CN116509773A - 多重护肤功效的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多重护肤功效的组合物及其应用，旨在提供‑种抗炎舒缓、对抗炎性衰老、抗氧化抑制黑色素生成强化皮肤屏障的多重护肤功效的组合物；其技术方案主要包括下述重量份组分：芍药根提取物1‑3份、显齿蛇葡萄叶提取物0.1‑0.5份、五味子果提取物2‑6份；属于化妆品技术领域。

Description

多重护肤功效的组合物及其应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体是涉及-种多重护肤功效的组合物。
技术背景
随着环境污染日益加重和精神压力增加等原因敏感肌发生率逐渐升高，特别是疫情下，消费者频繁佩戴口罩而导致微生物滋生与屏障受损，以及随疫情产生的焦虑和烦躁心情等因素，均会引起皮肤问题，导致敏感肌人群进一步扩大。
敏感肌通常与细胞炎症相关，细胞炎症通常会引起细胞焦亡，细胞焦亡(pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是-种程序性细胞死亡。其通过Caspase-1酶发挥作用；细胞焦亡发生时伴随着向胞外释放大量的促炎性细胞因子白细胞介素IL-1β、IL-18等，同时还具有细胞膜渗透性增高、细胞肿胀、破裂、胞质及内容物外泄、引起炎症反应等细胞坏死的形态特征，在机体衰老进程中起重要作用。
细胞焦亡发生的执行酶Caspase-1的活化受到细胞内炎症小体多蛋白复合物的调控，ROS及NF-κ B通路激活均可刺激该炎性小体的产生。尽管上游各类刺激信号分子和途径各异，但各种炎性小体均可以使下游Caspase-1激活，引发质膜孔径形成、炎性因子释放、DNA损伤等后继事件，最终导致细胞焦亡发生。炎症性衰老(inflaMmaging)以促炎性细胞因子水平升高以及细胞衰老为特征，会导致细胞功能紊乱和周围组织的过早老化，诱发因素主要有免疫衰老、细胞衰老和光暴露。其中，免疫衰老过程中，我们的免疫细胞如T细胞、巨噬细胞等都会发生变化，而巨噬细胞的变化是便是护肤品能针对改善的-个靶点。
因此，近年皮肤学级(敏感肌)护肤品成交占比持续提升，较海外市场仍有提升空间。
发明内容
为此，本发明的目的在于提供-种抗炎舒缓、对抗炎性衰老、抗氧化抑制黑色素生成强化皮肤屏障的多重护肤功效的组合物。
本发明的第二个目的是该多重护肤功效的组合物作为化妆品添加剂的应用。
为此，本发明提供的第-个技术方案是这样的：
-种多重护肤功效的组合物，主要包括下述重量份组分：芍药根提取物1-3份、显齿蛇葡萄叶提取物0.1-0.5份、五味子果提取物2-6份。
进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，还包括丁醇90-95份。
进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，还包括桃树脂提取物0.5-2份。
进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，还包括苹果果提取物0.5-2份。
进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，还包括石榴皮提取物0.2-0.8份、虎杖提取物0.2-0.6份。
进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，还包括石人参提取物0.1-0.5份。
更进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，所述的芍药根提取物通过下述方法提取得到的：
1)将芍药根清洗干净、烘干和粉碎，得芍药根粉末；
2)按照1∶20料液比将步骤1)所述的芍药根粉末浸泡在75％的乙醇溶液中，浸泡4-6个小时后，置入超声波提取仪器中，设置超声波功率300瓦，提取10-15分钟，过滤收集上清液；
3)将上清液通过AB-8大孔树脂，采用85％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，在再0.05MPa、温度为50℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～-50℃，冷冻干燥4～8h，得芍药根提取物。
更进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，所述的显齿蛇葡萄叶提取物通过下述方法提取得到的：
1)称取粉碎后的显齿蛇葡萄嫩叶，加入75％的乙醇溶液浸泡12小时，置入超声波提取仪器中，设置超声波功率250瓦，提取30分钟，过滤收集上清液，将浸提液浓缩干燥后加去离子水，配制成浓度为1.5mL/g的显齿蛇葡萄嫩叶根浸提液，并将浸提后的显齿蛇葡萄嫩叶药渣置30℃下干燥；
