CN116448900A - 一种利用液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮及其代谢物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种利用液相色谱‑串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮及其代谢物的方法。该方法通过以下步骤实现：（1）配置标准溶液；（2）样品前处理；（3）采用液相色谱‑串联质谱法进行定性定量分析。本发明通过特征光谱和质谱对标准物质定性，提出使用峰面积加和定量方式；通过优化样品前处理方法和色谱质谱条件实现植物源性食品中烯草酮及其代谢物同时测定；通过对基质效应进行定量评价，选择基质加标外标法定量；结合二级质谱图对烯草酮及其代谢物可能的裂解机理进行分析预测。

Description

一种利用液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮 及其代谢物的方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种利用液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮及其代谢物的方法。

背景技术

烯草酮(clethodim)是美国化学公司开发的一种新型环己烯酮类旱田苗后除草剂产品，属内吸传导型，具有高选择性的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，能被禾本科杂草茎叶迅速吸收并传导至茎尖及分生组织，抑制分生组织的活性，破坏细胞分裂，最终导致杂草死亡，可以除去大多数一年生和多年生的禾本科杂草，对花生、大豆、有才及果园等多数双子叶作物安全。食品中农药最大残留限量国家标准中烯草酮残留是以烯草酮及其代谢物亚砜和砜之和计，以烯草酮标示。烯草酮分子式为C17H26ClNO3S，分子量359.91，烯草酮原药为琥珀色透明液体，溶于大多数有机溶剂。紫外光、高温、强酸和强碱下分解。烯草酮亚砜(clethodim sulfoxide)是烯草酮的氧化代谢产物，分子式为C17H26ClNO4S，分子量375.91。烯草酮砜(clethodim sulfone)是烯草酮的代谢产物，分子式为C17H26ClNO5S，分子量391.49，烯草酮及代谢物转化如式一所示。GB2763-2019中规定了烯草酮在谷物、油料和油脂、蔬菜和糖类等4类产品的最大残留限量在0.1～2mg/kg之间，判定标准中规定了烯草酮残留物以烯草酮及代谢物亚砜、砜之和计，目前检测标准中普遍存在适用范围覆盖不全，检测目标物不全等，在监管过程中可能存在问题。

烯草酮除草剂具有安全高效、良好的耐雨水冲刷性能等特点，使用范围越来越广泛。因此，为了改善环境、保障人类健康，检测植物源性食品中的烯草酮及其代谢物的残留量具有重要的现实意义。目前，植物源性食品中烯草酮及其代谢物的常用的检测方法有近红外光谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法等，近红外光谱法灵敏度相对较低，不适合痕量分析；气相色谱-串联质谱法通常需要使用甲苯等有机溶剂，对环境不友好；液相色谱法同时分离多化合物需要时间更长，基质中容易存在干扰成分，容易出现色谱干扰峰，影响定量结果。这些方法是应用于单类目标物检测，烯草酮及其代谢物同时研究的较少。现有检测方法不能完全涵盖烯草酮及其代谢物，其对应异构体在检测时往往会被认定为干扰组分被忽略。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮及其代谢物的方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种利用液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮及其代谢物的方法，包括以下步骤：

（1）配置标准溶液；

（2）样品前处理：待测样品中加入混合溶剂进行涡旋振荡，超声，再次加入乙腈，振摇超声后，加入无水乙酸钠和无水硫酸镁，立即涡旋混合，离心取上清液，净化；

（3）采用液相色谱-串联质谱法进行定性定量分析。

进一步的，步骤（1）中，标准溶液的具体配置过程为：

分别准确称取10 mg烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜标准品置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并转移至10 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL标准储备液；

分别准确移取烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜标准储备液各1.00 mL，置于同一10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，制成浓度均为100 μg/mL的混合标准中间液A；

准确移取混合标准中间液A1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为10 μg/mL的混合标准中间液B；

依次准确移取混合标准中间液B0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL的混合标准工作溶液；

分别准确移取混合标准中间液B和混合标准工作溶液各浓度标准工作溶液50 μL，置于2 mL离心管中，加入950 μL空白基质提取液，涡旋混匀，配制成浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL或依需要配制适当浓度的基质混合标准系列。

