CN116529358A - 细胞外囊泡的产生用培养基、培养基试剂盒、添加剂及细胞外囊泡的产生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种促进细胞外囊泡的产生的细胞外囊泡的产生用培养基、培养基试剂盒、添加剂及细胞外囊泡的产生方法。本发明提供一种细胞外囊泡的产生用培养基，其含有动物细胞培养用基础培养基、及选自L‑谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，含有L‑谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L‑谷氨酰胺或其盐的浓度为5mM以上。并且，本发明还提供一种培养基试剂盒、添加剂及细胞外囊泡的产生方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞外囊泡的产生用培养基、培养基试剂盒、添加剂、细胞外囊泡的产生方法。
背景技术
来源于细胞的由脂质双重膜构成的小型膜囊泡即细胞外囊泡(Extracellularvesicle)被认为担负着经由内包的mRNA或microRNA等核酸、或者蛋白质的搬运的细胞间信息传递(非专利文献1)。并且，以使用了细胞外囊泡的疾病的诊断或质量等为目的，进行培养并获得细胞外囊泡。
作为由间充质干细胞产生(分泌)的细胞外囊泡的获得方法，已知有从培养了间充质干细胞的细胞培养上清液通过超离心分离法等获得的方法。
通常，细胞培养时使用以向细胞供给营养成分为目的添加了来源于胎牛的血清(FBS)的培养基(细胞培养液)。然而，由于FBS含有大量来源于胎牛的细胞外囊泡，因此在细胞外囊泡的纯化中不希望使用包含FBS的培养基。
因此，作为无血清培养基，非专利文献2中，使用作为基础培养基的D-MEM(包含4mM的L-谷氨酰胺)，非专利文献3中，使用在作为基础培养基的D-MEM(包含4mM的L-谷氨酰胺)中包含0.01μg/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的培养基。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Mathieu M,Martin-Jaular L,Lavieu G,Thery C(2019)Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellularvesicl es for cell-to-cell communication.Nat Cell Biol,21(1):9-17
非专利文献2：Basalova et al.,(2020)Secretome of Mesenchymal Stroma lCells Prevents Myofibroblasts Differentiation by Transferring Fibrosis-Associat ed microRNAs within Extracellular Vesicles.Cells:9(5):1272.
非专利文献3：Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles asMediators of Anti-Inflammatory Effects:Endorsement of Macrophage Polarization
发明内容
发明要解决的技术课题
然而，本发明人等使用作为所述基础培养基的D-MEM、或者在作为基础培养基的D-MEM中添加了bFGF的培养基而产生细胞外囊泡时，发现所产生的细胞外囊泡极少，不足以在产业中利用。
鉴于上述情况，本发明的课题在于提供一种促进细胞外囊泡的产生的细胞外囊泡的产生用培养基、试剂盒、添加剂及细胞外囊泡的产生方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题，对细胞外囊泡的产生用培养基的成分进行了深入研究的结果发现，通过使用细胞外囊泡的产生用培养基，促进细胞外囊泡的产生，以致完成了本发明，该细胞外囊泡的产生用培养基含有选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mM以上。
即，本发明是细胞外囊泡的产生用培养基，其基本方式为如下：
(1)一种细胞外囊泡的产生用培养基，其含有动物细胞培养用基础培养基、及选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，
含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mM以上；
(2)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述L-谷氨酰胺或其盐；
(3)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转铁蛋白；
(4)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述亚硒酸或其盐；
(5)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转铁蛋白及所述亚硒酸或其盐；
(6)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述胰岛素；
(7)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述胰岛素样生长因子；
(8)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述血清素化合物；
(9)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转化生长因子β；
(10)根据选自(1)至(9)中任一项所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其不包含血清；
(11)根据选自(1)至(10)中任一项所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有选自所述L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少两种成分；
(12)根据选自(1)至(10)中任一项所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有选自所述L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少三种成分。
本发明是细胞外囊泡的产生用培养基试剂盒，具体而言为如下。
(13)一种细胞外囊泡的产生用培养基试剂盒，
