CN116519929A - 一种快速鉴别检测SADS-CoV与TGEV的乳胶双联免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴别检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS‑CoV）与猪传染性胃肠炎冠状病毒（TGEV）的乳胶双联免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条包括PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上设有质控线C和检测线T1和检测线T2。结合垫上喷涂乳胶微球标记的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和抗SADS‑CoV N蛋白的单克隆抗体6E8，检测线T1线处包被抗SADS‑CoV N蛋白的单克隆抗体6E8，检测线T2线处包被抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9，质控线C线处包被羊抗鼠IgG。该试纸条优势在于能一卡双联，特异的对临床症状容易混淆的TGEV和SADS‑CoV进行鉴别诊断。

Description

一种快速鉴别检测SADS-CoV与TGEV的乳胶双联免疫层析试纸 条及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴别检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)与猪传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)的乳胶双联免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
由于近年来我国猪群饲养方式的改变以及从国外引进种猪的频率不断增加，在一定程度导致引起猪腹泻的病因变得复杂。其中最为复杂的则是病毒性腹泻，对仔猪的危害极大。临床上腹泻病毒经常以两种或更多种病毒混合感染的方式存在，无疑增加了防控的难度，同时对国家养殖业造成了巨大的经济损失。在当前尚无有效疫苗的条件下，建立能够快速且便捷的对多种病毒同时鉴别检测的诊断方法就显得尤为重要。
猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome virus，SADS-CoV)与猪传染性胃肠炎冠状病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)是猪的两种肠道冠状病毒，其临床症状均表现为急性腹泻、呕吐、新生仔猪由于严重脱水、体重下降而死亡。两种病原常用的病原学检测方法均包括病毒分离鉴定、免疫组化、酶联免疫吸附试验(ELISA)或聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR等方法。然而，这些方法检测时间长、操作复杂，需特定的或昂贵的大型仪器以及专业的技术人员，很难满足基层养殖场快速、廉价、高效监测的要求。相较于上述方法，免疫层析检测技术能够在保证高灵敏度和强特异性的条件下将整体反应时间严格控制在10～15min内，极大的缩短了操作时间，提高了检测效率，非常适用于基层或现场的快速筛查。
免疫层析检测技术常用的标记物包括胶体金、乳胶、量子点以及时间分辨荧光微球等。其中胶体金最为常用，但其在反应过程中容易受pH和盐离子等的影响，因此稳定性欠佳。基于乳胶微球表面链接有羧基基团，其在水溶性二亚胺(EDC)的作用下发生活化，能够与蛋白或抗体的氨基基团发生共价结合，形成稳定且牢固的化学键，在反应过程中不易受到pH和高浓度盐离子的影响，因此，乳胶微球的稳定性强于胶体金。相较于胶体金，乳胶微球内部填充了油溶性彩色染料，对比度高、颜色深、可视化程度，在显色效果上同样优于胶体金。
冠状病毒核衣壳蛋白(N)保守性好，且在病毒感染的整个过程中均能大量表达，能够刺激机体产生特异性抗体。N蛋白在免疫学诊断和新型疫苗研发方面均具有重要的应用价值。
发明内容
本发明基于冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的特性，同时结合乳胶微球的优势，提供一种可以快速鉴别检测SADS-CoV与TGEV的乳胶双联免疫层析试纸条，该试纸条耗时短、操作简便、可不借助任何仪器直接用肉眼观察、且显色明显，灵敏度强，可用于临床上TGEV与SADS-CoV混合感染样本的检测，为TGEV与SADS-CoV的防控提供新的技术支撑，同时这也是当前第一个能够同时检测TGEV与SADS-CoV的双联乳胶试纸条。
本发明具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种用于快速检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征乳胶双联免疫层析试纸条。该试纸条包括PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述结合垫上喷涂乳胶微球标记的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8。硝酸纤维素膜上设有质控线C和检测线T1和检测线T2，检测线T1线处包被抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8，检测线T2线处包被抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9，质控线C线处包被羊抗鼠IgG。