进一步的，步骤（2）中，每2-5g样品中加入10mL混合溶剂；所述混合溶剂是由水和乙腈按照体积比1:0.1组成；所述混合溶剂和乙腈的体积比为1:2；所述所述涡旋振荡的时间为5min；所述超声的时间为10-30min；每20mL乙腈中加入1.5 g无水乙酸钠和6 g无水硫酸镁；所述涡旋混合的时间为5min；所述离心为以8000r/min的转速离心5min。

进一步的，步骤（2）中，所述净化为将上清液2 mL置于装有100 mg C₁₈的15 mL离心管中，涡旋混合2 min，以8000 r/min离心5 min，上清液经0.22 µm有机相滤膜过滤即可。

进一步的，步骤（3）中，所述液相色谱的条件为：液相色谱柱：BEH C₁₈，100 mm×2.1mm，1.7 μm；流速：0.30 mL/min；柱温：40℃；进样体积：1 μL；流动相：A为乙腈，B为0.1 %甲酸水溶液，进行梯度洗脱。

上述梯度洗脱的程序为：

。

进一步的，步骤（3）中，所述质谱的条件为：离子源：电喷雾离子源；采集方式：多反应监测MRM；扫描方式：正离子模式扫描；接口温度：300℃；脱溶剂气温度：500℃；雾化气流量：3.00 L/min；加热气流量：10.00 L/min；加热块温度：400℃。

上述质谱的参数为：

进一步的，步骤（4）中，定量分析时，烯草酮及其代谢物的两个峰加和计算峰面积进行定量。

本发明建立了液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮及其代谢物残留量的方法，针对谷物、油料及油脂、蔬菜和甜菜等对目标物进行高效提取，优化QuEChERS方法对不同样品进行净化；通过质谱电喷雾正离子多反应监测模式实现烯草酮及其代谢物和对应异构体测定，并且对不同植物源性样品进行定量基质效应评价。对烯草酮及其代谢物标准物质异构体通过液相色谱特征性光谱图和液相色谱串联质谱特异性离子对信息鉴定，证明烯草酮及其代谢物存在异构体，应该采用峰面积加和方式对目标物进行准确定量；通过对烯草酮及其代谢物进行二级质谱子离子扫描并且预测了可能的裂解规律。

本发明的有益效果为：

（1）本发明通过特征光谱和质谱对标准物质定性，提出使用峰面积加和定量方式；通过优化样品前处理方法和色谱质谱条件实现植物源性食品中烯草酮及其代谢物同时测定；通过对基质效应进行定量评价，选择基质加标外标法定量；结合二级质谱图对烯草酮及其代谢物可能的裂解机理进行分析预测。

（2）本发明能够为精准监管提供快速准确的分析方法。

附图说明

图1为烯草酮、烯草酮砜和烯草酮亚砜定量离子与定性离子对MRM色谱图；

图2为烯草酮及其代谢物液相色谱及特征光谱图；其中，A-烯草酮亚砜光谱图；B-烯草酮砜光谱图；C-烯草酮光谱图；

图3为化合物二级质谱图及预测裂解规律图；其中，A-烯草酮；B-烯草酮砜；C-烯草酮亚砜；

图4为提取溶剂对不同基质中目标化合物的提取效率；

图5为超声时间对提取效率的影响；

图6为净化条件的影响；

图7 加含水溶剂的体积对不同基质提取回收率的影响；其中，A为大豆；B为花生；C为玉米；D为葵花油毛油；

图8为烯草酮及其代谢物在不同基质中的基质效应。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

三重四极杆液质谱联用仪LCMS-8050（日本岛津公司）；高效液相色谱仪Agilent1260（美国安捷伦） ；液相色谱高分辨质谱联用仪Thermo Q-Exactive （美国赛默飞）3-18K 高速冷冻离心机（德国sigma公司）；MS3 涡旋振荡器（德国IKA公司）；电子分析天平（德国赛多利斯）。

标准物质：烯草酮标准品（美国AccuStandard和坛墨质检科技股份有限公司）；烯草酮砜标准品（北京曼哈格生物科技有限公司和天津阿尔塔科技有限公司）；烯草酮亚砜（加拿大toronto research chemicals和天津阿尔塔科技有限公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，sigma公司），氯化钠、无水乙酸钠、无水硫酸镁（分析纯），购于国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）；C18（40～60μm，天津迪马科技有限公司）；石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）上海阿拉丁生化科技有限公司；0.22 μm尼龙（Nylon）微孔滤膜；实验室用水为Milli-Q超纯水。实验中所用样品均购自农贸市场。

