CN116496363A - 一种铜绿假单胞菌外膜蛋白免疫优势表位肽及其应用 - Google Patents

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顾江
张怡
程新
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Abstract

本发明提供了一种铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，其选自铜绿假单胞菌外膜蛋白的胞外loop区肽段的全部或截短肽段，所述截短肽段含有不少于10个氨基酸残基；所述铜绿假单胞菌外膜蛋白选自PA1777,PA4067,PA0595,PA0958,PA2398,PA1178,PA4554和PA0165。本发明还提供了该铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽在用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染中的用途。本发明提供的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽具有良好的免疫原性，且具有良好的临床应用前景。

Description

一种铜绿假单胞菌外膜蛋白免疫优势表位肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及具有良好免疫原性和免疫反应性的铜绿假单胞菌外膜蛋白免疫优势表位肽及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，是医院获得性感染特别是下呼吸道感染是最为常见的病原菌之一，具有分布广泛、容易传播的特点。中国细菌耐药监测网CHINET数据显示，近年来PA的分离率在革兰氏阴性细菌中稳居前。呼吸功能受损如慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、呼吸机使用患者、囊性纤维化患者，免疫功能不全如老年人、糖尿病患者等是PA感染的高风险因。调查结果显示，稳定期COPD患者下呼吸道标本PA培养阳性率约3％-20％，急性加重期住院患者阳性率高达30-40％。呼吸机相关性肺炎(VAP)患者中PA的分离率排名第2，约占10％-20％，PA导致的感染总病死率仍高达32％-42.9％。
另一方面，PA耐药问题也日趋突出。全球耐药监测网SENTRY对1997-2016年监测结果发现，PA对常用抗菌药物的耐药率逐渐升高，超过15％的PA菌株出现了对3种抗生素抵抗的多重耐药和甚至泛耐药。中国耐药监测网CHINET数据发现PA对常用药物亚胺培安和美罗培兰的耐药率有所下降，但仍然维持在较高水平(～20％)。2017年世界卫生组织(WHO)发布了《全球抗生素耐药细菌优先性列表》，同时将危害严重的铜绿假单胞菌列为第1级(最危急级别)。抗生素是治疗PA感染的主要手段，但是它不仅价格昂贵，还可能出现“抗生素耐药—新抗生素-新抗生素耐药”的死循环，导致无药可用。通过PA疫苗不仅可以预防感染性疾病的发生，而且还可以减少抗生素的使用，在一定程度上缓解甚至解决PA耐药的问题，然而，迄今还未有PA疫苗获批上市。
研制PA疫苗的关键问题在于筛选到保护效果好的抗原组分。研究发现，PA感染人体后其表达谱会发生明显的变化。如细菌鞭毛和菌毛的缺失导致其依从性和能动性发生改变；mucA、mucB、mucD基因的突变使细菌形成粘液型菌落；以及脂多糖的改变、O抗原的缺失、群体感应系统的变化。发生以上突变的菌株其毒力显著下降。传统的疫苗抗原成分主要以细菌的鞭毛蛋白、分泌性毒素、细菌III型分泌系统组件蛋白为主，虽然这些疫苗抗原可以激发机体产生强烈的免疫应答，但是由于细菌感染后这些关键靶标表达量下降甚至缺失，帮助细菌逃逸宿主的免疫杀伤，最终导致疫苗的免疫保护效果大打折扣。因此，亟需创建新的研究策略和技术，筛选PA感染人体动态时的功能性、保护性抗原组分。
发明内容
本发明通过聚焦PA感染人体、动态过程中基因表达变化，挑选感染后表达上调的基因编码产物作为候选疫苗靶标，并从这些靶标中筛选并鉴定保护性抗原表位，从而克服了传统筛选方法的不足。
本发明首先提供了一种铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，其选自铜绿假单胞菌外膜蛋白的胞外loop区肽段的全部或截短肽段，所述截短肽段含有不少于10个氨基酸残基；所述铜绿假单胞菌外膜蛋白选自PA1777,PA4067,PA0595,PA0958,PA2398,PA1178,PA4554和PA0165；优选地，所述截短肽段含有的氨基酸残基数量为10-40个，更优选为14-39个。
在根据本发明的一个实施方案中，铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中的任一种。
在根据本发明的一个实施方案中，铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽选自SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:52中的一种或多种。更优选地，在N端添加氨基酸残基GS。
