CN116445523A - 一种小麦抗逆性基因TaBSL3与应用 - Google Patents

一种小麦抗逆性基因TaBSL3与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小麦抗逆性基因TaBSL3与应用，属于基因工程技术领域，所述TaBSL3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明将基因TaBSL3过表达转化到拟南芥中进行功能验证，结果表明，过表达TaBSL3基因的拟南芥相比于野生型拟南芥的抗旱性显著提高，对于植物激素脱落酸(ABA)的敏感性显著增强，因此TaBSL3基因在植物生长发育和抗旱过程中扮演着正向调控作用，为小麦分子育种提供理论基础和基因资源，为今后获得抗旱高产的株系，提高小麦抗旱性具有十分重要的意义。

Description

一种小麦抗逆性基因TaBSL3与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种小麦抗逆性基因TaBSL3与应用。
背景技术
植物作为一种不可自主移动的生物，在生长过程中会面临复杂的环境，包括各种逆境胁迫，比如高温、冷害、干旱等。干旱条件会降低植物光合作用，气孔不能正常开张，抑制叶绿素形成，对于作物的产量和品质都造成了巨大的影响。小麦是我国三大粮食作物之一，对小麦进行抗旱基因挖掘对培育抗旱小麦品种并提高小麦产量具有重要意义。
拟南芥BSL家族作为一种蛋白磷酸酶，包括四个成员：BSU1、BSL1、BSL2、BSL3。BSL家族成员响应激素油菜素类固醇(BR)，同时还参与植物应对生物胁迫的免疫反应。在植物应答激素油菜素类固醇(BR)的研究中，认为以BSU1为代表的BSL家族在响应过程中表现为功能冗余，其作用于胞质激酶BSK1的下游，能去磷酸化并促进胞质激酶BIN2的降解，从而促进BR应答转录因子的表达，启动植物对BR的响应。然而，小麦中BSL家族成员在植物抗逆包括抗旱在内的逆境胁迫中的功能仍未报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小麦抗逆性基因TaBSL3与应用，该抗逆性基因TaBSL3能够显著提高植物抗旱性，促进植物的生长发育。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种小麦抗逆性基因TaBSL3，所述TaBSL3的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供了一种上述抗逆性基因TaBSL3编码的蛋白质。
本发明还提供了一种含有上述抗逆性基因TaBSL3的生物材料，为以下任意一种：
A1)包含上述抗逆性基因TaBSL3的重组表达载体；
A2)包含上述抗逆性基因TaBSL3的重组菌；
A3)包含A1)所述的重组表达载体的重组菌。
优选的，所述重组表达载体的空载体包括pENTR、pCAMBIA1300-EGFP、pCAMBIA1307-FLAG或pC336。
本发明还提供了一种上述抗逆性基因TaBSL3、蛋白质或生物材料在抗逆性转基因植物育种中的应用。
本发明还提供了一种上述抗逆性基因TaBSL3、蛋白质或生物材料在提高转基因植物抗逆性中的应用。
优选的，所述抗逆性包括耐旱性。
优选的，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。
本发明还提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中如上述的抗逆基因TaBSL3的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤。
优选的，所述抗逆性包括耐旱性；所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种小麦抗逆性基因TaBSL3与应用，本发明将基因TaBSL3过表达转化到拟南芥中进行功能验证，结果表明，过表达TaBSL3基因的拟南芥相比于野生型拟南芥的抗旱性显著提高，对植物激素脱落酸(ABA)的敏感性显著增强，因此TaBSL3基因在植物生长发育和抗旱过程中扮演着正向调控作用，为小麦分子育种提供理论基础和基因资源，为今后获得抗旱高产的株系，提高小麦抗旱性具有十分重要的意义。
附图说明
图1为DH5α大肠杆菌菌落PCR鉴定小麦TaBSL3基因表达的电泳图结果，其中泳道：1～9为鉴定的编号为1～9的大肠杆菌单克隆，10为plus DNA marker(TRANS)，其中泳道1，4，8的结果表明编号为1，4，8的单克隆为阳性克隆；
图2为TaBSL3-FLAG序列扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道：1～4为编号为1～4的TaBSL3-FLAG基因扩增产物，5为plus DNA marker(TRANS)；