其中，本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7的重链可变区包括氨基酸序列为GFNIKDTY的CDR1、氨基酸序列为IDPADGYT的CDR2、氨基酸序列为ARPGTLDY的CDR3，本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDFN的CDR1、氨基酸序列为INPNNGRS的CDR2、氨基酸序列为ARRHWDWYFDV的CDR3。
本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2、氨基酸序列为QHIRELTR的CDR3，本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9的轻链可变区包括氨基酸序列为KSLLHSN的CDR1、氨基酸序列为QMS的CDR2、氨基酸序列为AQNLEFPWT的CDR3。
本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。
本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:5所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；本发明的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明的抗TGEV N蛋白单克隆抗体重链恒定区为IgG1或IgG2b型。本发明的抗TGEV N蛋白单克隆抗体轻链恒定区为Kappa型。
另外，本发明的抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8采用公开号为CN113956353A的发明的专利方法制备得到，单克隆抗体6E8的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDYA的CDR1、氨基酸序列为FSTYYGNA的CDR2和氨基酸序列为ARGGDYYGSSNVDYAMDY的CDR3，单克隆抗体6E8的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2和氨基酸序列为QHIRELTRCDR3。
进一步的，抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:9所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
优选地，所述样品垫采用样品垫封闭液浸泡处理；所述样品垫封闭液为含有2％BSA、0.5％S17、2％PEG20000及0.5％酪蛋白酸钠的Tris-HCl溶液。其中S17为表面活性剂。
优选地，所述结合垫的制备方法为：
将结合垫采用结合垫封闭液封闭处理；
将乳胶微球用N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，离心，用MES缓冲液重悬，超声使乳胶微球充分分散，随后加入抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8，室温孵育，再加入封闭液进行封闭，室温孵育，离心；用乳胶微球标记物保护剂将沉淀重悬，即得抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的乳胶微球标记混合溶液；
将上述制备的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的乳胶微球标记混合溶液均匀喷涂在已封闭好的结合垫上。
所述结合垫封闭液为含有5％m/v蔗糖、1.5％m/v BSA、2％m/v Tween-20和1.5％m/v PVP-40的超纯水溶液。
所述乳胶微球标记物封闭液为含有10％m/v BSA的超纯水溶液。
所述乳胶微球标记物保护剂为含有3％m/v蔗糖、1％m/v PVP-40、1％v/v Tween-20的Tris-HCl溶液。
所述抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的乳胶微球标记混合溶液组成为：每1ml乳胶微球溶液含80μg TGEV N蛋白单克隆抗体1B7和80μgSADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8。
优选地，所述检测线T1包被有1mg/ml SADS-CoV N蛋白单克隆抗体6E8。
优选地，所述检测线T2包被有1mg/ml的TGEV N蛋白单克隆抗体2A9。
优选地，所述质控线C包被有1mg/ml的羊抗鼠IgG。
第二方面，本发明提供了一种上述快速检测TGEV与SADS-CoV乳胶双联免疫层析试纸条的制备方法。所述方法包括以下步骤：