本发明还提供了一种用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的抗原，其活性成分包含上述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽。
在根据本发明的一个实施方案中，抗原含有的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽部分还经由修饰处理，所述修饰处理选自N端乙酰化、C端酰胺化、生物素标记、FITC标记、甲基化修饰、偶联蛋白载体和聚乙二醇(PEG)修饰中的一种或多种；所述蛋白载体为BSA蛋白、OVA蛋白或KLH蛋白。
本发明还提供了上述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，或者，上述的抗原在制备用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。
本发明的另一方面提供了一种用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物，其包含上述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，或者上述的抗原，以及药学上可接受的辅料。
在根据本发明的一个实施方案中，所述药物还包含佐剂，所述佐剂选自弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、白细胞介素-l、白细胞介素-2、干扰素-γ、氢氧化铝、明矾、磷酸铝、双链多聚肌苷酸佐剂、胞苷酸佐剂、双链多聚腺苷酸佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油、羊毛脂中的一种或多种；优选为氢氧化铝、明矾、磷酸铝；更优选为氢氧化铝。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
本发明提供的铜绿假单胞菌外膜蛋白具有显著的免疫原性，能够有效的用于防治铜绿假单胞菌感染，具有良好的临床前景。
附图说明
图1为候选跨膜蛋白PA1178,PA1777,PA4067,PA4554,PA0595,PA0958,PA2398及PA01653D结构图。深色代表预测得到的膜外功能区序列。
图2为54个多肽与10例PA感染恢复期患者血清及10例健康人血清反应的平均荧光强度热图分析结果。
图3为不同蛋白功能区表位肽与10例PA感染恢复期患者血清及10例健康人血清反应的平均荧光强度柱状图分析结果。
图4为多肽PA4554 C167-W193,PA2398 F636-G672,PA0165 R163-A174,PA2398K694-Q712,PA0958 A200-Q235,PA2398 T302-V331,PA4554 D148-T172,PA2398 V552-R568,PA0958 Q295-S319与PA感染恢复期患者血清IgG反应的平均荧光强度热图分析结果。
图5为多肽PA4554 C167-W193,PA2398 F636-G672,PA0165 R163-A174,PA2398K694-Q712,PA0958 A200-Q235,PA2398 T302-V331,PA4554 D148-T172,PA2398 V552-R568,PA0958 Q295-S319与PA感染恢复期患者血清IgG反应的平均荧光强度柱状图分析结果。
图6为多肽PA4554 C167-W193,PA2398 F636-G672,PA0165 R163-A174,PA2398K694-Q712,PA0958 A200-Q235,PA2398 T302-V331,PA4554 D148-T172的KLH复合物免疫小鼠血清IgG抗体滴度。
图7为纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193的透射电镜图。
图8为PLGA纳米颗粒(PNPs)、巨噬细胞膜(MM)、包裹巨噬细胞膜的PLGA纳米颗粒(PNPs@M)及纳米颗粒表位疫苗(PNPs@M-Ep167-193)的SDS-PAGE结果。
图9为PNPs@M-Ep167-193,PNPs@M和PNPs的纳米粒径。
图10为PNPs@M-Ep167-193,PNPs@M和PNPs的电位。
图11为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫组小鼠血清IgG抗体滴度。
图12为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫组小鼠血清IgG1,IgG2a及IgG2b抗体滴度。
图13为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫小鼠攻毒后24h感染状态评分。
图14为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫小鼠攻毒后24h体重变化。
图15为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫小鼠攻毒后24h肺部细菌定植结果。
