CN116496970A - 一种微载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微载体及其应用，该微载体具有三维立体结构，所述微载体具有壳层且内部为空心或实心，所述壳层外壁不平整且具有多处凹陷点。该微载体提高了传统微载体的渗透性，有利于细胞与外界环境进行物质交换，提高了细胞活率，为细胞增殖提供了良好的机械保护以及构建良好的细胞生长的三维结构，实现了细胞的友好连接，有利于细胞在有限空间中的大规模扩增，以及在长期培养中维持细胞理化性质的稳定。

Description

一种微载体及其应用
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种微载体及其应用。
背景技术
随着生命医学领域的快速发展，二维细胞培养无法满足实验室及企业对于细胞数量的需求。相比于三维细胞培养，二维细胞培养的劣势越来越凸显，主要表现在：(1)二维细胞培养只能用培养皿进行细胞的培养，贴壁生长的细胞增殖受限于皿底的大小，长期培养需要耗费大量的人力物力，且无法实现短时间的大规模扩增，资源损耗较大；(2)二维培养细胞无法为细胞的生长构建一个友好的微环境，细胞在平面上增殖，长期培养会影响细胞的结构，为后续研究带来困难。
因此，能够为细胞提供三维培养的载体结构还需进一步研究。
发明内容
本发明旨在解决上述二维细胞培养的突出问题之一。本发明提供了一种微载体及其制备方法并对其应用进行了说明。本发明提供的微载体提高了传统微载体的渗透性，有利于细胞与外界环境进行物质交换，提高了细胞活率，为细胞增殖提供了良好的机械保护以及构建良好的细胞生长的三维结构，实现了细胞的友好连接，有利于细胞在有限空间中的大规模扩增，以及在长期培养中维持细胞理化性质的稳定；本发明的微载体具有更加灵活的结构特点，可以满足生物，医疗，临床治疗等多种应用场景。
为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种微载体，其中，所述微载体具有三维立体结构，所述微载体具有壳层且内部为空心或实心，所述壳层外壁不平整且具有多处凹陷点。
在一些实施方案中，所述壳层外壁的凹陷面积占壳层外壁总表面积的比例为15％以上，例如20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上，或者例如20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％或90％-95％，具体例如15％、20％、50％、60％、80％、85％或90％。
在一些实施方案中，所述壳层外壁具有的凹陷点的数量为2～800个，可选的凹陷点的数量为2～700个，可选的凹陷点的数量为2～600个，可选的凹陷点的数量为2～500个，可选的凹陷点的数量为2～400个，可选的凹陷点的数量为2～300个，可选的凹陷点的数量为2～200个，可选的凹陷点的数量为5～200个，可选的凹陷点的数量为5～100个。
在一些实施方案中，所述壳层外壁具有的凹陷点的数量为5～60个，例如5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55或55-60个。在一些具体实施方案中，所述壳层外壁具有的凹陷点的数量为10～60个(具体例如为10个、20个、25个、30个、40个、50个或60个)。
在一些实施方案中，所述壳层外壁具有的凹陷点的形状选自圆弧状凹陷(或称为弧形凹陷)、细槽型凹陷(或称为狭长型凹陷)、球形凹陷、多边形凹陷、不规则凹陷或其任意组合。
在一些实施方案中，所述圆弧状凹陷的平均半径为1～500μm，可选的平均半径为1～400μm，可选的平均半径为1～300μm，可选的平均半径为10～300μm，可选的平均半径为50～300μm，可选的平均半径为80～300μm，可选的平均半径为80～200μm。
在一些实施方案中，所述圆弧状凹陷的平均半径为1-100μm，例如，1-10μm、10-20μm、20-30μm、30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm或90-100μm。
在一些实施方案中，所述细槽型凹陷的凹陷面的平均宽度为1～500μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～400μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为10～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为50～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～200μm。
在一些实施方案中，所述细槽型凹陷的平均宽度为1-100μm，例如，1-10μm、10-20μm、20-30μm、30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm或90-100μm。
在一些实施方案中，所述多边形凹陷的凹陷面的平均宽度为1～500μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～400μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为10～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为50～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～200μm。
在一些实施方案中，所述多边形凹陷的凹陷面的平均宽度为1-100μm，例如，1-10μm、10-20μm、20-30μm、30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm或90-100μm。
在一些实施方案中，所述不规则凹陷的凹陷面的平均宽度为1～500μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～400μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为10～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为50～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～200μm。
在一些实施方案中，所述不规则凹陷的凹陷面的平均宽度为1-100μm，例如，1-10μm、10-20μm、20-30μm、30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm或90-100μm。
在一些实施方案中，所述球形凹陷的平均半径小于500μm，可选的平均半径小于400μm，可选的平均半径小于300μm，可选的平均半径小于200μm，可选的平均半径小于100μm，可选的平均半径小于50μm，可选的平均半径小于20μm，可选的平均半径小于10μm。