其包括动物细胞培养用基础培养基、及含有选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分的细胞外囊泡的产生用添加剂，
所述细胞外囊泡的产生用添加剂含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的所述细胞外囊泡的产生用添加剂包含细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mM以上的量的L-谷氨酰胺或其盐。
本发明也是细胞外囊泡的产生用添加剂，具体而言为如下。
(14)一种细胞外囊泡的产生用添加剂，其用于制造培养基，其中，
所述培养基是选自(1)至(12)中任一项所述的培养基，
含有选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，
包含含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mM以上的量的L-谷氨酰胺或其盐。
本发明也是细胞外囊泡的产生方法，具体而言为如下。
(15)一种细胞外囊泡的产生方法，其包括使用选自(1)至(12)中任一项所述的培养基，并从间充质干细胞产生细胞外囊泡的步骤。
发明效果
根据本发明的细胞外囊泡的产生用培养基、试剂盒及细胞外囊泡的产生方法，促进细胞外囊泡的产生。
附图说明
图1是通过纳米跟踪分析法对使用各种培养基而产生的细胞外囊泡的粒子数进行分析的结果。
图2是表示使用于定量PCR的引物的图。
图3是以Collagen III(III型胶原)的mRNA表达量为指标，对使用各种培养基并从间充质干细胞产生的细胞外囊泡的活性进行评价的结果的图。
图4是以Collagen III的mRNA表达量为指标，对使用各种培养基并从间充质干细胞产生的细胞外囊泡的活性进行评价的结果的图。
具体实施方式
在本说明书中，表示范围的上限和下限时，除非另有记载，A～B表示A以上且B以下。
本发明所涉及的细胞外囊泡是指来源于细胞的由脂质双重膜构成的小型膜囊泡。该细胞外囊泡通常可以举出具有20nm～1000nm的直径的细胞外囊泡，优选为50nm～800nm的细胞外囊泡，更优选为50nm～500nm的细胞外囊泡，尤其优选为50nm～200nm的细胞外囊泡。作为所述细胞外囊泡，例如可以举出自然综述免疫学9，581-593(2009年8月)、如主题“肥胖研究”Vol.13No.22007，青木直人等中记载，根据其产生起源或小型膜囊泡的大小等进行各种分类。具体而言，可以举出外泌体、微囊泡、胞外体、膜粒子、类外泌体囊泡、凋亡小体、脂肪体等，优选为外泌体及微囊泡，更优选为外泌体。
所述外泌体是来源于细胞的由脂质双重膜构成的小型膜囊泡，例如可以举出具有50nm～200nm的直径的小型膜囊泡，优选为50nm～150nm的小型膜囊泡，更优选为50nm～100nm的小型膜囊泡。另外，认为外泌体来源于晚期内吞体。所述微囊泡是来源于细胞的由脂质双重膜构成的小型膜囊泡，例如可以举出具有100nm～1000nm的直径的小型膜囊泡，优选为100nm～800nm的小型膜囊泡，更优选为100nm～500nm的小型膜囊泡。另外，认为微囊泡来源于细胞膜。
本发明所涉及的间充质干细胞是指，具有分化成属于成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞等来源于中胚层的组织(间充质)的细胞的能力的干细胞。所述间充质干细胞通过从来源于中胚层的组织分离的方法或由iPS细胞、ES细胞等干细胞诱导的方法来获得。作为所述间充质干细胞，优选使用来源于选自由脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、牙髓、羊膜及胎盘组成的组中的一种以上的1种以上的组织的细胞，及来源于iPS细胞的细胞。间充质干细胞可以进行回收、浓缩、纯化、分离、基于缓冲液的稀释、过滤灭菌等预处理。这些预处理可以按照常规方法适当地进行。作为本发明所涉及的间充质干细胞的来源，例如可以举出动物，优选为哺乳类，更优选为人类。
＜细胞外囊泡的产生用培养基＞
本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有动物细胞培养用基础培养基、及选自L-谷氨酰胺、转铁蛋白、硒酸类、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素及转化生长因子β中的至少一种成分(以下，有时简写为本发明所涉及的成分)，含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mM以上。本发明的细胞外囊泡的产生用培养基最终可以不包含本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基中所包含的成分和本发明所涉及的成分(其中，含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mM以上)，例如，通过混合包含含有本发明所涉及的成分且含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mM以上的量的添加剂(以下、有时简写为本发明的细胞外囊泡产生用添加剂)、本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基或本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基的成分及水而获得。根据本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，促进细胞外囊泡的产生。具体而言，例如，与使用作为基础培养基的D-MEM的情况或使用在D-MEM中添加了bFGF的培养基的情况相比，促进细胞外囊泡的分泌，能够获得更多的细胞外囊泡。细胞外囊泡的粒子数例如能够通过纳米粒子追踪分析法(Nano Tra cking Analysis法)来测量。本发明的细胞外囊泡的产生用培养基由于在血清中包含细胞外囊泡，因此优选不包含血清(无血清培养基)，尤其优选不含有FBS。作为血清，例如可以举出胎牛血清(FBS、FCS)、小牛血清(CS)、马血清(HS)等。本发明的细胞外囊泡的产生用培养基可以是本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基中包含的成分及本发明所涉及的成分(其中，含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mM以上)溶解或分散于水等溶剂而得的水溶液、分散液等液态形态(液体培养基)，也可以是琼脂状(琼脂培养基)或凝胶等固态形态(固体培养基)，优选为液态形态(液体培养基)。