(1)制备样品垫和包被有抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的乳胶微球标记的结合垫；
(2)将抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8(1mg/ml)和羊抗鼠IgG抗体(1mg/ml)间隔3mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线T1和质控线C；将抗TGEV蛋白单克隆抗体2A9(1mg/ml)喷在离抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8(1mg/ml)5mm处，作为检测线T2。
(3)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上，得到鉴别检测TGEV与SADS-CoV乳胶双联免疫层析试纸条。
第三方面，本发明试纸条的检测方法，其步骤如下：
(1)准备待检样品。
(2)检测：取出试纸条平衡至室温，在加样区加入待检样品，室温静置不超过15min。
(3)结果判定：反应结束后，通过肉眼对阴阳性进行定性判断。
本发明的有益效果是：
本发明提供的鉴别检测TGEV与SADS-CoV乳胶双联免疫层析试纸条，单独检测TGEV或SADS-CoV时没有非特异性反应，且与临床症状相似的其他猪源肠道冠状病毒PEDV和PDCoV不发生交叉反应。同时试纸条能够检出TGEV和SADS-CoV阳性对照中病毒的最低限位分别为104.69TCID50/0.1mL和103.39TCID50/0.1mL，所制备的试纸条具有较好的特异性、灵敏性、操作简单、时间短等优点，为两种腹泻病毒的现场或者实验室的快速鉴别检测提供了一种快速检测方法。
附图说明
图1为TGEV N基因PCR扩增结果。
M：DL2000相对分子质量标准；1：对照水；2：N基因，大小约为1000bp。
图2为pET32a-N重组蛋白表达及纯化结果。(A)M：蛋白Marker；1：pET32a-N诱导前；2：pET32a-N诱导后；3：pET32a-N裂解上清；4：pET32a-N裂解后沉淀。(B)M：蛋白Marker；1：纯化后的pET32a-N蛋白。
图3为N蛋白免疫后ELISA检测小鼠抗体效价。1～3：1、2和3号免疫鼠，NC：阴性对照。
图4为抗体纯化SDS-PAGE鉴定结果。M：蛋白Marker，1：1B7单克隆抗体；2：2A9单克隆抗体。
图5为IFA鉴定单克隆抗体的反应性。(A)1B7单克隆抗体；(B)2A9单克隆抗体；(C)SP2/0细胞培养液。
图6为Westernblot鉴定单克隆抗体的反应性。(A)1B7单克隆抗体；(B)2A9单克隆抗体；(C)内参对照。
图7为亚类鉴定结果。
图8为可变区PCR扩增结果。(A)重链可变区PCR扩增结果。M：DL2000 marker；1：水对照；2：1B7单克隆抗体；3：2A9单克隆抗体；(B)轻链K可变区PCR扩增结果。M：DL2000marker；1：水对照；2：1B7单克隆抗体；3：2A9单克隆抗体。
图9为SADS-CoV/TGEV双联乳胶试纸条模式图。
图10为SADS-CoV/TGEV双联乳胶试纸条结果判定示意图。
图11为SADS-CoV/TGEV双联乳胶试纸条敏感性检测结果。1～9：先将SADS-CoV和TGEV阳性对照均从2-1倍比稀释至2-9，再将上述每个样品作为独立样本按照1:5稀释，最后用试纸条逐一检测。10：NC。
图12为SADS-CoV/TGEV双联乳胶试纸条特异性检测结果。1：同时检测SADS-CoV和TGEV阳性对照；2：只检测SADS-CoV阳性对照；3：只检测TGEV阳性对照；4：检测PEDV阳性抗原；5：检测PDCoV阳性抗原；6：NC。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
实施例1猪传染性腹泻冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备
1.TGEV N蛋白重组质粒的构建、表达、纯化
1.1pET32a-N重组质粒的构建
TGEV毒株为HLJ-17毒株(Genbank登录号：MT522161.1)，以该毒株N蛋白为参考，设计特异性引物，上游P1：5′-CGCGGATCCATGGCCAACCAGGGACAACG-3′，下游P2：5′-CCGCTCGAGTTAGTTCGTTACCTCATCAATTATC-3′，上、下游引物5′端引入了BamHI与XhoI酶切位点(下划线部分)。引物合成后，提取感染PK15细胞的TGEV细胞上清RNA，反转录为cDNA，进而以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA 1μL，ddH2O补至50μL。反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，TGEV的N片段大小约为1000bp。随后按Omega公司EZNAGel Extraction Kit的使用说明书进行胶回收。
TGEV的N基因PCR胶回收产物与pET32a载体用BamHⅠ与XhoI双酶切后，进行连接、转化DH5α感受态细胞。将构建好的重组质粒进行测序鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a-N。
1.2N重组蛋白的诱导表达与纯化
