CN116509886A - miR-214-3p在制备降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物中的应用 - Google Patents
miR-214-3p在制备降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了miR‑214‑3p在制备降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物中的应用。经过验证分析，miR‑214‑3p过表达的染尘巨噬细胞来源的外泌体的促炎和促纤维化作用降低。使用miR‑214‑3pagomir治疗硅肺小鼠，可降低硅肺炎症水平和纤维化程度。体内实验中使用miR‑214‑3p治疗硅肺小鼠可降低SiO2诱导的小鼠肺纤维化和炎症反应。
Description
技术领域
本发明涉及miR-214-3p在制备降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物中的应用。属于生物医药技术领域。
背景技术
硅肺是一种预后较差的传统职业病，是尘肺中最常见的一种类型，通常由长期吸入游离二氧化硅粉尘(SiO2)引起。硅肺的特征包括广泛的硅结节形成、慢性炎症、成纤维细胞异常活化和细胞外基质(ECM)过度沉积，最终导致肺组织结构异常和不可逆的肺衰竭。硅结节的形成和弥漫性组织纤维化是其主要病理特征。患者大部分在接触SiO2粉尘10～15年后发病，即使远离SiO2粉尘接触后，肺部病变仍持续进展。持续吸入高浓度、高游离的SiO2粉尘，1～2年后可发病，称为“速发型硅肺”。需要在细胞和分子水平上进一步扩大对硅肺的认知，并寻找和改进硅肺的治疗方案进而改善其预后。
肺泡巨噬细胞和成纤维细胞在硅肺发病过程中起重要作用。肺泡巨噬细胞首先识别并捕获吸入的二氧化硅粉尘，进而激活炎症小体，合成和分泌一系列的促炎因子。各种促炎和促纤维化因子如转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)被释放和激活后，诱导成纤维细胞分化为活化的肌成纤维细胞，促进成纤维细胞募集和增殖，导致胶原纤维过度累积，最终导致肺纤维化。迄今为止，巨噬细胞和成纤维细胞之间的相互交流，以及这些细胞如何相互通信以应对硅肺中SiO2暴露的压力，尚未完全阐明。此外，非特异性抗炎或抗纤维化治疗在临床也没有取得很好的治疗效果。因此，研究巨噬细胞和成纤维细胞之间的通讯方式并从中寻找有效的治疗靶点是本课题的重点。
外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡，其直径在30-200nm之间。研究表明，外泌体可以介导细胞间的通讯，穿越完整的生物屏障将各种生物活性物质传递至受体细胞，调节细胞间的微环境，它们被认为是局部和远距离细胞间通信的重要介质。外泌体通过携带各种细胞货物，如核酸、脂质和蛋白质等，广泛参与各种生物过程，如肿瘤进展、免疫反应、心力衰竭、糖尿病等。因此外泌体研究引起了科研工作者浓厚的兴趣。在生理或病理条件相似的不同细胞中可以发现不同类型的外泌体成分，其中的各种蛋白质、mRNA及miRNA等的变化在疾病的诊断、治疗和监控等方面发挥重要作用。miRNA是短的非编码RNA，其作为外泌体携带的主要信号分子之一，可以调节多种生物学过程。2007年Valadi等人最早证明了mRNA和miRNA可以从人或小鼠肥大细胞的外泌体中分泌出来，并转移到其他细胞中，在新的位置发挥其功能。miRNA通过与靶基因的3’UTR不完全配对结合，在转录后水平调控靶基因的表达，降低mRNA的稳定性或抑制靶基因的翻译，几乎参与了机体所有生理以及病理过程。目前关于硅肺病人血浆外泌体的miRNA表达谱仍不清楚，因此本课题组拟构建SiO2诱导的小鼠硅肺模型，分离血浆中的外泌体，并进行外泌体miRNA的差异表达分析，为后续研究奠定基础。此外，最近的研究揭示了外泌体是慢性肺部疾病发病机制中的重要介质。例如，在特发性肺纤维化中，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的外泌体分泌水平增加，并作为蛋白质/miRNA的载体，促进肺纤维化进展。
我们前期的研究表明，在硅肺进展过程中，染尘巨噬细胞分泌的外泌体(SiO2-Exos)数目明显增加，这些外泌体能促进成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化，促进成纤维细胞增殖和迁移。在体内研究中，抑制外泌体分泌可降低肺泡灌洗液中炎症因子水平，减轻硅肺纤维化程度。然而，肺泡巨噬细胞来源的外泌体中的何种细胞成分参与了这一过程，是否存在潜在的治疗靶点目前尚未探索。因此从新的角度探索硅肺纤维化病变发生的分子机制并寻找有效治疗靶点，已成为迫切的需要。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供miR-214-3p在制备降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、miR-214-3p在制备降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物中的应用。