作为本发明所涉及的L-谷氨酰胺或其盐，例如可以举出L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺的卤化物，优选为L-谷氨酰胺。本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的L-谷氨酰胺或其盐的含量为5mM以上，例如为5mM～18mM，优选为5mM～16mM，更优选为5mM～14mM，进一步优选为6mM～12mM，尤其优选为6mM～10mM。本发明所涉及的L-谷氨酰胺或其盐可以使用1种或2种以上。
作为本发明所涉及的转铁蛋白，例如可以举出来源于天然的转铁蛋白、转基因体(重组体)的转铁蛋白、通过化学合成法而获得的转铁蛋白等。作为成为来源于天然的转铁蛋白的来源的生物，例如可以举出人类、小鼠等。作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的转铁蛋白的含量，例如为0.01mg/L～1000mg/L，优选为0.05mg/L～500mg/L，更优选为0.1mg/L～100mg/L，进一步优选为0.5mg/L～50mg/L，尤其优选为1mg/L～10mg/L。
作为本发明所涉及的亚硒酸或其盐，优选为亚硒酸、亚硒酸钠、亚硒酸钾、亚硒酸镁、亚硒酸钙，尤其优选为亚硒酸、亚硒酸钠。作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的亚硒酸化合物的含量，例如为0.001μg/L～0.1mg/L，优选为0.005μg/L～0.05mg/L，更优选为0.01μg/L～0.01mg/L，进一步优选为0.05μg/L～0.005mg/L，尤其优选为0.1μg/L～0.001mg/L。本发明所涉及的亚硒酸或其盐可以使用1种或2种以上。
作为本发明所涉及的胰岛素，例如可以举出来源于天然的胰岛素、转基因体(重组体)的胰岛素、通过化学合成法而获得的胰岛素等。作为成为来源于天然的胰岛素的来源的生物，例如可以举出人类、小鼠等。作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的胰岛素的含量，例如为0.05mg/L～500mg/L，优选为0.1mg/L～250mg/L，更优选为0.5mg/L～100mg/L，进一步优选为1mg/L～50mg/L，尤其优选为5mg/L～25mg/L。
作为本发明所涉及的胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors，以下有时简写为IGF)例如可以举出IGF-1、IGF-2等，优选为IGF-1。并且，作为本发明所涉及的胰岛素样生长因子，例如可以举出来源于天然的胰岛素样生长因子、转基因体(重组体)的胰岛素样生长因子、通过化学合成法而获得的胰岛素样生长因子等。作为成为来源于天然的胰岛素的来源的生物，例如可以举出人类、小鼠等。作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的胰岛素样生长因子的含量，例如为0.05μg/L～50mg/L，优选为0.1μg/L～10mg/L，更优选为0.5μg/L～5mg/L，进一步优选为0.001mg/L～1mg/L，尤其优选为0.005mg/L～0.5mg/L。
作为本发明所涉及的血清素化合物，例如可以举出血清素、血清素复合物及这些的盐，优选为血清素、血清素-肌酸酐复合物及这些的盐，更优选为血清素、血清素-肌酸酐硫酸盐复合物、硫酸血清素、盐酸血清素，进一步优选为血清素、血清素-肌酸酐硫酸盐复合物，尤其优选为血清素-肌酸酐硫酸盐复合物。作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的血清素化合物的含量，例如为0.005mg/L～500mg/L，优选为0.01mg/L～100mg/L，更优选为0.05mg/L～50mg/L，进一步优选为0.1mg/L～10mg/L，尤其优选为0.5mg/L～5mg/L。
作为所述转化生长因子β，例如可以举出TGFβ1、TGFβ3等，优选为TGFβ3。并且，作为本发明所涉及的转化生长因子β，例如可以举出来源于天然的转化生长因子β、转基因体(重组体)的转化生长因子β、通过化学合成法而获得的转化生长因子β等。作为来源于天然的转化生长因子β的来源的生物，例如可以举出人类、小鼠等。作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的转化生长因子β的含量，例如为0.01μg/L～0.5mg/L，优选为0.05μg/L～0.1mg/L，更优选为0.1μg/L～0.1mg/L，进一步优选为0.5μg/L～0.05mg/L，尤其优选为0.001mg/L～0.01mg/L。
作为本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基，只要可用于动物细胞、尤其间充质干细胞等的细胞培养，则并无特别限定。本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基只要包含用于动物细胞生存所需的成分即可，例如可以举出包含无机盐类、氨基酸类、糖类、维生素等的培养基。作为无机盐类，例如可以举出氯化钾、氯化钠、氯化钙、氯化镁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁、硝酸铁(III)、硝酸钙、硝酸铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠等。作为氨基酸类，例如可以举出L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等。本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基可以包含4mM以下的L-谷氨酰胺。作为维生素类，例如可以举出抗坏血酸、生物素、D-泛酸、胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺、氰钴胺、DL-α-生育酚等。作为糖类，例如可以举出葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖等。作为本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基，具体例如可以举出DMEM(Dulbec co改良Eagle培养基)、DMEM/F-12、Ham's F-12、Ham's F-12K、Ham's F-10、MEM(Eagle最小必需培养基)、EMEM(Eagle最小必需培养基)、α-ME M(Eagle最小必需培养基α改良型)、GMEM(格拉斯哥最小必需培养基)、IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基)、RPMI-1640(洛斯维帕克纪念研究所1640培养基)、ATCC-CRCM30、BME(Eagle基础培养基)、Fischer’s培养基、McCoy’s 5A培养基、Leibovitz’sL-15培养基、RITC80-7培养基、MCDB 105培养基、MCDB107培养基、MCDB131培养基、MCDB153培养基、MCD B201培养基、NCTC109培养基、NCTC135培养基、Waymouth’s MB 752/1培养基、CMRL-1066培养基、Williams’培养基E、ReproFF2 cell culture培养基(ReproCELL Inc.)