图16为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫小鼠攻毒后24h肺组织匀浆上清炎性因子TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-12水平检测。
图17为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫小鼠攻毒后24h肺组织HE染色切片。
图18为PNPs@M-Ep167-193,Ep167-193,PNPs@M和PBS免疫小鼠攻毒后24h肺组织HE染色切片病理评分。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1跨膜蛋白外膜柔性区预测分析
1.试验方法
(1)本发明在mRNA水平筛选了8个PA感染前后表达水平稳定或者升高外膜蛋白，分别是PA1777(Gene ID:878442),PA4067(Gene ID:879793),PA0595(Gene ID:880756),PA0958(Gene ID:881970),PA2398(Gene ID:878605),PA1178(Gene ID:878005),PA4554(Gene ID:877859)和PA0165(Gene ID:879418)。
(2)PA1777,PA4067,PA0595,PA0958和PA2398的结构来源于PDB数据库，PA1178,PA4554和PA0165的结构通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)建模并利用Procheck(https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK/)和QMEAN(https://swissmodel.expasy.org/qmean/)进行验证。
(3)利用PRED-TMBB(http://bioinformatics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/)对上述蛋白的跨膜区进行预测，共得到了54个胞外柔性结构域。54个多肽由江苏金斯瑞生物科技有限公司合成，N端添加氨基酸GS，C端标记生物素。
2.试验结果
(1)候选抗原跨膜蛋白功能区结构预测
在前期研究中，我们收集了PA感染前后细菌总RNA，定量分析PA感染过程中基因表达谱动态变化情况，得到感染过程中表达稳定和升高的外膜蛋白信息。我们选取了PA感染过程中表达稳定或升高的8个外膜蛋白，分别是PA1178,PA1777,PA4067,PA4554,PA0595,PA0958,PA2398及PA0165。图1所示为候选跨膜蛋白3D结构图。其中PA1777(PDB:4RLC),PA4067(PDB:2N6L),PA0595(PDB:5IVA),PA0958(PDB:2ODJ)及PA2398(PDB:1XKH)蛋白结构来源于PDB数据库，PA1178,PA4554及PA0165结构来源于SWISS-MODEL建模。深色代表预测得到的膜外功能区序列。
(2)同时，我们利用生物信息学软件PRED-TMBB对筛选出来的外膜蛋白序列进行跨膜区结构的预测，获得全部胞外功能区的氨基酸序列信息如表1所示。
表1候选跨膜蛋白胞外loop区序列信息
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实施例2强反应性多肽表位的筛选
1.试验方法
(1)收集血清：收集10例铜绿假单胞菌感染恢复期患者血清样本及10例健康人血清样本。
(2)磁珠偶联：根据Luminex磁珠说明书操作要求，将30μg链霉亲和素与2.5×106个磁珠进行共价偶联。
(3)将磁珠分装至96孔板中，50μl/孔，弃去上清。
(4)将生物素标记的多肽(2μg/ml)加入上述装有磁珠的96孔板中，每个反应均
设置双复孔，37℃，200rpm共孵育1h，并以不偶联多肽的磁珠作为空白对照。
(5)PBST清洗三次后，加入1:200稀释的血清样本，37℃共孵育1h。
(6)弃去反应上清，PBST清洗磁珠三次加入1:2500稀释的Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(PE)到上述96孔板中，50μl/孔，37℃，200rpm避光孵育40min。
(7)弃去反应上清，PBST清洗磁珠三次。
(8)利用Luminex 200仪器测定磁珠的荧光强度。
2.试验结果
如图2、3所示，54个多肽免疫反应性强弱不一，我们选择了免疫反应性较强的前10个多肽(PA2398 Q737-K754,PA4554 C167-W193,PA2398 F636-G672,PA0165 R163-A174,PA2398 K694-Q712,PA0958 A200-Q235,PA2398T302-V331,PA4554 D148-T172,PA2398V552-R568,PA0958 Q295-S319)进行下一步的验证。其中图2为54个多肽针对10例PA感染恢复期患者血清及10例健康人血清的免疫反应性结果，图3为不同蛋白功能区表位肽免疫反应性结果。
实施例3强反应性多肽表位的验证
1.试验方法
(1)收集血清：收集100例铜绿假单胞菌感染恢复期患者血清样本。
(2)磁珠偶联：根据Luminex磁珠说明书操作要求，将30μg链霉亲和素与2.5×106个磁珠进行共价偶联。
