CN116445348A - 具有除氮作用的盐单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及具有除氮作用的盐单胞菌及其应用。从海洋沉积物中经过富集分离纯化后获得1株高效异养硝化‑好氧反硝化脱氮菌，并命名为J1‑11，经鉴定J1‑11为盐单胞菌，保藏编号为CCTCC NO:M20221934。实验结果表明，本发明提供的盐单胞菌在高盐环境中对盐度适应较快，在处理高盐含氮废水时具有更快的去除速率和去除效果，并且具有更好的耐盐特性，在盐度90g/L时氨氮去除率高达100％，在盐度100g/L时仍然有50％左右的氨氮去除率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及具有除氮作用的盐单胞菌及其应用。
背景技术
水体中氮素超标会引发水体富营养化以及饮用水供应安全等一系列问题，对生态平衡和人类健康造成严重威胁，所以，解决水中氮素的问题已经迫在眉睫。常见的脱氮技术可分为物理法、化学法和生物法，生物法由于其脱氮效果好以及不会产生二次污染而得到了广泛的应用。但传统的生物脱氮技术分为硝化和反硝化两个独立的部分，且各部分的工艺条件要求不同，导致工艺流程长、成本高等问题。
针对来源于海水养殖、食品加工、石油生产、制革和制药厂等行业的高盐含氮废水而言，脱氮效果好且不会造成二次污染的生物脱氮技术难以应用其中，因为盐度过高会导致渗透压过高，造成微生物质壁分离，破坏细菌细胞；另外，过高的盐度会影响会微生物分泌的生物酶活性，抑制微生物代谢，最终造成微生物在高盐环境中的脱氮能力降低甚至丧失。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供具有除氮作用的盐单胞菌及其应用，本发明提供的盐单胞菌能够利用生物法去除高盐含氮废水中的氮素。
本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M20221934的盐单胞菌(Halomonas)。
本发明提供了包括上述技术方案所述的盐单胞菌的菌群。
本发明提供了包括上述技术方案所述的盐单胞菌或菌群的菌剂。
本发明提供了上述技术方案所述的盐单胞菌、菌群、和/或菌剂在制备除氮产品中的应用。
优选的，所述除氮为在高盐废水中除氮。
优选的，所述除氮过程中实现同步硝化反硝化。
优选的，所述高盐度废水的盐度为15～100g/L。
本发明提供了除氮产品，其原料包括上述技术方案所述的盐单胞菌、菌群、和/或菌剂。
本发明提供了除氮方法，采用上述技术方案所述的除氮产品。
优选的，所述除氮产品的体积为高盐废水体积的1～10％。
本发明提供的盐单胞菌可以解决高盐废水中难以利用生物法去除氮素的问题；在处理高盐含氮废水时能够实现同步硝化反硝化，可改善传统生物脱氮技术工艺流程长的问题(现有生物脱氮技术(传统生物脱氮技术)为：自养硝化菌在好氧条件下将NH4 +-N转化为NO2 --N和NO3 --N，然后异养反硝化菌在厌氧条件下又将其转化为气态氮从系统中排出)。本发明提供的盐单胞菌可以耐更高的盐度，可以提高对氨氮的去除率以及去除速率。
生物保藏说明
盐单胞菌J1-11(Halomonas venusta J1-11)，于2022年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20221934。
附图说明
图1为本发明实施例获得的菌株J1-11在高盐环境中去除氨氮的特性；
图2为本发明实施例获得的菌株J1-11在高盐环境中去除硝态氮的特性；
图3为本发明实施例获得的菌株在不同盐度的含氮废水中的脱氮特性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M20221934的盐单胞菌J1-11(Halomonasvenusta J1-11)。
本发明从海洋沉积物中经过富集分离纯化后共筛选出272株菌，并分别对其在高盐环境中的硝化、反硝化能力进行测试，最终共获得1株高效脱氮菌，并命名为J1-11，经鉴定J1-11为盐单胞菌，并送至中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO:M20221934。
进一步的，本发明提供了包括本发明所述的盐单胞菌的菌群。本发明所述的菌群包括与所述的盐单胞菌不存在相互拮抗或竞争关系的单个或多个菌形成的菌群，本发明对此不做限定。