优选的，所述药物通过过表达miR-214-3p降低巨噬细胞中炎症因子表达，从而降低硅肺炎症水平。
进一步优选的，所述炎症因子包含：TNF-α，IL-1β，IL-6。
优选的，所述药物通过过表达miR-214-3p降低肌成纤维细胞表型转化、增殖和迁移，从而减缓纤维化进展。
2、一种降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物，其有效成分为miR-214-3p agomir。
本发明的有益效果：
本申请在小鼠血浆外泌体miRNA表达谱中筛选出35个表达上调miRNA分子，5个表达下调的miRNA分子，其中包括miR-214-3p。经过验证分析，miR-214-3p在硅肺小鼠血浆外泌体，硅肺组织，染尘巨噬细胞及其分泌的外泌体中都呈表达下调的趋势。在染尘巨噬细胞中恢复miR-214-3p表达，可降低炎症因子IL-1β表达水平。染尘巨噬细胞来源的外泌体具有促炎和促纤维化作用，而当恢复miR-214-3p表达后，miR-214-3p过表达的染尘巨噬细胞来源的外泌体的促炎和促纤维化作用降低。使用miR-214-3p agomir治疗硅肺小鼠，可降低硅肺炎症水平和纤维化程度。
申请人发现SiO2-Exos中miR-214-3p表达降低，miR-214-3p可以抑制M0巨噬细胞向M1巨噬细胞分化，降低炎症因子表达水平，同时可抑制肌成纤维细胞分化、增殖和迁移。体内实验中使用miR-214-3p治疗硅肺小鼠可降低SiO2诱导的小鼠肺纤维化和炎症反应。
综上所述，miR-214-3p可作为硅肺的潜在治疗靶点。
附图说明
图1是miR-214-3p在硅肺小鼠血浆外泌体中表达下调。A.生理盐水对照组和硅肺小鼠血浆外泌体中miRNA表达热图。B.RT-PCR检测miR-214-3p在硅肺小鼠血浆外泌体中表达情况。Student’s t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2是miR-214-3p在硅肺组织和肺泡巨噬细胞及其外泌体中表达下调。A.RT-PCR检测miR-214-3p在硅肺小鼠肺组织中的表达水平。B.RT-PCR检测miR-214-3p在硅肺小鼠肺泡巨噬细胞中的表达水平。C.RT-PCR检测miR-214-3p在RAW264.7巨噬细胞中的表达水平。D.RT-PCR检测miR-214-3p在RAW264.7巨噬细胞来源的外泌体中的表达水平。Student’s t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3是过表达miR-214-3p可降低巨噬细胞中炎症因子表达。A.RT-PCR检测RAW264.7巨噬细胞中IL-1β的表达水平，Student’s t检验。B.WB检测RAW264.7巨噬细胞中IL-1β的表达水平。C.显微镜下观察RAW264.7巨噬细胞的形态。D.RT-PCR检测RAW264.7巨噬细胞中IL-1β，IL-6，TNF-α和IL-10的表达水平，Two-way ANOVAI检验。比例尺：50μm。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n.s：not significant，差异不显著。
图4是过表达miR-214-3p可降低肌成纤维细胞表型转化、增殖和迁移。A.构建RAW264.7巨噬细胞和NIH/3T3成纤维细胞共培养体系，RT-PCR检测NIH/3T3成纤维细胞中α-SMA的表达水平。B.RT-PCR检测共培养体系中NIH/3T3成纤维细胞中I型胶原表达水平。C.RT-PCR检测共培养体系中NIH/3T3成纤维细胞中III型胶原表达水平。D.提取RAW264.7巨噬细胞上清中的外泌体并将其与NIH/3T3成纤维细胞共培养，RT-PCR检测NIH/3T3成纤维细胞中α-SMA的表达水平。E.RT-PCR检测外泌体处理的NIH/3T3成纤维细胞中I型胶原表达水平。F.RT-PCR检测外泌体处理的NIH/3T3成纤维细胞中III型胶原表达水平。G.WB检测外泌体处理的NIH/3T3成纤维细胞中I型胶原，III型胶原和α-SMA表达水平。H.CCK8检测外泌体处理的NIH/3T3成纤维细胞的增殖能力。Two-way ANOVAI检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。I.伤口愈合实验检测外泌体处理的NIH/3T3成纤维细胞的迁移能力。比例尺：200μm。PCR数据分析采用Student’s t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n.s：notsignificant，差异不显著。
