CN116500168A - β-丙氨酸和哌啶酸的组合作为巨大儿预测标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了β‑丙氨酸和哌啶酸的组合作为巨大儿预测标志物的应用，本发明属于分析化学及临床医学技术领域。本发明通过采用UPLC‑QexactiveMS比较正常对照和巨大儿母亲孕期血浆中的代谢小分子，发现了孕期血浆中存在可用于评估母亲是否孕有巨大儿，具有诊断价值的血浆代谢小分子标志物组合β‑丙氨酸和哌啶酸，可用于临床诊断巨大儿或制备诊断巨大儿的试剂、试剂盒。

Description

β-丙氨酸和哌啶酸的组合作为巨大儿预测标志物的应用

技术领域

本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及β-丙氨酸和哌啶酸的组合作为巨大儿预测标志物的应用。

背景技术

巨大儿(Macrosomia)是指出生后1小时内体重大于等于4kg的新生儿。巨大儿的发生对母婴皆有危害。我国产妇中巨大儿造成的难产死亡率高于顺产死亡率；巨大儿引起的剖宫术后引发的伤口感染、腹腔粘连、子宫内膜异位等疾病，都有可能直接或间接导致产妇及新生儿的死亡。巨大儿对新生儿的健康也有危害。巨大儿在分娩时通过勉强的牵拉过程易引发骨骼损伤，因为分娩时间的延长，还会发生窒息，甚至死亡；剖宫产术后的巨大儿易发生低血糖、红细胞增多症、高胆红素血症和肺部的并发症。此外，巨大儿中发生心脏畸形的比例高于一般正常体重儿。现在研究发现，巨大儿长大后患肥胖症的几率较大，将成为糖尿病、高血压等多种疾病的易患人群。

目前，巨大儿的早期诊断一般基于母亲的一些易感医学特征比如患有糖尿病、肥胖和过期妊娠。然而对于不具备上述特征的人群，巨大儿的早期诊断需要依赖B超检测。然而B超检测时间较长，检查价格较高，且有些孕妇对B超检查的辐射也较为担心。这些都给巨大儿诊断带来了难度并且给家庭带来严重的经济负担，因而亟需找到新的巨大儿诊断的方法。

代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。

正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。通过代谢组学分析了解代谢小分子在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找有关的生物标志物(biomarker)可以辅助疾病的诊断和预测，也可以帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。近年来，代谢组学在人类各类疾病的研究中、在疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌症，相关论文发表在学术期刊《Nature》、《Nature medicine》、《Journal ofhepatology》和《Cancerresearch》上，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。然而采用代谢组学分析孕期血浆中代谢小分子在巨大儿早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注。

目前，代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术(NMR)。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏，样本前处理简单，但灵敏度较低；气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点。UPLC-Q exactive MS是新一代高分辨质谱与超高效液相的组合，具有相比传统LC-MS更强的灵敏度、特异度和稳定性。故而本发明采用UPLC-Q exactive MSS进行代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与巨大儿发病相关的特异血浆代谢小分子作为生物标志物，并研发相应疾病的代谢小分子标志的UPLC-Q exactive MS检测方法，不仅在该领域处于国际领先地位，还可创造令人瞩目的经济效益，对提高我国母婴健康水平也将是一次强有力的推动。

发明内容

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了β-丙氨酸和哌啶酸的组合作为巨大儿预测标志物的应用。

优选的，所述β-丙氨酸和哌啶酸存在于孕期血浆代谢物中。

本发明还提供了β-丙氨酸和哌啶酸的组合在制备巨大儿早期诊断或监测试剂中的应用。

本发明还提供了一种早期诊断或监测巨大儿的试剂盒，包括如下试剂：β-丙氨酸标准品、哌啶酸标准品、碳13标记的β-丙氨酸、碳13标记的哌啶酸。

优选的，还包括如下仪器或试剂：Hypersil GOLD C18色谱柱、甲醇、含0.1％的甲酸的水、含0.1％的甲酸的乙腈、超纯水。

本发明通过采用UPLC-Q exactive MS比较正常对照和巨大儿母亲孕期血浆中的代谢小分子，发现了孕期血浆中存在可用于评估母亲是否孕有巨大儿，具有诊断价值的血浆代谢小分子标志物组合，以及该血浆代谢小分子标志物检测的UPLC-Q exactive MS的应用，研制出可便于临床应用的巨大儿诊断、监测试剂盒。

