CN116531394A - 黄芩苷在制备对免疫检查点抑制剂治疗不适用的肿瘤的药物组合物中的应用 - Google Patents
黄芩苷在制备对免疫检查点抑制剂治疗不适用的肿瘤的药物组合物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了黄芩苷在制备对免疫检查点抑制剂治疗不适用的肿瘤的药物组合物中的应用，所述免疫检查点抑制剂包含PD‑1抑制剂、PD‑L1抑制剂、CTLA‑4抑制剂中的一种或两种及以上的混合物，“对免疫检查点抑制剂不适用”具体表现为因药效不佳诊疗指南中不推荐使用，所述肿瘤为MSS型（微卫星稳定型）结直肠癌亚型。所述药物组合物可以通过增加CD8+T细胞浸润，促进其分泌细胞因子，有效改善MSS型结直肠癌亚型的“肿瘤免疫抑制微环境”，可用于治疗该类型肿瘤。该药物组合物抗肿瘤增敏作用显著，一改常规认为免疫检查点抑制剂不能用于治疗MSS型结直肠癌亚型的现状，且未发现明显的不良反应，安全性好，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别是针对免疫检查点抑制剂不适用的肿瘤的药物制备中提出的药物组合物应用，具体为黄芩苷在制备对免疫检查点抑制剂治疗不适用的肿瘤的药物组合物中的应用。
背景技术
免疫检查点抑制剂是近年来新兴的癌症治疗手段，其疗效较好且副作用少，已成为治疗和改善多种恶性肿瘤预后的最有希望的方法之一。而对于结直肠癌，并不是所有患者都能从中获益。根据中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南，在2021年帕博利珠单抗已被批准用于微卫星不稳定（MSI-H）型结直肠癌的一线治疗，而对于微卫星稳定（MSS）型，因药效不佳，免疫检查点抑制剂不被推荐用于各线治疗。
然而在临床真实世界中，MSS型占整体结直肠癌患者的85%以上（Cancers(Basel), 2020, 12(4): 889.），这类患者仍然在使用传统的化疗药物进行治疗，而化疗药会产生明显的副作用，影响患者生活质量。因此，亟待探索出MSS型结直肠癌患者也能使用免疫检查点抑制剂治疗的方法。
MSS型结直肠癌临床预后较差的原因是其是典型的“冷肿瘤”，即CD8+T细胞浸润极少（Front Oncol, 2023, 13: 1112276.），而免疫检查点抑制剂发挥作用正是通过阻断CD8+T细胞的激活抑制信号。因此，若能在使用免疫检查点抑制剂激活肿瘤微环境中已有CD8+T细胞的同时，进一步增加其数量和功能，将有助于提高治疗功效。
黄芩苷是一种具有生物活性的黄酮类化合物，具有免疫调节的作用。在专利（CN114870009 A）中公开了黄芩苷联合免疫检查点抑制剂治疗肺癌、黑色素瘤、肾癌或乳腺癌的药物组合物，能够增加CD8+T细胞的数量。但是关于黄芩苷在逆转CD8+T细胞及其分泌细胞因子浸润少导致的免疫抑制微环境，提高免疫检查点抑制剂对MSS型结直肠癌的药效方面的作用未见相关报道。
本申请的技术方案是针对免疫检查点抑制剂不适用的MSS型结直肠癌展开研究，提出一种黄芩苷和免疫检查点抑制剂的药物组合物，通过逆转“肿瘤免疫抑制微环境”改善免疫检查点抑制剂对MSS型结直肠癌的疗效。该药物组合物能够一改常规认为免疫检查点抑制剂不能用于治疗MSS型结直肠癌亚型的现状，让免疫检查点抑制剂有更加广阔的适应症范围。
发明内容
本发明针对MSS型结直肠癌的免疫抑制微环境提出制备黄芩苷和免疫检查点抑制剂的药物组合物，该药物组合物可通过逆转“肿瘤免疫抑制微环境”而有效改善免疫检查点抑制剂对该类型肿瘤的药效，一改常规认为免疫检查点抑制剂不能用于治疗MSS型结直肠癌亚型的现状。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了黄芩苷在制备抗肿瘤的药物组合物中的应用，所述药物组合物的活性成分包含黄芩苷和免疫检查点抑制剂。在一个具体的实施方式中，所述药物组合物的活性成分由黄芩苷和免疫检查点抑制剂组成。
优选的，所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂中的一种或两种及以上的组合。
优选的，所述肿瘤为对免疫检查点抑制剂不适用的肿瘤，具体表现为因免疫检查点抑制剂对所述肿瘤药效不佳而在其诊疗指南中不推荐使用。