图5是使用miR-214-3p治疗硅肺小鼠可降低SiO2诱导的小鼠肺纤维化和炎症反应。A.小鼠肺功能检测肺阻力(RL)。B.小鼠肺功能检测动态肺顺应性(Cdyn)。C.Elisa检测肺泡灌洗液中IL-1β表达。D.Elisa检测肺泡灌洗液中IL-6表达。E.Elisa检测肺泡灌洗液中TNF-α表达。F.H&E染色观察肺组织结构，Masson染色观察肺组织中胶原沉积情况，免疫组化检测肺组织中α-SMA表达水平。G.WB检测肺组织中I型胶原表达水平。比例尺：100μm。Student’s t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n.s：not significant，差异不显著。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
方法：
首先构建28天硅肺小鼠模型，收集小鼠血清提取外泌体，提取外泌体中miRNA分子进行高通量测序，筛选出差异表达的miR-214-3p分子并进行差异表达验证。接着在体外染尘巨噬细胞中过表达miR-214-3p，Elisa检测细胞上清中炎症因子IL-1β表达，WB检测巨噬细胞中IL-1β表达。将过表达miR-214-3p的染尘巨噬细胞来源的外泌体与M0巨噬细胞共培养，RT-PCR检测巨噬细胞中炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10表达。将过表达miR-214-3p的染尘巨噬细胞与胚肺成纤维细胞共培养，RT-PCR检测成纤维细胞中肌成纤维细胞标志分子(α-SMA和I型胶原)表达。提取过表达miR-214-3p的染尘巨噬细胞的细胞上清中的外泌体，并将其与胚肺成纤维细胞共培养，RT-PCR和WB检测成纤维细胞中α-SMA，I型胶原和III型胶原表达，伤口愈合实验检测成纤维细胞迁移能力，CCK8实验检测成纤维细胞增殖能力。通过尾静脉注射miR-214-3p agomir构建28天硅肺小鼠治疗模型，检测小鼠肺功能，HE和masson染色检测肺组织纤维化程度，免疫组化检测α-SMA表达，WB检测肺组织中I型胶原表达，Elisa检测肺泡灌洗液中TNF-α，IL-1β和IL-6表达。
结果：
1.硅肺小鼠血清外泌体中miR-214-3p分子表达下调，肺泡巨噬细胞和体外染尘巨噬细胞及其分泌的外泌体中miR-214-3p分子表达下调。
2.与对照组相比，在体外染尘巨噬细胞中过表达miR-214-3p后，IL-1β表达下调；与miR-NC mimic组相比，过表达miR-214-3p的染尘巨噬细胞来源的外泌体处理组的巨噬细胞中TNF-α，IL-1β，IL-6表达下调，IL-10表达无差异。
3.在共培养体系中，与对照组相比，过表达miR-214-3p的染尘巨噬细胞组的成纤维细胞中α-SMA和I型胶原表达下调。
4.和miR-NC mimic组相比，与过表达miR-214-3p的染尘巨噬细胞来源的外泌体共培养的成纤维细胞中α-SMA和I型胶原表达下调，成纤维细胞迁移和增殖能力下降。5.在miR-214-3p agomir治疗模型中，小鼠肺功能中气道阻力降低，肺顺应性增加。HE、masson染色、免疫组化和WB检测结果显示肺组织纤维化程度降低，肺泡灌洗液中TNF-α，IL-1β和IL-6表达下调。
结论：
miR-214-3p能有效降低硅肺炎症水平和减缓纤维化进展。
实施例：
1.构建动物模型
(1)120只6-8周的SPF级C57BL/6雄性小鼠(购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，体重18g±2g，饲养于中南大学实验动物学部SPF级动物饲养室内，饲养室恒温25℃±2℃，昼夜交替。采用完全随机分组的方法将小鼠分为对照组和SiO2组，每笼五只，饲养一周以适应环境后进行造模。所有操作和处理均遵循中南大学实验动物伦理指南。
(2)术前准备：将锡箔纸包好的1g SiO2粉末于180℃烘烤16h，以灭菌和灭活内毒素。用10ml无菌生理盐水配制成100mg/ml的悬浊液，于冰上间断超声震荡10分钟以充分混匀。用无菌生理盐水配置质量浓度0.3％戊巴比妥钠溶液。通过高温高压将所有手术器械，马克笔，记录本等传入屏障内，质量浓度0.3％戊巴比妥钠溶液、100mg/ml SiO2悬浊液则通过紫外照射30分钟传入屏障内，纱布、无菌手套、铺巾，棉球、生理盐水、1ml胰岛素注射器、碘酒和75％酒精由动物学部提供。
(3)造模：腹腔注射质量浓度0.3％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，用量为30mg/kg。待麻药起效后将小鼠四肢和头部固定于小鼠固定板上，充分暴露颈部后，碘酒消毒颈部皮肤，利用眼科剪剪开颈部皮肤并钝性分离肌肉和结缔组织，用小镊子固定在气管两侧以充分暴露气管，用1ml注射器将100mg/ml的SiO2悬液缓慢滴注进气管内(100mg/kg)，对照组滴注等量生理盐水，滴注完成后缝合皮肤，消毒，然后将小鼠固定板垂直竖起保持5分钟，保证SiO2悬浊液顺利进入小鼠肺部，暖灯保暖以等待小鼠麻醉苏醒。造模后饲养28天。
