CN116473017A - 基于小鼠泪腺诱导的干燥综合征小鼠模型的造模方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于小鼠泪腺诱导的干燥综合征小鼠模型的造模方法，本发明通过提取小鼠的泪腺匀浆制成抗原与弗氏佐剂混合为乳化剂，使用该乳化剂对同种小鼠进行多点注射，使小鼠发生自身免疫反应，产生干燥综合征小鼠模型。本发明首次使用小鼠泪腺作为抗原，相比现有采用小鼠下颌腺的诱导造模方法，本发明的造模方法诱导小鼠出现干燥综合征相关全身症状的同时，眼部及泪腺症状更为明显，因而更适合于干燥综合征相关干眼的基础研究。
Description
技术领域
本发明涉及医药实验领域，尤其涉及一种基于小鼠泪腺诱导的干燥综合征小鼠模型的造模方法。
背景技术
干燥综合征(Sjogren’s syndrome,SS)是一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病。临床除有唾液腺和泪腺受损功能下降而出现口干、眼干外，尚有其他外分泌腺及腺体外其他器官受累而出现多系统损害的症状。原发性干燥综合征(primary SS,pSS)指不具另一诊断明确的结缔组织病的SS，属全球性疾病，女性多见，发病年龄多在40-50岁。
干眼(dry eye disease,DED)是多因素引起的由泪液的质、量及动力学异常导致的慢性眼表疾病，目前已成为临床上除屈光不正外最常见的眼科疾病。干燥综合征是水液缺乏型干眼的主要原因，在国际干燥综合征登记在册的参与者中，85％的受试者报告有干眼症状。为了研究干燥综合征的治疗方案尤其是干眼的基础研究和治疗方案，需要构建相关模型。
pSS动物模型主要分为自发型以及诱导型。目前国内外常使用的自发型动物模型主要有TSP-1-/-小鼠、NOD小鼠以及MRL小鼠等。诱导型动物模型多采用蛋白抗原、多肽抗原以及碳酸酐酶II诱导出免疫性涎腺炎。例如，一些方案公开用8周龄Balb/c小鼠颌下腺匀浆与弗氏完全佐剂混合制成的抗原，多点注射于足垫和背部皮下，同时背部注射百日咳杆菌，可以在造模后观察到小鼠颌下腺淋巴细胞浸润逐渐加重以及唾液流率降低；另有一些方案则使用8周龄雌性C57BL/6小鼠的颌下腺匀浆与等体积完全弗氏佐剂(Freunds CompletAdjuvant,FCA)或不完全弗氏佐剂(Freunds Incomplete Adjuvant,FIA)混合，在第0/7/14天背部皮内多点注射，可以在造模后观察到颌下腺炎症浸润加重，Th17细胞表达水平明显升高。然而，基于小鼠泪腺诱导型小鼠干燥综合征的方案未见报道，且前述方案构建的主要都是干燥综合征的全身症状，在针对干眼方面并不突出。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种基于小鼠泪腺诱导的干燥综合征小鼠模型的造模方法，该造模方法首次使用小鼠泪腺作为抗原，诱导小鼠出现干燥综合征相关全身症状的同时，眼部及泪腺症状更为明显，更适合于干燥综合征相关干眼的基础研究。本发明是一种新的干燥综合征小鼠模型造模方法。
(二)技术方案
本发明提供一种基于小鼠泪腺诱导的干燥综合征小鼠模型的造模方法，通过提取小鼠的泪腺匀浆制成抗原与弗氏佐剂混合为乳化剂，使用该乳化剂对同种小鼠进行多点注射，使小鼠发生自身免疫反应，产生干燥综合征小鼠模型。
根据本发明的较佳实施例，所述干燥综合征小鼠模型主要是小鼠干燥综合征相关干眼模型。
根据本发明的较佳实施例，所述造模方法包括：
S1:将7-9周龄小鼠脱颈椎处死，取出双侧眶外泪腺，显微镜下剥离包膜及结缔组织，用PBS缓冲液洗净后放入离心管中，冰上制备组织匀浆以及超声粉碎后离心取上清液，测上清液的蛋白浓度，以上清液为抗原；
S2：根据上清液蛋白浓度的高低，用PBS缓冲液稀释调整，再与等量的FCA(弗氏完全佐剂)与混合，分别得到抗原终浓度为4mg/mL和2mg/mL的乳化剂；