在一些实施方案中，所述球形凹陷的平均半径小于100μm，例如小于90μm、小于80μm、小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm、小于30μm、小于20μm或小于10μm。
需要说明的是，所述平均宽度指的是最短边的平均长度，例如，所述细槽型凹陷的平均宽度，指的是所述细槽型凹陷的最短边的平均长度。
在一些实施方案中，所述微载体的平均粒径为1～3000μm，可选的平均粒径为1～2000μm，可选的平均粒径为1～1000μm，可选的平均粒径为1～800μm，可选的平均粒径为1～600μm，可选的平均粒径为10～600μm，可选的平均粒径为50～500μm，可选的平均粒径为100～500μm，可选的平均粒径为100～400μm。
在一些实施方案中，所述微载体的平均粒径为10-500μm，例如10-50μm、50-100μm、100-150μm、150-200μm、200-250μm、250-300μm、300-350μm、350-400μm、400-450μm或450-500μm。
在一些实施方案中，所述微载体的平均粒径为30-400μm。
在一些实施方案中，所述壳层的厚度为1-100μm，可选的厚度为1-90μm，可选的厚度为1-80μm，可选的厚度为1-70μm，可选的厚度为1-60μm，可选的厚度为1-50μm。
在一些实施方案中，所述壳层的厚度为1-100μm，例如1-10μm、10-20μm、20-30μm、30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm或90-100μm。
在一些实施方案中，所述微载体具有的三维立体结构为圆球、梭形、椭圆球、棒状、扁球体或不规则球体。在一些具体实施方案中，所述微载体具有的三维立体结构为圆球状。
在一些实施方案中，所述微载体的内部为空心，所述微载体具有非封闭式三维立体结构。在一些实施方案中，所述微载体的壳层具有一个或多个通孔，所述通孔穿透所述壳层以便联通壳层的内部和外部。
在一些实施方案中，所述微载体内部的空心结构通过溶出占位材料来得到。
在一些实施方案中，所述壳层的外壁和/或内壁经过表面修饰。
在一些实施方案中，所述壳层的外壁和/或内壁经过RGD表面修饰。
在一些实施方案中，所述微载体负载有细胞。
在一些实施方案中，所述细胞设置在所述微载体的壳层内壁，或者设置在所述微载体的壳层外壁，或者同时设置在所述微载体的壳层内壁和所述微载体的壳层外壁。
在一些实施方案中，所述细胞同时设置在所述微载体的壳层内壁和所述微载体的壳层外壁时，设置于壳层内壁和壳层外壁的细胞种类可以相同或不同。
在一些实施方案中，所述微载体的壳层外壁设置有细胞时，所述细胞设置在所述壳层外壁的凹陷点处，或者设置在所述壳层外壁的光滑表面处(即非凹陷点处)，或者同时设置在所述壳层外壁的凹陷点处和光滑表面处。
在一些实施方案中，所述微载体的壳层外壁设置有细胞时，所述细胞设置在所述壳层外壁的凹陷点处。
在一些实施方案中，所述细胞通过所述通孔设置在所述微载体的壳层内壁。
在一些实施方案中，所述细胞通过细胞注射设置在所述微载体的壳层内壁。
在一些实施方案中，所述细胞通过与所述微载体进行共培养设置在所述微载体的壳层外壁。
在一些实施方案中，所述细胞选自原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、植物细胞、动物细胞、藻类细胞、真菌细胞、人造细胞或其任意组合。
在一些实施方案中，所述细胞选自干细胞、体细胞、生殖细胞或其任意组合。
在一些实施方案中，所述干细胞选自胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、上皮干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、中胚层干细胞、内皮干细胞或其任意组合。
在一些实施方案中，所述体细胞选自上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、骨细胞、肝细胞、胰腺细胞、外源细胞、内源细胞、心肌细胞、骨骼细胞、心脏成肌细胞、骨骼成肌细胞、少突胶质细胞、神经胶质细胞、造血细胞、神经元或其任意组合。
在一些实施方案中，所述生殖细胞选自卵母细胞、精子、卵原细胞、精原细胞或其任意组合。
在一些实施方案中，所述壳层或所述微载体由生物材料制成。即，若所述微载体内部为空心，则所述壳层由生物材料制成；若所述微载体内部为实心，则所述微载体由生物材料制成。
在一些实施方案中，所述生物材料选自人工合成的生物材料、天然生物材料或其组合。
在一些实施方案中，所述人工合成的生物材料选自聚乙二醇，聚乙二醇衍生物，聚乳酸，聚乳酸醇共聚物，聚酸酐，聚酸酯，聚氨基酸，聚氧化乙烯，聚酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚碳酸酯，聚氨基甲酸酯，聚己内酯，聚羟基脂肪酸酯，聚硅氧烷，聚乙烯，聚氯乙烯，聚四氟乙烯，聚苯乙烯，聚丙烯，马来酸酐接枝共聚物，聚丙烯酰胺，聚缩醛，聚吡咯或其任意组合。
在一些实施方案中，其中，所述天然生物材料选自天然蛋白质，胶原及胶原衍生物，明胶及明胶衍生物，琼脂及琼脂衍生物，蛋白多糖，海藻酸盐及其海藻酸盐衍生物，基质胶，蜂胶，纤维素及纤维素衍生物，甲壳素及甲壳素衍生物，蚕丝蛋白及其衍生物，层连接蛋白及其衍生物，纤维连接蛋白及其衍生物，透明质酸钠及透明质酸衍生物，琼脂糖及其衍生物，葡聚糖及其衍生物，蔗糖及蔗糖衍生物，淀粉，壳聚糖及壳聚糖衍生物或其任意组合。
在一些实施方案中，所述生物材料选自透明质酸钠、明胶。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种微载体聚集体，其中，所述聚集体由前述的微载体颗粒聚集而成。
在一些实施方案中，所述聚集体是单一性状微载体的集合体，或各种性状微载体任意比例的集合体。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种制备前述的微载体的方法，如图5，其包括：
(a)提供有机相溶液；
(b)提供水相溶液；
(c)将所述水相溶液加入所述有机相溶液，形成混合液；使所述混合液乳化，混合均匀，形成均一的油包水体系；
(d)将所述油包水体系进行过滤，滤饼为待处理的载体基质；
(e)将所述待处理的载体基质进行后处理，以便溶出占位材料，并用包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白与后处理后的载体基质进行缀合，获得所述微载体；
任选地，所述缀合后进一步包括清洗、筛分和冻干的步骤。
在一些实施方案中，所述乳化是在温度为4-200℃，如20-75℃，或者如20-25℃下进行的。
在一些实施方案中，所述乳化的时间是4-72h，优选5-30h，例如5-10h、10-15h、15-20h、20-25h或25-30h，具体如10h。
在一些实施方案中，所述乳化是通过搅拌法，超声法，震荡法或微流道法实现的。在一些实施方案中，乳化时的转速为100-5000rpm/min，优选为300-1000rpm/min，例如300-400rpm/min、400-500rpm/min、500-600rpm/min、600-700rpm/min、700-800rpm/min、800-900rpm/min或900-1000rpm/min，具体如600rpm/min。