(4)构建miR-214-3p agomir硅肺小鼠治疗模型：将15只6-8周的C57BL/6雄性小鼠随机分成3组，空白对照组，miR-NC agomir治疗组，和miR-214-3pagomir治疗组，每组5只。按照前面步骤进行小鼠硅肺造模，于造模后第10天通过尾静脉注射100μl miR-NC agomir或miR-214-3p agomir(10nM/只，生理盐水配制)，空白对照组注射等量的生理盐水，每3天注射1次，一共注射4次。造模28天后处死小鼠，取肺泡灌洗液和肺组织。
2.收集小鼠肺泡灌洗液和肺组织
饲养28天后，将小鼠从动物屏障运到解剖室。麻醉后首先采血，然后将小鼠固定在实验板上，充分暴露气管，将气管周围的结缔组织剥离干净。用眼科弯镊支撑在气管下方，另一只手用眼科直镊夹起两根外科缝线穿过气管和食管之间，先用一根外科线结扎气管远心端。将静脉留置套管针插入气管，退出针芯，用剩下的外科线扎紧软管和气管，不可太过用力，避免切断气管。在留置针上连接2ml注射器，抽取0.7ml冰PBS(pH7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L)进行肺部灌洗，按摩胸部30s后缓慢抽出灌洗液，可见乳白色泡沫状液体。当感觉活塞抽不动且有阻力时停止，将抽出的液体转移至离心管中，重复灌洗3次，将收集到的肺泡灌洗液置于冰上保存。然后剪开胸腔，仔细分离肺组织，将取出的肺组织放置于福尔马林中固定或液氮中保存，以便用于后续实验。
3.小鼠血清外泌体提取
构建28天C57BL/6雄性小鼠硅肺模型，在麻醉状态下通过摘取右眼球方式进行采血，将全血常温放置30分钟，然后在4℃下以1500*g离心10分钟，收集上清中的血清，重复离心1-2次，以尽可能去除血细胞。根据SBI ExoQuick试剂盒操作指南提取血清中的外泌体，然后使用miRNeasy Micro Kit(cat.no.217084，Qiagen公司)试剂盒提取血清外泌体中的miRNA。
4.miRNA高通量测序：
(1)使用安捷伦2100生物分析仪(Agilent RNA 6000 Nano Kit)检测所提取出来的外泌体中miRNA的完整度和浓度。
(2)通过NanoDrop检测盐离子是否污染，为文库的构建和后期信息分析提供参考。
(3)检测样本合格后建库：富集Small RNA、接头连接、反转录-PCR扩增、回收PCR产物。
(4)使用安捷伦2100生物分析仪检测浓度与文库长度，接下来进行环化处理，变性打开双链PCR产物后加入环化引物，使PCR成环状，在phi29酶的作用下所得文库形成拥有300多个复制的DNA纳米球，将DNA纳米球加载到测序芯片上，进行BGISEQ-500测序。
(5)待测序程序运行完毕后，将所得的rawdata数据进行过滤得到clean tags数据，将clean reads通过比对软件AASRA比对到参考基因组以及其他小RNA数据库，并将所有小RNA与各类RNA的比对、注释情况进行总结。
5.细胞系和细胞培养
小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CCTCC，中国上海)。RAW264.7和NIH/3T3细胞使用Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM；Gibco,Grand Island,NY,USA)培养，添加体积浓度10％胎牛血清(FBS)。所有细胞都放置在37℃，体积百分数5％ CO2恒温培养箱中培养。在伤口愈合实验中，NIH/3T3细胞使用不含胎牛血清的DMEM培养基培养。在SiO2处理前，将二氧化硅粉末(SiO2；S5631,1-5μm,Sigma-Aldrich,Merck KGaA,Darmstadt,Germany)包装在锡纸中并烘烤过夜(180℃,16h)以杀菌和灭活内毒素。本实验中SiO2的用量为200μg/ml。在用SiO2处理48小时后，收取巨噬细胞的条件培养基。
6.细胞上清外泌体的分离和处理
通过超速离心法(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)提取RAW264.7细胞上清中的外泌体。RAW264.7在含体积浓度10％无外泌体胎牛血清(FBS)的培养基中培养，SiO2处理后继续培养48h，收集细胞培养上清液(SN)。将收集的SN在4℃下3000×g离心10min，去除细胞和细胞碎片，然后在4℃下20000×g离心25min，去除微囊泡。用0.22-μm过滤器(Millipore,MA,USA)过滤后，在110,000×g条件下，4℃离心120min，从而收集小于200nm的囊泡。将沉淀重悬于冰的无菌PBS中，在4℃，110,000×g再次离心120min，以去除污染蛋白。最后，根据不同的实验目的，使用不同的缓冲液将外泌体沉淀重悬，比如100μl无菌PBS(pH7.4，NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L)。这些纯化的外泌体可以立即使用或储存在-80℃中。在细胞处理方面，用50μg外泌体处理1×105个受体细胞。
7.Western blot(WB)分析