等动物细胞培养用基础培养基，优选DMEM、DMEM/F-12、Ham's F-12、Ham's F-12K、Ham's F-10、MEM、EMEM、α-MEM、GMEM、IMDM、RPMI-1640，更优选DMEM、DMEM/F-12、Ham's F-12、Ham'sF-12K、Ham's F-10，进一步优选DMEM、DMEM/F-12，最优选DMEM。本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基可以为1种或2种以上的动物细胞培养用基础培养基的混合培养基或其他培养基的混合培养基。本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基可以进行动物细胞培养用基础培养基的改变，以使适合细胞外囊泡的产生，也可以追加、去除、增量、减量1种或2种以上的成分。作为所述动物细胞，优选为本发明所涉及的间充质干细胞。并且，作为所述动物细胞的来源，优选为哺乳类，更优选为人类。
本发明的细胞外囊泡的产生用培养基可以举出包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种本发明所涉及的成分，优选包含2种以上本发明所涉及的成分，最优选包含7种。作为包含1种本发明所涉及的成分的培养基，例如可以举出包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐的培养基、包含转铁蛋白的培养基、包含亚硒酸或其盐的培养基、包含胰岛素的培养基、包含胰岛素样生长因子的培养基、包含血清素化合物的培养基、包含转化生长因子β的培养基，优选包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐的培养基、包含胰岛素样生长因子的培养基、包含血清素化合物的培养基，尤其优选包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐的培养基。作为包含2种本发明所涉及的成分的培养基，优选包含转铁蛋白及亚硒酸或其盐的培养基、包含胰岛素样生长因子及转化生长因子β的培养基。作为包含3种本发明所涉及的成分的培养基，优选包含转铁蛋白、亚硒酸或其盐及胰岛素的培养基、包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐、胰岛素样生长因子及转化生长因子β的培养基。作为包含7种本发明所涉及的成分的培养基，可以举出包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β的培养基。作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，优选包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐的培养基、包含胰岛素样生长因子的培养基、包含血清素化合物的培养基；包含转铁蛋白及亚硒酸或其盐的培养基、包含胰岛素样生长因子及转化生长因子β的培养基；包含转铁蛋白、亚硒酸或其盐及胰岛素的培养基、包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐、胰岛素样生长因子及转化生长因子β的培养基；包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β的培养基。并且，作为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，动物细胞培养用基础培养基是选自由DMEM、DMEM/F-12、Ham's F-12、Ham's F-12K、Ham's F-10、MEM、EMEM、α-MEM、GMEM、IMDM及RPMI-1640组成的组中的1种培养基，且本发明所涉及的成分优选选自L-谷氨酰胺或其盐；胰岛素样生长因子；血清素化合物；转铁蛋白及亚硒酸或其盐：胰岛素样生长因子及转化生长因子β；转铁蛋白、亚硒酸或其盐、及胰岛素；L-谷氨酰胺或其盐、胰岛素样生长因子及转化生长因子β；L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β的1种成分或1个组合的培养基，包含L-谷氨酰胺或其盐的情况下，本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的其浓度为5mM以上。
本发明的细胞外囊泡的产生用培养基除了本发明所涉及的成分以外，还可以含有任意成分。作为任意成分，例如可以举出还原剂(例如，2-巯基乙醇、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、N-乙酰半胱氨酸等)、有机酸(例如，丙酮酸、乳酸等)、微量金属(钠、钾、镁、钙、铁、钴、镍、铜、锌、硒、锡、钼、硅等)、抗生物质(例如，链霉素、青霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素等)、类固醇(例如，β-雌二醇、黄体酮、睾丸素、可的松、皮质醇、氢化可的松等)、聚胺类(例如，腐胺等)、缓冲剂(例如，HEPES、碳酸氢钠等)、pH指示剂(酚红)、乙醇胺等。
本发明的细胞外囊泡的产生用培养基除例示的添加物以外，也可以包含用于动物细胞、尤其间充质干细胞等细胞培养的添加物。这些任意成分优选根据所使用的目的并以自身公知的浓度范围包含任意成分。
＜细胞外囊泡的产生用添加剂＞
本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂含有选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，且包含含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mM以上的量的L-谷氨酰胺或其盐。