优选的，所述肿瘤为肠癌。在一些实施方式中，所述肿瘤是直肠癌；在一些实施方式中，所述肿瘤是结直肠癌；在一个具体实施方式中，所述结直肠癌是MSS型结直肠癌。
为了方便药物的制备，可以将药学上可接受的辅料作为添加剂用于该药物中，并将药物制作为固体制剂或液体制剂的剂型。
进一步的，所述应用所制备的药物组合物是单位剂量药物组合物，其中含有质量百分含量为0.05%-99.0%的黄芩苷。
本发明的另一方面，提供了上述应用所制备的药物组合物。
进一步的，所述的药物组合物（药包、药盒、组合药物）中的黄芩苷与免疫检查点抑制剂既可以混合在一起形成单一的给药单元，也可分别独立成为给药单元，两种活性成分一起、同时、连续、分别使用。在一些实施方式中，所述黄芩苷的给药时间通常选择在免疫检查点抑制剂之前给药或与所述免疫检查点抑制剂同时给药。在一些具体实施方式中，所述黄芩苷的给药量为1 mg/天~1000 mg/天，免疫检查点抑制剂的给药量为0.1~1 mg/3天。
可选的，所述药物组合物中的黄芩苷质量百分含量为0.05%-99.0%。
可选的，所述药物组合物中的黄芩苷与免疫检查点抑制剂的组分配比为94%：6%。
为了方便药物的制备，可以将药学上可接受的辅料作为添加剂用于该药物中，并将药物制作为固体制剂或液体制剂的剂型。
优选的，所述药物组合物的给药剂量为每天给药1 mg/天至1000 mg/天。
优选的，所述药物组合物采用口服或胃肠道给药方式给药。
本发明还提供了黄芩苷在抗肿瘤治疗方面的应用。所述应用包括将黄芩苷以及免疫检查点抑制剂同时或各自独立地分别施用于患者。
优选的，所述肿瘤为对免疫检查点抑制剂不适用的肿瘤，具体表现为因药效不佳诊疗指南中不推荐使用。
进一步优选的，所述肿瘤为肠癌；在一些实施方式中，所述肿瘤为直肠癌；在一些具体实施方式中，所述肿瘤为结直肠癌；在一个具体实施方式中，所述结直肠癌是MSS型结直肠癌。
优选的，所述应用是将黄芩苷与免疫检查点抑制剂联合使用。黄芩苷与免疫检查点抑制剂既可以混合在一起形成单一的给药单元，也可分别独立成为给药单元，两种活性成分一起、同时、连续、分别使用。在一些实施方式中，所述黄芩苷与免疫检查点抑制剂分别给药或同时给药。
在一些具体实施方式中，所述黄芩苷与免疫检查点抑制剂分别给药；在一些具体实施方式中，黄芩苷在免疫检查点抑制剂之前给药。在一些具体实施方式中，黄芩苷的给药频次为每天一次或每两天一次，免疫检查点的给药频次为每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次。在一个具体实施方式中，黄芩苷的给药频次为每天一次，免疫检查点的给药频次为每三天一次。
本发明所述的黄芩苷和免疫检查点抑制剂的药物组合物通过增加CD8+T细胞浸润，促进其分泌细胞因子，改善MSS型结直肠癌的免疫抑制微环境，发挥抗肿瘤增敏作用。本申请所述的药物组合物能够逆转低CD8+T细胞浸润导致的免疫抑制微环境提高免疫检查点抑制剂对荷瘤小鼠的疗效，一改常规认为免疫检查点抑制剂不能用于治疗MSS型结直肠癌亚型的现状，且未发现明显的不良反应，安全性好，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是MSI-H荷瘤小鼠经粪菌移植MSS模型和MSI-H模型后以αPD-1治疗后的肿瘤体积；
图2是MSI-H荷瘤小鼠经粪菌移植MSS模型后以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤体积；
图3是MSS荷瘤小鼠以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤体积；
图4是MSI-H荷瘤小鼠经粪菌移植MSS模型和粪菌移植MSI-H模型后的肿瘤内的CD8+T细胞的数量；
图5是MSI-H荷瘤小鼠经粪菌移植MSS模型和粪菌移植MSI-H模型后的肿瘤内的CD8+T细胞分泌的IFN-γ的数量；
图6是MSI-H荷瘤小鼠经粪菌移植MSS模型和粪菌移植MSI-H模型后的肿瘤内的CD8+T细胞分泌的TNF-α的数量；
图7是MSI-H荷瘤小鼠经MSS-FMT后以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤内的CD8+T细胞的数量；