将重组质粒pET32a-N转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落于5mL氨苄抗性的LB培养基中，待OD600约为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导后5h，12000rpm离心2min收集沉淀，沉淀用适量的PBS重悬后，进行超声处理5min(超3s，停3s)，超声后4℃，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。取上清液和沉淀加入5×loadingbuffer，沸水中煮沸10min，进行SDS-PAGE鉴定。结果显示pET32a-N在上清和沉淀中均有表达(图2A)，说明N蛋白有部分是可溶性的。
按照上述方法扩大pET32a-N蛋白的诱导表达量，取超声后裂解上清，进行镍柱纯化。纯化的具体操作步骤如下：
(1)装树脂：取一个空柱，加入2mL镍柱NTA树脂，待保存液下降至树脂表面时，用5倍柱体积蒸馏水清洗柱子一次，然后用5倍柱体积平衡液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5mM咪唑，pH7.4)对柱子进行平衡；
(2)上样：待平衡液降至树脂表面时，加入3mL含重组蛋白的裂解上清，重复上样2～3次，每次作用2min，收集样品流穿液；加入5倍柱体积的平衡液冲洗柱子1次；
(3)蛋白洗脱：用平衡液配置不同浓度咪唑(25mM，50mM，75mM，100mM，150mM，200mM和300mM)对蛋白样品进行洗脱，每次1mL，每个浓度重复两遍，其目的是为了确定咪唑的最佳洗杂和蛋白洗脱浓度；
(4)柱子清洗及保存：5倍体积的0.5M的NaOH冲洗柱子一次，然后用蒸馏水冲洗一次，随后加入适量的70％无水乙醇，置4℃冰箱保存。每次收集的样品进行SDS-PAGE鉴定。由图2B所示，获得了纯度较高的N蛋白。
2.动物免疫
选取6W(周)龄雌性BALB/c小鼠3只，将纯化的N重组蛋白按30μg/只的量免疫小鼠。首次免疫，将N蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后进行乳化，采用多点皮下注射小鼠(背部一个点，腹部两个点)。每隔2W进行加强免疫，共免疫四次，加强免疫是将N重组蛋白和弗氏不完全佐剂等体积混匀进行乳化，免疫方法同首次免疫。四免后7d(天)尾部采血测定抗体效价。
3.ELISA方法检测多克隆抗体效价
将TGEV病毒液与包被液1:1稀释包被ELISA板，50μL/孔，4℃过夜包被，用PBST洗四次后，加入2％海藻糖4℃封闭10h。将阳性血清和阴性血清用PBST倍比稀释，稀释梯度从1:100至1:12800，稀释8个梯度，37℃作用1h，PBST洗四次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:20000稀释)，PBST洗四次后，TMB显色，置酶标仪上测定OD450。
结果如图3所示，以未免疫小鼠血清作为阴性对照(NC)，血清1:102400稀释时，1、2和3号免疫鼠OD450仍大于NC组，说明该抗体效价能达到1:102400以上。
4.单克隆抗体的制备
具体操作步骤如下：
(1)制备饲养层细胞：将HAT培养液注射雌性BALB/c小鼠腹腔，慢慢反复抽吸，液体吸出后，铺于96孔板中。
(2)细胞融合：将脾细胞和适量的SP20细胞在融合剂PEG作用下进行细胞融合。融合后的细胞铺于含有饲养层细胞的96孔板中。
(3)阳性克隆的筛选：
a)间接ELISA检测方法，将纯化的N蛋白包被ELISA板，检测融合细胞分泌抗体的情况。
b)间接免疫荧光(IFA)检测方法，将ELISA抗体阳性细胞孔中的上清，加入TGEV感染PK15细胞，然后加入FITC标记的山羊抗鼠IgG，反应完毕后置荧光显微镜下观察结果。
(4)阳性杂交瘤细胞的亚克隆：选取ELISA和IFA阳性孔，采用有限稀释法对筛选到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清，利用上述ELISA和IFA方法进行抗体检测。阳性细胞进入下一轮的亚克隆，共进行三次。
(5)腹水的制备：取10～12W的Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，1W后每只小鼠腹腔注射5×105个杂交瘤细胞(0.2mL)，7～10天后，鼠体腹腔明显隆起，采集腹水，ELISA检测其效价，分装，-80℃保存。
(6)腹水的纯化：按照PIERCE公司NAbTM Protein G Spin Purification Kit进行亲和层析纯化，后经SDS-PAGE电泳鉴定纯度，纯化后的1B7单抗和2A9单抗的重链和轻链分别约为55kDa和约25kDa(图4)说明该纯化法纯化后抗体条带正确，且纯度较高。
5.单克隆抗体的鉴定
(1)特异性鉴定：包括IFA及Westernblot验证。
a)IFA验证：将TGEV感染PK15细胞，病毒感染后36h，用多聚甲醛固定细胞，细胞固定后，腹水用PBS稀释(500倍)加入病毒感染细胞，随后孵育FITC-抗鼠二抗(100倍稀释)，待反应结束后置荧光显微镜下观察。结果如图5A和5B所示，单克隆抗体1B7和2A9作用TGEV感染的PK15细胞能够检测到特异性的绿色荧光信号，而SP2/0细胞上清液作用TGEV感染细胞未见荧光信号(图5C)。