图3为pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG重组表达载体中小麦TaBSL3基因表达的电泳图结果，其中泳道：1～4为编号为1～4的转化重组表达载体的大肠杆菌单克隆，5为plusⅡDNAmarker(TRANS)，其中编号3的单克隆为阳性克隆；
图4为pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG重组表达载体转化至GV3101农杆菌后的小麦TaBSL3基因表达的电泳图结果，其中泳道：1～13为编号为1～13的转化pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG的GV3101农杆菌单克隆，14为DNA marker(TRANS)，其中1～13均为阳性克隆，后续挑选阳性克隆4进行农杆菌侵染试验；
图5为转化成功的农杆菌侵染拟南芥得到TaBSL3转基因过表达株系中的小麦TaBSL3基因表达的电泳图结果，其中泳道从左至右依次为1～3为TaBSL30E 4-1转基因株系，4～6为株系TaBSL30E 4-2转基因株系，7～9为TaBSL30E 15-37转基因株系，10～12为TaBSL30E 15-35转基因株系，13-15为TaBSL30E 15-39转基因株系，16～18为TaBSL30E 10-19转基因株系，19～21为TaBSL30E 10-18转基因株系，22～24为TaBSL30E 10-14转基因株系，25为DNAmarker(TRANS)；
图6为野生型拟南芥Col-0和TaBSL3转基因过表达株系分别在干旱前、干旱后和复水后的植株的存活情况；
图7为不同浓度的ABA分别对野生型拟南芥Col-0和TaBSL3转基因过表达株系的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种小麦抗逆性基因TaBSL3，所述TaBSL3的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明通过质谱分析鉴定到小麦磷酸酶基因，该基因通过序列比对发现其与拟南芥中AtBSL3同源，因此将其命名为TaBSL3，并克隆得到小麦TaBSL3基因，所述TaBSL3基因全长编码框核苷酸序列长度为2964bp，所述TaBSL3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述TaBSL3基因的获得方法包括：通过提取小麦花穗部位的RNA并反转录扩增得到TaBSL3基因。
本发明还提供了一种上述抗逆性基因TaBSL3编码的蛋白质。
本发明还提供了一种含有上述抗逆性基因TaBSL3的生物材料，为以下任意一种：
A1)包含权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3的重组表达载体；
A2)包含权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3的重组菌；
A3)包含A1)所述的重组表达载体的重组菌。
在本发明中，所述TaBSL3构建到表达载体上时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种启动子，如可以CaMV35S为启动子构建TaBSL3基因过表达的双元载体pCaMV35S::TaBSL3-FLAG。本发明可用现有的植物表达载体构建含有所述TaBSL3基因的重组表达载体，所述的植物表达载体优选的包括双元农杆菌载体等，如pENTR、pCAMBIA1300-EGFP、pCAMBIA1307-FLAG或pC336等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hyg基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
在上述生物材料中，作为进一步优选的实施方式，本发明所述重组表达载体为将上述TaBSL3基因插入pCAMBIA-1307-FLAG载体中得到的重组载体。所述TaBSL3基因插入pCAMBIA-1307-FLAG载体中的限制性内切酶SalⅠ和SacⅠ之间。
在上述生物材料中，所述重组菌可为细菌或真菌，如大肠杆菌和农杆菌。
本发明还提供了一种上述抗逆性基因TaBSL3、蛋白质或生物材料在抗逆性转基因植物育种中的应用。
本发明还提供了一种上述抗逆性基因TaBSL3、蛋白质或生物材料在提高转基因植物抗逆性中的应用。
上述应用中，所述抗逆性优选的包括耐旱性。所述植物优选的包括单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如拟南芥Col-0；所述单子叶植物优选为小麦。