实施例1

（一）标准溶液配制

分别准确称取约10 mg（精确至0.01 mg）烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜标准品置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并转移至10 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL 标准储备液，-18℃以下避光保存，有效期6个月。

分别准确移取烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜标准储备液各1.00 mL，置于同一10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，制成浓度均为100 μg/mL的混合标准中间液A，-18℃以下避光保存，有效期1个月。

准确移取混合标准中间液A（100 μg/mL）1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为10 μg/mL的混合标准中间液B。-18℃以下避光保存1个月。

依次准确移取混合标准中间液B（10 μg/mL）0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL的混合标准工作溶液。-18℃以下避光保存1周。

分别准确移取混合标准中间液B和混合标准工作溶液各浓度标准工作溶液50 μL，置于2 mL离心管中，加入950 μL空白基质提取液，涡旋混匀，配制成浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL或依需要配制适当浓度的基质混合标准系列。基质混合标准工作溶液现用现配。

（二）样品前处理

（1）提取：

植物源食品基质（如谷物、油料和油脂）试样称取5.0 g（精确至0.01 g），油脂试样称取2.0 g（精确至0.01 g），置于50 mL具塞离心管中，加入9mL水和1mL乙腈，涡旋振荡5min，超声30 min，加入20 mL乙腈，振摇5 min，超声10 min，加入1.5 g无水乙酸钠和6 g无水硫酸镁，立即涡旋混合5 min，以8000 r/min 离心5 min，取上清液，待净化。

（2）净化：

取上清液2 mL置于装有100 mg C18的15 mL离心管中，涡旋混合2 min，以8000 r/min离心5 min，上清液经0.22 µm有机相滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

（三）基质效应

取空白基质样品，按上述前处理步骤制备空白基质溶液。分别用空白基质溶液和定容溶剂稀释标准储备液，得到同质量浓度水平的测定液。通过分别测定样品空白基质溶液与纯溶剂中添加同水平目标成分的响应值，计算二者的相对比值评价基质效应，按下式计算：

通过分别测定纯溶剂中标准溶液响应值(A)和样品基质中添加相同含量标准溶液响应值(B)，计算基质效应Matrix effect(%)=B/A×100%。基质效应在85～115%之间认为不存在基质效应，当小于85%时表示存在基质抑制效应；当大于115%时表示存在基质增强效应。

（四）液相色谱-串联质谱条件

(1) 液相色谱条件

液相色谱柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.30 mL/min；柱温：40℃；进样体积：1 μL；流动相：A为乙腈，B为0.1 %甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1；

表1 梯度洗脱程序

(2) 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI源）；采集方式：多反应监测（MRM）；扫描方式：正离子模式扫描；接口温度：300℃；脱溶剂气温度：500℃；雾化气流量：3.00 L/min；加热气流量：10.00 L/min；加热块温度：400℃。详细质谱参数见表2。

表2 烯草酮及其代谢物砜、亚砜的的定性离子对、定量离子、质谱参数和保留时间

注：烯草酮及其代谢物亚砜、砜均存在两个色谱峰，定量时需将峰面积加和后计算。

结果与分析

（一）色谱条件优化

将不同比例的水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇作为流动相对烯草酮、烯草酮亚砜、烯草酮砜的响应值、峰型及分离度进行试验比较，得出在0.1%甲酸水-乙腈条件下，烯草酮、烯草酮亚砜和烯草酮砜的先后出峰，分离度好，灵敏度高，达到理想色谱分离效果。因此，选用0.1%甲酸水-乙腈作为实验的流动相。实验测试了BEH C18、HSST3、Shim-packXR-ODS III三种色谱柱，实验结果发现三种色谱柱的分离差别不大，得到烯草酮及其代谢物烯草酮亚砜和烯草酮砜的峰形对称、均有较高响应且有较好分离度的色谱图。烯草酮、烯草酮砜和烯草酮亚砜定量离子与定性离子对MRM色谱图1；图1中，1，2-烯草酮定量离子；1'，2'-烯草酮定性离子；3，4-烯草酮砜定量离子，3'，4'-烯草酮砜定性离子；5，6-烯草酮亚砜定量离子，5'，6'-烯草酮亚砜定性离子。