将细胞蛋白裂解液进行SDS-PAGE检测。Western blot分析采用抗I型胶原(500μg/ml，体积稀释比：1：1000；14695-1–ap；Proteintech)，抗III型胶原(900μg/ml，体积稀释比：1：1000；22734-1–ap；Proteintech)，抗-α-平滑肌肌动蛋白(SMA)(500μg/ml，体积稀释比：1：1000；14395-1–ap；Proteintech)，抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(1000μg/ml，体积稀释比：1：2000；60004-1–lg；Proteintech)和相应的酶标二抗。使用化学发光系统(AmershamECL Plus；Piscataway，NJ，USA)进行检测。
8.RT-PCR分析
遵循说明书，使用Trizol试剂(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)提取总RNA，然后使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)评估RNA的质量和数量。使用cDNA合成试剂盒(Genecopoeia,GuangZhou,China)将总RNA进行逆转录，然后使用ABI-7500仪器(Applied Biosystems；赛默飞世尔科技公司Waltham,MA,USA)进行实时PCR。I型胶原，III型胶原和α-SMA的表达水平以GAPDH表达水平进行标准化。
miR-214-3p的表达水平以U6或cel-miR-39表达水平进行标准化。反应中使用的引物序列如下所示：
小鼠I型胶原：5′GCTCCTCTTAGGGGCCACT3′，
3′CCACGTCTCACCATTGGGG5′
小鼠III型胶原：5′CTGTAACATGGAAACTGGGGAAA′，
3′CCATAGCTGAACTGAAAACCACC′；
小鼠α-SMA：5′GTCCCAGACATCAGGGAGTAA3′，
3′TCGGATACTTCAGCGTCAGGA5′；
小鼠GAPDH：5′AGGTCGGTGTGAACGGATTTG′，
3′TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA′；
miR-214-3p：UGACGGACAGACACGGACGACA；
cel-miR-39：CGCGTCACCGGGTGTAAATCAGCTTG；
U6：CTCGCTTCGGCAGCACATATACTACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。9.酶联免疫吸附试验(Elisa)
小鼠Elisa检测试剂盒购买自proteintech公司。IL-1β货号为KE10003，IL-6货号为KE10007，TNF-α货号为KE10002。
⑴物品准备：使用前30分钟，将样品稀释液，抗体稀释液，20×洗涤液，TMB底物溶液和反应终止溶液放置于室温中平衡。根据实验需求量，用双蒸水配置1×洗涤液。
⑵制作标准曲线：在标准品中加入2ml样品稀释液，标记为sd7。从sd7中吸出500μl溶液+500μl样品稀释液进行浓度梯度稀释，依次标记为sd6，sd5，sd4，sd3，sd2，sd1，将样品稀释液作为空白对照，标记为sd0。配好的标准品于30分钟内使用。
⑶实验步骤：
a.从试剂盒中取出所需的微孔板并固定于孔架上，将剩余的微孔板密封起来放置于4℃保存。
b.在10分钟内将100μl标准品和样品分别加到微孔板中。
c.用封板膜将微孔板密封起来，放置于37℃恒温箱中孵育2小时。
d.洗孔：
i.轻轻揭开封板膜。
ii.将孔内的液体倒出。
iii.在干净的滤纸上轻敲数次以去除孔内残留的液体。
iv.每孔加入350μl 1×洗涤液进行洗涤，倒出洗涤液后在干净的滤纸上轻敲2次，一共重复4次，最后一次洗涤结束后在干净的滤纸上轻敲10次，以去除残留的液体。
e.每孔加入100μl配置好的一抗(1:100)，用封板膜将微孔板密封起来后放置于37℃恒温箱中孵育1小时。
f.按照步骤d进行洗孔。
g.每孔加入100μl配置好的二抗(1:100)，用封板膜将微孔板密封起来后放置于37℃恒温箱中孵育40分钟。
h.按照步骤d进行洗孔。
i.在避光环境中，于每孔加入100μl TMB底物溶液，用封板膜将微孔板密封起来后放置于37℃恒温箱中孵育15-20分钟。注意观察样品颜色，如若蓝色过深，可提前终止反应；若蓝色过浅，可适当延长反应时间。
j.按照加入TMB底物溶液的顺序，于每孔加入100μl反应终止溶液，轻敲微孔板侧面以充分混匀。
k.在加入反应终止溶液后5分钟内，使用酶标仪于450nm和630nm波长检测样品OD值。
l.数据分析
10.免疫组化
⑴脱蜡：
①将石蜡切片放置于65℃烤箱中烘烤2小时。
②脱蜡与水化：
a.二甲苯I浸泡20min。
b.二甲苯II浸泡20min。
c.无水乙醇I浸泡5min。
d.无水乙醇II浸泡5min。
e.体积浓度95％乙醇水溶液浸泡5min。
f.体积浓度80％乙醇水溶液浸泡5min。
g.体积浓度60％乙醇水溶液浸泡5min。
h.去离子水浸洗3遍。每遍1min.