本发明还提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中如上述的抗逆基因TaBSL3的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤。
上述方法中，所述抗逆性优选的包括耐旱性；所述植物优选包括单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物优选为小麦，所述双子叶植物优选为拟南芥，如拟南芥Col-0。所述转基因植物比受体植物的耐旱性增强。所述提高受体植物中如上述的抗逆基因TaBSL3的表达量和/或活性可通过向受体植物中导入上述生物材料的方式实现，如可通过向受体植物中导入上述TaBSL3基因的方式、通过向受体植物中导入上述重组表达载体的方式或通过上述重组菌转化至受体植物中的方式实现。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1小麦TaBSL3基因的克隆
S1、将小麦的种子避光置于4℃冰箱中低温春化3～4d，黑暗条件下萌发4d后，用镊子取下发芽的植株移入营养土中，在22℃/16℃，12h/12h光照/黑暗条件下培养至小麦花期，用镊子小心取下小麦花穗0.1g，用RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取总RNA。
利用Trizol试剂盒提取总RNA，具体方法如下：
(1)将植物样品用镊子小心取下，立即放入在液氮中预冷的2.0mL EP管中，并加入钢珠在研磨机上研磨样品，在1400rpm转速下研磨60s；
(2)加入1mL解离液，上下颠倒混匀，室温静置5min；
(3)在4℃离心机中12000rpm转速离心10min，取上清并将其加入到1.5mL进口EP管；
(4)在上清中加入200μL氯仿，振荡15s，室温放置3min，在4℃离心机中12000rpm；
(5)转速离心10min，取离心产物的上清并将其加入到1.5mL进口EP管；
(6)在上清中加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，加入到吸附柱CR3中，在4℃离心机中12000rpm转速离心1min；
(7)加入500mL去蛋白液RD溶液，在4℃离心机中12000rpm转速离心1min；
(8)加入500mL漂洗液RW溶液，室温静置2min，在4℃离心机中12000rpm转速离心1min；
(9)重复以上步骤一次；
(10)在4℃离心机中12000rpm转速离心2min；
(11)将CR3转移到新的1.5mL进口离心管，加入30μL RNase-free ddH2O，室温放置2min，在4℃离心机中12000rpm转速离心2min；
(12)使用超微量分光光度仪测量提取后RNA浓度。
S2、cDNA的获得
步骤如下：
(1)将模板RNA取2μg用RNase-free ddH2O补齐到8μL，然后与5×gRNA buffer混合，如表1所示；
(2)42℃条件下3min，迅速放于冰上，得到RNA预混样；
(3)按表2体系混合样品；
(4)在42℃条件下孵育15min，42℃条件下孵育3min，迅速置于冰上(所得cDNA需冷冻保存)。
表1RNA预混样
表2cDNA扩增体系
S3、小麦基因扩增
根据GC含量和引物退火温度等特性，在小麦基因TaBSL3的5’UTR和3’UTR区域设计特异性基因扩增引物，所述引物序列如下：
TaBSL3-F：ACTCTCGCCCCAAATCTCCC(SEQ ID No.2)
TaBSL3-R：TGGCATGGCTGTGGGCTAAAA(SEQ ID No.3)
获得基因扩增引物后，根据小麦基因组庞大且重复序列多的特点，选择扩增能力强的Gflex高保真酶进行基因扩增。方法如下：
按照表3中的试剂配制PCR反应液:
表3基因扩增反应体系
反应体系混好后，通过表4所述扩增程序进行序列扩增：
表4PCR扩增程序
反应后将扩增产物进行基因末尾加“A”处理，反应如下：
表5加“A”反应体系
将加“A”反应体系均匀混合，在72℃条件下反应30min；
将反应产物进行加“A”处理后，与pMD18-T(Takara)载体进行TA克隆。
反应如下：
表6pMD18-T载体连接反应体系
均匀混合，在16℃条件下反应16h；
与pMD18-T中间载体连接产物转化DH5α大肠杆菌，涂布菌液于含有氨苄抗生素的LB固体培养基过夜生长，通过菌落PCR鉴定目的片段是否成功连接到目标载体上，PCR结果如附图1所示，测序检验序列的特异性。
图1结果表明，本发明成功获得小麦TaBSL3基因。通过测序结果，所述的TaBSL3基因的核苷酸序列如下：
ATGACGACGGAGTCGGACTCCGACTCCGACGCGACCACCGCCGCCGCGCTGGGCCG
AGGCTCCGGGAGCGAGACCTCCTCCTCGTCCGCCCCGTCGACGCCCGGGACGCCCACGG