本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂可以是按照本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂中包含的本发明所涉及的成分溶解或分散于水等溶剂的水溶液、分散液等液态形态，也可以是粉状、粒子状等固态形态，也可以按照本发明所涉及的成分而形态不同。本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂中，本发明所涉及的各成分可以独立存在，也可以2种以上的本发明所涉及的成分成为一体并包含，优选2种以上的本发明所涉及的成分成为一体。本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂用于制造(制备)本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，换言之，在后述的本发明的细胞外囊泡的产生方法中使用，且在本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基中混合使用。本发明的细胞外囊泡的产生用培养基及本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基可以与所述培养基相同，具体例或优选方式也相同。本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂中，以与本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基混合而获得的本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的终浓度例如成为上述的本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的成分的含量的方式，含有本发明所涉及的成分即可。即，本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基含有本发明所涉及的成分的情况下，使本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂中含有从上述的本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的成分的含量(浓度)减去本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基中包含的本发明所涉及的成分的含量(浓度)的量的本发明所涉及的成分即可。例如，作为本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基使用D-MEM(包含4mM的谷氨酰胺的培养基)的情况下，使用从上述例示的本发明的细胞外囊泡的产生用培养基中的本发明所涉及的L-谷氨酰胺或其盐的含量减去4mM而计算的量即可。本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂除本发明所涉及的成分以外，可以包含通常在该领域中使用的试剂类、例如，缓冲剂、增敏剂、表面活性剂、防腐剂(例如，叠氮化钠、水杨酸、苯甲酸等)、稳定化剂(例如，白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、活化剂、共存物质的影响避免剂以及其他在该领域中使用，且阻碍与共存的试剂的稳定性、或不会阻碍促进基于本发明所涉及的成分的细胞外囊泡产生的试剂。并且，这些试剂类等浓度范围等也可以为了发挥各试剂类所具有的效果而适当选择使用通常使用的浓度范围等。
＜培养基试剂盒＞
本发明的培养基试剂盒包括本发明的动物细胞培养基、及含有选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物和转化生长因子β中的至少一种成分的细胞外囊泡产生添加剂，所述细胞外囊泡的产生用添加剂含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下的所述细胞外囊泡的产生用添加剂包含细胞外囊泡的培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mM的量的L-谷氨酰胺或其盐。即，本发明的培养基试剂盒包括本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基及本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂。
本发明的培养基试剂盒用于制造(制备)本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，换言之，在后述的本发明的细胞外囊泡的产生方法中使用。本发明的试剂盒混合试剂盒中包含的本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂和本发明所涉及的动物细胞培养用基础培养基来使用。关于本发明的培养基试剂盒中的本发明的细胞外囊泡的产生用培养基、本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂、本发明所涉及的基础培养基等与上述相同，具体例或优选的也相同。
本发明的培养基试剂盒在1个容器中可以包含1种或2种以上本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂，优选在1个容器中包含2种以上本发明的细胞外囊泡的产生用添加剂。
本发明的试剂盒还可以包括例如后述的生长用培养基、从所述试样获得细胞外囊泡的方法中使用的试剂类、操作说明书等。作为在从所述试样获得细胞外囊泡的方法中使用的试剂类，例如可以举出MagCaptureTM外泌体隔离试剂盒PS(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)等细胞外囊泡获得用试剂盒或构成该试剂盒的试剂类、ExoQuickExosome Precipitation Solution(System Biosciences公司)等细胞外囊泡浓缩用试剂盒或构成该试剂盒的试剂类等。
＜细胞外囊泡的产生方法＞
本发明的细胞外囊泡的产生方法是包括使用本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，从间充质干细胞产生细胞外囊泡的步骤的细胞外囊泡的产生方法。
关于本发明的细胞外囊泡的产生方法中的本发明的细胞外囊泡的产生用培养基、间充质干细胞、细胞外囊泡与上述相同，具体例或优选的也相同。
本发明的细胞外囊泡的产生方法例如通过使用本发明的细胞外囊泡的产生用培养基，例如在2％～7％的CO2环境下，例如35℃～40℃，优选为36℃～38℃下，例如24小时～240小时，优选48小时～180小时培养间充质干细胞而完成。培养可以是静置培养，也可以是振荡培养，优选静置培养。
作为在本发明的细胞外囊泡的产生方法中使用的培养容器，例如可以举出烧瓶、器皿、培养皿、微孔板、微载片、腔载片、软管、托盘、培养袋、培养槽等。并且，培养容器可以是细胞粘附的，也可以是细胞非粘附的。