附图说明

图1为实施例1中第一阶段纳入的100名孕产中巨大儿和对照婴儿出生体重差异；箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端线段和下端线段分别代表最大值和最小值，箱式图中间的粗线段表示中位数，(+)为平均数。

图2为实施例1中第二阶段纳入的30名孕产中巨大儿和对照婴儿出生体重差异，箱式图的含义同图1。

图3为实施例3中采用孕期血浆代谢小分子含量信息制作的正常对照组和巨大儿组之间的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明以下实施例中以标准操作程序(SOP)采集符合标准的孕期血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC-Qexactive MS的代谢组学方法进行分析。

实施例1研究对象选择和分组依据

本实施例从南京医科大学附属南京妇幼保健院搜集符合要求的巨大儿患儿及正常儿童的病例。对出生后新生儿称重，如出生后1小时内体重等于或大于4kg者，即诊断为“巨大儿”，同时采集母亲孕期血液样品。

一、研究对象选择和分组依据

第一阶段随机纳入了符合要求的100例孕产妇样本，其中15例为巨大儿(巨大儿和对照婴儿出生体重差异见图1)；第二阶段纳入30例孕产妇样本，其中15例为健康对照，15例为巨大儿(巨大儿和对照婴儿出生体重差异见图2)，作为巨大儿孕期血液代谢小分子生物标志物的筛选实验对象。具体的样品归类标准如下：

第一阶段筛选阶段

随机纳入孕产妇共100人。

1.年龄在23到36岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病；

7.含巨大儿病例(婴儿出生体重≥4kg，15人)。

第二阶段验证阶段

纳入病例巨大儿组和健康对照组孕产妇共30人。

A组：健康对照组(15人，2.5kg≤婴儿出生体重<4kg)：

1.年龄在23到33岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病。

B组：巨大儿组(15人，婴儿出生体重≥4kg)：

1.年龄在25至34岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病。

实施例2、UPLC-Q exactive MS代谢组学分析和巨大儿诊断用代谢小分子筛选和验证

1.样本前处理

1.1取实施例1收集的第一和第二阶段巨大儿组和健康对照组新鲜孕期血液于离心机3000rpm离心5min，取血浆上清100μl分装至洁净1.5ml EP管中。

1.2取50μl步骤1.1中的血浆上清用150μl甲醇沉淀蛋白。

1.3吸取步骤1.2中的上清，用氮气吹干再用真空干燥。

1.4用100μL水溶解真空干燥物。

2.仪器检测

2.1分析仪器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive高分辨质谱仪。

2.2.液相条件：

2.2.1液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm,Thermo Scientific,Germany)，柱温为40℃。

2.2.2采用的流动相为(A)含0.1％甲酸的水和(B)含0.1％甲酸的乙腈，流速为400μL/min。

2.2.3仪器梯度为：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min 99％到1％B，13.1-17min 1％B。

2.2.4进样方式：体积10μl。

2.3质谱条件

2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。

2.3.2正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70to 1050m/z；分辨率：70000；自动增益控制(ACG)：1×10^-6charges；最大注射时间：30ms。

3.物质定性

代谢小分子定性采用与标准品β-丙氨酸和哌啶酸比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息)，并实时比对样本中同位素内标标准品(碳13标记的β-丙氨酸、碳13标记的哌啶酸稳定同位素内标物)的色谱信息(保留时间)。