图8是MSI-H荷瘤小鼠经MSS-FMT后以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤内的CD8+T细胞分泌的IFN-γ的数量；
图9是MSI-H荷瘤小鼠经MSS-FMT后以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤内的CD8+T细胞分泌的TNF-α的数量；
图10是MSS荷瘤小鼠以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤内的CD8+T细胞的数量；
图11是MSS荷瘤小鼠以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤内的CD8+T细胞分泌的IFN-γ的数量；
图12是MSS荷瘤小鼠以αPD-1、BA、BA+αPD-1治疗后的肿瘤内的CD8+T细胞分泌的TNF-α的数量。
具体实施方式
为了重现临床免疫检查点抑制剂对MSS型结直肠癌的药效，申请人构建了肠道人源化MSS型结肠癌小鼠模型，同时以肠道人源化MSI-H结肠癌小鼠作为对照。两种小鼠均给予免疫检查点抑制剂进行治疗，研究小鼠的体积变化。结果显示，免疫检查点抑制剂能对MSI-H型结直肠癌产生明显药效，而无法有效治疗MSS型结直肠癌。
在本申请中，BA、αPD-1分别表示黄芩苷、PD-1抑制剂；R-FMT组和NR-FMT组分别表示粪菌移植MSS模型组和粪菌移植MSI-H模型组；R-和NR-分别代表粪菌移植MSS模型和粪菌移植MSI-H模型接受治疗组。
为了更清楚阐述本申请的黄芩苷的应用效果和作用，除以上模型外，申请人另以MSS型结肠癌细胞构建了MSS型荷瘤小鼠，以上述2种模型为研究对象，均分别给予免疫检查点抑制剂、BA、BA与免疫检查点抑制剂联合治疗（同时给予BA和免疫检查点抑制剂；或先给予BA，再给予免疫检查点抑制剂），研究小鼠肿瘤的体积变化。在2种造模方法的模型中结果均显示，免疫检查点抑制剂单独治疗组的肿瘤体积均与control组无明显差异；BA与免疫检查点抑制剂联合治疗组的小鼠肿瘤体积与control组和免疫检查点抑制剂单独治疗组相比均明显降低，且有显著性差异；BA单独治疗组的小鼠体积与control组无明显差异。以上结果表明BA联合免疫检查点抑制剂能明显改善免疫检查点抑制剂对MSS型结直肠癌的药效，且BA单独治疗组无效。
采用本申请的方案，申请人还研究了上述2种荷瘤小鼠模型肿瘤组织中的CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和TNF-α的数量，结果经MSI-H-FMT的荷瘤小鼠control组较MSS-FMT的荷瘤小鼠control组的肿瘤中CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和TNF-α数量增多，说明免疫检查点抑制剂对MSS型肿瘤的药效不佳可能与肿瘤内免疫抑制微环境有关。另外，BA单独治疗后，CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和 TNF-α数量有增多趋势但无显著性差异，而BA联合免疫检查点抑制剂治疗后CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和 TNF-α数量都出现显著性增多。以上结果说明单独BA治疗虽能促进CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和TNF-α的释放，但效果不明显；而BA联合免疫检查点抑制剂治疗能够明显逆转MSS型肿瘤的免疫抑制微环境，从而改善免疫检查点抑制剂对MSS型结直肠癌的药效。
上述研究中，BA单独治疗组和联合治疗组未出现明显的不良反应。
为验证上述结果的准确性，下面对具体实验过程中的结果和数据进行介绍和分析。为了清楚、明确将实验测试中所使用的药物和试剂予以介绍，表1给出了不同试剂的名称、货号及生产制作方信息。
表1：本申请实施例选用的主要材料及来源
实施例1：实验溶液的制备
广谱抗生素（ABX）的制备：称取硫酸新霉素、甲硝唑、氨苄西林，万古霉素适量，加生理盐水得40 mg/mL的硫酸新霉素、甲硝唑、氨苄西林和20 mg/mL的万古霉素。混匀，分装至15 mL离心管，置于-20℃存储备用。