在一些实施方案中，所述有机相溶液是通过将有机溶剂与非离子表面活性剂进行混合得到的。在一些实施方案中，所述混合是在温度为4-200℃，优选20-75℃(例如20-25℃、25-30℃、30-35℃、35-40℃、40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃、60-65℃或65-70℃，具体如60℃)下进行的。在一些实施方案中，所述混合的时间为10-120min，优选10-60min。在一些实施方案中，所述混合是在搅拌桨的作用下进行的。在一些实施方案中，所述搅拌桨的转速为100-2000rpm/min，优选为300-1000rpm/min，例如300-700rpm/min。在一些实施方案中，所述有机溶剂选自液体石蜡，石油醚，四氯化碳，二甲基亚砜，三氯甲烷，二氯甲烷，食用油，硅油，大豆油，矿物油或其任意组合。在一些实施方案中，所述有机溶剂为液体石蜡。在一些实施方案中，所述非离子表面活性剂选自吐温，司班80，脂肪酸甘油酯，十二烷基苯磺酸钠，PO-500,氢氟醚，聚乙二醇，嵌段聚氧乙烯-聚氧丙烯醚(PO-EO共聚物)，多元醇酯类或其任意组合。在一些实施方案中，所述非离子表面活性剂为司班80。在一些实施方案中，所述有机溶剂与所述非离子表面活性剂的体积比为200-400:1，例如200:1、210:1、220:1、230:1、240:1、250:1、260:1、270:1、280:1、290:1、300:1、310:1、320:1、330:1、340:1、350:1、360:1、370:1、380:1、390:1或400:1，具体如300:1。
在一些实施方案中，所述水相溶液是通过如下步骤得到的：将生物材料溶解在水中，获得溶解液；占位材料和固化剂悬浮在所述溶解液中，形成分散均匀的悬浊液，所述悬浊液即为所述水相溶液。在一些实施方案中，所述溶解是在温度为4-200℃，优选10-80℃下进行的。在一些实施方案中，所述分散均匀的悬浊液是通过搅拌、震荡、超声或摇晃实现的，优选地，转速为100-2000rpm/min，优选为300-700rpm/min。
在一些实施方案中，所述水相溶液中，所述生物材料的质量分数为3-10％，例如为3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选为5％-10％，具体如5％或10％。
在一些实施方案中，所述水相溶液中，所述占位材料的质量分数为0.01-1％，例如0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1％，优选为0.05％-1％，具体如0.05％、0.1％、0.5％或1％。
在一些实施方案中，所述水相溶液中，所述固化剂的质量分数为0.5-7％，例如0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％或7％，优选为0.5％-5％，具体如0.5％或5％。
在一些实施方案中，所述生物材料选自人工合成的生物材料、天然生物材料或其组合。
在一些实施方案中，所述人工合成的生物材料选自聚乙二醇，聚乙二醇衍生物，聚乳酸，聚乳酸醇共聚物，聚酸酐，聚酸酯，聚氨基酸，聚氧化乙烯，聚酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚碳酸酯，聚氨基甲酸酯，聚己内酯，聚羟基脂肪酸酯，聚硅氧烷，聚乙烯，聚氯乙烯，聚四氟乙烯，聚苯乙烯，聚丙烯，马来酸酐接枝共聚物，聚丙烯酰胺，聚缩醛，聚吡咯或其任意组合。
在一些实施方案中，所述天然生物材料选自天然蛋白质，胶原及胶原衍生物，明胶及明胶衍生物，琼脂及琼脂衍生物，蛋白多糖，海藻酸盐及其海藻酸盐衍生物，基质胶，蜂胶，纤维素及纤维素衍生物，甲壳素及甲壳素衍生物，蚕丝蛋白及其衍生物，层连接蛋白及其衍生物，纤维连接蛋白及其衍生物，透明质酸钠及透明质酸衍生物，琼脂糖及其衍生物，葡聚糖及其衍生物，蔗糖及蔗糖衍生物，淀粉，壳聚糖及壳聚糖衍生物或其任意组合。
在一些实施方案中，所述生物材料选自透明质酸钠、明胶。
在一些实施方案中，所述占位材料选自聚乙二醇及聚乙二醇衍生物，石蜡球，氧化海藻酸盐及其衍生物，聚己内酯，二氧化硅，蜂蜡，蜂胶，琼脂，琼脂糖，海藻酸盐及其衍生物，大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂，磷脂，葡聚糖，壳聚糖，淀粉，明胶，透明质酸钠及透明质酸衍生物或其任意组合。
在一些实施方案中，所述占位材料选自琼脂糖、葡聚糖，透明质酸钠。
在一些实施方案中，所述固化剂选自N,N-亚甲基双丙烯酰胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二异氰酸酯，戊二醛，京平尼，硫酸铵，钙离子，丁二醇二缩水甘油醚，转谷酰胺酶，二乙烯基苯，己二酸二酰肼或其任意组合。
在一些实施方案中，所述固化剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、戊二醛。
在一些实施方案中，所述过滤是通过过滤装置实现的，所述过滤装置的网孔直径为30-1000微米。
在一些实施方案中，所述过滤装置具有四层结构，第一层的网孔直径为500-800微米，第二层的网孔直径为300-400微米，第三层的网孔直径为200-300微米，第四层的网孔直径为100-200微米。
在一些实施方案中，所述溶出占位材料是通过以下步骤实现的：将所述待处理的载体基质与有机溶剂进行混合，以便溶出占位材料。在一些实施方案中，所述混合是在温度为15℃-150℃，优选25-100℃(如25-30℃、30-35℃、35-40℃、40-45℃或45-50℃，具体如25℃)下进行4-48h，优选6-24h(如6-8h、8-10h、10-12h、12-14h、14-16h、16-18h或18-20h，具体如6h)。在一些实施方案中，所述有机溶剂选自丙酮，无水乙醇，石油醚，三氯甲烷，二甲基亚砜，二氯甲烷，石油醚，四氯化碳，乙腈，甲苯，甲醇或其任意组合。在一些实施方案中，所述有机溶剂为无水乙醇。
在一些实施方案中，所述用包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白与后处理后的载体基质进行缀合是通过以下步骤实现的：将所述后处理后的载体基质与所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白进行混合，以便实现所述后处理后的载体基质的RGD表面修饰。在一些实施方案中，所述混合是在温度为15-25℃，优选20℃的条件下进行的。在一些实施方案中，所述混合的时间为4-10小时，优选6小时。
在一些实施方案中，所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白选自胶原或胶原衍生物，明胶或明胶衍生物，纤维连接蛋白，丝素蛋白，层连接蛋白，基质胶或其任意组合。
在一些实施方案中，所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白选自胶原、明胶。
