加100μg的OVA和2mg氢氧化铝)。从OVA致敏第21天到第35天中，第21天、28天、35天向小鼠尾静脉注射PBS或DPSC-EX(具体流程见图8)。第36天观察小鼠出现的AR临床反应，并处死小鼠检测小鼠鼻粘膜组织的变化，以及血清中特异性IgE抗体和Th2细胞因子的变化。小鼠出现的AR临床反应和鼻粘膜组织检测结果如图9所示，A代表AR临床表现，可看出，注射PBS组小鼠出现了AR临床反应，包括抓伤、打喷嚏、流鼻涕和鼻周围皮肤病变，特征为脱发、发红；而注射DPSC-EX组小鼠的鼻过敏临床反应(抓伤、打喷嚏、流鼻涕和鼻周围皮肤病变，特征为脱发、发红等)减少。B和C代表小鼠鼻粘膜组织的病理学检测结果，C为B中方框圈出部分的放大图，可以看出，注射PBS组小鼠的鼻粘膜增厚，小血管扩张，炎症细胞浸润；而注射DPSC-EX组小鼠表现出较少的腺体增生、血管扩张，炎症细胞浸润减少，鼻粘膜厚度降低，与正常对照组小鼠的鼻粘膜组织相当。
另外，采用ELISA检测了正常对照组小鼠、注射PBS组小鼠和注射DPSC-EX组小鼠血清中OVA特异性IgE抗体、Th2细胞因子IL-4和干扰素γ(IFN-γ)的水平，结果如图10、11、12显示。可以看出，与注射PBS组小鼠相比，注射DPSC-EX组小鼠不仅能降低血清中OVA特异性IgE抗体的表达，还能降低血清中Th2细胞因子IL-4的分泌，且能升高血清中IFN-γ的分泌。综上，经牙髓间充质干细胞治疗后小鼠表现出的鼻部症状明显减轻，特异性IgE抗体减少，炎症因子分泌减少，IFN-γ增加。表明牙髓间充质干细胞能有效抑制过敏性鼻炎的发作。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取牙髓间充质干细胞，经超速离心后，去除上清液，即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括先将所述牙髓间充质干细胞于4～6℃，300～500g条件下离心10～12min，去除未贴壁细胞，收集第一上清液；再将所述第一上清液于4～6℃，1400～1700g条件下离心30～35min，去除死细胞和杂质，收集第二上清液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述第二上清液于4～6℃，10000～11000g条件下超速离心55～65min，去除细胞碎片，收集第三上清液；再将所述第三上清液于4～6℃，100000～110000g条件下超速离心60～70min，去除上清液，将沉淀重悬即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞的获取方法包括以下步骤：提取牙齿中的牙髓，清洗后将所述牙髓剪碎形成组织块，对所述组织块进行消化，得牙髓悬液；离心所述牙髓悬液，重悬离心后的细胞沉淀，培养得所述牙髓间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牙齿选自脱落乳牙、智齿、多生牙、无治疗价值的牙周炎患牙、正畸需拔除的牙齿中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，重悬离心后的所述细胞沉淀，培养4～8代得所述牙髓间充质干细胞。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的牙髓间充质干细胞外泌体。
8.权利要求7所述牙髓间充质干细胞外泌体在制备治疗过敏性鼻炎产品中的应用。
9.一种用于治疗过敏性鼻炎的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求7所述牙髓间充质干细胞外泌体。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括喷剂、注射剂、溶液剂、洗剂、气雾剂、粉雾剂中的任一种。
Priority Applications (1)
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2023
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