总之，本发明的细胞外囊泡的产生方法可以在生长用培养基使本发明所涉及的间充质干细胞生长之后，培养基替换为本发明的细胞外囊泡的产生用培养基之后，使用如上述使用本发明的细胞外囊泡的产生用培养基从本发明所涉及的间充质干细胞产生细胞外囊泡。作为所述生长用培养基，只要具有间充质干细胞的生长能力的培养基均可，例如可以举出α-MEM、DMEM、DMEM/F-12、Ham's F-12、Ham's F-12K、Ham's F-10、MEM、EMEM、GMEM、IMDM等基础培养基、间充质干细胞生长培养基2(Takara Bio Inc.)、KBM ADSC-1(Kohjin-BioCo.,Ltd.)、KBM ADSC-2(Kohjin-Bio Co.,Ltd.)、MSC NutriSt emTM XF培养基(BioLogicalIndustries)、TheraPEAKTM MSCGMTM间充质干细胞生长培养基(Lonza)、原代间充质干细胞用无血清培养基STKR1(Kanto Chemical Co.,Inc.)、间充质干细胞用无血清培养基STKR2(Kanto Chemica l Co.,Inc.)、StemXVivo无异种人MSC增强介质(R&D Systems)、StemXVivo无血清人MSC扩增培养基(R&D Systems)、StemXVivo间充质干细胞扩增培养基(R&DSystems)、CnT-Prime MSC无异种培养基(CELLnTE C)、CnT-Prime MSC培养基(CELLnTEC)、StemProtm MSC SFM(Therm oFisher SCIENTIFIC)、PRIME-XVTM MSC Expansion XSFM(FUJIFILM Irvi ne Scientific)、MesenCult ACF Plus培养试剂盒(STEMCELLTechnologies)等间充质干细胞的生长用培养基等。所述生长用培养基中可以含有5-20％的血清(例如FBS)，优选含有FBS。所述生长用培养基可以为1种或2种以上的基础培养基或间充质干细胞的生长用培养基的混合培养基，也可以是与其他培养基的混合培养基。所述生长用培养基可以进行修改以适合间充质干细胞的生长，也可以追加、去除、增加、减少1种或2种以上的成分。
本发明所涉及的间充质干细胞的生长例如通过使用所述生长用培养基，例如在2％～7％的CO2环境下，例如35℃～40℃，优选为36℃～38℃下，例如24小时～240小时，优选48小时～120小时培养间充质干细胞而完成。培养是静置培养，也可以是振荡培养。并且，作为在本发明所涉及的间充质干细胞的生长中使用的培养容器，可以与在本发明的细胞外囊泡的产生方法中使用的培养容器相同。
根据本发明，还提供一种通过本发明的细胞外囊泡的产生方法而产生的细胞外囊泡、及细胞囊泡的获得方法。
作为通过本发明的细胞外囊泡的产生方法而产生的细胞外囊泡的获得(分离·纯化)方法，只要是能够从试样获得细胞外囊泡的方法均可，例如可以举出亲和法(例如，PS亲和法)、分馏离心分离法(例如，颗粒下降法、蔗糖垫法、密度梯度离心法等超离心法)、免疫沉淀法、色谱法(例如，离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法)、密度勾配法(例如，蔗糖密度梯度法)、电泳法(例如，细胞器电泳法)、磁性分离法(例如，磁性活性细胞分选(MACS)法)、超滤浓缩法(例如，纳米膜超滤浓缩法)、珀可梯度分离法、利用微流体器件的方法、PEG沉淀法等，优选可获得高纯化度的细胞外膜囊泡的亲和法、或理论上能够无偏差回收的分馏离心分离法，更优选亲和法或超离心法，尤其优选亲和法。亲和法中，优选通过利用具有相对于磷脂酰丝氨酸的亲和性的物质的方法获得细胞外囊泡的方法(PS亲和法)。亲和法及分馏离心分离法例如可以根据日本特开2016-088689中记载的方法进行。这些分离方法可以仅使用1种，也可以组合2种以上。并且，可以重复进行2次以上基于1种分离方法的分离。
作为具有相对于所述磷脂酰丝氨酸的亲和性的物质(以下，有时简写为PS亲和性物质)，只要是与构成细胞外囊泡的膜的磷脂酰丝氨酸特异性结合的物质均可，例如可以举出Annexin V；MFG-E8；Tim1蛋白质(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子1、T-cellimmunoglobulin-mucin-domain1)、Tim2蛋白质(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子2、T-cell immunoglobulin-mucin-domain2)、Tim3蛋白质(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子3、T-cell immunoglobulin-mucin-domain3)、Tim4蛋白质(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子4、T-cell immunoglobulin-mucin-domain4)等Tim蛋白质，能够有效地获得细胞外囊泡，因此优选Tim蛋白质，更优选选自Tim4蛋白质、Tim3蛋白质及Tim1蛋白质，进一步优选Tim4蛋白质、Tim1蛋白质，尤其优选Tim4蛋白质。
PS亲和法通过使包含细胞外囊泡的细胞培养上清液与PS亲和性物质在钙离子存在下接触，形成该细胞培养上清液中的细胞外囊泡与PS亲和性物质的复合物之后，从该复合物分离PS亲和性物质，获得PS阳性细胞外囊泡而完成。PS阳性细胞外囊泡是指认为磷脂酰丝氨酸露出于细胞外囊泡的膜表面的PS阳性(含有PS)的所述细胞外囊泡。
PS亲和法的优选方法具体包括下述工序。
(1)使包含细胞外囊泡的细胞培养上清液与PS亲和性物质在钙离子存在下接触，形成该细胞培养上清液中的PS阳性细胞外囊泡与PS亲和性物质的复合物的工序、
(2)从包含所述细胞外囊泡的细胞培养上清液，分离在(1)中获得的PS阳性细胞外囊泡与PS亲和性物质的复合物的工序、及
(3)从PS阳性细胞外囊泡与PS亲和性物质的复合物分离PS阳性细胞外囊泡，获得PS阳性细胞外囊泡的工序。
实施例
实施例以下根据实施例和比较例具体说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
实验例1.间充质干细胞的培养
将作为来源于骨髓的间充质干细胞的PoieticsTM人类间充质干细胞(Lonza
Group AG)、以及含有15％FBS(Selborne Biological Sevice Pty.Ltd.)的“MEMα(含有L-谷氨酰胺、酚红)”(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corpora tion，本培养基含有2mM的L-谷氨酰胺)用作生长培养基来培养。之后，将所培养的来源于骨髄的间充质干细胞以细胞数3×105接种在100mm细胞培养用器皿(Corning Incorporated)中，在设定为5％CO2、37℃的条件的细胞培养用培养箱内培养72小时，生长至细胞数3×106。