每种化合物选择2家不同生产厂家标准品进行液相色谱特征光谱图进行对比，结果证明，不同品牌标准品发现烯草酮及其代谢物砜、亚砜三种化合物出两个峰，每种标准溶液在液相色谱图中能够完全分离出保留时间不同特征光谱图一致的两个峰，结果见图2所示。与烯草酮农药标准GB/T 22614-2008进行对比发现液相色谱中同样出两个峰，标准中只对其中峰响应较高的定为烯草酮。对烯草酮原药进行液相色谱分析，出现两个保留时间不同特征光谱一致的色谱峰。特征从烯草酮结构推测有顺反式异构体，所以出现两个峰，因此确认两个峰都是同一个化合物，定量选择两个峰加和计算峰面积进行定量。

（二）质谱条件优化

分别将烯草酮、烯草酮砜和烯草酮亚砜的标准溶液配制成100 ng/mL浓度的标准溶液, 在电喷雾正离子扫描模式下进行优化,通过一级质谱扫描，对锥孔电压和毛细管电压进行优化，确定分子离子，然后以分子离子作为母离子进行二级质谱分析，对碰撞能量等质谱参数进行优化，选取丰度较高的两个离子作为定量离子和定性离子，优化后的质谱条件见表2所示。结合二级全扫描质谱谱图推测三种化合物的裂解规律如图3所示所示。

（三）前处理条件优化

（1）提取溶剂的选择

为了更准确地检测，需要先用提取溶液把目标物提取出来，再进行方法定量检测。通过对烯草酮、烯草酮亚砜和烯草酮砜性质的了解，在样品提取时选用乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈和酸化乙腈作为提取溶剂。提取溶剂结果结果见图4所示，乙腈作为提取剂在番茄、大豆和葵花籽毛油三种代表性基质中的平均回收率在70～120%之间，乙酸乙酯和丙酮对烯草酮及其砜和亚砜代谢物提取回收率较低，不适于作为提取溶剂，甲醇和酸化乙腈对三种目标物的提取回收率不稳定，偏差较大。因此乙酸乙酯、丙酮、甲醇和酸化乙腈不适合用于提取三种目标化合物。乙腈作为提取烯草酮及其代谢物砜和亚砜时，回收率符合农残分析的要求，最终选择乙腈作为烯草酮、烯草酮亚砜和烯草酮砜的提取溶剂。

（2）提取方式优化

实验过程中，根据样品状态不同会进行补水后用乙腈提取，当直接加入乙腈时，由于样品在称取时呈非分散状态，若直接加入有机相可能导致样品表面形成有机液膜而提取溶液很难进入样品内部，可能导致目标物提取不出，采用前期水和乙腈混合溶剂的形式预先进行补水，能够大大提高后续目标物的溶出，提高提取效率。且需要进一步对样品进行分散，选择涡旋振荡的方式进行样品基质分散，涡旋时间不同导致样品分散不同或水的浸润状态不同，试验选取1 min、2 min、5 min、10 min、15 min五个不同时间对样品进行分散。实验结果证明，当分散时间为5 min时样品基质能够分散完全，当时间低于5 min时，样品分散不充分；当涡旋振荡时间大于5 min时，样品已经处于完全分散状态。因此从样品处理效果、节约时间和提高工作效率等三面综合考虑，选择涡旋振荡时间为5 min。

当基质成为分散状态时，就需要选择合适的方式从基质内部将烯草酮及代谢物砜、亚砜完全提取出来，实验考察了水浴振荡和超声两种提取方式，通过实验结果发现，水浴震荡提取方式无法完全从样品基质中提取出来，通过超声波大功率提取，能将目标物从基质内部完全提取出来，因此选择超声提取方式对样品进行提取。进而对超声时间进行优化，实验考察10 min、20 min、30min、40 min、50 min、60 min不同时间内提取效率，实验结果见图5所示，证明当超声时间达到30 min时，提取效率最高，当超过30min时，提取效率几乎不变，说明当超声时间达到30 min时，烯草酮及代谢物砜、亚砜几乎被完全提取出来，因此选择超声30 min作为提取条件。