2)称取经过步骤1)干燥后的显齿蛇葡萄嫩叶根药渣，按照料液比1∶15的比例在药渣中加入去离子水，煎煮1h，过滤后在药渣中加入蒸煮前显齿蛇葡萄嫩叶药渣5倍体积的75％的乙醇，搅匀，静置并抽滤获得提取液；
3)将提取液离心处理使固液分离，将固体残渣过滤得到滤液；重复浸提2次，并将上述滤液合并得到显齿蛇葡萄嫩叶根提取液，用AB-8大孔树脂吸附，弃去残液，再用85％乙醇水溶液洗脱AB-8大孔树脂后，收集洗脱液，将洗脱液在再0.05MPa、温度为450℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～-50℃，冷冻干燥10～15h，得显齿蛇葡萄叶提取物。
更进一步的，上述的多重护肤功效的组合物，所述的五味子果提取物通过下述方法提取得到的：
1)将新鲜五味子果根洗净后，紫外线消毒，用压榨机压榨出五味子果粗汁液，再转移到离心机中，在2500r/min条件下离心25min，收集上清液；
2)向步骤1)制备的加入3g活性炭静置吸附24h，达到吸附平衡，转移到离心机中，在3000r/min的转速下离心30min，去除活性炭，再次收集上清液；
3)对步骤2)制得的上清液再用孔径为0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌，制得五味子果粗提取物；
4)向步骤3)制备的五味子果粗提取物添加五味子果粗提取物质量0.5％的植物乳杆菌，五味子果粗提取物质量0.8％的维素酶，五味子果粗提取物质量0.5％的酸性蛋白酶，并且添加柠檬酸调节提取液pH值为3-4，充分混匀后于超声波提取装置，设置超声功率220W，提取温度为45℃，提取时间100-120min；
5)将提取液浓缩在0.02MPa、温度为80℃，减压浓缩50-100min至浓缩液，再压力为10Pa，温度为-60℃，冷冻干燥20h，得五味子果提取物。
本发明的第二个技术方案是上述的多重护肤功效的组合物作为化妆品添加剂的应用。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1、本发明提供的技术方案主要采用芍药根提取物、显齿蛇葡萄叶提取物、五味子果提取物相互组方，协同增效，能有效抑制透明质酸酶和组胺活性，从而减少肌肤过敏现象，通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6的表达和提供IL-10的表达达到舒缓功效；抑制弹性蛋白酶生成，从而到达抗皱功效；清除自由基，延缓衰老，抑制酪氨酸酶升高，到达美白功效。
2、本发明提供的技术方案提取的显齿蛇葡萄叶提取物，含丰富的黄酮类化合物、二氢杨梅素、槲皮素、显齿蛇葡萄素、山柰酚、VE等活性组分，能有效抗氧化、抗炎、抑菌等作用；特别是对金黄色葡萄球菌、酵母菌等有较好的抑菌活性，并且能有效的清除.0H的效果，降低TNF-α、IL-1β、IL-6的表达和提供IL-10的表达，从而来缓炎症。
3、本发明提供的技术方案提取的芍药根提取物含丰富的芍药苷，能有效抑制炎症细胞因子分泌、清除自由基、抗氧化应激、调控衰老相关基因表达，从而达到抗炎、免疫调节等作用，下调NF-kB、TNF-a、IL-1B、IL-6等炎症因子，从而延缓衰老；促进SH-SY5Y细胞自噬小体与溶酶体结合，下调R0S水平，降低自噬相关蛋白LC3II表达，促进自噬受体蛋白p62降解，进而促进H202损伤后SH-SY5Y细胞自噬，改善细胞氧化损伤，抗菌抑菌、抗氧化。
4、本发明提供的技术方案提取的五味子提取物，富含丰富的五味子多糖，抑制NF-κ B，MAPKs和Jak2-Stat3信号通路相关因子的活化，激活Nrf2、PI3K/Akt和PPAR-γ等信号通路，进而减少TNF-α，IL-6，IL-1β、N0、PGE2等炎症因子的产生与释放，起到一定的抗炎作用；能有效清除自由基，从而具有抗氧化，延缓衰老的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明。
本申请未明确说明书百分含量均为体积分数。
实施例1
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，丁醇93.7g。
实施例2
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物1g、显齿蛇葡萄叶提取物0.1g、五味子果提取物6g，丁醇92.9g。
实施例3
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物3g、显齿蛇葡萄叶提取物0.5g、五味子果提取物2g，丁醇94.5g。
实施例4
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2.5g、显齿蛇葡萄叶提取物0.4g、五味子果提取物5g，丁醇92.1g。
实施例5