CGGCTCCGGCCTCTCCGGCCGTGGCAGGATCGGGGCCGAGGCCGGCGCCAGGGTACACC
GCGGTGAACGCGGTGATCGACAAGAAGGAGGACGGCCCGGGGTGCCGCTGCGGCCACAC
GCTCACGGCAGTGCCGGCTGTCGGGGAGGAGGGCTCGCCCGGCTACGTCGGGCCGCGGC
TCATCCTCTTCGGCGGCGCAACCGCGCTAGAGGGCAACTCTGCAACGCCTCCCTCCTCAG
CTGGCAGCGCTGGGATCCGTCTTGCCGGTGCCACAGCAGATGTCCACTGTTACGATGTATT
ATCAAATAAGTGGAGCAGGCTTACTCCACTTGGTGAGCCTCCTTCACCAAGAGCTGCACAT
GTAGCAACCGCGGTTGGAACCATGGTTGTCATTCAGGGTGGAATTGGCCCAGCTGGTTTAT
CTGCGGAGGACCTTCATGTTCTAGATCTTACACAACAGAGACCACGATGGCACAGAGTGG
TGGTTCAAGGACCTGGTCCAGGTCCACGATATGGACATGTGATGGCCTTGGTTGGACAGA
GGTTCTTGTTGACAATAGGTGGAAATGATGGGAAGCGGCCTCTGGCGGATGTATGGGCTCT
TGATACGGCTGCTAAGCCATATGAATGGAGGAAACTTGAACCAGAAGGTGAAGGACCACC
ACCATGCATGTATGCCACTGCCAGTGCACGATCTGATGGTCTACTTTTACTCTGCGGTGGGA
GGGATGGTAATAGTGTGCCACTATCAAGTGCATATGGTCTCGCGAAACATAGAGATGGGCG
CTGGGAGTGGGCAATAGCCCCTGGTGTCTCTCCGTCACCAAGATACCAACATGCAGCTGTT
TTCGTGAATGCACGTCTTCATGTGTCAGGAGGTGCTCTTGGAGGTGGTCGGATGGTAGAG
GACTCCTCAAGTGTTGCAGTGCTGGACACGGCTGCTGGAGTTTGGTGCGACACGAAGTCA
GTTGTCACAACTCCCAGGACAGGAAGATATAGTGCGGATGCAGCAGGAGGTGATGCTGCT
GTTGAACTTACGCGACGGTGTAGGCATGCAGCAGCTGCTGTTGGCGACTTAATATTCCTTTA
TGGAGGTTTACGGGGAGGTGTATTGCTAGATGATCTTCTTGTGGCTGAAGATCTTGCTGCC
GCAGAAACGACAACTGCTGCTAATCACGCAGCGGCAAGTTCAGCAGCTACTGACACACA
AGCTGGAAAGGCACCTGGAAGATATGCTTACAATGATGAACGTACAAAACAGGCAGCTTC
AGAATCAGCTCCAGATGGATCTGTAGTTCTTGGAACACCAGTTGCTCCTCCTCTTAATGGG
GACATATATACTGATATTAGCCCTGAGAATGCCGTGCCGCAGGGACAGAGGAGATCAAGTA
AAGGTGTTGATTACTTGGTCGAAGCATCAGCAGCAGAGGCAGAGGCAATTAGTGCTACTTT
AGCTGCTGTAAAGGCTAGGCAGGTTAATGGTGAGGCAGAAGAGTTGTCTGACAAGGAGC
AGTCTCCAGATTCTTCATCAAGCAACAAACATTCAAGCCTCATTAAACCAGACACTGCACT
TTCAAATAACATGACACCTCCACCTGGTGTTCGGTTGCACCACAGAGCTGTGGTAGTGGCT
GCGGAAACTGGAGGTGCCTTAGGTGGCATGGTCAGACAGCTTTCGATTGACCAGTTTGAA
AACGAAGGAAGAAGGGTCAGCTATGGCACACCTGAGAATGCAACTGCTGCAAGGAAGTT
GCTTGACCGCCAGATGTCCATTAATAGTATTCCTAAAAAGGTGATTGCATCTCTGTTGAAAC
CTCGCGGCTGGAAGCCTCCCGTGCGAAGGCAGTTCTTCTTGGACTGCAATGAGATTGCAG
ATCTGTGTGATAGTGCTGAGAGAATATTTTCAAGTGAACCAAGTGTTTTGCAACTTAAAGC
TCCCATTAAAATATTTGGTGATTTACATGGTCAATTTGGTGACCTTATGCGATTGTTTGATGA
GTATGGTTCTCCTTCAACGGCTGGAGACATCGCGTACATTGATTATCTTTTCTTGGGTGATTA