（3）净化条件优化

基质中干扰成分是复杂多样的，不同的干扰成分对目标化合物是有不同的影响，目标化合物从基质中提取出来后，应该对提取液中的干扰成分进行处理，以降低干扰对烯草酮及代谢物烯草酮亚砜和烯草酮砜的影响。分散固相萃取法时通常用净化剂有N-丙基乙二胺(PSA)，碳十八硅烷（C18）和石墨化碳黑（GCB）。PSA对烯草酮及代谢物烯草酮亚砜，烯草酮砜有一定的吸附性，回收率约为50%左右，不能作为净化剂使用；GCB对色素的除杂效果较好，但同时对烯草酮及代谢物烯草酮亚砜，烯草酮砜同样有较强的吸附作用，回收率随GCB用量增加迅速降低，因此不加GCB，实验结果见图6所示。C18对烯草酮及代谢物烯草酮亚砜，烯草酮砜的吸附作用不大，回收率为90%左右。

对烯草酮及代谢物在0 mg、10 mg、50 mg、100 mg和200 mg的C18中的回收率进行考察，实验结果见图7所示，可以得出：C18的量不同对烯草酮及代谢物的回收率影响不大，回收率均在90%～120%内，但当C18量低于100mg时，对于基质杂质的净化效果不好，回收率稳定性差，100 mg的量与200 mg的净化效果差异不大。从经济的角度出发，选用100 mg C18作为净化剂，能满足农药残留分析的要求。

（4）加含水溶剂体积优化

植物源性食品基质复杂，含水量存在差异，直接加乙腈提取会影响回收率。因此实验考查了加含水溶剂体积分别为0、1、2、5、10、15、20 mL时对待测目标物的影响。通过图8可以看出，当加含水溶剂体积为10 mL时提取回收率最高，因此谷物、油脂和油料加10 mL水最合适。分析可能是因为玉米、大豆和花生呈现出几乎没有水分的状态，样品内部的目标物不容易被乙腈快速直接提取出来，所以需要加入一定体积的含水溶剂，用含水溶剂对样品进行分散，然后再加入乙腈进行提取烯草酮及代谢物砜和亚砜，因此提取效率会提高，当加含水溶剂体积能够使样品分散时，再增加含水溶剂的体积时，提取回收率几乎不变，因为此时目标物几乎完全从样品中释放出来。葵花油毛油样品基质用乙腈直接提取时，可能提取出弱极性物质，增强了基质效应导致回收率偏高，当加含水溶剂10 mL时，样品中弱极性物质溶解于含水溶剂中，目标物被提取在乙腈溶液中，提取回收率正常。因此选择样品中加入10mL含水溶剂进行提取。

（四）基质效应评价

基质对分析物的分析过程有显著干扰，并影响分析结果的准确性。超高效液相色谱-串联质谱具有较高的灵敏度，但基于其检测原理，存在一定的基质效应（Matrixeffect，ME）。建立UPLC-MS/MS方法时对基质效应进行评价，同时采取一定的消除或减弱措施对于保证定量结果的准确性是十分必要的。

本发明通过提取后添加标准物质法定量评价烯草酮及其代谢物砜、亚砜在不同植物源食品中的基质效应。采用如上所述方法对12种典型基质中烯草酮及其代谢物砜、亚砜的基质效应进行评价，见图8所示，在选择的12类基质中，烯草酮及其代谢物均存在基质抑制效应。鉴于对基质效应的考察，本实验采用基质匹配校正曲线定量，以减少基质干扰对结果的影响。

（五）方法的线性范围及检出限

稀释并检测系列混合标准溶液，计算信噪比（S/N）。以S/N=3为检出浓度，以S/N=10为最低定量浓度。向不含目标物质的空白样品中定量添加混合标准溶液，按前处理方法处理后，进行检测，计算信噪比（S/N）。以S/N=3为检出限，以S/N=10为定量下限，由此得到目标物的方法检出限和定量限。当称样量为5 g时，烯草酮及其代谢物砜和亚砜的检出限为0.010 mg/kg，定量限为0.020 mg/kg。当称样量为2 g时，烯草酮及其代谢物砜和亚砜的检出限为0.025mg/kg，定量限为0.050 mg/kg。