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，桃树脂提取物1g，丁醇92.7g。
实施例6
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，桃树脂提取物1g，苹果果提取物0.7g丁醇92g。
实施例7
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，桃树脂提取物1g，苹果果提取物0.7g石榴皮提取物0.3g、虎杖提取物0.4g，丁醇91.3g。
实施例8
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，桃树脂提取物1g，苹果果提取物0.7g石榴皮提取物0.3g、虎杖提取物0.4g，人参提取物0.2g，丁醇91.1g。
实施例1-8中所采用芍药根提取物通过下述方法提取得到的：
1)将芍药根清洗干净、烘干和粉碎，得芍药根粉末；
2)按照1：20料液比将步骤1)所述的芍药根粉末浸泡在75％的乙醇溶液中，浸泡4-6个小时后，置入超声波提取仪器中，设置超声波功率300瓦，提取10-15分钟，过滤收集上清液；
3)将上清液通过AB-8大孔树脂，采用85％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，在再0.05MPa、温度为50℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～-50℃，冷冻干燥4～8h，得芍药根提取物。
实施例1-8中所采用显齿蛇葡萄叶提取物通过下述方法提取得到的：
1)称取粉碎后的显齿蛇葡萄嫩叶，加入75％的乙醇溶液浸泡12小时，置入超声波提取仪器中，设置超声波功率250瓦，提取30分钟，过滤收集上清液，将浸提液浓缩干燥后加去离子水，配制成浓度为1.5mL/g的显齿蛇葡萄嫩叶根浸提液，并将浸提后的显齿蛇葡萄嫩叶药渣置30℃下干燥；
2)称取经过步骤1)干燥后的显齿蛇葡萄嫩叶根药渣，按照料液比1：15的比例在药渣中加入去离子水，煎煮1h，过滤后在药渣中加入蒸煮前显齿蛇葡萄嫩叶药渣5倍体积的75％的乙醇，搅匀，静置并抽滤获得提取液
3)将提取液离心处理使固液分离，将固体残渣过滤得到滤液；重复浸提2次，并将上述滤液合并得到显齿蛇葡萄嫩叶根提取液，用AB-8大孔树脂吸附，弃去残液，再用85％乙醇水溶液洗脱AB-8大孔树脂后，收集洗脱液，将洗脱液在再0.05MPa、温度为450℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～一50℃，冷冻干燥10～15h，得显齿蛇葡萄叶提取物。
实施例1-8中所采用五味子果提取物通过下述方法提取得到的：
1)将新鲜五味子果根洗净后，紫外线消毒，用压榨机压榨出五味子果粗汁液，再转移到离心机中，在2500r/min条件下离心25min，收集上清液；
2)向步骤1)制备的加入3g活性炭静置吸附24h，达到吸附平衡，转移到离心机中，在3000r/min的转速下离心30min，去除活性炭，再次收集上清液；
3)对步骤2)制得的上清液再用孔径为0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌，制得五味子果粗提取物；
4)向步骤3)制备的五味子果粗提取物添加五味子果粗提取物质量0.5％的植物乳杆菌，五味子果粗提取物质量0.8％的维素酶，五味子果粗提取物质量0.5％的酸性蛋白酶，并且添加柠檬酸调节提取液pH值为3-4，充分混匀后于超声波提取装置，设置超声功率220W，提取温度为45℃，提取时间100-120min；
5)将提取液浓缩在0.02MPa、温度为80℃，减压浓缩50-100min至浓缩液，再压力为10Pa，温度为-60℃，冷冻干燥20h，得五味子果提取物。
对比例1
本案例的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，丁醇93.7g。
其中：所述的芍药根提取物通过下述方法制备的：
1)将芍药根清洗干净、烘干和粉碎，得芍药根粉末；
2)按照1∶20料液比将步骤1)所述的芍药根粉末浸泡在水溶液中，浸泡4-6个小时后，加热至沸腾，煮2个小时，重复提取3三次，收集提取液过滤后收集上清液；
3)将上清液在再0.05MPa、温度为50℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～50℃，冷冻干燥4～8h，得芍药根提取物。
对比例2
本案例的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，丁醇93.7g。
其中：所述的显齿蛇葡萄叶提取物通过下述方法制备的：
