CN116515786A - 一种人tgm3乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人tgm3乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人TGM3乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用，所述人TGM3乙酰化多肽的序列为DVTDKYK(acetyl)YPEGSDC，所述抗原为所述人TGM3乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。所述抗体可特异性结合所述的人TGM3乙酰化多肽。本发明还提供一种检测试剂盒，可用于检测发生K441位点乙酰化修饰的人TGM3蛋白。本发明的人TGM3蛋白Lys441位点乙酰化抗体可用于检测正常细胞、肿瘤细胞以及用药后肿瘤细胞的表达差异，探讨人TGM3蛋白K441位点乙酰化对肿瘤细胞增殖、迁移侵袭等过程中的影响，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的治疗靶点，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

Description

一种人TGM3乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，特别涉及一种人TGM3乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是目前世界上最难解决的疾病之一，也就是人们常说的癌症。大数据显示全球恶性肿瘤的死亡率一直居高不下，即便某些肿瘤疾病被治疗过后，患者的预后也不理想。因此有很多学者在研究各种癌症的发病机制与机理，期望能够得到有效治疗各种癌症的方法。此外，对癌症的早期监测以及预后分析也尤为重要，它可以帮助医生尽早地发现患者患癌的风险概率，起到预警作用，从而使患者能够得到更早的治疗，提高生存概率。而预后析也是一种判断患者治愈后生存状况的科学手段。然而无论是对癌症的早期监测还是对患者的预后分析都离不开各种肿瘤标志物的作用，肿瘤标志物(TM)是指肿瘤组织和肿瘤细胞由于原癌基因或者抑癌基因和其他肿瘤相关基因及其产物异常表达所产生的抗原和生物活性物质。一般在正常人的组织细胞中也会有所表达，但在各类癌症患者的组织细胞中这些标志物的表达程度要高。目前肿瘤标志物的分类也无统一的分类和命名，但这些标志物可粗略地分为细胞标志物和体液标志物。
转谷氨酰胺酶TGM(transglutaminase)是一种依赖Ca2+的转谷氨酰胺酶，广泛存在于动植物体内，能够催化一种蛋白质中赖氨酸残基侧链和另一种蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺侧链之间的结合，从而形成不溶性大分子聚集体。目前已知人体中TGM家族有9种，包括TGM1、TGM2、TGM3等，TGM3首先在表皮系统中发现，能够催化蛋白质中谷氨酰胺和赖氨酸残基之间钙依赖性异肽交联的形成，以及多胺与蛋白质的结合。TGM3表达异常与许多肿瘤疾病相关，包括肝细胞癌、结直肠癌、食管鳞状细胞癌以及口腔癌等。Hu等人发现TGM3在肝细胞癌症患者体内高表达，且他们的预后较差。他们还发现TGM3表达降低可以抑制AKT和ERK的磷酸化，进而抑制肿瘤细胞凋亡和迁徙侵袭。Li等人通过研究NF-κB信号通路在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用，发现TGM3的过表达会通过该信号通路抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖并且能够诱导细胞凋亡。Wu等人发现外源性TGM3表达抑制口腔白斑细胞的增殖，并有可能向口腔鳞状细胞癌的方向恶化。以上的研究表明TGM3在肿瘤发生发展中有着重要作用。
蛋白质乙酰化修饰是指在乙酰基转移酶的作用下将乙酰基转接到蛋白质分子链上的一种蛋白质修饰过程。它属于蛋白质翻译后修饰的一种，包括组蛋白乙酰化和非组蛋白乙酰化，主要发生位点在赖氨酸上。蛋白质乙酰化修饰会影响蛋白质的功能作用的发挥，比如酶的活化与失活、蛋白质稳定性、亚细胞结构定位和特殊功能复合体的形成等。组蛋白中的H3、H4发生乙酰化修饰可以激活基因转录。组蛋白乙酰化除了可以激活特定基因的转录过程外，还是一个可逆的动态调节过程，维持这种可逆的乙酰化过程对于稳定染色质的结构和调控基因表达有着至关重要的作用。非组蛋白乙酰化也参与了与生理学和疾病相关的关键细胞过程，如基因转录、DNA损伤修复、细胞分裂、信号转导、蛋白质折叠、自噬和代谢。总之，对非组蛋白乙酰化修饰与肿瘤发生的研究加深了对肿瘤发生机制的认识，对肿瘤的治疗提供了新思路和新靶点。
TGM3蛋白乙酰化修饰属于非组蛋白乙酰化修饰，同样也受到赖氨酸乙酰基转移酶(KATs)的调控，目前研究表明KATs主要包括CCN5、P300以及MYST三种乙酰化酶家族。