表3 不同基质目标物线性范围及回归方程

（六）回收率及精密度实验

称取不含分析物的玉米、大豆、花生、葵花油毛油、洋葱、番茄、甜菜，分别加入烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜混合标准溶液得到定量限、1/2倍限量值、限量值、2倍限量值四个水平各选一个点进行试验，按照本方法处理测定，得到回收率为74.1%～118.6%，在不同基质中烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜回收率均较满意。对不同试样不同加标水平平行测定6次，测定结果均具有良好的重现性，RSD为0.79%～9.93%，测定结果见表4。

表4 烯草酮及其代谢物的线性关系、回收率、精密度、检出限与定量限（n=6）

（七）稳定性实验

（1）标准溶液稳定性

为了考察标准品的稳定性，选取-18℃避光保存的标准溶液在不同时间进行稳定性考察。对1 mg/mL的烯草酮、烯草酮砜和烯草酮亚砜三种标准溶液进行6个月考察，考察上机的色谱峰响应峰面积在近6个月的实验期内，标准储备液RSD值小于5%。

（2）日内精密度试验

用空白基质提取液稀释标准储备液，配置浓度为5 ng/mL、50 ng/mL和500 ng/mL的标准溶液，在设定的色谱质谱条件下，在同一日内平行测定6次，以色谱峰峰面积的重复性作为指标，进行液质法日内精密度实验，结果见表5所示，日内精密度RSD值小于5%，实验结果能够满足方法要求。

表5 标准溶液日内精密度

（3）日间稳定性试验

用空白基质提取液稀释标准储备液，配置浓度为500 ng/mL的混合标准溶液，在2～6℃下密封避光保存，连续测定7天。以色谱峰峰面积的重复性作为指标，进行液质法日间稳定性试验。结果表明，在基质提取液中烯草酮及其代谢物砜和亚砜在2~6℃下放置7天是稳定的，因此建议样品基质经过前处理后应尽快上机分析测试，否则可能会致使基质成分发生改变。

Claims (9)

1.一种利用液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中烯草酮及其代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配置标准溶液；

（2）样品前处理：待测样品中加入混合溶剂进行涡旋振荡，超声，再次加入乙腈，振摇超声后，加入无水乙酸钠和无水硫酸镁，立即涡旋混合，离心取上清液，净化；

（3）采用液相色谱-串联质谱法进行定性定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，标准溶液的具体配置过程为：

（a）分别准确称取10 mg烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜标准品置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并转移至10 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL标准储备液；

（b）分别准确移取烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亚砜标准储备液各1.00 mL，置于同一10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，制成浓度均为100 μg/mL的混合标准中间液A；

准确移取混合标准中间液A1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为10 μg/mL的混合标准中间液B；

（c）依次准确移取混合标准中间液B0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL的混合标准工作溶液；

（d）分别准确移取混合标准中间液B和混合标准工作溶液各浓度标准工作溶液50 μL，置于2 mL离心管中，加入950 μL空白基质提取液，涡旋混匀，配制成浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL或依需要配制适当浓度的基质混合标准系列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，每2-5g样品中加入10mL混合溶剂；所述混合溶剂是由水和乙腈按照体积比1:0.1组成；所述混合溶剂和乙腈的体积比为1:2；所述所述涡旋振荡的时间为5min；所述超声的时间为10-30min；每20mL乙腈中加入1.5 g无水乙酸钠和6 g无水硫酸镁；所述涡旋混合的时间为5min；所述离心为以8000r/min的转速离心5min。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述净化为将上清液2 mL置于装有100 mg C₁₈的15 mL离心管中，涡旋混合2 min，以8000 r/min离心5 min，上清液经0.22 µm有机相滤膜过滤即可。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述液相色谱的条件为：液相色谱柱：BEH C₁₈，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流速：0.30 mL/min；柱温：40℃；进样体积：1 μL；流动相：A为乙腈，B为0.1 %甲酸水溶液，进行梯度洗脱。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：

。

7.根据权利要求1、5或6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述质谱的条件为：离子源：电喷雾离子源；采集方式：多反应监测MRM；扫描方式：正离子模式扫描；接口温度：300℃；脱溶剂气温度：500℃；雾化气流量：3.00 L/min；加热气流量：10.00 L/min；加热块温度：400℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述质谱的参数为：

。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，定量分析时，烯草酮及其代谢物的两个峰加和计算峰面积进行定量。