1)称取粉碎后的显齿蛇葡萄嫩叶，加入水浸泡12小时，置入超声波提取仪器中，设置超声波功率250瓦，提取30分钟，过滤收集上清液，将浸提液浓缩干燥后加去离子水，配制成浓度为1.5mL/g的显齿蛇葡萄嫩叶根浸提液，在再0.05MPa、温度为450℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～-50℃，冷冻干燥10～15h，得显齿蛇葡萄叶提取物。
对比例3
本案例的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物0.3g、五味子果提取物4g，丁醇93.7g。
其中：所述的五味子果提取物通过下述方法制备的：
1)将新鲜五味子果根洗净后，紫外线消毒，用压榨机压榨出五味子果粗汁液，再转移到离心机中，在2500r/min条件下离心25min，收集上清液；
2)向步骤1)制备的加入3g活性炭静置吸附24h，达到吸附平衡，转移到离心机中，在3000r/min的转速下离心30min，去除活性炭，再次收集上清液；
3)对步骤2)制得的上清液再用孔径为0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌，制得五味子果粗提取物，将提取液浓缩在0.02MPa、温度为80℃，减压浓缩50-100min至浓缩液，再压力为10Pa，温度为-60℃，冷冻干燥20h，得五味子果提取物。
对比例4
本案例的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物6.3g、丁醇93.7g。
对比例5
本案例的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：显齿蛇葡萄叶提取物6.3g、丁醇93.7g。
对比例6
本案例的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：五味子果提取物6.3g，丁醇93.7g。
对比例7
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2.3g，五味子果提取物4g，丁醇93.7g。
对比例8
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：显齿蛇葡萄叶提取物2.3g、五味子果提取物4g，丁醇93.7g。
对比例9
本发明提供的-种多重护肤功效的组合物，由下述组分组成：芍药根提取物2g、显齿蛇葡萄叶提取物4.3g，丁醇93.7g。
对比例4-9中涉及到的芍药根提取物、显齿蛇葡萄叶提取物、五味子果提取物与实施例1-8中所述的提取方法相同。
实施例9
本实施例提供的-种多效精华水，包括下述组分及其含量，参阅表1：
表1
实施例10
本实施例提供的-种多效精华水，包括下述组分及其含量，参阅表2：
表2
实施例11
本实施例提供的-种多效精华水，包括下述组分及其含量，参阅表3：
表3
实施例12
本实施例提供的-种多效精华水，包括下述组分及其含量，参阅表4：
表4
实施例13
本实施例提供的-种多效精华水，包括下述组分及其含量，参阅表5：
表5
实施例9-13提供的多效精华水通过下述方法制备的：
1、将A相中的原料准确称量加入锅中，升温至80℃左右，恒温30min，备用；
2、将B相的原料预溶好，加热并在搅拌下加入A相锅中，搅拌2min直至搅拌均匀，再加入C相中其余原料，搅拌至溶解完全，搅拌15-20min，冷却水降温。
3、降温45℃左右再加入预溶好的D相，搅拌1min，检验合格出料。
为了证明本申请提供的技术方案的技术优点，下面给出本申请提供的多效精华水实验检测数据。
一、紧致抗皱-弹性蛋白酶抑制率
1、试验目的和原理
抗皱、紧致功效主要通过评估试验样品对弹性蛋白酶的抑制率来表征。弹性蛋白酶主要由成纤维细胞合成分泌，能够降解皮肤中的弹性蛋白导致皮肤老化。抑制弹性蛋白酶的实验原理是猪胰腺弹性蛋白酶与酶底物发生催化反应，添加活性物质后吸光度发生变化，通过吸光度变化的大小反映弹性蛋白酶抑制剂抑制率大小。
本试验参考实验室方法(HMC-WI-028弹性蛋白酶抑制率)，将试验样品与阴性对照进行弹性蛋白酶抑制率试验结果比对，如试验样品的抑制率高于阴性对照的抑制率且具有显著性差异(P＜0.05)，则可认为试验样品具有一定的抗皱、紧致功效。
2、试验指标
试验指标：·弹性蛋白酶抑制率
判定标准：样品弹性蛋白酶抑制率高于阴性对照且具有显著性差(p＜0.05)，则可认为试验样品具有一定的抗皱、紧致功效。
3、试验材料与方法
3.1仪器设备
BSA224S分析天平；RT-6100酶标分析仪
3.2、试剂
弹性蛋白酶(猪胰)，BR
N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸，98％
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，98％
3.3、试验方法
(1)对照物及试验样品的处理