b)Westernblot验证：取纯化的N蛋白或收集病毒感染和未感染的PK15细胞进行SDS-PAGE，随后将蛋白胶转移至NC膜上，进行western blot验证。一抗为单克隆抗体1B7或2A9，二抗为HRP-抗鼠IgG。结果如图6A和6B所示，单克隆抗体1B7和2A9均能识别病毒感染细胞中的N蛋白。图6C为检测细胞内参β-actin。
(2)亚类鉴定：按照Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明对所获得的单抗进行抗体亚类鉴定。结果显示如图7，1B7单抗重链恒定区为IgG1型，2A9为IgG2b型，它们的轻链恒定区为Kappa型。
6.单克隆抗体可变区基因PCR扩增与序列测定
首先提取单克隆抗体杂交瘤细胞的RNA，利用Oligo-dt或随机引物分别将其逆转录合成cDNA(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA，6210A)。
抗体可变区基因采用套式PCR扩增。首先以上述cDNA为模板，利用第一轮鼠源抗体IgG1及κ轻链引物扩增抗体可变区基因，然后以第一轮产物为模板，利用第二轮鼠源抗体IgG1及κ轻链引物扩增抗体可变区基因。PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA 1μL，ddH2O补至50μL。反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。抗体可变区基因扩增的引物参照文献(von Boehmer,L.,Liu,C.,Ackerman,S.,Gitlin,A.D.,Wang,Q.,Gazumyan,A.,Nussenzweig,M.C.,2016.Sequencing and cloning of antigen-specific antibodiesfrom mouse memory B cells.Nature protocols 11,1908-1923.)。
扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，重链、κ轻链可变区基因大小均约为300bp(图8A和8B)，切胶回收目的片段。将回收的目的片段插入pMD-19T载体中，进行序列测定。
单克隆抗体1B7的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:5所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；单克隆抗体2A9的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
单克隆抗体1B7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；单克隆抗体2A9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
单克隆抗体1B7的重链可变区包括氨基酸序列为GFNIKDTY的CDR1、氨基酸序列为IDPADGYT的CDR2、氨基酸序列为ARPGTLDY的CDR3；单克隆抗体2A9的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDFN的CDR1、氨基酸序列为INPNNGRS的CDR2、氨基酸序列为ARRHWDWYFDV的CDR3。
单克隆抗体1B7的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2、氨基酸序列为QHIRELTR的CDR3；单克隆抗体2A9的轻链可变区包括氨基酸序列为KSLLHSN的CDR1、氨基酸序列为QMS的CDR2、氨基酸序列为AQNLEFPWT的CDR3。
实施例2检测猪急性腹泻综合征冠状病毒与猪传染性胃肠炎冠状病毒的乳胶双联免疫层析试纸条的制备
1.结合垫的制备
1.1TGEV N蛋白单克隆抗体1B7和SADS-CoV N蛋白单克隆抗体6E8乳胶微球标记混合溶液的制备
取975μl 0.1M pH 5.6MES缓冲液加入2mL离心管中，再加入25μL固体含量为4％的乳胶微球(苏州为度生物科技有限公司)轻轻混匀；再加入10μL 20mg/mL EDC(购自sigma，货号：03449)和5μL 20mg/mL的NHS(购自sigma，货号：8045180025)，充分混匀后室温活化20min，17000r 20min离心；去除上清溶液，用1mL MES缓冲液充分重悬后再次17000r20min离心；同时加入80μg TGEV N蛋白单克隆抗体1B7和80μg SADS-CoV N蛋白单克隆抗体6E8，常温孵育2h；加入200μl 10w/v％BSA溶液进行封闭，常温孵育1h，17000r 10min离心后弃掉上清；最后用2mL乳胶微球标记物保护剂重悬；如果有明显无法混匀的沉淀，100W超声，超3s，停3s，共超声1min，4℃保存备用。
1.2乳胶微球结合垫的制备