i.PBS浸洗5min.
⑵抗原修复：将切片浸没在柠檬酸钠抗原修复液中，浸泡5min后，将修复盒放置在高压锅内，高压锅内添加双蒸水直至抗原修复盒1/2高度，盖紧锅盖和高压阀后通电加热，上汽后继续修复10min，修复完成后停止加热，等待温度降至室温。
⑶将修复完成的切片放置于PBST(pH7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L；吐温-20：1:1000，体积比)中浸洗3遍，每遍5min。然后将切片放置于去离子水中浸洗3遍，每遍1min。
⑷染色：
①甩干切片，将组织周围擦干，用免疫组化笔在组织周围画圈，滴加过氧化氢酶抑制剂，将切片放置于湿盒中于37℃烤箱中孵育15min。PBS浸洗5min。
②甩干切片，将组织周围擦干，滴加山羊血清封闭，将切片放置于湿盒中于37℃烤箱中孵育30min。
③用吸水纸吸走山羊血清，滴加稀释后的一抗，将切片放置于湿盒中于37℃烤箱中孵育30min，然后将湿盒放置于4℃冰箱中过夜，第二天于37℃烤箱中复温30min。将复温结束的切片放置于PBST中浸洗3遍，每遍5min。
⑸甩干切片，将组织周围擦干，滴加适量的反应增强液，将切片放置于湿盒中于37℃烤箱中孵育20min。将切片放置于PBST中浸洗3遍，每遍5min。
⑹甩干切片，将组织周围擦干，滴加适量的增强型酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，将切片放置于湿盒中于37℃烤箱中孵育30min。将切片放置于PBST中浸洗3遍，每遍5min。
⑺甩干切片，将组织周围擦干，滴加适量的DAB溶液(pH3.8，1mg/ml，新鲜配制1：20，体积比)，于室温下避光孵育5min。流水冲洗3min。
⑻甩干切片，将组织周围擦干，滴加适量的苏木素染色液，室温复染5min。流水冲洗3min。PBS中浸洗5min。去离子水浸洗3遍，每遍1min。
⑼甩干切片，将组织周围擦干，于饱和碳酸锂中浸泡10s，流水冲洗3min。去离子水浸洗3遍，每遍1min。甩干后镜检查看染色情况。
⑽脱水:
a.体积浓度60％乙醇水溶液浸泡5min。
b.体积浓度80％乙醇水溶液浸泡5min。
c.体积浓度95％乙醇水溶液浸泡5min。
d.无水乙醇I浸泡5min。
e.无水乙醇II浸泡5min。
f.二甲苯III浸泡5min。
g.二甲苯IV浸泡5min。
⑾沥干后，滴加适量中性树胶封片。
11.增殖和伤口愈合试验
按照说明书，用细胞计数试剂盒-8(CCK-8Kit；Dojindo MolecularTechnologies,Rockville,MD,USA)检测成纤维细胞增殖能力，首先将3×104个/ml的细胞悬液接种在96孔板中，100μl/孔，根据不同的处理方式和时间点每组样本设置4-5个复孔，到达预计时间点后，在避光环境下加入CCK-8试剂(10μl/孔)，继续放在37℃恒温培养箱中培养2小时，使用酶标仪于450nm波长检测样品OD值。在2D培养系统中通过伤口愈合试验评估细胞迁移能力。将1×105个NIH3T3细胞接种于24孔培养板中。当细胞融合到70-80％时，用200μl无菌Tip头在每个孔中小心地划出十字形划痕。然后用无菌PBS清洗3次以去除所有分离和未贴壁的细胞。在不同时间点(0h、12h或24h)捕获数字图像，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Rockville,Maryland,USA)定量评估间隙宽度。
数据分析：
使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)进行统计分析。采用Student's t检验(unpaired,two-tail)或Two-way ANOVA进行数值比较,p＜0.05为统计结果差异显著。
实验结果：
1.miRNA高通量测序结果和结果验证。