实施例1中的组合物用纯水稀释至样品质量浓度为0.5％；
实施例1、5、6、7、8；对比例1-9中的组合物：分别用纯水稀释至样品质量浓度为2％：
阳性对照物(EGCG)：用水稀释至阳性对照物浓度为0.1％；
阴性对照物：纯水。
(2)试验操作步骤
设立样品组、样品本底组、溶剂组和溶剂本底组，每个组别需设立3个平行，在96孔板中分别加入不同试剂溶液，轻轻摇匀，25℃孵育15min后，将其放在酶标仪中，在410nm处测定吸光值。
(3)计算公式
弹性蛋白酶抑制率(％)＝(1-(C-D)/(A-B))*100
式中：A-为不含样品的反应溶液的吸光度；B-为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；
C-为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；D-为含有样品和不含酶的反应溶液的吸光度。
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物弹性蛋白酶抑制率之间的比较采用独立样本t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05。P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
4、试验结果，参阅表6：
表6
按照实验室方法(HMC-WI-028弹性蛋白酶抑制率)，对样品的抗皱、紧致功效进行实验室方法测试；测试结果表明：阳性对照弹性蛋白酶抑制率＞50％，反应体系有效，弹性蛋白酶抑制率为与阴性对照相比具有显著性差异(p＜0.05)，表明样品有一定的抗皱、紧致功效；并且本申请提供的技术方案其弹性蛋白酶抑制率明显大于对比例提供的产品的弹性蛋白酶抑制率，说明本申请复配后的技术方案协同增效。
二、抗皱-DPPH自由基清除率
1、试验目的和原理
自由基过量产生会导致皮肤自然衰老和光老化，从而产生皱纹。因此，是否具有清除自由基的能力是评价延缓衰老、抗氧化的化妆品(原料)的重要指标之一。
本试验参考实验室方法(HMC-WI-030DPPH自由基清除率)，将试验样品与阴性对照进行DPPH自由基清除率试验结果比对，如试验样品的清除率高于阴性对照的清除率且具有显著性差异(P＜0.05)，则可认为试验样品具有一定的抗氧化功效。
2、试验指标
试验指标：DPPH自由基清除率
判定标准：样品DPPH自由基清除率高于阴性对照的清除率且具有显著性差异(p＜0.5)
则可认为试验样品具有一定的抗氧化功效。
3、试验材料与方法
3.1仪器设备
BSA224S分析天平；L6s紫外分光光度计
3.2、试剂
DPPH(1，1-二苯基2苦基麟)，98％
3.3、试验方法
(1)对照物及试验样品的处理
实施例1中的组合物用纯水稀释至样品质量浓度为0.5％；
实施例1、5、6、7、8；对比例1-9中的组合物：分别用纯水稀释至样品质量浓度为2％；
阳性对照物(维生素E，纯度＞96％)：用95％乙醇稀释至阳性对照物浓度为0.1％；
阴性对照物：纯水。
(2)试验操作步骤
设立样品管、样品本底管、DPPH管和溶剂本底管，每个组别需设立3支平行管，分别在四个组别中加入不同试剂溶液，轻轻摇匀，室温下静置5分钟。将各组反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。
DPPH自由基清除率(％)＝(1-(T-T0)/(C-C0)*100％
式中：T-样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0-样品本底吸光值；
C-DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0-溶剂本底吸光值。
(4)数据分析
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物DPPH自由基清除率之间的比较采用独立样本t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05；
P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
4、试验结果，参阅表7：
表7
/>
注；DPPH自由基清除率保留三位小数，P＜0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异。
按照实验室方法(HMC-WI-030DPPH自由基清除率)，对样品的抗氧化功效进行实验室方法测试；测试结果表明：阳性对照DPPH自由基清除率＞50％，反应体系有效，DPPH自由基清除率平均值与阴性对照相比具有显著性差异(p＜0.05)；表明该产品具有一定的抗氧化功效；并且本申请提供的技术方案其DPPH自由基清除率明显大于对比例提供的产品的DPPH自由基清除率，说明本申请复配后的技术方案协同增效。