(3)将磁珠分装至96孔板中，50μl/孔，弃去上清。
(4)将生物素标记的多肽(2μg/ml)加入上述装有磁珠的96孔板中，每个反应均
设置双复孔，37℃，200rpm共孵育1h，并以不偶联多肽的磁珠作为空白对照。
(5)PBST清洗三次后，加入1:200稀释的血清样本，37℃共孵育1h。
(6)弃去反应上清，PBST清洗磁珠三次加入1:2500稀释的Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(PE)到上述96孔板中，50μl/孔，37℃，200rpm避光孵育40min。
(7)弃去反应上清，PBST清洗磁珠三次。
(8)利用Luminex 200仪器测定磁珠的荧光强度。
2.试验结果
我们收集了100例PA感染恢复期患者血清样本，利用Luminex技术对筛选得到的10个免疫优势表位肽的免疫反应性进行进一步的验证。图4、5为强反应性多肽表位的验证结果。研究表明，筛选得到的10个多肽具有较强的免疫反应性。其中，图4为筛选得到的10个多肽针对100例PA感染恢复期患者血清免疫反应性热图结果，图5为不同多肽免疫反应性平均荧光强度统计结果。
实施例4多肽免疫原性评价
1.试验方法
1.1免疫Balb/c小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)
1)合成上述多肽并与KLH偶联。
2)上述多肽-KLH复合物与Al(OH)3佐剂吸附结合2h后制成表位肽疫苗，设置PBS对照组和Al(OH)3佐剂对照组。
3)选取6-8周龄雌性Balb/c小鼠，大腿肌肉注射500μl 100μg相应抗原，分别于第0天，第14天和第21天免疫接种。
4)末次免疫后7天，收集小鼠的尾静脉血。
5)将收集的尾静脉血至于37℃孵箱中孵育2h后8000rpm,4℃离心10min，收集上清置于-20℃备用
1.2ELISA检测抗体效价
(1)SA(链霉亲和素)的包被：用包被液将SA稀释成2μg/ml，包被于酶标板，100μl/孔。用膜包裹好放置于4℃过夜(14-16小时)。
(2)洗板：包被过夜后，将酶标板取出，洗板机洗板。设置洗板机参数为：洗涤3次，每次加液300μL，震动5秒，吸液2.5秒。
(3)封闭：将封闭液(1％BSA)以250μl/孔封闭酶标板，37℃封闭2h。
(4)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(5)加多肽：将多肽分别稀释成2μg/ml，每孔100μl加入板中，每个多肽2个复孔，37℃孵育1h。
(6)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(7)加血清：血清从1:100开始倍比稀释，每孔100μl加入板中，37℃孵育1h。
(8)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(9)加二抗：将HRP标记二抗以1：5000稀释，每孔100μl加入板中，37℃孵育45min。
(10)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(11)显色：将TMB显色液以每孔100μl加入板中，37℃孵育10min，每孔50μl终止液终止显色。
(12)检测：检测450nm处的吸光度值。
(13)计算Cut-off值：Cut-off值＝阴性对照平均值A450值x 2.1，高于Cut-off值的孔为阳性孔。
1.3试验结果
如图6所示，研究表明，上述8个免疫优势表位肽均具有良好的免疫原性，其中PA2398 Q737-K754及PA4554 C167-W193免疫原性最强，本发明以表位PA4554 C167-W193(Ep167-193)为例进行研究。
实施例5以多肽PA4554 C167-W193为例，制备纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193并对其纳米表征进行鉴定。
1.试验方法
1.1制备纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193
(1)将100mg PLGA(聚乳酸-乙醇酸)溶解于2mL二氯甲烷中。
(2)冰浴中超声2min将上述混合物进行乳化。
(3)将上述乳化后的混合物立即加入10ml PVA(聚乙烯醇)溶液(3％，w/v)中，超声3分钟。
(4)搅拌过夜以去除有机溶剂。
(5)12000rpm离心15min，去离子水清洗3遍。
(6)小鼠巨噬细胞(RAW264.7)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胰蛋白酶消化后-80℃冷冻，室温解冻，反复冻融三次。
(7)14000rpm离心15min收集细胞膜。
(8)用含蛋白酶抑制剂的PBS清洗3次后，超声5min。
(9)将(5)中得到的PLGA纳米颗粒(PNPs)与(8)中得到的小鼠巨噬细胞膜质量比1：1混合。
(10)冰浴超声3min后4℃过夜。
(11)12000rpm离心15min即得到包裹了小鼠巨噬细胞膜的PLGA纳米颗粒(PNPs@M)。
(12)合成偶联DSPE-PEG(2000)的多肽PA4554 C167-W193即DSPE-PEG(2000)-Ep167-193