4.数据分析

生物标志物筛选采用Logistic回归筛选稳健的与巨大儿有关的代谢物组合，再采用调整协变量的多元Logistic回归确认关键代谢物组合。结果如表1所示。

表1第一阶段人群Logistic回归分析和经过校正母亲孕周和BMI的多元Logistic回归分析

注：¹模型根据孕周和BMI进行调整。

从表1中可以看出，第一阶段人群Logistic回归分析发现孕期血浆β-丙氨酸和哌啶酸的比值组合能够增加发生巨大儿的风险，OR值为2.26，P值为0.017。通过调整母亲孕周和BMI，多元Logistic回归分析发现孕期血浆β-丙氨酸和哌啶酸的比值组合能够增加发生巨大儿的风险，OR值为2.22，P值为0.044，与Logistic原始回归分析结果一致。

实施例3代谢小分子组合对巨大儿的诊断

根据上述UPLC-Q exactive MS代谢组学方法，本实施例采用独立人群15病例和15对照的孕期血浆样品检测β-丙氨酸和哌啶酸，以此绘制ROC曲线并评估预测的灵敏性和特异性，进而评估检测血浆中这2个代谢小分子水平对巨大儿的评估能力。

结果如图3所示，组合β-丙氨酸和哌啶酸诊断巨大儿，灵敏度为73.33％，特异度为86.67％，ROC曲线下面积为0.8578。故而组合β-丙氨酸和哌啶酸具有较好地诊断巨大儿的能力。

实施例4用于巨大儿血浆代谢小分子检测和诊断试剂盒的制作

根据上述一系列实验结果，本实施例提供了一种能用于巨大儿动态监测的诊断试剂盒。

所述诊断试剂盒包含

β-丙氨酸标准品

哌啶酸标准品

碳13标记的β-丙氨酸(内标物)

碳13标记的哌啶酸(内标物)

色谱柱(Thermo 100mm×2.1mm,粒径1.9μm，Hypersil GOLD C18色谱柱)

试剂A(含100％甲醇)(用于沉淀血浆蛋白)

试剂B(含0.1％的甲酸的水)(流动相)

试剂C(含0.1％的甲酸的乙腈)(流动相)

试剂D(100％超纯水)(用于提取代谢小分子)。

此试剂盒的价值在于只需要100μl孕期血浆，即可检测血浆代谢小分子标志物(β-丙氨酸和哌啶酸)的含量，再通过所测含量预测巨大儿发生的可能性或诊断为巨大儿病，易于进行动态监测和观察治疗效果。

本发明采用孕期血浆代谢小分子作为巨大儿评价的标志物的优越性在于：

(1)血浆代谢小分子是一种新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高巨大儿诊断的敏感性和特异性，该类小分子生物标志物的成功开发将为不良出生结局的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的血浆代谢小分子标志物可用于巨大儿的诊断标志物，可在早期通过微创方式预测巨大儿的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用巨大儿和健康对照人群的母亲孕期血浆样本进行验证，证明了孕期血浆中β-丙氨酸和哌啶酸水平在预测巨大儿中具有较高灵敏度和特异度，可作为标志物使用。

(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血浆代谢小分子，应用UPLC-Q exactive MS进行独立人群验证，保证了该血浆代谢生物标志物和诊断方法的可靠性。

(5)UPLC-Q exactive MS技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，具有较高的临床诊断实用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.β-丙氨酸和哌啶酸的组合作为巨大儿预测标志物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β-丙氨酸和哌啶酸存在于孕期血浆代谢物中。

3.β-丙氨酸和哌啶酸的组合在制备巨大儿早期诊断或监测试剂中的应用。

4.一种早期诊断或监测巨大儿的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：β-丙氨酸标准品、哌啶酸标准品、碳13标记的β-丙氨酸、碳13标记的哌啶酸。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括如下仪器或试剂：HypersilGOLDC18色谱柱、甲醇、含0.1％的甲酸的水、含0.1％的甲酸的乙腈、超纯水。