更进一步的，本发明提供了含有所述的盐单胞菌或所述的菌群的菌剂。所述的菌剂的剂型包括颗粒、液体及干粉，本发明对此不做限定。本发明中，所述的菌剂还包括所述盐单胞菌的发酵液，菌体，上清及其中所含活性物质，本发明对此不做限定。
本发明提供了上述技术方案所述的盐单胞菌、菌群、和/或菌剂在制备除氮产品中的应用。
在本发明中，所述除氮优选为在高盐废水中除氮；所述高盐废水的盐度优选为15～90g/L，本发明提供的盐单胞菌在15～90g/L的盐度范围都具有较好的除氮效果；所述盐度的指的是高盐废水中的氯化钠含量；所述高盐废水的pH值优选为7；所述高盐废水中的氮浓度优选为100～1000mg/L，更优选为200～800mg/L，更优选为300～600mg/L，最优选为400～500mg/L。
在本发明中，所述除氮过程中能够实现同步硝化反硝化；所述除氮过程中优选去除氨氮和硝态氮。
本发明提供了除氮产品，其原料包括上述技术方案所述的盐单胞菌、菌群、和/或菌剂。
本发明还提供了一种除氮方法，其包括采用本发明所述的除氮产品。
在本发明中，所述除氮方法优选包括：
将菌株通过20mL的LB培养基在30℃，180rpm的摇床中培养24h，再按体积1～10％的比例转接入60mL的LB培养基中在30℃，180rpm的摇床中培养12h后，收集菌体并离心，然后用生理盐水洗2～3次后制成细胞悬液，按体积比为1～10％的比例接入废水中。
现有生物脱氮技术难以在高盐废水中得到应用，而现有的部分耐盐菌株其对盐度的耐受性还相对比较低，本发明提供的盐单胞菌对于盐度具有较大的耐受范围，可以更好地解决高盐废水中难以利用生物技术去除氮素的问题；本发明提供的盐单胞菌在高盐环境中对盐度适应较快，相对其他菌株而言，在处理高盐含氮废水时其具有更快的去除速率和去除效果；现有生物脱氮技术工艺流程长、成本高，本发明在处理高盐含氮废水时能够实现同步硝化反硝化，可极大地改善工艺流程长的问题。
实施例菌株分离鉴定与性能研究
通过蛟龙号等海洋科航次，获得了大量海洋沉积物，然后采用盐度梯度驯化的方式在反应器中富集驯化56周，然后将从反应器中取出的样品震荡均匀，经10-3、10-5、10-7和10-9梯度稀释后分别涂布于分离培养基上，平板培养48h后挑取不同形态的单菌落进行分离纯化，再分别接种至异养硝化培养基中，30℃、180rpm条件下培养2天；定时取样检测培养液中氨氮浓度的变化，完成初筛。
将初筛得到的效果较好的菌株再分别接种至异养硝化、好氧反硝化培养基中，30℃、180rpm条件下培养2天；定量检测培养液中氨氮、硝态氮浓度的变化，选出对两种氮源均有较好脱氮效果的菌株作为目的菌株。
鉴定方法：采用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，鉴定结果为Halomonasvenusta。
菌株J1-11的脱氮特性
将盐单胞菌J1-11通过20mL的LB培养基在30℃，180rpm的摇床中培养24h，再按体积1～10％的比例转接入60mL的LB培养基中在30℃，180rpm的摇床中培养12h后，离心收集菌体，通过生理盐水清洗2～3次后制成细胞悬液，按10％的体积比例将细胞悬液接入pH为7，盐度为30g/L，分别以氯化铵、硝酸钠为唯一氮源的模拟废水中，温度20～35℃，转速150～220rpm培养24h，每4h取样测定OD600，氨氮含量，硝态氮含量以及亚硝态氮含量；菌体生长量(OD600)为菌液在波长为600nm时的吸光度，NH4 +-N含量采用纳氏试剂分光光度法检测，NO3 --N含量采用紫外分光光度法检测，NO2 --N含量采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法检测。
检测结果如图1和图2所示，在盐度为30g/L，pH＝7时，菌株J1-11可以将106mg/L的初始氨氮在12h内快速降解，去除率接近100％且没有硝态氮和亚硝态氮的积累，去除速率高达8.83mg/L/h；在盐度为30g/L，pH＝7时，菌株J1-11可以将94mg/L的初始硝态氮在16h内快速降解，去除率最终达到96％左右，无氨氮的积累，有少量亚硝态氮的积累，去除速率为5.88mg/L/h；由此可说明菌株J1-11的脱氮特点为：J1-11同时具备硝化和反硝化的能力，且由于J1-11为盐单胞菌，对高盐环境的响应较快，所以在高盐环境下，相较其他菌株，J1-11去除氨氮、硝态氮(分别是12h和16h)所需时间更短，去除速率更快。菌株J1-11可在异养、好氧的条件下均同时具备硝化和反硝化的能力，与传统脱氮微生物硝化和反硝化过程是两个独立的部分，且两个部分对有机物和氧气的需求不同而言，这种脱氮方式可极大地改善工艺流程长、成本高的问题；菌株J1-11在高盐废水中的脱氮效果良好，对氨氮和硝态氮均有较好的去除效果，可以极大的改善绿色无污染的生物脱氮技术难以在高盐废水中得以应用的情况。