近年来越来越多的研究表明乙酰化修饰是一种比较保守的蛋白质翻译后修饰。且这个过程受到赖氨酸乙酰化酶和去乙酰化酶的调控，是一个可逆的过程。TGM3在很多肿瘤疾病当中，与正常组织的表达情况相比都呈现出一定的差异。目前，有人发明了涉及一种新的可与人食管癌细胞天然膜抗原结合的单克隆抗体，该单克隆抗体可与具有转移能力的人食管癌细胞系EC-9706细胞膜表面的天然抗原结合，以及与人食管癌细胞系YES2细胞膜表面的天然抗原结合，体外可以显著抑制人食管癌细胞系细胞的增殖、迁移、粘附和侵袭，体内显著抑制人食管癌细胞转移。然而与TGM3相关的乙酰化抗体目前尚无已知的研究。
抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，乙酰化抗体的制备和应用逐渐成为国际上关注的热点。但是目前仍缺乏用来检测人TGM3蛋白的氨基酸序列中Lys441位点乙酰化状态的抗体。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种针对TGM3蛋白K441乙酰化位点的抗原多肽，可特异性识别人肿瘤细胞表达的TGM3蛋白K441乙酰化位点的多克隆抗体以及其制备方法和应用。
本发明提供一种人TGM3乙酰化多肽，所述人TGM3乙酰化多肽的序列为DVTDKYK(acetyl)YPEGSDC，其中K(acetyl)表示人TGM3蛋白K441位点氨基酸乙酰化赖氨酸。所述抗原多肽为人TGM3蛋白第441位赖氨酸位点的附近14肽作为候选多肽筛选得到，其中该K441位点的赖氨酸为乙酰化状态。
本发明提供一种抗原，所述抗原为所述人TGM3乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。
进一步的，所述载体蛋白选自KLH、OVA、THY或BSA。
本发明还提供一种抗体，所述抗体可特异性结合所述的人TGM3乙酰化多肽。所述抗体是针对人TGM3蛋白K441位点氨基酸乙酰化的抗体，其中所述抗体制备中采用了由以下氨基酸序列组成的抗原多肽，其具体序列为：DVTDKYK(acetyl)YPEGSDC，其中K(acetyl)表示人TGM3蛋白K441位点氨基酸乙酰化赖氨酸。
进一步的，所述抗体选自多克隆抗体或其经过化学手段或酶消化处理后可仍然保持结合所述人TGM3乙酰化多肽的性质的抗体片段。
进一步的，所述多克隆抗体为利用DVTDKYK(acetyl)YPEGSDC和载体蛋白的偶联物免疫非人动物接着纯化提取所述非人动物的血清后获得的。
进一步的，所述抗体可用于人TGM3蛋白K441乙酰化位点的乙酰化水平检测。
本发明还提供所述抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)对TGM3蛋白第441位点附近赖氨酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段多肽序列；人工合成所述的人TGM3乙酰化多肽；
(2)将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫非人动物；
(3)经过五次免疫的非人动物血清用ELISA法对抗体效价进行检测，收集免疫非人动物血清，并用多肽包被的溴化氰活化的琼脂糖亲和纯化柱纯化抗体；
(4)对纯化后抗体进行ELISA、免疫组化鉴定。
本发明还提供所述的人TGM3乙酰化多肽或所述的抗原或所述的抗体在制备用于特异性癌细胞检测的试剂或试剂盒中的应用。所述的癌细胞优选为人食管癌细胞。
本发明还提供一种检测试剂盒，包括所述的抗体、抗原修复液、PBS缓冲溶液、内源性过氧化物酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。所述抗原修复液为EDTA(1X)抗原修复液；所述PBS缓冲溶液pH为7.4；所述阻断剂为内源性过氧化物酶阻断剂，如3％H2O2；所述环保透明剂为Van-Clear环保透明剂。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
本发明采用人工设计和合成含有一段TGM3蛋白K441乙酰化位点的抗原多肽，并制备对应的多克隆抗体。该多克隆抗体经过ELISA等鉴定可特异性识别TGM3蛋白K441乙酰化位点，并且相对于癌旁组织其在多种癌组织细胞中高表达，其差异具有统计学意义。本发明的乙酰化多克隆抗体可特异性识别TGM3蛋白K441乙酰化位点，可用于检测肿瘤细胞该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的流程示意图。
图2为本发明实施例1中DNAstar软件分析人TGM3蛋白亲水性、疏水性以及抗原性的结果。
图3为本发明实施例4的ELISA实验检测结果。
图4为本发明实施例5的免疫组化实验过后的食管癌切片观察结果。