在37℃～38℃条件下，将结合垫完全浸泡于结合垫封闭液(5％m/v蔗糖、1.5％m/vBSA、2％m/v Tween-20、1.5％m/v PVP-40和0.05％Krovin 300的超纯水溶液)中2h，取出置于烘箱中烘干2～4h。将制备的乳胶微球标记抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和抗SADS-CoVN蛋白的单克隆抗体6E8的标记混合溶液用喷膜仪均匀喷涂在结合垫上，置于37℃烘箱中干燥2～3h，密封保存。
抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8采用公开号为CN113956353A的发明的专利方法制备得到，单克隆抗体6E8的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.样品垫的制备
在37℃～38℃条件下，将样品垫浸泡于样品垫封闭液(2％ BSA、0.5％S17、2％PEG200000、0.5％酪蛋白酸钠和和0.05％Krovin 300的Tris-HCl溶液)中2h，取出置于烘箱中烘干2～4h，再置于铝箔袋中干燥备用。
3.硝酸纤维素膜的制备
将抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8(1mg/ml)和羊抗鼠IgG抗体(1mg/ml)间隔3mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线T1和质控线C；将抗TGEV蛋白单克隆抗体2A9(1mg/ml)喷在离抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体6E8(1mg/ml)5mm处，作为检测线T2。
4.试纸条的组装
在PVC底板上依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫进行连接，得到试纸条，按照试纸条卡壳的大小对试纸条进行切条，然后将切条后的试纸条装入试纸条卡壳中。其中试纸条的结构示意图如图9所示。
实施例3检测SADS-CoV/TGEV的乳胶双联免疫层析试纸条的应用
1.试纸条的使用方法
(1)检测：取出试纸条平衡至室温，将待检样品用样品稀释液1:5稀释，室温下，将100μl样品滴在样品垫上15min内观察结果；
(2)结果判定：若质控线C和检测线T1显色，而检测线T2不显色，则说明SADS-CoV呈阳性且TGEV呈阴性；若质控线C和检测线T2显色，而检测线T1不显色，则说明TGEV呈阳性且SADS-CoV呈阴性；若质控线C、检测线T1和T2均显色，则说明SADS-CoV和TGEV均呈阳性；若质控线C显色，检测线T1和T2均不显色，则呈阴性；若质控线C线不显色可判定为试纸条失效。如图10所示。
2.试纸条的敏感性
将TGEV(TCID50为107.8/0.1mL)的病毒液和SADS-CoV(TCID50为106.5/0.1mL)TCID50为1:5倍比稀释后，再进行2倍比稀释检测已建立的试纸条的敏感性。结果表明，当病毒以1:28倍稀释后检测值仍为阳性，1:29稀释后检测值为阴性。因此，本发明制备的试纸条的敏感性可达到1:28，即本发明方法最低病毒检测量TGEV为104.69TCID50/0.1mL，SADS-CoV为103.39TCID50/0.1mL，如图11所示。
3.试纸条的特异性
用试纸条检测TGEV、SADS-CoV、猪流行性腹泻冠状病毒(PEDV)和猪δ冠状病(PDCoV)，发现只检测SADS时T1显色呈阳性，而T2不显色呈阴性；同理只检测TGEV时T2显色呈阳性，而T1不显色呈阴性；上述说明两者无交叉。检测PEDV和PDCoV均不反应，说明本发明建立的该方法可以特异性识别TGEV和SADS-CoV，与其余容易混淆的猪腹泻冠状病毒无非特异性交叉反应，结果如图12所示。
4.稳定性试验
稳定性是现场应用的一个重要因素，将试纸条分别在室温(18～25℃)和4℃条件下保存，在第0、1、2、4、5、6、7个月时对试纸条进行稳定性试验，由表1可知，试纸条可在常温下稳定保存4个月，在4℃可稳定保存6个月。
表1试纸条稳定性检测结果
注：－：阴性；+、++、+++:阳性程度依次增强。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (10)

1.一种快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，所述试纸条包括PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上；其特征在于，所述结合垫上喷涂乳胶微球标记的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有质控线C和检测线T1和检测线T2，检测线T1线处包被抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体，检测线T2线处包被抗TGEV N蛋白的单克隆抗体B，质控线C线处包被羊抗鼠IgG；
所述抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A的重链可变区包括氨基酸序列为GFNIKDTY的CDR1、氨基酸序列为IDPADGYT的CDR2、氨基酸序列为ARPGTLDY的CDR3；抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2、氨基酸序列为QHIRELTR的CDR3；