(13)将多肽DSPE-PEG(2000)-Ep167-193溶解于去离子水中，与上述步骤中得到的PNPs@M溶液混合，室温反应1h。
(14)12000rpm离心15min去除未反应的多肽DSPE-PEG(2000)-Ep167-193。
1.2PNPs@M-Ep167-193疫苗的纳米表征
(1)使用透射电镜观察纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193的粒径及形态。
(2)样品变性后进行SDS-PAGE试验。
(3)使用透射电镜测定纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193的粒径大小及电位。
1.3试验结果
研究表明，巨噬细胞膜作为递送系统递送表位肽可以显著提高其保护效果。因此为了增强筛选得到的免疫优势表位Ep167-193的免疫原性，我们制备了巨噬细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒(PNPs@M)，并通过DSPE-PEG2000将表位肽Ep167-193共价偶联至纳米颗粒表面，从而构建携带了表位肽Ep167-193的PLGA纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep167-193。并通过透射电镜、SDS-PAGE及动态光散射对纳米颗粒疫苗的理化性质、粒径、电位及形态进行评价。如图7-10所示，纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep167-193可以形成粒径均一的纳米颗粒，动态光散射结果提示，其粒径大约为272nm。
实施例6以多肽PA4554 C167-W193为例，对纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193进行效果评价
1.试验方法
1.1免疫Balb/c小鼠
(1)20只Balb/c小鼠随机分成4组。
(2)在第0天，第14天和第21天分别免疫PNPs@M-Ep167-193(50μg),Ep167-193(50μg),PNPs@M(50μg)和PBS。
(3)分别在第一次、第二次和末次免疫后的第7天，收集尾静脉血，离心得到血清，冻存于-80℃备用。
1.2ELISA检测抗体效价(IgG，IgG1,IgG2a及IgG2b)
(1)SA(链霉亲和素)的包被：用包被液将SA稀释成2μg/ml，包被于酶标板，100μl/孔。用膜包裹好放置于4℃过夜(14-16小时)。
(2)洗板：包被过夜后，将酶标板取出，洗板机洗板。设置洗板机参数为：洗涤3次，每次加液300μL，震动5秒，吸液2.5秒。
(3)封闭：将封闭液(1％BSA)以250μl/孔封闭酶标板，37℃封闭2h。
(4)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(5)加多肽：将多肽分别稀释成2μg/ml，每孔100μl加入板中，每个多肽2个复孔，37℃孵育1h。
(6)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(7)加血清：血清从1:100开始倍比稀释，每孔100μl加入板中，37℃孵育1h。
(8)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(9)加二抗：将HRP标记二抗以1：5000稀释，每孔100μl加入板中，37℃孵育45min。
(10)洗板：按上述设置的洗板参数洗板，拍干板。
(11)显色：将TMB显色液以每孔100μl加入板中，37℃孵育10min，每孔50μl终止液终止显色。
(12)检测：检测450nm处的吸光度值。
(13)计算Cut-off值：Cut-off值＝阴性对照平均值A450值x 2.1，高于Cut-off值的孔为阳性孔。
1.3试验结果
图11-12所示为纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193诱导的免疫应答结果，其中疫苗组PNPs@M-Ep167-193的总IgGs抗体效价及主要抗体亚型IgG1,IgG2a，IgG2b抗体效价均显著高于其余几组，提示纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193在小鼠体内可以显著诱导以Th2型为主的免疫应答。
实施例7以多肽PA4554 C167-W193为例，通过免疫小鼠攻毒试验鉴定纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193的免疫保护性
1.试验方法
1.1免疫Balb/c小鼠
(1)60只Balb/c小鼠随机分成4组。
(2)在第0天，第14天和第21天分别免疫PNPs@M-Ep167-193(50μg),Ep167-193(50μg),PNPs@M(50μg)和PBS。
1.2攻毒试验
(1)上述小鼠末次免疫后第7天，气管注射压致死剂量(1.3×106CFU/只)的PA XN-1菌株。
(2)根据小鼠的呼吸、立毛、运动、鼻腔分泌物和姿势对感染状态进行评分。整体得分记录为未感染(0-1)、轻度感染(2-4)、中度感染(5-7)或严重感染(8-10)。每24小时记录一次小鼠体重，持续10天。