分析小鼠血清外泌体miRNA高通量测序结果，设置log2＞0.6或log2＜-0.6筛选出差异表达较高的miRNA制作差异表达热图，其中35个miRNA分子表达上调，5个miRNA分子表达下调(图1中A)。通过查阅文献和功能分析，我们筛选出miR-214-3p作为进一步研究的关键分子。接着我们再次构建了一批28天小鼠硅肺模型，提取血浆外泌体miRNA，通过RT-PCR对测序结果进行验证。RT-PCR结果显示，和生理盐水对照组相比，硅肺小鼠血浆来源的外泌体中miR-214-3p表达下调(图1中B)，与测序结果一致。
2.miR-214-3p在硅肺组织和肺泡巨噬细胞及其外泌体中表达下调。
接下来我们检测硅肺小鼠肺组织和肺泡巨噬细胞中miR-214-3p表达水平。RT-PCR结果显示，和生理盐水对照组相比，硅肺小鼠肺组织和肺泡巨噬细胞中miR-214-3p表达下调(图2中A-B)。以200μg/ml浓度的SiO2悬浊液处理RAW264.7巨噬细胞48小时后提取细胞miRNA和细胞上清中的外泌体miRNA。RT-PCR结果显示，和空白对照组相比，SiO2暴露的巨噬细胞及其分泌的外泌体中miR-214-3p表达下调(图2中C-D)。
3.过表达miR-214-3p可降低巨噬细胞中炎症因子表达。
在RAW264.7巨噬细胞中过表达miR-214-3p后，以200μg/ml浓度的SiO2悬浊液处理RAW264.7巨噬细胞48小时，Elisa结果显示，与空白对照组(Control)相比，SiO2暴露组的巨噬细胞中IL-1β表达上调，相较于SiO2+miR-NC mimic组，miR-214-3p过表达组(SiO2+miR-214-3p mimic)巨噬细胞中IL-1β表达下调(图3中A)，WB也得到了一致的结果(图3中B)。收集细胞上清并通过超速离心法提取细胞上清中的外泌体(SiO2+miR-NC mimic-Exos和SiO2+miR-214-3pmimic-Exos)，将这些外泌体与M0巨噬细胞(RAW264.7巨噬细胞)共培养48小时，显微镜下可见，与空白对照组中小而圆的细胞形态相比，SiO2+miR-NC mimic-Exos处理组中的巨噬细胞体积增大，广泛呈多边形长角的形态。相较于SiO2+miR-NC-Exos处理组，SiO2+miR-214-3p-Exos处理组中呈多边形长角的形态的巨噬细胞数目和比例降低(图3中C)。
RT-PCR结果显示，与空白对照组相比，SiO2+miR-NC mimic-Exos处理组和SiO2+miR-214-3p-Exos处理组的巨噬细胞中IL-1β，IL-6和TNF-α表达显著上调，IL-10表达无明显差异。相较于SiO2+miR-NC-Exos处理组，SiO2+miR-214-3p-Exos处理组中IL-1β，IL-6和TNF-α表达显著下调，IL-10表达无明显差异(图3中D)。
4.过表达miR-214-3p可降低肌成纤维细胞表型转化、增殖和迁移。
在RAW264.7巨噬细胞中过表达miR-214-3p后，以200μg/ml浓度的SiO2悬浊液处理RAW264.7巨噬细胞，将这些巨噬细胞与NIH/3T3成纤维细胞共培养24小时，提取NIH/3T3成纤维细胞的mRNA进行RT-PCR检测。结果显示，与空白对照组(Control)相比，SiO2和SiO2+miR-NC mimic巨噬细胞共培养组的成纤维细胞中α-SMA，I型胶原和III型胶原表达上调。相较于SiO2+miR-NC mimic组，SiO2+miR-214-3p mimic巨噬细胞共培养组的成纤维细胞中α-SMA，I型胶原和III型胶原表达下调(图4中A-C)。
收集细胞上清并提取细胞上清中的外泌体(SiO2-Exos，SiO2+miR-NC mimic-Exos和SiO2+miR-214-3p mimic-Exos)，将这些外泌体与NIH/3T3成纤维细胞共培养24小时。
RT-PCR结果显示，与空白对照组相比，SiO2-Exos和SiO2+miR-NC mimic-Exos处理组成纤维细胞中α-SMA，I型胶原和III型胶原表达上调。相较于SiO2+miR-NC-Exos处理组，SiO2+miR-214-3p-Exos处理组中α-SMA，I型胶原和III型胶原表达下调(图4中D-F)。WB也得到了一致的结果(图4中G)。
CCK8实验检测外泌体处理的成纤维细胞的增殖能力。结果显示，与空白对照组相比，SiO2+miR-NC mimic-Exos处理组成纤维细胞增殖能力明显增强，相较于SiO2+miR-NC-Exos处理组，SiO2+miR-214-3p-Exos处理组的成纤维细胞增殖能力明显下降(图4中H)。