在一些实施方案中，所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白是以溶液的形式提供的。其中，所述溶液的溶剂是本领域技术人员在RGD修饰时常规使用的溶剂，例如，在一些实施方案中，溶剂为水(如去离子水)。另外，所述溶液中，所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白的质量分数是本领域技术人员在RGD修饰时常规使用的质量分数，例如，在一些实施方案中，所述溶液中，所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白的质量分数为0.1％-20％，例如0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含前述的微载体或者前述的微载体聚集体或者前述的方法制备得到的微载体。
在本发明的第五方面，本发明提供了前述的微载体或者前述的微载体聚集体或者前述的方法制备得到的微载体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于细胞三维培养和/或扩增、3D生物打印、仿生结构体构建、细胞治疗、载药或医疗注射。
在一些实施方案中，所述仿生结构体为三维构建体、组织前体、组织、器官或胚胎(如小鼠胚胎)。
在一些实施方案中，所述仿生结构体构建为胚胎仿生模拟构建或软骨仿生构建。
在一些实施方案中，所述仿生结构体为关节软骨的软骨陷窝结构。
在一些实施方案中，所述细胞治疗为皮肤表面治疗、临床角膜治疗、骨治疗或软骨修复与骨损伤治疗。
在本发明的第六方面，本发明提供了前述的微载体或者前述的微载体聚集体或者前述的方法制备得到的微载体的用途，其用于体外细胞三维培养和/或扩增、体外3D生物打印、体外仿生结构体构建、体外载药；优选地，所述用途用于非诊断或治疗目的。
在一些实施方案中，所述仿生结构体为三维构建体、组织前体、组织、器官或胚胎(如小鼠胚胎)。
在一些实施方案中，所述仿生结构体构建为胚胎仿生模拟构建或软骨仿生构建。
在一些实施方案中，所述仿生结构体为关节软骨的软骨陷窝结构。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种体外细胞三维培养和/或扩增的方法，其包括：
1)将细胞接种于前述的微载体或者前述的微载体聚集体或者前述的方法制备得到的微载体上进行培养(例如在37℃二氧化碳恒温培养箱中培养)；
任选地，步骤1)后，进一步包括：
2-A)将步骤1)获得的混合物进行原位冻存(如-80℃冻存)；
或者任选地，步骤1)后，进一步包括：
2-B)将步骤1)获得的负载于微载体上的细胞进行消化、收集。
在一些实施方案中，所述培养为动态培养。
在一些实施方案中，所述动态培养为搅拌式动态培养或悬浮式动态培养。
在一些实施方案中，所述细胞如第一方面所述。
发明的有益效果
1、本发明的微载体可以很好的弥补二维细胞培养出现的缺点，表现出大量的优势：(1)细胞摆脱平面培养空间的限制，不再依赖于平面内，而是在三维空间上生长，短期内可收获大量细胞；(2)微载体及凹陷结构为细胞提供大量的贴附面积，使细胞连结性更好为细胞构建更加友好的生长微环境，更进一步仿生模拟体内细胞生存环境，有利于维持细胞的理化性质；(3)空腔结构细胞三维培养微载体有更加灵活的结构特点，能够为细胞提供友好生存环境的同时提供更加独特的结构支撑，与传统微载体相比有空腔结构的存在提高了微载体的渗透性，加快了营养物质的交换与输送，大幅提高细胞存活率及扩增速率，有利于在实验室级别有限的空间内实现细胞的快速扩增；空腔结构细胞三维培养微载体更加灵活的结构特点可满足生物，医疗，临床等多种应用场景。
2、本发明的微载体生物相容性好，能够实现细胞的良好黏附，实现细胞的生长和增殖。
3、本发明的微载体能够在短时间内实现培养基的渗透，有利于细胞与外界进行物质交换，细胞在微载体表面长满后，投入新的微载体，当球与球接触后，细胞可以实现跨球生长。利用该微载体对细胞进行长期培养，培养较长时间(例如7天)后细胞仍保持较高活率和增殖。
4、利用本发明的微载体进行干细胞的培养和扩增，干细胞粘附性良好，长期培养干细胞保持较高活率和增殖率。
5、利用本发明的微载体用于大鼠软骨细胞进行培养和扩增能够实现大规模扩增培养，可以模拟体内培养环境，维持软骨细胞的生物功能。
6、本发明的微载体表面有大的凹陷结构，利用该结构特点，在微载体上接种大鼠软骨细胞后能够促进软骨细胞的聚集生长与增殖进而模拟体内关节软骨的软骨陷窝结构，同时可以对微载体进行多肽和因子修饰促进软骨细胞的分泌功能。
7、利用本发明的微载体进行干细胞的封装和培养，将干细胞封装在微载体后具有良好的生物活性，加入诱导因子后可在微载体内进行定向分化，培养较长时间(例如7天)后细胞仍保持较高活率和增殖。
8、本发明的微载体用于小鼠胚胎仿生结构模拟，将小鼠胚胎干细胞封装在微载体内部，具有体外诱导分化成三胚层的潜能；微载体表面粘度小鼠滋养层干细胞，可以实现与内部小鼠胚胎干细胞的相互作用，具备小鼠胚胎植入的潜能。
9、对于本领域技术人员来说，常规的细胞冻存都是指细胞和冻存液一起冻存,其中冻存液中包含10％CPA(防冻剂，对细胞有一定毒性)。而本发明的微载体在进行细胞培养后可直接(即连同细胞一起)进行原位-80℃冻存，可将防冻剂(CPA)减少50％，复苏后细胞活率可达70％以上。需要说明的是，这里的原位冻存是指细胞在本发明的微载体上增殖长满以后可以连同微载体一起与冻存液冻存，其中冻存液中的CPA浓度可从原来的10％减少至5％。
10、现有技术中有些微载体在细胞增殖长满后，无法通过消化将细胞完全分离下来，还有些微载体在细胞增殖长满且消化后，细胞的功能性发生了改变，例如，干细胞不再具有干性等等。而本发明的微载体可以进行细胞大规模扩增，扩增完成后可直接对细胞进行消化收集，使用该微载体进行细胞扩增，培养7天后细胞扩增可达12倍，更重要的是，细胞的功能性(例如细胞的干性即分化能力)保持稳定。
11、本发明的微载体可以进行细胞大规模动态培养，包含搅拌式动态培养及悬浮式动态培养，在动态培养过程中，该微载体可耐受较大剪切力，可以对细胞提供保护使细胞免受剪切损害，且微载体渗透性良好，细胞粘附后可以及时进行物质交换，利用该方法扩增细胞，细胞状态良好，具备较高活率及增殖率，更重要的是，细胞的功能性保持稳定。
附图说明
图1为本发明实施例的微载体结构SEM图；
图2为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图3为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图4中A为鼠软骨切片显微形貌图，B为软骨细胞与微载体共培养1天后细胞粘附图；
图5为本发明微载体制备流程示意图；