实施例1-5.细胞外囊泡产生用培养基的制备
(1)细胞外囊泡产生用培养基的制备
使“D-MEM(高葡萄糖)(含有L-谷氨酰胺、酚红)”(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation，本培养基含有4mM的L-谷氨酰胺)中以使bFGF成为0.01μg/mL的方式含有，制备了成为基准的培养基。接着，按照下述表1，以使各添加剂成为规定浓度方式，分别制备了成为该基准的培养基中含有的20mL培养基。将所获得的各培养基设为“研究培养基1”～“研究培养基5”。另外，添加剂的L-谷氨酰胺584(μg/mL)为4(mM)，研究培养基1与D-MEM中包含的L-谷氨酰胺合计含有8mM。
(2)细胞外囊泡的产生
将在实验例1中生长的来源于骨髄的间充质干细胞从生长培养基分别培养基替换为研究培养基1～研究培养基5。之后，在设定为5％CO2、37℃的条件的细胞培养用培养箱内进行了120小时培养。将所获得的各培养上清液回收到50mL的离心管并以2000×g离心20分钟并回收了上清液。
(3)细胞外囊泡的获得
从在(2)中回收的各上清1mL，使用超离心分离机(Beckman：OptimaTM L-100XP)在110,000×g下离心分离了70分钟。在所获得的颗粒中添加1mL的PBS，并再次以110,000×g离心分离了70分钟。将最终获得的颗粒通过添加了EV-SaveTM细胞外囊泡阻断试剂(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporati on)的PBS来溶解。将所获得的溶液记载为细胞外囊泡溶液。
比较例1.细胞外囊泡产生用培养基的制备
(1)细胞外囊泡产生用培养基的制备
将在上述实施例1-5(1)中制备的成为基准的培养基设为“比较培养基1”。
除代替研究培养基1使用比较培养基1以外，通过与实施例1相同的方法，进行细胞外囊泡的产生及获得，以获得了细胞外囊泡溶液。
[表1]
实验例2.基于纳米跟踪分析法的细胞外囊泡粒子数的测量
关于在比较例1及实施例1-5中分别获得的细胞外囊泡溶液的每单位体积的粒子数，使用粒径分析仪(Malvern Panalytical Ltd)，通过纳米粒子追踪分析法(NanoTracking Analysis法)，根据粒径分析仪的说明书中记载的步骤来测量，计算出每单位体积的平均粒子数[粒子/mL]。将所获得的平均粒子数示于图1及下述表2。
[表2]
从图1可知，与使用了在“D-MEM(高葡萄糖)(含有L-谷氨酰胺、酚红)”(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation)，本培养基含有4mM的L-谷氨酰胺)中含有使bFGF成为0.01μg/mL的培养基(比较培养基1)的情况相比，使用了在比较培养基1中还分别包含4mM的L-谷氨酰胺(实施例1)、转铁蛋白及亚硒酸Na(实施例2)、血清素肌酸酐硫酸盐一水合物(实施例3)、胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸Na(实施例4)、胰岛素样生长因子(实施例5)的培养基的情况下，细胞外囊泡的产生数显著增加。在表2中，以基于比较培养基1的细胞外囊泡的产生数为基准，以“++++”表示4倍以上的情况，以“+++”表示3倍以上且小于4倍的情况，以“++”表示2倍以上且小于3倍的情况，对细胞外囊泡的产生效果进行了评价。+越多则细胞外囊泡的产生效果越高，从细胞外囊泡的产生效果的观点考虑，表示优选作为细胞外囊泡的产生用培养基的成分。使用包含转铁蛋白及亚硒酸或其盐的培养基的情况(实施例2)为“++++”，使用包含5mM以上的L-谷氨酰胺或其盐的培养基的情况(实施例1)为“+++”，使用包含胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸或其盐的培养基的情况(实施例4)为“+++”，使用包含血清素化合物的培养基的情况(实施例3)为“++”，使用包含胰岛素样生长因子的培养基的情况(实施例3)为“++”。从这些结果可知，含有选自L-谷氨酰胺或其盐(其中，作为培养基中的浓度为5mM以上)、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分的细胞外囊泡的产生用培养基促进细胞外囊泡的产生。
实施例6-9.细胞外囊泡产生用培养基的制备
(1)细胞外囊泡产生用培养基的制备
使“D-MEM(高葡萄糖)(含有L-谷氨酰胺、酚红)”(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation，本培养基含有4mM的L-谷氨酰胺)中以使bFGF成为0.01μg/mL的方式含有，制备了成为基准的培养基。接着，按照下述表3，以使各添加剂成为规定浓度方式，分别制备了在成为该基准的培养基中含有的30mL培养基。表3中的〇是指包含相应的成分。将所获得的各培养基设为“研究培养基6”～“研究培养基9”。
(2)细胞外囊泡的产生及获得
除了代替研究培养基1分别使用研究培养基6～研究培养基9以外，通过实施例1相同的方法，进行细胞外囊泡的产生及获得，分别获得了细胞外囊泡溶液。
[表3]
实验例3.细胞外囊泡的抗纤维化活性的评价
对在实施例6～9中获得的细胞外囊泡的抗纤维化作用进行了评价。在含有10％FBS(Biosera公司)DMEM(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporat ion)中悬浮人类胎肺来源成纤维细胞即TIG3细胞(JCR出售)，并在24孔板(Corning公司)中，以每个孔的细胞数2.5×104、培养基量500μL分别接种。接种细胞24小时之后，将在实施例6-10中的获得的细胞外囊泡溶液以成为終浓度1×109粒子/mL的量分别添加到孔中，培养了16小时。之后，将成为終浓度5ng/mL TGFβ1(R&D systems公司)的量分别添加到各孔中并刺激，进一步培养了24小时。使用PureLinkTMRNA Mini试剂盒(Thermo Fisher Scientifi c)，根据该试剂盒附带的说明中记载的步骤分别提取RNA。从所提取的RNA 200ng，使用ReverTra AceTMqPCRRT Master Mix with gDNARemover(Toyo bo Co.,Ltd.)，根据该试剂盒附带的说明中记载的步骤合成了cDNA。使用合成的cDNA，通过KOD SYBR qPCR Mix(Toyobo Co.,Ltd.)，通过定量PCR分别测量了纤维化相关基因即Collagen III、及作为内部标准的GAPDH的mRNA表达量。将使用于定量PCR的引物(序列号1～2)示于图2。将测量结果示于图3。关于CollagenIII基因的表达量，将从使用针对各基因的引物进行的qPCR获得的数值相对于GAPDH进行标准化，纵轴表示对照中相对于对象mRNA表达的相对值(ΔΔct值)。