1.3肺部细菌定植试验及炎性因子水平检测
(1)攻毒后24h，分离小鼠肺组织并至于装有1ml无菌PBS的匀浆器中进行研磨。
(2)梯度稀释上述组织匀浆并接种于LB固体培养平板中，37℃培养过夜。
(3)次日进行菌落计数。
(4)将上述收集的肺组织匀浆进行离心，收集上清。
(5)按照小鼠ELISA试剂盒(达科为)的操作说明检测炎性因子TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-12的水平。
1.4小鼠肺组织HE染色切片
(1)攻毒后24h,分离小鼠肺组织，4％多聚甲醛固定。
(2)然后将样品进行石蜡包埋，切割成4μm切片。切片用苏木精和伊红(HE)染色，400倍放大视野在光学显微镜下进行观察。
(3)根据出血、水肿、充血、中性粒细胞浸润和支气管结构破坏的情况对每个切片进行疾病评分。每个部分的得分从0到2(0＝无，2＝严重)，每切片的最终得分是五个部分的得分之和。
2.试验结果
为了评价纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193的保护效果，对完成了接种程序的小鼠进行攻毒保护试验。如图13-18所示，纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193免疫后的小鼠感染状态评分显著低于其余几组；体重下降幅度较小，恢复较快；肺部细菌定植较少且炎性因子表达水平较低。观察HE染色切片提示，PNPs@M-Ep167-193组小鼠出血、水肿、充血、中性粒细胞浸润和支气管结构破坏的情况与其他几组相比显著减少。以上结果共同表明，纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep167-193对铜绿假单胞菌PA XN-1攻毒后的小鼠具有显著的保护作用。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，其特征在于，选自铜绿假单胞菌外膜蛋白的胞外loop区肽段的全部或截短肽段，所述截短肽段含有不少于10个氨基酸残基；所述铜绿假单胞菌外膜蛋白选自PA1777,PA4067,PA0595,PA0958,PA2398,PA1178,PA4554和PA0165；优选地，所述截短肽段含有的氨基酸残基数量为10-40个，更优选为14-39个。
2.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，其特征在于，选自氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的多肽。
3.如权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，其特征在于，选自氨基酸序列为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:52的多肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，其特征在于，在N端添加氨基酸残基GS。
5.一种用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的抗原，其特征在于，活性成分包含如权利要求1-4中任一项所述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽。
6.如权利要求5所述的抗原，其特征在于，所述铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽还经由修饰处理，所述修饰处理选自N端乙酰化、C端酰胺化、生物素标记、FITC标记、甲基化修饰、偶联蛋白载体和聚乙二醇(PEG)修饰中的一种或多种；所述蛋白载体为BSA蛋白、OVA蛋白或KLH蛋白。
7.如权利要求1-4中任一项所述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，或者，如权利要求5或6所述的抗原在制备用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。
8.一种用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物，其特征在于，包含如权利要求1-4中任一项所述的铜绿假单胞菌外膜免疫优势表位肽，或者如权利要求5或6所述的抗原，以及药学上可接受的辅料。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，还包含佐剂，所述佐剂选自弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、白细胞介素-l、白细胞介素-2、干扰素-γ、氢氧化铝、明矾、磷酸铝、双链多聚肌苷酸佐剂、胞苷酸佐剂、双链多聚腺苷酸佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油、羊毛脂中的一种或多种；优选为氢氧化铝、明矾、磷酸铝；更优选为氢氧化铝。
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