图6为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图7为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图8为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图9为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图10为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图11为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图12为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图13为本发明实施例的微载体冻存后细胞活死染色结果图；
图14为本发明实施例的微载体动态培养细胞活死结果图；
图15为本发明实施例的微载体动态培养细胞增殖曲线图；
图16为本发明实施例的微载体动态培养细胞后细胞干性表征图；
图17为本发明实施例的微载体显微形貌图；
图18为本发明实施例的微载体渗透性表征图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
需要说明的是，以下实施例中，微载体水化溶胀之前和之后，微载体的形状构造不会发生变化。
实施例1：微载体的制备
将混合好的有机相液体石蜡与司班80放入带有搅拌器的反应装置中，其中液体石蜡与司班80体积比为300:1，加热至60℃以上，搅拌使其混合均匀，水相由HA(透明质酸钠)(5wt％)与不溶于水的占位材料即粒径均匀的琼脂糖(1wt％)以及交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5wt％)混合形成；待有机相混合均匀后，转至室温条件下，在搅拌浆的作用下向有机相中缓慢滴加混合好的水相，常温搅拌使其乳化。室温下反应10小时后过滤，其中搅拌速度控制在600rpm/min,待微载体成球后洗去有机相。过滤微载体，并将过滤后的载体材料转移到装有无水乙醇的试剂瓶中，其中有机溶剂要完全浸没载体，25℃摇床摇6小时，使得载体内部占位材料充分溶解并完全溶出。之后过滤材料并对载体材料进行去离子水冲洗进一步洗去多余的有机溶剂，最后将材料投入到含有RGD位点的氨基酸溶液(胶原溶液)中，20℃下搅拌6小时，之后清洗、筛分、冻干，获得微载体。
将获得的微载体利用扫描电镜进行观察可得，该微载体直径在30-400微米之间，冻干后呈圆球状或颗粒状。另外，将该微载体水化一夜后微载体溶胀，进一步观察可得，其呈规则球状表面带有凹陷，如图1所示，凹陷比例占比约85％，凹陷个数约40个。
实施例2：微载体的制备
将混合好的有机相液体石蜡与司班80放入带有搅拌器的反应装置中，其中液体石蜡与司班80体积比为300:1，加热至60℃以上，搅拌使其混合均匀，水相由HA(透明质酸钠)(5wt％)与不溶于水的占位材料即粒径均匀的琼脂糖(0.5wt％)以及交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5wt％)混合形成；待有机相混合均匀后，转至室温条件下，在搅拌浆的作用下向有机相中缓慢滴加混合好的水相，常温搅拌使其乳化。室温下反应10小时后过滤，其中搅拌速度控制在600rpm/min,待微载体成球后洗去有机相。过滤微载体，并将过滤后的载体材料转移到装有无水乙醇的试剂瓶中，其中有机溶剂要完全浸没载体，25℃摇床摇6小时，使得载体内部占位材料充分溶解并完全溶出。之后过滤材料并对载体材料进行去离子水冲洗进一步洗去多余的有机溶剂，最后将材料投入到含有RGD位点的氨基酸溶液(胶原溶液)中，20℃下搅拌6小时，之后清洗、筛分、冻干，获得微载体。
将获得的微载体利用扫描电镜进行观察可得，该微载体直径在30-400微米之间，冻干后呈圆球状或颗粒状。将该微载体水化一夜后微载体溶胀，进一步观察可得，其呈规则球状表面带有凹陷，如图2所示，凹陷比例占比约50％，凹陷个数约30个。
实施例3：微载体的制备
将混合好的有机相液体石蜡与司班80放入带有搅拌器的反应装置中，其中液体石蜡与司班80体积比为300:1，加热至60℃以上，搅拌使其混合均匀，水相由HA(透明质酸钠)(5wt％)与不溶于水的占位材料即粒径均匀的琼脂糖(0.1wt％)，以及交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5wt％)混合形成；待有机相混合均匀后，转至室温条件下，在搅拌浆的作用下向有机相中缓慢滴加混合好的水相，常温搅拌使其乳化。室温下反应10小时后过滤，其中搅拌速度控制在600rpm/min,待微载体成球后洗去有机相。过滤微载体，并将过滤后的载体材料转移到装有无水乙醇的试剂瓶中，其中有机溶剂要完全浸没载体，25℃摇床摇6小时，使得载体内部占位材料充分溶解并完全溶出。之后过滤材料并对载体材料进行去离子水冲洗进一步洗去多余的有机溶剂，最后将材料投入到含有RGD位点的氨基酸溶液(胶原溶液)中，20℃下搅拌6小时，之后清洗、筛分、冻干，获得微载体。
将获得的微载体利用扫描电镜进行观察可得，该微载体直径在30-400微米之间，冻干后呈圆球状或颗粒状。将该微载体水化一夜后微载体溶胀，进一步观察可得，其呈规则球状表面带有凹陷，如图3所示，凹陷比例占比约20％，凹陷个数约10个。
实施例4：微载体的制备
将混合好的有机相液体石蜡与司班80放入带有搅拌器的反应装置中，其中液体石蜡与司班80体积比为300:1，加热至60℃以上，搅拌使其混合均匀，水相由HA(透明质酸钠)(5wt％)与不溶于水的占位材料即粒径均匀的琼脂糖(0.5wt％)，以及交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5wt％)混合形成构成；待有机相混合均匀后，转至室温条件下，在搅拌浆的作用下向有机相中缓慢滴加混合好的水相，常温搅拌使其乳化。室温下反应10小时后过滤，其中搅拌速度控制在600rpm/min,待微载体成球后洗去有机相。过滤微载体，并将过滤后的载体材料转移到装有无水乙醇的试剂瓶中，其中有机溶剂要完全浸没载体，25℃摇床摇6小时，使得载体内部占位材料充分溶解并完全溶出。之后过滤材料并对载体材料进行去离子水冲洗进一步洗去多余的有机溶剂，最后将材料投入到含有RGD位点的氨基酸溶液(胶原溶液)中，20℃下搅拌6小时，之后清洗、筛分、冻干，获得微载体。
将获得的微载体利用扫描电镜进行观察可得，该微载体直径在30-400微米之间，冻干后呈圆球状或颗粒状，如图6所示。将该微载体紫外光照灭菌后，由基础培养基进行水化，水化一夜后微载体溶胀，进一步观察可得，其呈规则球状且表面带有曲率较大的圆弧状凹陷，所述圆弧状凹陷的平均半径约为30-40μm。
实施例5：微载体的制备
将混合好的有机相液体石蜡与司班80放入带有搅拌器的反应装置中，其中液体石蜡与司班80体积比为300:1，加热至60℃以上，搅拌使其混合均匀，水相由明胶(10wt％)与不溶于水的占位材料即粒径均匀的琼脂糖(1wt％)以及交联剂戊二醛(0.5wt％)混合形成；待有机相混合均匀后，转至室温条件下，在搅拌浆的作用下向有机相中缓慢滴加混合好的水相，常温搅拌使其乳化。室温下反应10小时后过滤，其中搅拌速度控制在600rpm/min,待微载体成球后洗去有机相。过滤微载体，并将过滤后的载体材料转移到装有无水乙醇的试剂瓶中，其中有机溶剂要完全浸没载体，25℃摇床摇6小时，使得载体内部占位材料充分溶解并完全溶出。之后过滤材料并对载体材料进行去离子水冲洗进一步洗去多余的有机溶剂，最后将材料投入到含有RGD位点的氨基酸溶液(胶原溶液)中，20℃下搅拌6小时，之后清洗、筛分、冻干，获得微载体。