临床患者粪便悬液的制备：取提前冷冻的临床MSS型结肠癌患者和MSI-H型结肠癌粪便样品重新悬浮在无菌氯化钠溶液（0.9%）中，稀释比例均为1 g粪便稀释成10 mL体积并将粪便搅匀至无明显大颗粒。用200目无菌网滤筛过滤以除去粪便中的大颗粒，所得滤液收集在无菌离心管中。通过涡旋5分钟得到重悬液。600×g 离心5分钟去除不溶物。立即将离心所得粪便悬液在洁净工作台内进行分装，-20℃冻存备用。
灌胃用BA溶液的制备：称取BA适量，用生理盐水配成20 mg/mL混悬液，-20℃存储备用。
αPD-1溶液的制备：吸取αPD-1适量，用生理盐水配成2.5 mg/mL混悬液，现配现用。
实施例 2：MSS-FMT 荷瘤小鼠和MSS 荷瘤小鼠的建立
36只雌性SPF级C57BL/6J小鼠，以及24只雌性SPF级Balb/C小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司，于北京郎克生物科技有限公司动物实验中心SPF环境中饲养，动物日常护理及实验条件参照《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》。
C57BL/6J小鼠适应性饲养一周后，每天灌胃100 μL ABX，连续灌胃3天。ABX停用2天后，将冻存好的临床MSS型结肠癌患者和MSI-H型结肠癌粪便悬液取出（1 g/10 mL），37℃水浴加热，ABX处理的小鼠进行灌胃，每只100 μL，连续灌胃7天。
将大约2×107 cells/mL MC38细胞（MSI-H型）分别接种于粪菌移植后的C57BL/6J小鼠右侧腋下, 接种量为0.05 mL/小鼠；将大约2×107 cells/mL CT26.WT细胞（MSS型）分别接种于Balb/C小鼠右侧腋下，接种量为0.05 mL/小鼠。游标卡尺测量肿瘤的最长径及最短径，体积=1/2长径×短径2。
R-FMT为粪菌移植MSI-H模型后MC38荷瘤小鼠，NR-FMT为粪菌移植MSS模型后MC38荷瘤小鼠。
实施例3：BA对MSS型结肠癌荷瘤小鼠的治疗作用
小鼠肿瘤长到50-100 mm3后，将R-FMT组小鼠分为R-Control组和R-αPD-1组，NR-FMT组分为NR-Control组和NR-αPD-1组，NR-BA组和NR-BA+αPD-1组，每组6只小鼠。将使用CT26.WT细胞造模的MSS型荷瘤小鼠分为Control组、αPD-1组、BA组和BA+αPD-1组。给药方式及给药量如下：
R-Control、NR-Control和Control组：每天分别生理盐水灌胃至实验结束（200 μL/d），每3天腹腔注射一次生理盐水（100 μL/次），共注射5次。
R-αPD-1、NR-αPD-1和αPD-1组：每天分别生理盐水灌胃至实验结束（200 μL/d），每3天腹腔注射一次αPD-1（100 μL/次），共注射5次。
NR-BA和BA组：每天进行BA灌胃至实验结束（200 μL/d），每3天腹腔注射一次生理盐水（100 μL/次），共注射5次。
NR-BA+αPD-1和BA+αPD-1组：每天进行BA灌胃至实验结束（200 μL/d），每3天腹腔注射一次αPD-1（100 μL/次），共注射5次。
给药期间每3天监测小鼠体重，测量瘤体积。
结果如图1，NR-FMT和R-FMT组分别经αPD-1治疗后，R-αPD-1组与R-Control组的小鼠肿瘤体积相比明显缩小，而NR-αPD-1组与NR-Control组的小鼠肿瘤体积相比无明显差异，且R-αPD-1组与NR-αPD-1组的小鼠肿瘤体积相比也明显缩小，说明免疫检查点抑制剂对粪菌移植MSI-H模型后的荷瘤小鼠产生药效，而粪菌移植MSS模型后的荷瘤小鼠药效不佳。
结果如图2-3，BA单独治疗的NR-BA组和BA组，没有降低小鼠肿瘤体积，但联合αPD-1的NR-BA+αPD-1和BA+αPD-1组，瘤体积均明显减小，说明BA能够改善免疫检查点抑制剂对MSS型结直肠癌的药效不佳。
实施例4：流式细胞术检测肿瘤组织中CD8+ T细胞及其分泌的IFN-γ和TNF-α