TGTGGATCGTGGGCAGCACAGTTTAGAAACTATGTCCCTTCTTCTTGCTTTGAAGGTTGAA
TATCCGCAAAACGTACATTTAATTCGTGGAAATCATGAGGCCGCTGACATTAACGCTTTATT
TGGCTTCCGAATAGAGTGTATAGAGCGAATGGGCGAAAGAGATGGCATCTGGACATGGCAT
CGTATGAATAGGCTATTTAACTGGCTTCCTTTGGCTGCACTCATAGAAAAGAAAATTATCTG
TATGCATGGTGGCATCGGTCGCTCAATCAACCATGTAGAACAGATCGAGAATCTTCAGAGA
CCAATTACCATGGAAGCAGGCTCGGTTGTCCTCATGGATCTTCTATGGTCTGATCCAACAG
AAAATGACAGCGTTGAAGGATTAAGACCAAATGCTCGGGGGCCTGGTCTTGTTACATTTG
GGCCTGATCGTGTAATGGAGTTCTGTAACAACAACGACCTTCAATTAATTGTACGAGCACA
TGAGTGCGTGATGGATGGCTTTGAGCGCTTTGCTCAAGGCCACCTGATCACTCTTTTCTCA
GCAACAAATTATTGCGGTACTGCAAACAATGCTGGTGCAATCTTAGTTTTGGGTAGAGATC
TTGTAGTTGTTCCAAAACTAATTCATCCTTTGCCTCCTGCAATCACATCACCTGAGACCTCA
CCAGATCAGATCGAAGATACATGGATGCAGGAGCTGAATGCAAATAGGCCAGCAACTCCA
ACCAGGGGCCGTCCCCAAGCAGTGGCAAATGATCGAGGTGCTCTTGCCTGGATATAG(SEQ IDNo.1)。
实施例2小麦TaBSL3基因重组表达载体的构建
根据pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG载体(简称FLAG载体)特点，设计载体构建引物，将实施例1的如SEQ ID No.1所示的小麦TaBSL3基因克隆至目标载体上。
第一部分：TaBSL3-FLAG基因扩增
首先利用限制性内切酶SalⅠ和SacⅠ将pCAMBIA-1307-FLAG载体酶切，获得线性化FLAG载体。根据FLAG载体质粒浓度，计算重组反应中需加入FLAG载体体积。
表7载体酶切体系
线性化后的载体通过通用型DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN)回收待用，具体方法见试剂盒说明书。
根据表8的基因扩增反应体系，将带有载体接头序列的引物将进行基因扩增。扩增体系使用的模板为实施例1回收的TaBSL3基因产物，扩增体系如下：
表8 TaBSL3-FLAG基因扩增体系
其中，TaBSL3-flag-F：GCAGCAATTTAGCTTGTCGACAAATGGACGTGGACTCGCGCATG(SEQID No.4)
TaBSL3-flag-R：GCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCTATATCCAGGCAAGAGCACCTCG(SEQ IDNo.5)
扩增产物使用5μL进行琼脂糖凝胶电泳分析是否有目的条带扩增，扩增结果如图2所示。
根据目的条带大小，在对应位置切胶回收，回收方法同上。
图2结果表明，本发明成功扩增得到了目的条带即TaBSL3-FLAG序列。
第二部分：同源重组
使用同源重组法将上述TaBSL3-FLAG序列连接到上述线性化FLAG载体中。该方法使用同源重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)。
方法如下：
1)根据公式计算重组反应所需DNA量。
X根据载体大小和浓度计算：X＝n(载体大小/bp)*0.02/c(载体浓度/ng·μL-1)；
Y根据基因大小和浓度计算：X＝n(基因大小/bp)*0.04/c(基因浓度/ng·μL-1)；
其中，本实施例中，X的浓度为50ng·μL-1，Y的浓度为150ng·μL-1。
为了确保加样的准确性，在配制重组反应体系前可将线性化FLAG载体与插入片段即回收的TaBSL3-FLAG核酸溶液做适当稀释，各组分加样体积不低于1μL。
2)于冰上配制以下反应体系，连接体系如下：
表9基因重组反应体系
3)连接产物通过热激法转化大肠杆菌，具体方法如下：
将5μL连接产物于50μL大肠杆菌感受态细胞轻柔混合，在冰上冰浴30min，将混合物在42℃条件下水浴90s，迅速置于冰上冷却5min，在超净台中加入无菌液体LB(无抗生素)，在37℃摇床复苏40min，将菌液高速短暂离心，倒去上清，将菌体重悬涂布于含有卡那霉素的固体LB培养基，在37℃培养箱过夜生长，挑取单菌落鉴定。PCR鉴定体系如下：