将获得的微载体利用扫描电镜进行观察可得，该微载体直径在30-400微米之间，冻干后呈圆球状或颗粒状，如图7所示，具有狭长型凹陷比例占比约90％，凹陷个数约50个。
另外，发明人还通过以下实施例制备获得了更多的微载体。具体如下表A所示。
表A：实施例6-实施例10
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测试例1：软骨陷窝结构仿生构建
发明人将GFP绿色荧光标记的大鼠原代软骨细胞(来自4周大鼠软骨)以1×105个/mg的密度接种到实施例4制备得到的微载体上，将接种后的微载体放入37℃恒温培养箱中培养，培养24小时后使用激光扫描共聚焦显微镜观察，发现软骨细胞在微载体上粘附并增殖，且首先粘附在凹陷处，如图4B所示。人体正常软骨发育成熟后，软骨细胞聚集并分泌基质蛋白形成软骨陷窝结构，其生理直径也在30μm左右，如图4A所示。
分析图4B可知，软骨细胞(绿色荧光)在凹陷处优先粘附，且更多情况下多个细胞一起粘附在凹陷处(图4B中绿色荧光区域性显示)，而对于微载体没有凹陷的地方没有细胞粘附。
因此，本发明的微载体可以模拟正常软骨陷窝结构，能够有效地抑制软骨细胞在体外增值所导致的去分化表现。
测试例2：微载体与细胞的原位冻存
发明人将人脐间充质干细胞以1×105个/mg的密度接种到实施例4制备得到的微载体上，将接种后的微载体放入37℃恒温培养箱中培养，培养72小时后(其中隔天换液)，此时细胞已经在微载体上长满。弃培养基，加入冻存液，冻存液的配置为90％FBS、10％甘油，以及95％FBS、5％甘油。冻存1d后复苏，复苏培养24h,后使用live&dead染色液染色并使用激光扫描共聚焦显微镜观察，结果如图13所示。
如图13所示，绿色表示活细胞红色表示死细胞，微载体无颜色显示，其中10％甘油组为对照组，常用冻存液配比为10％甘油90％FBS，在本实验中发明人将甘油浓度降低至原来的50％，即采用5％甘油95％FBS，发现细胞活率与对照组相比几乎无差别，活细胞数量(绿色荧光)达到总数量的70％以上。
因此，本发明的微载体可以进行细胞培养后直接原位冻存，能够有效地抑制CPA(主要是DMSO与甘油)的使用，冻存后细胞活率较高。
测试例3：微载体能够保持培养细胞的功能性
发明人将人脐间充质干细胞通过培养基重悬，得到细胞悬液。将1.6×107个细胞接种至装有微载体和80ml培养基(微载体和培养基的比例为3g/L)的生物反应器，细胞密度为2×105个/ml。将接种后的生物反应器置于37℃二氧化碳培养箱进行培养，反应器搅拌程序为40rpm/min，3min；1rpm/min，1h；循环程序24次。接种24h后程序改为恒速40rpm。细胞培养第二天、第三天分别进行一次换液处理，换液量为60ml/次。其中选用市售微载体cytodex3,来自美国cytiva公司作为对照组进行对比。实验组选用上述实施例3所制备的微载体。4d后对实验组细胞进行收获，使用live&dead染色液染色并使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞活死情况(如图14所示)，消化计数并用CCK8检测试剂盒测量细胞在微载体上的增殖结果(如图15所示)以及动态培养并对细胞进行消化后细胞功能性(干性)表达进行测试结果(如图16所示)。
图14结果：绿色为活细胞，红色为死细胞。结果表明所制备的微载体具有优异的生物相容性，使细胞能够粘附并且出现了增殖，以及抗剪切性能。在搅拌的情况下能够保护细胞，减少剪切力对细胞的损害，细胞在微载体上出现增殖并保持高活率。
图15结果表明，细胞培养1,2,3,4天后细胞在微载体上出现了增殖，其中第四天收获的细胞与第一天收获的细胞数量相比，细胞增殖可达12倍。
图16结果表明，使用胰酶将细胞从微载体上消化收集后对细胞进行抗体孵育，其中实验组CD105 marker表达量为99.3％高于对照组99.1％，说明干细胞在微载体上增殖后其功能性(干性)保持非常好，且优于市售微载体。
图14-16结果证明了本发明的微载体能够很好的进行细胞扩增，消化收集且其功能性保持优异，具有临床使用的潜力。
测试例4：微载体渗透性测试
取实施例6制备的微载体进行渗透测试表征，主要操作方法为：取冻干后的微载体约10mg于15ml离心管中，加入PBS水化过夜，之后弃上层清液，PBS洗2-3遍，弃上清。将微载体放置在荧光标记(488)的培养基中(培养基需浸没微载体)，分别在10min、20min、40min,使用激光扫描共聚焦显微镜观察。结果如图18所示。
其中，图18a为10min时微载体渗透结果图，其中绿色荧光部分为标记的培养基，黑色为未标记荧光的微载体，图18b为渗透时间为20min时渗透结果，可见培养基已逐渐渗透至空腔中，图18c为渗透时间为40min时渗透结果，可见培养基已完全渗透至微载体空腔中。
结果表明，本发明的微载体具有良好的渗透性，40min完成完全渗透，有利于细胞的培养及物质交换，且本发明具有空腔结构的微载体具备实现空腔内部培养细胞的条件。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (27)

1.一种微载体，其特征在于，所述微载体具有三维立体结构，所述微载体具有壳层且内部为空心或实心，所述壳层外壁不平整且具有多处凹陷点。
2.根据权利要求1所述的微载体，其中，所述壳层外壁的凹陷面积占壳层外壁总表面积的比例为15％以上。
3.根据权利要求1-2任一项所述的微载体，其中，所述壳层外壁具有的凹陷点的数量为2～800个，可选的凹陷点的数量为2～700个，可选的凹陷点的数量为2～600个，可选的凹陷点的数量为2～500个，可选的凹陷点的数量为2～400个，可选的凹陷点的数量为2～300个，可选的凹陷点的数量为2～200个，可选的凹陷点的数量为5～200个，可选的凹陷点的数量为5～100个，可选的凹陷点的数量为5～60个，可选的凹陷点的数量为10～60个。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微载体，其中，所述壳层外壁具有的凹陷点的形状选自圆弧状凹陷、细槽型凹陷、多边形凹陷、不规则凹陷、球形凹陷或其任意组合；
优选地，所述圆弧状凹陷的平均半径为1～500μm，可选的平均半径为1～400μm，可选的平均半径为1～300μm，可选的平均半径为10～300μm，可选的平均半径为50～300μm，可选的平均半径为80～300μm，可选的平均半径为80～200μm；
优选地，所述细槽型凹陷的凹陷面的平均宽度为1～500μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～400μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为10～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为50～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～200μm；