图5是免疫组化评分差异结果，所使用数据为食管癌芯片免疫组化数据。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1TGM3蛋白K441乙酰化多肽的设计及合成
(1)TGM3氨基酸序列
根据UniProt数据库获得人TGM3蛋白氨基酸序列(Q08188)如下：
1MAALGVQSIN WQTAFNRQAH HTDKFSSQEL ILRRGQNFQV LMIMNKGLGS NERLEFIVST
61GPYPSESAMT KAVFPLSNGS SGGWSAVLQA SNGNTLTISI SSPASAPIGR YTMALQIFSQ
121GGISSVKLGT FILLFNPWLN VDSVFMGNHA EREEYVQEDA GIIFVGSTNR IGMIGWNFGQ
181FEEDILSICL SILDRSLNFR RDAATDVASR NDPKYVGRVL SAMINSNDDN GVLAGNWSGT
241YTGGRDPRSW NGSVEILKNW KKSGFSPVRY GQCWVFAGTL NTALRSLGIP SRVITNFNSA
301HDTDRNLSVD VYYDPMGNPL DKGSDSVWNF HVWNEGWFVR SDLGPSYGGW QVLDATPQER
361SQGVFQCGPA SVIGVREGDV QLNFDMPFIF AEVNADRITW LYDNTTGKQW KNSVNSHTIG
421RYISTKAVGS NARMDVTDKY KYPEGSDQER QVFQKALGKL KPNTPFAATS SMGLETEEQE
481PSIIGKLKVA GMLAVGKEVN LVLLLKNLSR DTKTVTVNMT AWTIIYNGTL VHEVWKDSAT
541MSLDPEEEAE HPIKISYAQY EKYLKSDNMI RITAVCKVPD ESEVVVERDI ILDNPTLTLE
601VLNEARVRKP VNVQMLFSNP LDEPVRDCVL MVEGSGLLLG NLKIDVPTLG PKEGSRVRFD
661ILPSRSGTKQ LLADFSCNKF PAIKAMLSID VAE
以上结果表明，人TGM3蛋白含有693个氨基酸。
(2)用DNAstar软件分析人TGM3蛋白特性(表1)：
表1
Analysis Whole Protein
Molecular Weight 76632.01m.w.
Length 693
1microgram＝ 13.049pMoles
1A(280)＝ 0.67mg/ml
Isoelectric Point 5.65
Charge at pH 7 -7.87
经过上述分析，本申请选用的多肽序列为DVTDKYKYPEGSDC。
图2是采用DNAstar软件分析人TGM3蛋白亲水性、疏水性以及抗原性，此多肽序列位于TGM3蛋白第441位赖氨酸附近，在此处其抗原性、亲水性及表面可及性较强，疏水性较弱。TGM3氨基酸序列中Lys441位点位于TGM3的胞内段序列区，是TGM3蛋白乙酰化修饰的一个位点，该抗体可以用于对TGM3该位点进行特异性检测，使得在研究TGM3乙酰化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中起到何种促进或抑制的作用提供了一种可靠的工具手段。
实施例2多肽合成及与载体蛋白偶联
为便于与载体蛋白偶联，合成多肽在C端加入一个半胱氨酸，而且第441位赖氨酸为乙酰化状态：DVTDKY-K(AC)-YPEGSDC。同时合成一段含有非乙酰化的第441位赖氨酸多肽序列：DVTDKYKYPEGSDC作为对照。多肽由百远生物科技(苏州)有限公司合成。
一、多肽合成流程：
A：多肽合成：采用固相合成法合成，即先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以该结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链，重复操作，直到达到所要合成的肽链长度为止，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。
B：纯化：RP-HPLC纯化
①HPLC条件：
流动相：A)0.1％TFA水溶液；
0.1％TFA乙腈溶液；
梯度：A/B(90/40)到A/B(40/90)30min；
流速：1ml/min；
温度：室温(23℃)检测：214nm的紫外光；
样品：冻干的粗品；
②步骤：
a.将粗品溶解在流动相中；
b.注入20-30mg(2-2.5ml)样品；
c.将主峰收集到50mL管中；
d.冻干；
③鉴定：LC/MS
条件：
流动相：A)0.05％TFA水溶液B)0.1％TFA乙腈溶液；
梯度：A/B(90/10)到A/B(40/60)15min；
流速：1ml/min；温度：室温(23℃)；
检测：214nm的紫外光；
MS API：ESI。
表2多肽合成结果
多肽合成号 多肽序列 多肽纯度(％)