表10菌落鉴定反应体系
其中，TaBSL3-FLAG-F1:GCAGCAATTTAGCTTGTCGACAAATGGAC GTGGACTCGCGCATG(SEQID No.4)
TaBSL3-FLAG-R1：TCACGGGTTGGGGTTTCTACAGGAC(SEQ ID No.6)
4)挑选阳性克隆，提质粒送测序鉴定，同时保存测序正确的菌株，即得到pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG重组表达载体。
菌落PCR结果如图3所示，测序成功的TaBSL3-FLAG序列结果如SEQ ID No.7所示。
图3结果表明，本发明成功将TaBSL3基因序列通过重组法构建到pCAMBIA-1307-FLAG载体上获得pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG重组表达载体。
所述TaBSL3-FLAG的核苷酸序列如下：
AAGTACCGAGCGCGCGCCCATCCAACGCATTGCTACTTCTATTCGCAGCAATTTAGCT
TGTCGACAAATGGACGTGGACTCGCGCATGACGACGGAGTCCGACTCCGACTCCGACGCG
ACCACCGCCGCTGCGCTGGGCCGAGGCTCGGGGAGCGAGACCTCCTCCTCGTCCGCCCCG
TCGACGCCCGGGACGCCCGCGGCGGCCCCGGCCTCGCCGGCCGTCGGGGGATCGGGGCC
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实施例3
实施例2构建的重组表达载体转化拟南芥获得过表达TaBSL3转基因株系
S1、电转化法转化农杆菌
将实施例2构建的重组表达载体pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG的质粒通过电击转化法转GV3101农杆菌菌株，转化过程如下：
(1)将1μL质粒与50μL GV3101农杆菌感受态细胞混合样置于冰上10min，同时将电极杯用ddH2.O清洗3遍后在紫外灯下灭菌15min的电极杯同时置于冰上；
(2)将上述质粒与感受态细胞的混合物小心加入电极杯的凹槽中(避免样品挂在电极杯杯壁上)，在2000V电压下转化，电击后立即加入空白无抗性YEP培养基复苏60min，在含有利福平(rifampin，rif)、庆大霉素(gentamicin,gen)和卡那霉素抗性(kanamycin，kan)的YEP培养基上在28℃恒温培养箱中培养；
(3)两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定体系如表10，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定转化是否成功，菌落PCR鉴定结果如图4所示，结果表明，重组表达载体pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG成功转化到GV3101农杆菌中。
S2、农杆菌侵染拟南芥植株(蘸花法)
(1)将S1步骤中的转化成功的菌株挑取单菌落在50mL离心管里摇菌，管中加入5mL含有利福平、庆大霉素和卡那霉素的YEP培养基中培养约36h；
(2)将5mL小摇菌液转接到含有200mLYEP(rif+，kan+，gen+)的500mL锥形瓶中，在28℃转速为180rpm的摇床上培养至OD600值为0.6，该过程大约5h；
(3)将菌液转移到50mL进口离心管中在转速为4500rpm的离心机中室温离心10min；
(4)离心后菌体用5％蔗糖溶液重悬至OD600值为1.2～1.5，在重悬液中按1:2000的体积比加入silwet L-77，混匀后在洁净干燥的培养皿中倒入农杆菌菌液，将待侵染的野生型拟南芥(Col-0)的花浸于菌液中60s，立即拿出放于干燥的吸水纸上；
(5)将侵染后拟南芥材料用黑色塑料袋或布避光，在22℃恒温培养箱中24h后去掉遮光材料，在正常条件下培养材料至自然成熟。
S3、侵染后阳性苗的筛选
S1步骤中的转化成功的农杆菌菌液侵染拟南芥所收获的种子为T1代种子，由于载体上带有HYG(潮霉素)抗性基因，故T1代种子的幼苗用含有0.1％的潮霉素固体培养进行筛选，叶片颜色显示为正常绿色且在培养基中长出根系的幼苗为阳性苗，将阳性苗转移栽培到营养土和蛭石以3:1比例混合的土壤中，在光照16h/d的22℃恒温人工气候室培养至获得T2代种子。将T2代种子用潮霉素培养基筛选得阳性苗土培至纯合T3代，通过PCR鉴定转基因株系中TaBSL3是否表达，使用Actin2引物作为内参，结果如图5所示。
其中，PCR鉴定引物：