优选地，所述多边形凹陷的凹陷面的平均宽度为1～500μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～400μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为10～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为50～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～200μm；
优选地，所述不规则凹陷的凹陷面的平均宽度为1～500μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～400μm，可选的凹陷面的平均宽度为1～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为10～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为50～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～300μm，可选的凹陷面的平均宽度为80～200μm；
优选地，所述球形凹陷的平均半径小于500μm，可选的平均半径小于400μm，可选的平均半径小于300μm，可选的平均半径小于200μm，可选的平均半径小于100μm，可选的平均半径小于50μm，可选的平均半径小于20μm，可选的平均半径小于10μm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的微载体，其中，所述微载体的平均粒径为1～3000μm，可选的平均粒径为1～2000μm，可选的平均粒径为1～1000μm，可选的平均粒径为1～800μm，可选的平均粒径为1～600μm，可选的平均粒径为10～600μm，可选的平均粒径为50～500μm，可选的平均粒径为100～500μm，可选的平均粒径为100～400μm；
优选地，所述微载体的平均粒径为30-400μm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的微载体，其中，所述壳层的厚度为1-100μm，可选的厚度为1-90μm，可选的厚度为1-80μm，可选的厚度为1-70μm，可选的厚度为1-60μm，可选的厚度为1-50μm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的微载体，其中，所述微载体具有的三维立体结构为圆球、梭形、椭圆球、棒状、扁球体或不规则球体。
8.根据权利要求1-7任一项所述的微载体，其中，所述微载体的内部为空心，所述微载体具有非封闭式三维立体结构；
优选地，所述微载体的壳层具有一个或多个通孔，所述通孔穿透所述壳层以便联通壳层的内部和外部。
9.根据权利要求1-8任一项所述的微载体，其中，所述微载体内部的空心结构通过溶出占位材料得到；
或者，所述壳层的外壁和/或内壁经过表面修饰；
优选地，所述壳层的外壁和/或内壁经过RGD表面修饰。
10.根据权利要求1-9任一项所述的微载体，其中，所述微载体负载有细胞；
优选地，所述细胞设置在所述微载体的壳层内壁，或者设置在所述微载体的壳层外壁，或者同时设置在所述微载体的壳层内壁和所述微载体的壳层外壁；
优选地，所述细胞同时设置在所述微载体的壳层内壁和所述微载体的壳层外壁时，设置于壳层内壁和壳层外壁的细胞种类可以相同或不同；
优选地，所述微载体的壳层外壁设置有细胞时，所述细胞设置在所述壳层外壁的凹陷点处，或者设置在所述壳层外壁的光滑表面处(即非凹陷点处)，或者同时设置在所述壳层外壁的凹陷点处和光滑表面处；
优选地，所述细胞通过所述通孔设置在所述微载体的壳层内壁；
优选地，所述细胞通过细胞注射设置在所述微载体的壳层内壁；
优选地，所述细胞通过与所述微载体进行共培养设置在所述微载体的壳层外壁。
11.根据权利要求10所述的微载体，其中，所述细胞选自原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、植物细胞、动物细胞、藻类细胞、真菌细胞、人造细胞或其任意组合；
或者，所述细胞选自干细胞、体细胞、生殖细胞或其任意组合；
优选地，所述干细胞选自胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、上皮干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、中胚层干细胞、内皮干细胞或其任意组合；
优选地，所述体细胞选自上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、骨细胞、肝细胞、胰腺细胞、外源细胞、内源细胞、心肌细胞、骨骼细胞、心脏成肌细胞、骨骼成肌细胞、少突胶质细胞、神经胶质细胞、造血细胞、神经元或其任意组合；
优选地，所述生殖细胞选自卵母细胞、精子、卵原细胞、精原细胞或其任意组合。
12.根据权利要求1-11任一项所述的微载体，其中，所述壳层或所述微载体由生物材料制成；
优选地，所述生物材料选自人工合成的生物材料、天然生物材料或其组合。
13.根据权利要求12所述的微载体，其中，所述人工合成的生物材料选自聚乙二醇，聚乙二醇衍生物，聚乳酸，聚乳酸醇共聚物，聚酸酐，聚酸酯，聚氨基酸，聚氧化乙烯，聚酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚碳酸酯，聚氨基甲酸酯，聚己内酯，聚羟基脂肪酸酯，聚硅氧烷，聚乙烯，聚氯乙烯，聚四氟乙烯，聚苯乙烯，聚丙烯，马来酸酐接枝共聚物，聚丙烯酰胺，聚缩醛，聚吡咯或其任意组合。
14.根据权利要求12所述的微载体，其中，所述天然生物材料选自天然蛋白质，胶原及胶原衍生物，明胶及明胶衍生物，琼脂及琼脂衍生物，蛋白多糖，海藻酸盐及其海藻酸盐衍生物，基质胶，蜂胶，纤维素及纤维素衍生物，甲壳素及甲壳素衍生物，蚕丝蛋白及其衍生物，层连接蛋白及其衍生物，纤维连接蛋白及其衍生物，透明质酸钠及透明质酸衍生物，琼脂糖及其衍生物，葡聚糖及其衍生物，蔗糖及蔗糖衍生物，淀粉，壳聚糖及壳聚糖衍生物或其任意组合。
15.一种微载体聚集体，其特征在于，所述聚集体由权利要求1-14任一项的微载体颗粒聚集而成。
16.根据权利要求15所述的微载体聚集体，其中，所述聚集体是单一性状微载体的集合体，或各种性状微载体任意比例的集合体。
17.一种制备权利要求1-14任一项所述的微载体的方法，其包括：
(a)提供有机相溶液；
(b)提供水相溶液；
(c)将所述水相溶液加入所述有机相溶液，形成混合液；使所述混合液乳化，混合均匀，形成均一的油包水体系；
(d)将所述油包水体系进行过滤，滤饼为待处理的载体基质；
(e)将所述待处理的载体基质进行后处理，以便溶出占位材料，并用包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白与后处理后的载体基质进行缀合，获得所述微载体；
任选地，所述缀合后进一步包括清洗、筛分和冻干的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述乳化是在温度为4-200℃，优选20-75℃下进行的；