收集各组小鼠的新鲜肿瘤组织剪碎，加入5 mL组织消化液,37℃消化30 min，经200目滤网过滤至5 mL离心管中，500 g离心5 min弃上清。细胞沉淀用3 mL小鼠淋巴细胞分离液充分重悬，在细胞悬液上层缓慢加入2 mL PBS（保证界面清晰），500 g离心30 min，升速快降速慢。离心结束后吸取中间淋巴细胞层至洁净离心管中，加入3 mL PBS涡旋混匀，500 g离心5 min，弃上清。0.5 mL RPMI 1640培养基重悬细胞并计数，取细胞1×106个，用1640完全培养基调整体积至500 μL，PMA（50 ng/mL）、Ionomycin(1 ug/mL)、Monensin(2 μM)，37℃ , 5% CO2孵育5 h。孵育结束后，收集细胞离心弃上清，样本管加入抗体CD8、CD25各2 μL，室温避光孵育15 min。加入0.5 mL细胞固定液，室温避光固定30 min，加入2 mL 1×细胞破膜液，500 g离心5 min弃上清。再次加入2 mL 1×细胞破膜液，500 g离心5 min弃上清。加入IFN-γ、TNF-α抗体各2 μL，室温避光孵育30 min。加入2 mL细胞破膜液，离心弃上清。用0.4 mL cell staining buffer重悬细胞，上机检测。
结果如图4-12所示，NR-Control组小鼠肿瘤中CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和TNF-α数量明显低于R-Control组，说明免疫检查点抑制剂对MSS型结肠癌荷瘤小鼠的药效不佳可能是由于免疫抑制微环境所导致。BA单独治疗的NR-BA组和BA组的CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和TNF-α数量虽然有增多趋势，但无明显差异，而但联合αPD-1的NR-BA+αPD-1和BA+αPD-1组，CD8+T细胞及其分泌的IFN-γ和TNF-α数量明显增多，说明BA改善免疫检查点抑制剂对MSS型结直肠癌的药效不佳是通过逆转免疫抑制微环境实现的。
本发明中的具体实施例仅是对本发明的解释，其并不对本发明限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.黄芩苷在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述应用所制备的药物组合物包含黄芩苷和免疫检查点抑制剂，所述肿瘤是肠癌。
2.如权利要求1所述的黄芩苷在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为MSS型结直肠癌亚型。
3.如权利要求1所述的黄芩苷在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述应用所制备的药物组合物是单位剂量药物组合物，其中含有质量百分含量为0.05%-99.0%的黄芩苷。
4.如权利要求1所述的黄芩苷在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂中的一种或两种及以上的组合。
5.如权利要求1所述的黄芩苷在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述应用所制备的药物组合物中还包括药学上可接受的辅料。
6.如权利要求1所述的黄芩苷在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述应用所制备的药物组合物为固体或液体制剂。
7.如权利要求1所述的黄芩苷在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，所述应用所制备的药物组合物为口服制剂或胃肠道给药制剂。
8.根据权利要求1-7任一项所述应用所制备的药物组合物。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，其中黄芩苷和免疫检查点抑制剂是两个独立的给药单元，黄芩苷与免疫检查点抑制剂分别给药或同时给药。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述黄芩苷的给药量为1 mg/天~1000 mg/天，免疫检查点抑制剂的给药量为0.1~1 mg/3天。
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