S3:将7-9周龄的同种小鼠随机分为模型组(Experimental Sjogren’ssyndrome,ESS)和对照组(Ctrl)，测量正常小鼠的泪液分泌量和唾液分泌量的基线水平；
S4:分别在第0天、第7天于模型组多点注射4mg/mL的乳化剂，注射量为0.1mL/只，在第14天于再次多点注射2mg/mL的乳化剂，注射量为0.1mL/只；对照组小鼠同时期同位置等量注射PBS缓冲液；
S5:造模6周后，检测指标，筛选造模成功小鼠。
根据本发明的较佳实施例，所述小鼠为雌性或雄性C57BL/6N小鼠、雌性或雄性c57小鼠或者雌性或雄性balb/c小鼠。
根据本发明的较佳实施例，S1、S3中，所述小鼠为8周龄小鼠。
根据本发明的较佳实施例，S4中，所述多点注射包括颈部皮下注射、颈部皮内注射、腹腔注射或足垫注射；优选是颈部皮下注射或颈部皮内注射。
根据本发明的较佳实施例，S5中，造模成功的检测指标包括：
饮水量：从造模前一周开始，每周测定小鼠饮水量；模型组小鼠饮水量逐渐上升；
泪液分泌量：造模前测正常小鼠的泪液分泌量的基线水平，造模后模型组小鼠泪液分泌量下降到基线以下；
唾液分泌量：造模前测正常小鼠的泪液分泌量的基线水平，造模后模型组小鼠唾液分泌量下降到基线以下；
角膜荧光素钠染色：造模后模型组小鼠角膜上皮着染面积较对照组增大；
血清抗SSA抗体浓度：造模后模型组小鼠的血清中抗SSA抗体浓度高于对照组；
泪腺组织及唾液腺组织的病理学检测：造模后模型组小鼠泪腺结构较对照组紊乱，导管附近出现淋巴细胞浸润；
泪腺组织炎症因子mRNA水平检测：造模后模型组小鼠泪腺炎性因子mRNA表达水平高于对照组小鼠。
(三)有益效果
本发明的造模方法首次使用小鼠泪腺作为抗原，诱导小鼠出现干燥综合征相关全身症状的同时，眼部及泪腺症状更为明显，更显著地表现出眼表及泪腺功能障碍相关症状，相较于主要是针对全身症状的现有技术，本发明的造模方法更适合于干燥综合征相关干眼的基础研究。
附图说明
图1为小鼠干燥综合征小鼠模型的造模时间轴。
图2为小鼠泪液分泌量(Schirmer I test,SIt)。
图3为小鼠唾液流率(Salivary Flow Rate,SFR)。
图4(a)为小鼠角膜荧光素钠染色外眼像(Corneal Fluorescein Staining,CFS)；图4(b)使用Image J软件对两组小鼠角膜上皮着染面积进行计算的结果。
图5为小鼠血清抗SSA抗体浓度。
图6为泪腺组织HE染色。
图7为qPCR检测泪腺组织中IL-1b、TNF-α、IFN-γ及MMP-9的mRNA表达水平。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本实施例的干燥综合征小鼠模型时间轴如图1所示：
1、泪腺抗原的制备：
取适量只数雌性8周龄C57BL/6小鼠(购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18-20g)，脱颈椎处死，无菌条件下取出双侧眶外泪腺，显微镜下剥离包膜及结缔组织，用PBS缓冲液洗净后放入无菌离心管中。离心管中加入PBS缓冲液后剪碎组织，PBS缓冲液不易加入太多，以免抗原浓度过低。冰上组织匀浆以及超声粉碎(30％，9s，三次)后离心(12000rpm 30s，3000rpm、15min)取上清液，BCA进行蛋白浓度测定，按需分装于超低温冰箱储存。
2、动物分组：
将雌性8周龄C57BL/6小鼠随机分为模型组和对照组，测定每只小鼠基线数据，颈部剃毛以便后续操作。
3、泪腺抗原注射：