伤口愈合实验检测外泌体处理的成纤维细胞的迁移能力。结果显示，与空白对照组相比，SiO2+miR-NC mimic-Exos处理组成纤维细胞迁移能力明显增强，相较于SiO2+miR-NC-Exos处理组，SiO2+miR-214-3p-Exos处理组的成纤维细胞迁移能力下降(图4中I)。
5.使用miR-214-3p治疗硅肺小鼠可降低SiO2诱导的小鼠肺纤维化和炎症反应。
构建硅肺小鼠miR-214-3p治疗模型，检测小鼠肺功能。结果显示，与空白对照组相比，miR-NC agomir治疗组的小鼠肺阻力明显增加，动态肺顺应性明显降低。相较于miR-NCagomir治疗组，miR-214-3p agomir治疗组小鼠的肺阻力下降，动态肺顺应性增加(图5中A-B)。
收集肺泡灌洗液进行Elisa检测，结果显示，与空白对照组相比，miR-NC agomir治疗组的小鼠肺泡灌洗液中IL-1β，IL-6和TNF-α表达上调。相较于miR-NC agomir治疗组，miR-214-3p agomir治疗组小鼠肺泡灌洗液中IL-1β，IL-6和TNF-α表达下调(图5中C-E)。
H&E染色显示，空白对照组肺组织肺泡结构清晰完整，无明显炎症细胞浸润和纤维化形成。相比之下，miR-NC agomir治疗组肺组织中肺泡结构明显受损，炎症细胞广泛聚集，弥漫性硅结节形成(图5中F)。Masson三色染色结果显示，与对照组相比，miR-NC agomir治疗组中深蓝色染色区域明显增大(图5中F)。
然而，与miR-NC agomir治疗组相比，miR-214-3p agomir治疗组肺组织中炎症细胞聚集区域，硅结节大小和胶原纤维沉积区域减少，着色较弱(图5中F)。
此外，miR-NC agomir治疗组α-SMA蛋白表达较对照组明显上调，miR-214-3pagomir治疗组较miR-NC agomir治疗组明显下调(图5F)。WB结果显示，与空白对照组相比，miR-NC agomir治疗组的小鼠肺组织中I型胶原表达明显上调。相较于miR-NC agomir治疗组，miR-214-3p agomir治疗组小鼠肺组织中I型胶原表达下调(图5中G)。
讨论：
本申请在小鼠血浆外泌体miRNA表达谱中筛选出35个表达上调miRNA分子，5个表达下调的miRNA分子，其中包括miR-214-3p。经过验证分析，miR-214-3p在硅肺小鼠血浆外泌体，硅肺组织，染尘巨噬细胞及其分泌的外泌体中都呈表达下调的趋势。在染尘巨噬细胞中恢复miR-214-3p表达，可降低炎症因子IL-1β表达水平。我们前期的结果表明，染尘巨噬细胞来源的外泌体具有促炎和促纤维化作用，而当恢复miR-214-3p表达后，miR-214-3p过表达的染尘巨噬细胞来源的外泌体的促炎和促纤维化作用降低。使用miR-214-3p agomir治疗硅肺小鼠，可降低硅肺炎症水平和纤维化程度。
综上所述，在本研究中我们探究了硅肺小鼠血浆外泌体miRNA表达谱，并发现了miR-214-3p可作为硅肺的潜在治疗靶点。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (5)
1.miR-214-3p在制备降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过过表达miR-214-3p降低巨噬细胞中炎症因子表达，从而降低硅肺炎症水平。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包含：TNF-α，IL-1β，IL-6。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过过表达miR-214-3p降低肌成纤维细胞表型转化、增殖和迁移，从而减缓纤维化进展。
5.一种降低硅肺炎症水平和/或减缓纤维化进展的药物，其特征在于，其有效成分为miR-214-3p agomir。
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