20072403 DVTDKY-K(AC)-YPEGSDC 95.62％
20072413 DVTDKYKYPEGSDC 97.61％
二、多肽与载体蛋白偶联
化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)，卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽交联载体。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。
多肽偶联流程：
a.溶液准备：偶联缓冲液包括Na2HPO4，NaH2PO4，NaCl，EDTA，调pH至7.2；
b.实验步骤：
1)柱床准备：纯水及偶联缓冲液洗涤柱床；
2)多肽准备：少量DMF溶解多肽，静置半小时，待溶液中无颗粒状不溶物，加适量AH液配制成6mg/ml的多肽溶液，从多肽溶液中分出需要偶联的量；
3)KLH、Sulfo-SMCC准备：根据质量比，偶联多肽总量：纯KLH＝1：1，计算出纯KLH的量，按照质量比，纯KLH：Sulfo-SMCC＝10：1，计算出Sulfo-SMCC的量；
4)KLH和Sulfo-SMCC反应与反应物收集：将称取的KLH溶于适量的AH液配置成终浓度10mg/ml，Sulfo-SMCC用DMSO溶解成100mg/ml的溶液，将二者混合摇匀，室温反应4h并间断混摇使其充分反应，用层析柱分离样品；
5)KLH与Sulfo-SMCC的反应物与多肽偶联：向每一管需偶联多肽中加入相应量KLH与Sulfo-SMCC反应物，室温反应2h或室温过夜，并用垂直混合仪混匀，将偶联好的多肽至于-20℃保存。
注：使用KLH载体蛋白偶联合成多肽，所得偶联肽作免疫抗原用。
实施例3抗MMP9多肽兔多克隆抗体制备
(1)免疫与采血：
(2)抗体效价ELISA检测方法
①血清ELISA检测：
a.溶液准备：
包被液：50mM Na2CO3(pH9.6)，20mM Tris-HCl(pH8.5)或10mM PBS(pH7.4)；
封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等；
洗涤液：PBST或纯水
b.实验步骤：
1)将抗原按适当浓度溶解于包被液中；
2)在对应的孔中加入100μl抗原，4℃过夜；
3)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
4)每孔加200μl封闭液，37℃孵育1小时；
5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
6)每孔加100μl一抗，37℃孵育1小时；
7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
8)每孔加100μl二抗，37℃孵育1小时；
9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；
10)拍干孔中残留液体，每孔加100μl显色液，37℃避光显色10min；
11)每孔加50μl 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm的OD值。
c.血清ELISA检测结果：
注：以上兔号混合血清ELISA显示转阳(1：27000，OD值>1.0)，进行抗原亲和纯化并进行ELISA抗体鉴定。
②抗体亲和纯化结果：
③抗体ELISA结果
项目CS10014免疫的R01647血清及抗体(SA201124X03)ELISA检测(与乙酰化抗原反应)均为阳性，且抗体在浓度为0.125μg/ml时与乙酰化抗原(20072403)的反应大于与非乙酰化抗原(20072413)反应值的5倍，目前共有合格抗体5.285mg。
项目CS10014免疫的R01648血清及抗体(SA201125X03)ELISA检测(与乙酰化抗原反应)均为阳性，且抗体在浓度为0.125μg/ml时与乙酰化抗原(20072403)的反应大于与非乙酰化抗原(20072413)反应值的5倍，目前共有合格抗体17mg。
以上结果表明本实施例制备的抗体效果良好，制备成功。
实施例4抗TGM3(ACK458)多克隆抗体的ELISA鉴定
一、ELISA实验步骤
(1)将多肽TGM3-Lys441(Lys441未乙酰化的对照组)和acTGM3-Lys441(Lys441乙酰化处理的实验组)，用1×CBS包被液溶解成0.2μg/100μl，铺至每个酶标板的孔中100μl，4℃过夜包被。
(2)第二天取出包被好的酶标板，甩干包被液，拍板。
(3)加封闭液(3％BSA)，每个孔加200μl，37℃孵育2h。
(4)封闭完毕后，取出酶标板，洗板三次，每个孔中加入300μl的PBST静置2min后甩干(避免孔与孔之间的污染)，将板拍在干净的纱布上，将孔内的液体拍干为佳。
(5)可直接进行下一步实验，也可用自封袋包装好，4℃保存备用。