从图3可知，通过不包含胰岛素样生长因子(IGF)的培养基(研究培养基7)、不包含转化生长因子的培养基(研究培养基8)分别产生的细胞外囊泡示出低于通过包含胰岛素样生长因子及转化生长因子的培养基(研究培养基6)的细胞外囊泡的抗炎活性。并且，通过L-谷氨酰胺的終浓度为8mM的培养基(研究培养基9)产生的细胞外囊泡示出高于通过包含4mM的L-谷氨酰胺的培养基(成为基准的培养基中仅含有4mM，研究培养基6)产生的细胞外囊泡的抗炎活性。从这些结果可知，含有选自L-谷氨酰胺或其盐(其中，作为培养基中的浓度为5mM以上)、胰岛素样生长因子及转化生长因子β中的至少一种成分的细胞外囊泡的产生用培养基促进活性高的细胞外囊泡的产生。
比较例2及实施例10～12.细胞外囊泡产生用培养基的制备
(1)细胞外囊泡产生用培养基的制备
将“D-MEM(高葡萄糖)(不含L-谷氨酰胺、含有酚红)”(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)设为成为基准的培养基(比较培养基2)，根据下述表4，分别制备了比较培养基2中含有成为规定浓度的各添加剂的30mL培养基。
将所获得的各培养基设为“研究培养基10”～“研究培养基12”。
(2)细胞外囊泡的产生及获得
除了代替研究培养基1分别使用比较培养基2或研究培养基10～研究培养基12以外，通过实施例1相同的方法，进行细胞外囊泡的产生及获得，分别获得了细胞外囊泡溶液。
[表4]
实验例4.细胞外囊泡的抗纤维化活性的评价
除了使用在比较例2及实施例10～12中获得的细胞外囊泡溶液以外，通过与实验例3相同的方法，分别通过定量PCR测量纤维化相关基因即CollagenIII的mRNA的表达量并对抗纤维化作用进行了评价。将所获得的结果示于图4。从图4可知，通过分别包含IGF(胰岛素样生长因子)、TGFβ(转化生长因子)或L-谷氨酰胺的培养基产生的细胞外囊泡在使用比较培养基2的情况下确认到未观察到的抗纤维化活性。从这些结果可知，含有选自IGF、TGFβ及L-谷氨酰胺中的至少一种成分的细胞外囊泡的产生用培养基促进活性高的细胞外囊泡的产生。
实验例5.细胞外囊泡产生用培养基的制备及抗纤维化活性的评价
根据上述表4，制备在比较培养基2中含有成为5(μg/L)的EGF的培养基30mL，通过与实验例4相同的方法对抗纤维化活性进行了评价。通过包含EGF的培养基产生的细胞外囊泡在使用比较培养基2的情况下确认到未观察到的抗纤维化活性。
产业上的可利用性
通过本发明提供一种细胞外囊泡的产生用培养基、培养基试剂盒、添加剂及细胞外囊泡的产生方法。根据本发明，为了促进细胞外囊泡的产生，例如在使用了细胞外囊泡的疾病的诊断或其研究的领域中有用。
Claims (15)
1.一种细胞外囊泡的产生用培养基，其含有动物细胞培养用基础培养基、及选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，
含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下，细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mM以上。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述L-谷氨酰胺或其盐。
3.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转铁蛋白。
4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述亚硒酸或其盐。
5.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转铁蛋白及所述亚硒酸或其盐。
6.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述胰岛素。
7.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述胰岛素样生长因子。
8.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述血清素化合物。
9.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转化生长因子β。
10.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其不包含血清。
11.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有选自所述L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少两种成分。
12.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有选自所述L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少三种成分。
13.一种细胞外囊泡的产生用培养基试剂盒，其包括动物细胞培养用基础培养基、及含有选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分的细胞外囊泡的产生用添加剂，
所述细胞外囊泡的产生用添加剂含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下，所述细胞外囊泡的产生用添加剂包含细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mM以上的量的L-谷氨酰胺或其盐。
14.一种细胞外囊泡的产生用添加剂，其用于制造培养基，其中，
所述培养基是选自权利要求1至12中任一项所述的培养基，
所述细胞外囊泡的产生用添加剂含有选自L-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，
所述细胞外囊泡的产生用添加剂含有L-谷氨酰胺或其盐的情况下，其包含细胞外囊泡的产生用培养基中的L-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mM以上的量的L-谷氨酰胺或其盐。
15.一种细胞外囊泡的产生方法，其包括使用选自权利要求1至12中任一项所述的培养基，从间充质干细胞产生细胞外囊泡的步骤。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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