分别在第0天、第7天于模型组(Experimental Sjogren’s syndrome,ESS)小鼠颈部皮下多点注射使用弗氏完全佐剂1:1配制的小鼠泪腺抗原，注射量为0.1mL/只。抗原终浓度为4mg/mL，调整方法如下：将小鼠泪腺抗原用PBS缓冲液调整至8mg/mL，加入等量弗氏完全佐剂将抗原调整至4mg/mL，冰上使用电动搅拌棒使溶液充分混匀呈不分层的乳白色。对照组小鼠颈部皮下多点注射PBS缓冲液，注射量为0.1mL/只。在第14天于模型组小鼠颈部皮下多点注射使用弗氏不完全佐剂1:1配制的小鼠泪腺抗原，注射量为0.1mL/只。抗原终浓度为2mg/mL，调整方法如上。对照组(Ctrl)小鼠颈部皮下多点注射PBS缓冲液，注射量为0.1mL/只。
4、模型鉴定：
饮水量：从造模前一周开始，每周测定小鼠饮水量。造模后，模型组小鼠饮水量逐渐上升。
泪液分泌量：小鼠使用3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，待其无角膜反射后，使用显微镊轻拉开小鼠下睑，夹取酚红棉线放置于小鼠下睑结膜囊距离外眦部约三分之一处，计时1min，取下酚红棉线测量其湿润长度(mm)记录。检测结果如图2所示，造模6周后模型组小鼠的泪液分泌量较基线下降(p<0.05)，对照组小鼠的泪液分泌量较基线无明显变化。
唾液分泌量：小鼠使用3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，使用0.04mg/mL的毛果芸香碱溶液按0.5mg/kg腹腔注射，5min后将吸水棉条一段塞入小鼠唾液腺开口处，测量15min唾液分泌量，以吸水棉条前后重量差(mg)记录。检测结果如图3所示，造模6周后模型组小鼠的唾液分泌量较基线下降(p<0.05)，对照组小鼠的唾液分泌量较基线无明显变化。
角膜荧光素钠染色：小鼠使用3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，将1μl 0.1％荧光素钠溶液滴入小鼠结膜囊使其涂布眼表，在裂隙灯显微镜钴蓝光照明及黄色滤光片下进行观察，使用Image J软件测算小鼠眼表荧光素钠染色面积。检测结果如图4a-图4b所示，造模6周后观察到模型组(左)小鼠的角膜上皮出现明显点染，对照组(右)小鼠的角膜上皮未见明显点染；使用ImageJ软件对两组小鼠角膜上皮着染面积进行计算，结果显示模型组小鼠的角膜上皮着染面积均较对照组增大且有统计学差异(p<0.05)。
血清抗SSA抗体浓度：小鼠使用3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后摘除眼球取血，室温下静置1h后离心(4℃，3000rpm，15min)，取上层澄清血清，使用小鼠抗SSA抗体(机体自身抗体中的抗核抗体)ELISA试剂盒进行检测。检测结果如图5所示，造模6周后模型组小鼠的血清中抗SSA抗体浓度高于对照组小鼠，并且有统计学差异(p<0.05)。
泪腺组织及唾液腺组织的病理学检测：小鼠处死后取泪腺及颌下腺，PBS缓冲液清洗组织后剥离包膜及结缔组织，置于4％多聚甲醛中固定，作石蜡包埋及切片，进行HE染色。检测结果如图6，造模6周后模型组(左图)小鼠泪腺结构较对照组紊乱，导管附近出现淋巴细胞浸润。
泪腺组织炎症因子mRNA水平检测：小鼠处死后取泪腺及颌下腺，PBS缓冲液清洗组织后剥离包膜及结缔组织，使用TRIzol法提取组织RNA，随后进行逆转录及qPCR，检测组织中IL-1b、TNF-α、IFN-γ及MMP-9的mRNA水平。检测结果如图7所示，造模6周后模型组小鼠的泪腺炎性因子mRNA表达水平高于对照组小鼠，其中IL-1b和MMP-9的mRNA表达水平有统计学差异(p<0.05)。
满足以上检测结果时，表明模型组已成功构建小鼠干燥综合征模型，且造模成功率达>88％，死亡率<4％。