(6)将TGM3一抗以1:4000的稀释浓度，加入每孔100μl，37℃孵育1h。
(7)1h后将酶标板取出，洗板三次后加入HRP二抗，37℃孵育30min。
(8)30min后将酶标板取出，洗板三次后加入TMB显色剂37℃避光孵育15min。
(9)15min后将酶标板取出(变蓝)，立即加入终止液，酶标仪震荡30s，450nm读数，分析结果。
二、ELISA实验检测抗体acTGM3-Lys441为特异性乙酰化位点抗体
鉴于TGM3-Lys441位点的乙酰化尚未见相关报道，因此委托公司定制了acTGM3-Lys441抗体，ELISA实验检测acTGM3-Lys441抗体是否为特异性乙酰化位点抗体。结果显示，acTGM3-Lys441抗体与acTGM3-Lys441抗原结合的OD值是明显大于acTGM3-Lys441抗体与非乙酰化acTGM3-Lys441抗原结合的OD值(图3)，并且acTGM3-Lys441抗体与acTGM3-Lys441抗原结合的OD值是随着抗体浓度的稀释而减小的，结果提示该acTGM3-Lys441抗体为特异性的acTGM3-Lys441位点的抗体。
实施例5抗TGM3(K441)多克隆抗体的组织免疫组化鉴定
一、实验步骤：选用食管癌组织芯片进行免疫组化，验证ac TGM3-Lys441抗体在癌、癌旁组织中的表达差异。
1、放入60℃烤箱烤片2小时。
2、切片脱蜡水化程序
(1)环保透明剂摇床脱蜡10分钟3次；
(2)100％—95％—85％—75％—50％乙醇各浸泡5分钟。
3、超纯水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。
4、抗原热修复：将EDTA(1X)抗原修复液与微波盒中将热至沸腾，将石蜡切片放入放入沸腾的抗原修复液中，中档微波处理20 30分钟。
5、停止加热，室温冷却20 30分钟。
6、将抗原修复后切片置超纯水，浸泡2次各3分钟，之后用PBS摇洗3次各3分钟。
7、将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3％H2O2，避光室温孵育15分钟。PBS缓冲液摇洗3次各5分钟。
8、取出切片，滴加一抗60μl，滴加一抗后放入专用孵育盒内，4℃冰箱过夜。
9、第二天，取出切片复温30分钟，随后放入PBS缓冲液中清洗3次各5分钟，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色。(前两次的PBS倒掉)。
10、擦干组织周围液体后滴加60μl辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物(根据实际情况要求覆盖样本)，室温孵育20分钟，PBS缓冲液洗涤3分钟×3次。
11、显色，滴加现配适量DAB显色剂，室温显色,5 20分钟。自来水终止显色。
12、复染，苏木素染液中染色5-10分钟，水洗，将切片置于盐酸乙醇快速分化液浸泡15秒左右，继续水洗，将切片至于0.5％氨水中10秒，水洗。
13、将切片依次置于75％乙醇85％乙醇95％乙醇100％乙醇中各3分钟。
14、取出后将切片依次置于透明剂浸泡5分钟3次。
15、中性树胶封片，光学显微镜下观察。
二、抗TGM3(acK441)多克隆抗体的组织免疫组化鉴定结果
将免疫组化实验过后的食管癌切片于镜下观察(如图4所示)，比较抗TGM3(acK441)多克隆抗体在癌、癌旁组织中的表达，可见癌组织于胞浆或胞核中可见棕黄色，呈阳性。癌旁组织于胞浆或胞核中可见蓝色，呈阴性。结果提示抗TGM3(acK441)多克隆抗体在癌组织中表达、癌旁组织中的不表达，两者存在明显差异。对于食管癌芯片180个点的癌与癌旁做统计分析，使用日本滨松数字病理扫描仪进行芯片扫描，使用image Pro plus软件进行染色强度评分。本实施例对于癌组织的TGM3-K441乙酰化蛋白表达量进行了ROC分析，选取了特异性和敏感性程度最高的点作为划分标准，对于高低表达分组进行了划分。Kaplan-Meier生存分析结果显示如图5所示，在癌组织中，TGM3-K441乙酰化蛋白表达量高时，患者生存时间明显延长，P＝0.018。
上述实验结果证明本发明的乙酰化多克隆抗体可特异性识别TGM3蛋白acK441乙酰化位点，可用于检测肿瘤细胞例如食管癌等该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
实施例6一种检测试剂盒
所述试剂盒包括如下组分：实施例3制备得到的抗体、抗原修复液、PBS缓冲溶液、酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。
所述抗原修复液可为EDTA(1X)抗原修复液；所述PBS缓冲溶液pH为7.4；所述阻断剂为内源性过氧化物酶阻断剂，如3％H2O2；所述环保透明剂为Van-Clear环保透明剂。