抗TGEV N蛋白的单克隆抗体B的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDFN的CDR1、氨基酸序列为INPNNGRS的CDR2、氨基酸序列为ARRHWDWYFDV的CDR3；抗TGEV N蛋白的单克隆抗体B的轻链可变区包括氨基酸序列为KSLLHSN的CDR1、氨基酸序列为QMS的CDR2、氨基酸序列为AQNLEFPWT的CDR3。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDYA的CDR1、氨基酸序列为FSTYYGNA的CDR2和氨基酸序列为ARGGDYYGSSNVDYAMDY的CDR3，单克隆抗体6E8的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2和氨基酸序列为QHIRELTRCDR3。
3.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；抗TGEV N蛋白的单克隆抗体B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:5所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；抗TGEV N蛋白的单克隆抗体B的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
6.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫采用样品垫封闭液浸泡处理；所述样品垫封闭液为含有2% BSA、 0.5%S17、2%PEG20000及0.5%酪蛋白酸钠的Tris-HCl溶液。
7.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫的制备方法为：
将结合垫采用结合垫封闭液封闭处理；所述结合垫封闭液为含有5% m/v蔗糖、1.5% m/v BSA、2% m/v Tween-20和1.5% m/v PVP-40的超纯水溶液；
将乳胶微球用N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化后，离心，用MES缓冲液重悬，超声使乳胶微球充分分散，随后加入抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体，室温孵育，再加入封闭液进行封闭，室温孵育，离心；用乳胶微球标记物保护剂将沉淀重悬，即得抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体的乳胶微球标记混合溶液；
将上述制备的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体的乳胶微球标记混合溶液均匀喷涂在已封闭好的结合垫上。
8.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，所述乳胶微球标记物封闭液为含有10% m/v BSA的超纯水溶液；
所述乳胶微球标记物保护剂为含有3% m/v蔗糖、1% m/v PVP-40、1% v/v Tween-20的Tris-HCl溶液。
9.根据权利要求1所述的快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条，其特征在于，
所述检测线T1包被有1mg/ml SADS-CoV N蛋白单克隆抗体；
所述检测线T2包被有1mg/ml的TGEV N蛋白单克隆抗体B；
所述质控线C包被有1mg/ml的羊抗鼠IgG。
10.一种快速鉴别检测猪传染性胃肠炎与猪急性腹泻综合征的乳胶双联免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）制备样品垫和包被有权利要求1所述的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和权利要求2所述的抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体的乳胶微球标记的结合垫；
（2）将1mg/ml抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体和1mg/ml羊抗鼠IgG抗体间隔3mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线T1和质控线C；将1mg/ml权利要求1所述的抗TGEV蛋白单克隆抗体B喷在离抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体5mm处，作为检测线T2；抗SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体的浓度为1mg/ml；
（3）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上，得到鉴别检测TGEV与SADS-CoV乳胶双联免疫层析试纸条。
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