三、美白-络氨酸酶抑制率
1、试验目的和原理
在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行-系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在pH6.8的磷酸溶液中，可催化多巴转化成多巴醌，在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的化妆品可以减少多巴转化成多巴醍，从而降低吸光值，根据吸光值的变化，评估化妆品对酪氨酸酶活性的抑制作用。
本试验参考实验室方法(HMC-W1-032酪氨酸酶抑制率)，将试验样品与阴性对照进行酪氨酸酶抑制率试验结
2、试验指标
1、试验指标酪氨酸酶抑制率
2、判定标准：样品酪氨酸酶抑制率高于阴性对照的抑制率且具有显著性差异(P＜0.05)，则可认为试验样品具有一定的美白功效。
3、试验材料与方法
3.1仪器设备
BSA224S分析天平；RT-6100酶标分析仪
3.2、试剂
多酚氧化酶(菌菇)，BR
左旋多巴，BR
3.3、试验方法
(1)对照物及试验样品的处理
实施例1中的组合物用纯水稀释至样品质量浓度为0.5％；
实施例1、5、6、7、8；对比例1-9中的组合物：分别用纯水稀释至样品质量浓度为2％；
阳性对照物(曲酸，纯度＞96％)：用纯水稀释至阳性对照物浓度为0.1％；
阴性对照物：纯水。
(2)试验操作步骤
设立样品管、样品本底管、酶反应管和溶剂本底管，每个组别需设立3支平行管，分别在四个组别中加入不同试剂溶液，轻轻摇匀，室温下静置5分钟。将各组反应溶液移入1cm比色皿中，在475nm处测定吸光值。
(3)计算公式
酪氨酸酶抑制率(％)＝(1-(T-T0)/(C-C0)*100％
式中：
T-样品管吸光值，即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值；T0-样品本底吸光值；
C-酶反应管吸光值3次平均值，即未加样品时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值；
C0-溶剂本底吸光值。
(4)数据分析
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物酪氨酸酶抑制率之间的比较采用独立样本t检验。
上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05，P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
4、试验结果，参阅表8：
表8
注：酪氨酸酶抑制率保留三位小数，P＜0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异.
按照实验室方法(HMC-WI-032酪氨酸抑制率)，对样品的美白功效进行实验室方法测试；测试结果表明：阳性对照酪氨酸酶抑制率>50％，反应体系有效，酪氨酸酶抑制率平均值与阴性对照相比具有显著性差异(P＜0.05)；表明该产品具有一定的美白功效。并且本申请提供的技术方案其酪氨酸酶抑制率明显大于对比例提供的产品的酪氨酸酶抑制率，说明本申请复配后的技术方案协同增效。
四、舒缓IL-8测试、舒缓IL-6测试
1、试验目的和原理
巨噬细胞可以作为研究化妆品抑制炎症因子1L-6、1L-8含量的细胞模型，通过细菌脂多糖(LPS)刺激，测定阴性对照与试验样品组的炎症因子IL-6、1L-8的含量，评价试验样品在抑制炎症因子IL-6、1L-8含量方面是否具有功效。IL-6、1L-8含量的测定采用酶联免疫方法(ELISA)测定。
本试验参考实验室方法(HMC-WI-050体外IL-6炎症因子含量测定，HMC-WI-049体外IL-8炎症因子含量测定)，将试验样品与阴性对照进行细胞IL-6、IL-8炎症因子含量测定结果比对，如试验样品的细胞IL-6、IL-8炎症因子含量低于阴性对照且具有显著性差异(P＜0.05)，则可认为试验样品具有一定的舒缓功效。
2、试验指标
试验指标：·IL-6、·IL-8炎症因子相对含量
判定标准：IL-6、IL-8炎症因子相对含量低于阴性对照，且与阴性对照有显著性差异，则反映该样品具有一定的舒缓功效。
3、试验材料与方法
3.1仪器设备
RT-6100酶标分析仪
3.2实验所用细胞
巨噬细胞：RAW264.7细胞
3.3、试验方法
(1)试验样品的处理
实施例1将样品用纯水稀释成体积分数为0.5％、2％的溶液，再用0.22pm过滤器过滤，收集滤液作为样品母液。
阴性对照：基础培养液(细胞活性试验)；含LPS的基础培养液(IL-6、IL-8炎症因子含量测定)。
细胞活性试验：取RAW264.7细胞铺96孔板，24h后吸弃培养基，加入含有不同浓度试验样品的基础培养基，24h后MTT法检测OD490nm，并通过t检验分析得出试验样品对RAW264.7细胞活性的影响。