本实施例还提供上述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)将待检测组织常规石蜡切片，经过环保透明剂，乙醇分别摇床脱蜡，超纯水漂洗；
(2)将抗原修复液加热至沸腾，将石蜡切片放入放入沸腾的抗原修复液中，中高档微波处理，室温冷却后置于超纯水中浸泡，之后用PBS摇洗3次；
(3)将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3％H2O2，避光室温孵育，PBS缓冲液摇洗；
(4)取出切片，滴加经过稀释的针对人TGM3蛋白K441位点的乙酰化抗体(实施例3制备的)，放入孵育盒内，4℃冰箱过夜，放入PBS缓冲液中充分洗涤；
(5)擦干组织周围液体后滴加辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育，PBS缓冲液洗涤，滴加现配适量DAB显色剂，室温显色，自来水终止显色，苏木素染液中染色，水洗后将切片置于0.5％氨水中浸泡，继续水洗；
(6)将切片依次置于乙醇中，取出后将切片置于透明剂，用中性树胶封片，光学显微镜下观察。
本发明制备得到的高特异性的人TGM3蛋白Lys441位点乙酰化抗体可用Westernblot实验检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，有助于研究TGM3蛋白的乙酰化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点。
本发明选择了TGM3蛋白包含第441位赖氨酸位点(K441)的附近14肽作为候选多肽，并用人工方法进行包含(AC)K441的多肽合成及完全抗原制备。对TGM3蛋白第441位点附近氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段肽序列进行人工合成；将合成的多肽应用RP-HPLC法进行纯化，将纯化后的产物免疫新西兰兔：并用多肽包被的溴化氰活化的琼脂糖(CNBr-activated sepharose)亲和纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别TGM3蛋白K441乙酰化位点，可用于检测肿瘤细胞该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人TGM3乙酰化多肽，其特征在于，所述人TGM3乙酰化多肽的序列为DVTDKYK(acetyl)YPEGSDC，其中acetyl表示乙酰化。
2.一种抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1的人TGM3乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。
3.根据权利要求2所述的抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自KLH、OVA、THY或BSA。
4.一种抗体，其特征在于，所述抗体可特异性结合权利要求1所述的人TGM3乙酰化多肽。
5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自多克隆抗体或其经过化学手段或酶消化处理后可仍然保持结合所述人TGM3乙酰化多肽的性质的抗体片段。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述多克隆抗体为利用DVTDKYK(acetyl)YPEGSDC和载体蛋白的偶联物免疫非人动物接着纯化提取所述非人动物的血清后获得的。
7.根据权利要求4-6任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体可用于人TGM3蛋白K441乙酰化位点的乙酰化水平检测。
8.权利要求4-7任一项所述的抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)人工合成权利要求1所述的人TGM3乙酰化多肽；
(2)将合成的多肽与载体蛋白偶联，将偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫非人动物；
(3)经过四次免疫的非人动物血清对抗体效价进行检测，收集免疫非人动物血清，并纯化抗体；
(4)对纯化后抗体进行检测。
9.权利要求1所述的人乙酰化TGM3多肽或权利要求2-3任一项所述的抗原或权利要求4-7任一项所述的抗体在制备用于癌细胞检测的试剂或试剂盒中的应用。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求4-7任一项所述的抗体、抗原修复液、PBS缓冲溶液、酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。
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