本发明构造的模型小鼠中不仅饮水量上升、唾液分泌量有明显下降，同时模型组小鼠的泪液分泌量显著下降、角膜荧光素钠染色面积更大、小鼠泪腺结构出现更加紊乱、泪腺炎性因子mRNA表达水平更高；这些结果表明，相较于现有采用下颌腺诱导的造模方法，本发明构建的小鼠模型眼部及泪腺症状更为明显，故本发明更适于干燥综合征相关干眼的相关研究。
以上实施例仅以雌性C57BL/6N小鼠为例对本发明的造模方法进行说明，但本发明主要提供了一种新型抗原诱导型小鼠干燥综合征模型，基于理论可知，雄性C57BL/6N小鼠、雌性或雄性c57小鼠或者雌性或雄性balb/c小鼠均能采用上述方法造模。此外，对于小鼠的年龄，本实施例使用8周龄小鼠，但略小于或大于该周龄的小鼠亦能满足造模要求。
上述实施例以多小鼠颈部皮下多点注射为例进行说明，但可理解地，颈部皮内注射、腹腔注射或足垫注射同样可以达到发生自身免疫反应并产生干燥综合征模型的目的。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种基于小鼠泪腺诱导的干燥综合征小鼠模型的造模方法，其特征在于，通过提取小鼠的泪腺匀浆制成抗原与弗氏佐剂混合为乳化剂，使用该乳化剂对同种小鼠进行多点注射，使小鼠发生自身免疫反应，产生干燥综合征小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述干燥综合征小鼠模型主要是小鼠干燥综合征相关干眼模型。
3.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述造模方法包括：
S1:将7-9周龄小鼠脱颈椎处死，取出双侧眶外泪腺，显微镜下剥离包膜及结缔组织，用PBS缓冲液洗净后放入离心管中，冰上制备组织匀浆以及超声粉碎后离心取上清液，测上清液的蛋白浓度，以上清液为抗原；
S2：根据上清液蛋白浓度的高低，用PBS缓冲液稀释调整，再与等量的FCA与混合，分别得到抗原终浓度为4mg/mL和2mg/mL的乳化剂；
S3:将7-9周龄的同种小鼠随机分为模型组和对照组，测量正常小鼠的泪液分泌量和唾液分泌量的基线水平；
S4:分别在第0天、第7天于模型组多点注射4mg/mL的乳化剂，注射量为0.1mL/只，在第14天于再次多点注射2mg/mL的乳化剂，注射量为0.1mL/只；对照组小鼠同时期同位置等量注射PBS缓冲液；
S5:造模6周后，检测指标，筛选造模成功小鼠。
4.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述小鼠为雌性或雄性C57BL/6N小鼠、雌性或雄性c57小鼠或者雌性或雄性balb/c小鼠。
5.根据权利要求3所述的造模方法，其特征在于，S1、S3中，所述小鼠为8周龄小鼠。
6.根据权利要求3所述的造模方法，其特征在于，S4中，所述多点注射包括颈部皮下注射、颈部皮内注射、腹腔注射或足垫注射。
7.根据权利要求3所述的造模方法，其特征在于，S4中，所述多点注射为颈部皮下注射或颈部皮内注射。
8.根据权利要求3所述的造模方法，其特征在于，S5中，造模成功的检测指标包括如下：
饮水量：从造模前一周开始，每周测定小鼠饮水量；模型组小鼠饮水量逐渐上升；
泪液分泌量：造模前测正常小鼠的泪液分泌量的基线水平，造模后模型组小鼠泪液分泌量下降到基线以下；
唾液分泌量：造模前测正常小鼠的泪液分泌量的基线水平，造模后模型组小鼠唾液分泌量下降到基线以下；
角膜荧光素钠染色：造模后模型组小鼠角膜上皮着染面积较对照组增大；
血清抗SSA抗体浓度：造模后模型组小鼠的血清中抗SSA抗体浓度高于对照组；
泪腺组织及唾液腺组织的病理学检测：造模后模型组小鼠泪腺结构较对照组紊乱，导管附近出现淋巴细胞浸润；
泪腺组织炎症因子mRNA水平检测：造模后模型组小鼠泪腺炎性因子mRNA表达水平高于对照组小鼠。
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