IL-6、IL-8炎症因子含量测定：取RAW264.7细胞铺96孔板，培养24h后，更换为含有不同浓度试验样品的基础培养基，24h后，收集细胞上清，离心。吸取上清，用ELISA试剂盒分别测定细胞培养上清中的IL-6、IL-8含量，得出试验样品对巨噬细胞IL-6、IL-8含量的影响。
(2)计算公式
IL-6相对含量(％)＝(样品IL-6含量/阴性对照IL-6含量)*100
IL-8相对含量(％)＝(样品IL-8含量/阴性对照IL-8含量)*100
(4)数据分析
统计分析软件为SPSS，试验样品和阴性对照之间的比较采用独立样本t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05；P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
4、试验结果
4.1细胞活性试验
进行试样细胞IL-6、IL-8炎症因子含量测试之前，先进行细胞活性筛选，得出最佳受试浓度0.08％。
4.2细胞症因子含量测试
经过细胞活性筛选出浓度后，选出最佳受试浓度，进行RAW264.7细胞IL-6、IL一8炎症因子含量测定，得出试样对RAW264.7细胞IL-6、IL-8炎症因子含量的影响。
按照实验室方法(HMC-WI-050体外IL-6炎症因子含量测定)，试验样品浓度在0.08％时，细胞活性较高，其细胞IL-6炎症因子含量约为阴性对照组的83％，0.08％的试验样品对抑制细胞IL-6炎症因子含量有显著作用(户＜0.05)，即试验样品在0.08％浓度下，有明显抑制细胞IL-6炎症因子含量的能力，表明该试验样品有一定的舒缓功效。
按照实验室方法(HMC-WI-049体外III-8炎症因子含量测定)，试验样品浓度在0.08％时，细胞活性较高，其细胞IL-8炎症因子含量约为阴性对照组的48％，0.08％的试验样品对抑制细胞IL-8炎症因子含量有显著作用(P＜0.01)，即试验样品在0.08％浓度下，有明显抑制细胞I-8炎症因子含量的能力，表明该试验样品有一定舒缓功效。
四、透明质酸酶抑制率
1、试验目的和原理
透明质酸酶是透明质酸的特异性裂解酶，是过敏反应的参与者，与肥大细胞释放组胺等有强相关性。试验样品是否具有舒缓功效，可以利用透明质酸酶抑制率来判断，透明质酸酶抑制率越高则反映该物质舒缓功效越强，反之则越弱。
本试验参考实验室方法(HMC-WI-029透明质酸酶抑制率)，将试验样品与阴性对照进行透明质酸酶抑制率试验结果比对，如试验样品的抑制率高于阴性对照的抑制率且具有显著性差异(P＜0.05)，则可认为试验样品具有一定的舒缓功效。
2、试验指标
试验指标：透明质酸酶抑制率
判定标准：样品透明质酸酶抑制率高于阴性对照且具有显著性差异(P＜0.05)，则可认为试验样品具有一定的舒缓功效。
3、试验材料与方法
3.1仪器设备
BSA224S分析天平
L6s紫外分光光度计
3.2、试剂
透明质酸酶，BR；
透明质酸钠，BR
3.3、试验方法
(1)对照物及试验样品的处理
实施例1中的组合物用纯水稀释至样品质量浓度为0.5％；
实施例1、5、6、7、8；对比例1-9中的组合物：分别用纯水稀释至样品质量浓度为2％；
阳性对照物(甘草酸二钾，纯度>98％)：用水稀释至阳性对照物浓度为3％；阴性对照物：纯水。
(2)试验操作步骤
设立样品组、样品本底组、溶剂组和溶剂本底组，每个组别需设立3个平行，分别在四组中加入不同试剂溶液，摇匀，室温放置30min显色，用紫外分光光度计测定波长为528nm处吸光度值。
(3)计算公式
透明质酸酶抑制率＝(1-(T-T0)/(C-C0)*100％
式中：A-为不含样品的反应溶液的吸光度；B-为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；
C-为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；D-为含有样品和不含酶的反应溶液的吸光度。
(4)数据分析
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物透明质酸酶抑制率之间的比较采用独立样本t检验。
上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05；P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；p＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
4、试验结果9：
表9
注：透明质酸酶抑制率保留三位小数，P＜0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异。