优选地，所述乳化的时间是4-72h，优选5-30h；
优选地，所述乳化是通过搅拌法，超声法，震荡法或微流道法实现的，优选地，转速为100-5000rpm/min，优选为300-1000rpm/min。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述有机相溶液是通过将有机溶剂与非离子表面活性剂进行混合得到的；
优选地，所述混合是在温度为4-200℃，优选20-75℃下进行的；
优选地，所述混合的时间为10-120min，优选10-60min；
优选地，所述混合是在搅拌桨的作用下进行的；
优选地，所述搅拌桨的转速为100-2000rpm/min，优选为300-1000rpm/min；
优选地，所述有机溶剂选自液体石蜡，石油醚，四氯化碳，二甲基亚砜，三氯甲烷，二氯甲烷，食用油，硅油，大豆油，矿物油或其任意组合；
更优选地，所述有机溶剂为液体石蜡；
优选地，所述非离子表面活性剂选自吐温，司班80，脂肪酸甘油酯，十二烷基苯磺酸钠，PO-500,氢氟醚，聚乙二醇，嵌段聚氧乙烯-聚氧丙烯醚(PO-EO共聚物)，多元醇酯类或其任意组合；
更优选地，所述非离子表面活性剂为司班80；
优选地，所述有机溶剂与所述非离子表面活性剂的体积比为200-400:1。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述水相溶液是通过如下步骤得到的：
将生物材料溶解在水中，获得溶解液；
将占位材料和固化剂悬浮在所述溶解液中，形成分散均匀的悬浊液，所述悬浊液即为所述水相溶液；
优选地，所述溶解是在温度为4-200℃，优选10-80℃下进行的；
优选地，所述分散均匀的悬浊液是通过搅拌、震荡、超声或摇晃实现的，优选地，转速为100-2000rpm/min，优选为300-700rpm/min；
优选地，所述水相溶液中，所述生物材料的质量分数为3-10％；
优选地，所述水相溶液中，所述占位材料的质量分数为0.01-1％；
优选地，所述水相溶液中，所述固化剂的质量分数为0.5-7％；
优选地，所述生物材料选自人工合成的生物材料、天然生物材料或其组合；
更优选地，所述生物材料选自透明质酸钠、明胶；
优选地，所述占位材料选自聚乙二醇及聚乙二醇衍生物，石蜡球，氧化海藻酸盐及其衍生物，聚己内酯，二氧化硅，蜂蜡，蜂胶，琼脂，琼脂糖，海藻酸盐及其衍生物，大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂，磷脂，葡聚糖，壳聚糖，淀粉，明胶，透明质酸钠及透明质酸衍生物或其任意组合；
更优选地，所述占位材料为琼脂糖、葡聚糖、透明质酸钠；
优选地，所述固化剂选自N,N-亚甲基双丙烯酰胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二异氰酸酯，戊二醛，京平尼，硫酸铵，钙离子，丁二醇二缩水甘油醚，转谷酰胺酶，二乙烯基苯，己二酸二酰肼或其任意组合；
更优选地，所述固化剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、戊二醛。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述过滤是通过过滤装置实现的，所述过滤装置的网孔直径为30-1000微米；
优选地，所述过滤装置具有四层结构，第一层的网孔直径为500-800微米，第二层的网孔直径为300-400微米，第三层的网孔直径为200-300微米，第四层的网孔直径为100-200微米。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述溶出占位材料是通过以下步骤实现的：
将所述待处理的载体基质与有机溶剂进行混合，以便溶出占位材料；
优选地，所述混合是在温度为15℃-150℃，优选25-100℃下进行4-48h，优选6-24h；
优选地，所述有机溶剂选自丙酮，无水乙醇，石油醚，三氯甲烷，二甲基亚砜，二氯甲烷，石油醚，四氯化碳，乙腈，甲苯，甲醇或其任意组合；
更优选地，所述有机溶剂为无水乙醇。
23.根据权利要求17所述的方法，其中，所述用包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白与后处理后的载体基质进行缀合是通过以下步骤实现的：
将所述后处理后的载体基质与所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白进行混合，以便实现所述后处理后的载体基质的RGD表面修饰；
优选地，所述混合是在温度为15-25℃的条件下进行的；
优选地，所述混合的时间为4-10小时；
优选地，所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白选自胶原或胶原衍生物，明胶或明胶衍生物，纤维连接蛋白，丝素蛋白，层连接蛋白，基质胶或其任意组合；
更优选地，所述包含RGD氨基酸序列的短肽或蛋白选自胶原、明胶。
24.一种试剂盒，其包含权利要求1-14任一项所述的微载体、权利要求15-16任一项所述的微载体聚集体或者权利要求17-23任一项所述的方法制备得到的微载体。
25.权利要求1-14任一项所述的微载体、权利要求15-16任一项所述的微载体聚集体或者权利要求17-23任一项所述的方法制备得到的微载体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于细胞三维培养和/或扩增、3D生物打印、仿生结构体构建、细胞治疗、载药或医疗注射；
优选地，所述仿生结构体为三维构建体、组织前体、组织、器官或胚胎(如小鼠胚胎)；
优选地，所述仿生结构体构建为胚胎仿生模拟构建或软骨仿生构建；
优选地，所述仿生结构体为关节软骨的软骨陷窝结构；
优选地，所述细胞治疗为皮肤表面治疗、临床角膜治疗、骨治疗或软骨修复与骨损伤治疗。
26.权利要求1-14任一项所述的微载体、权利要求15-16任一项所述的微载体聚集体或者权利要求17-23任一项所述的方法制备得到的微载体的用途，其用于体外细胞三维培养和/或扩增、体外3D生物打印、体外仿生结构体构建、体外载药；优选地，所述用途用于非诊断或治疗目的；
优选地，所述仿生结构体为三维构建体、组织前体、组织、器官或胚胎(如小鼠胚胎)；
优选地，所述仿生结构体构建为胚胎仿生模拟构建或软骨仿生构建；
优选地，所述仿生结构体为关节软骨的软骨陷窝结构。
27.一种体外细胞三维培养和/或扩增的方法，其包括：
1)将细胞接种于权利要求1-14任一项所述的微载体、权利要求15-16任一项所述的微载体聚集体或者权利要求17-23任一项所述的方法制备得到的微载体上进行培养；
任选地，步骤1)后，进一步包括：
2-A)将步骤1)获得的混合物进行原位冻存；
或者任选地，步骤1)后，进一步包括：
2-B)将步骤1)获得的负载于微载体上的细胞进行消化、收集；
优选地，所述培养为动态培养；
优选地，所述动态培养为搅拌式动态培养或悬浮式动态培养；
优选地，所述细胞如权利要求11所限定。
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