TaBSL3-qrt-F:GGCATCGGTCGCTCAAT(SEQ ID No.8)
TaBSL3-qrt-R:TCAAAGCCATCCATCACG(SEQ ID No.9)
Actin2-F:GCCATCCAAGCTGTTCTCTC(SEQ ID No.10)
Actin2-R:GCTCGTAGTCAACAGCAACAA(SEQ ID No.11)
图5结果表明，重组表达载体pCAMBIA-1307-TaBSL3-FLAG成功整合到拟南芥基因组中并成功表达TaBSL3。
实施例4小麦TaBSL3基因功能分析
(1)土壤干旱试验
将拟南芥野生型材料Col-0、实施例3获得的转基因过表达株系TaBSL30E15-35；TaBSL30E 10-18；TaBSL30E 4-1种子于4℃黑暗条件下春化3天。配置1/2MS培养基，配方为：MS粉末2.22g/L，蔗糖10g/L，琼脂10g/L，并使用Tris溶液调pH 5.80。将种子布种于固体培养基上，培养基垂直于水平面放置，生长5～6天的幼苗移栽到土中。提前准备好要用的土(蛭石：营养土＝1：1)，在天平上称量适量的土，确保每一盆土重量一致，提前加入水至饱和，种苗前将多余水倒去。每一小盆中种入大小一致的拟南芥9棵，在培养箱中生长10天。培养箱条件：14h/10h光照/黑暗；22℃/20℃。在幼苗生长至一定大小，将其浇透水，使其吸水至饱和，倒掉多余水分，进行干旱处理30天。干旱处理期间每天更换材料位置，避免位置影响。干旱后进行复水，复水3天后(注意：复水不可过早)，观察存活率。
图6结果显示，与野生型拟南芥Col-0相比，TaBSL3过表达株系(TaBSL30E15-35；TaBSL30E 10-18；TaBSL30E 4-1)在拟南芥中均表现出明显的耐旱表型。
(2)ABA萌发试验
将拟南芥野生型材料Col-0、转基因过表达株系TaBSL30E 15-35；TaBSL30E10-18；TaBSL30E 4-1种子于4℃黑暗条件下春化3天。配置含有不同浓度ABA的1/2MS培养基(0，0.1，0.25μM)。将相同数量(野生型和不同转基因株系材料各25颗)的种子分别在不同浓度ABA培养基上布种，在光照培养箱中萌发7天，每24h统计一次萌发率。
图7结果显示，与野生型拟南芥Col-0相比，TaBSL3过表达株系(TaBSL30E15-35；TaBSL30E 10-18；TaBSL30E 4-1)在拟南芥中均表现出明显的ABA敏感表型，说明TaBSL3过表达能提高拟南芥对ABA的敏感性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种小麦抗逆性基因TaBSL3，其特征在于，所述TaBSL3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3编码的蛋白质。
3.一种含有权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3的生物材料，其特征在于，为以下任意一种：
A1)包含权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3的重组表达载体；
A2)包含权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3的重组菌；
A3)包含A1)所述的重组表达载体的重组菌。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述重组表达载体的空载体包括pENTR、pCAMBIA1300-EGFP、pCAMBIA1307-FLAG或pC336。
5.根据权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3、权利要求2所述蛋白质或权利要求3或4所述的生物材料在抗逆性转基因植物育种中的应用。
6.根据权利要求1所述抗逆性基因TaBSL3、权利要求2所述蛋白质或权利要求3或4所述的生物材料在提高转基因植物抗逆性中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述抗逆性包括耐旱性。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。
9.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，其特征在于，包括提高受体植物中如权利要求1所述的抗逆基因TaBSL3的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗逆性包括耐旱性；所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。
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