按照实验室方法(HMC-WI-029透明质酸酶抑制率)，对样品的舒缓功效进行实验室方法测试；测试结果表明：阳性对照透明质酸酶抑制率>50％，反应体系有效，当样品稀释成0.5％、2％水溶液时，与阴性对照相比具有显著性差异(P＜0.05)，表明样品有一定的舒缓功效；并且本申请提供的技术方案其透明质酸酶抑制率明显大于对比例提供的产品的透明质酸酶抑制率，说明本申请复配后的技术方案协同增效。

Claims (10)

1.一种多重护肤功效的组合物，其特征在于，主要包括下述重量份组分：芍药根提取物1-3份、显齿蛇葡萄叶提取物0.1-0.5份、五味子果提取物2-6份。
2.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，还包括丁醇90-95份。
3.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，还包括桃树脂提取物0.5-2份。
4.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，还包括苹果果提取物0.5-2份。
5.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，还包括石榴皮提取物0.2-0.8份、虎杖提取物0.2-0.6份。
6.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，还包括石人参提取物0.1-0.5份。
7.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，所述的芍药根提取物通过下述方法提取得到的：
1)将芍药根清洗干净、烘干和粉碎，得芍药根粉末；
2)按照1：20料液比将步骤1)所述的芍药根粉末浸泡在75％的乙醇溶液中，浸泡4-6个小时后，置入超声波提取仪器中，设置超声波功率300瓦，提取10-15分钟，过滤收集上清液；
3)将上清液通过AB-8大孔树脂，采用85％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，在再0.05MPa、温度为50℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～-50℃，冷冻干燥4～8h，得芍药根提取物。
8.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，所述的显齿蛇葡萄叶提取物通过下述方法提取得到的：
1)称取粉碎后的显齿蛇葡萄嫩叶，加入75％的乙醇溶液浸泡12小时，置入超声波提取仪器中，设置超声波功率250瓦，提取30分钟，过滤收集上清液，将浸提液浓缩干燥后加去离子水，配制成浓度为1.5mL/g的显齿蛇葡萄嫩叶根浸提液，并将浸提后的显齿蛇葡萄嫩叶药渣置30℃下干燥；
2)称取经过步骤1)干燥后的显齿蛇葡萄嫩叶根药渣，按照料液比1：15的比例在药渣中加入去离子水，煎煮1h，过滤后在药渣中加入蒸煮前显齿蛇葡萄嫩叶药渣5倍体积的75％的乙醇，搅匀，静置并抽滤获得提取液
3)将提取液离心处理使固液分离，将固体残渣过滤得到滤液；重复浸提2次，并将上述滤液合并得到显齿蛇葡萄嫩叶根提取液，用AB-8大孔树脂吸附，弃去残液，再用85％乙醇水溶液洗脱AB-8大孔树脂后，收集洗脱液，将洗脱液在再0.05MPa、温度为450℃，减压浓缩40-60min至浓缩液，再压力为5～10Pa，温度为-20℃～-50℃，冷冻干燥10～15h，得显齿蛇葡萄叶提取物。
9.根据权利要求1所述的多重护肤功效的组合物，其特征在于，所述的五味子果提取物通过下述方法提取得到的：
1)将新鲜五味子果根洗净后，紫外线消毒，用压榨机压榨出五味子果粗汁液，再转移到离心机中，在2500r/min条件下离心25min，收集上清液；
2)向步骤1)制备的加入3g活性炭静置吸附24h，达到吸附平衡，转移到离心机中，在3000r/min的转速下离心30min，去除活性炭，再次收集上清液；
3)对步骤2)制得的上清液再用孔径为0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌，制得五味子果粗提取物；
4)向步骤3)制备的五味子果粗提取物添加五味子果粗提取物质量0.5％的植物乳杆菌，五味子果粗提取物质量0.8％的维素酶，五味子果粗提取物质量0.5％的酸性蛋白酶，并且添加柠檬酸调节提取液pH值为3-4，充分混匀后于超声波提取装置，设置超声功率220W，提取温度为45℃，提取时间100-120min；
5)将提取液浓缩在0.02MPa、温度为80℃，减压浓缩50-100min至浓缩液，再压力为10Pa，温度为-60℃，冷冻干燥20h，得五味子果提取物。
10.权利要求1所述的多重护肤功效的组合物作为化妆品添加剂的应用。
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