菌株J1-11的耐盐特性
将通过上述方法把菌株J1-11活化后制成的细胞悬液，按10％的体积比例将细胞悬液接入pH为7，以氯化铵唯一氮源的模拟废水中，设置盐度分别为0、15g/L、30g/L、45g/L、60g/L、75g/L、90g/L、100g/L，在温度为20～35℃，转速150～220rpm培养24h，每4h取样测定OD600，氨氮含量，硝态氮含量以及亚硝态氮含量；测定方法同上。
菌株J1-11在不同盐度的含氮废水中的脱氮特性如图3所示，可以看出，在盐度为15～100g/L的条件下，菌株J1-11对NH4 +-N的去除率稳定在较高水平。根据目前的文献报道，从海洋沉积物或其他盐渍环境中分离出的部分异养硝化-好氧反硝化菌株能够在高盐度下脱氮，但其耐盐性有待提高，如菌株ADP-19(Liet al.，2021)和CY-10(Chen et al.，2022b)在60g/L盐度下对氨氮的去除率分别仅为20％和40.73％；当NaCl浓度为50g/L时，菌株NNA4对NH4+-N的去除效率低于35％(Liuet al.，2019)。在本发明中，菌株J1-11在15～90g/L的盐度范围内，NH4 +-N去除率均达到了接近100％，这大大扩展了其适用范围，使得菌株J1-11不仅可以应用于较低盐度的城市废水处理，也可以应用于海水养殖废水、海鲜加工废水等高盐度废水的处理。此外，当盐度增加到100g/L时，菌株J1-11的NH4 +-N去除率虽然明显下降，但仍达到50％左右，而根据(Duan et al.，2015)，菌株SF16在盐度为100g/L时几乎没有去除氨氮，因为高盐度会抑制微生物活动，干扰细菌的物质吸收过程，诱发细胞质解，甚至导致细菌死亡。
随着盐度从15g/L增加到100g/L，氨氮的平均去除率逐渐降低(去除速率下降说明去除相同浓度的时间变长)，在15g/L时，其去除氨氮的速率为9.20mg/L/h，在盐度为90g/L时降低至1.14mg/L/h。而在相似条件下，嗜盐菌株SND-01在盐度为90g/L时，氨氮平均去除率仅为0.735mg/(L·h)(Cuiet al.，2021)。根据(Guo et al.，2013)和(Yang et al.，2019)，大多数HN-AD细菌生长代谢的适宜盐度均低于40g/L。相比之下，菌株J1-11在高盐环境中表现出更好的生长适应性和脱氮特性，在处理高盐含氮废水方面具有较大的应用潜力。
本发明从海洋沉积物中筛选获得1株耐盐异养硝化-好氧反硝化菌株，与传统生物脱氮技术相比：一是改善了难以利用生物法处理高盐废水的情况，二是改善了工艺流程长、成本高的问题。本发明所获得的盐单胞菌J1-11在高盐环境中可以快速去除氨氮和硝态氮，且去除效果较好，此外，其可以耐受更高的盐度，耐受较广的盐度范围，在较大盐度范围内均可生长并发挥脱氮作用，在盐度15～90g/L时，菌株J1-11对氨氮的去除率仍可接近100％，甚至在盐度为100g/L时，对氨氮的去除率还可以达到50％左右；此外，菌株J1-11脱氮时，硝化和反硝化可同步进行，不需要像传统生物脱氮技术那样分成两个独立的部分。
虽然已参考本发明的特定实施例描述并说明本发明，但是这些描述和说明并不限制本发明。所属领域的技术人员可清晰地理解，在不脱离如由所附权利要求书定义的本发明的真实精神和范围的情况下，可进行各种改变，以使特定情形、材料、物质组成、物质、方法或过程适宜于本申请的目标、精神和范围。所有此类修改都意图在此所附权利要求书的范围内。虽然已参考按特定次序执行的特定操作描述本文中所公开的方法，但应理解，可在不脱离本发明的教示的情况下组合、细分或重新排序这些操作以形成等效方法。因此，除非本文中特别指示，否则操作的次序和分组并非本申请的限制。
Claims (10)
1.保藏编号为CCTCC NO:M20221934的盐单胞菌(Halomonas)。
2.包括权利要求1所述的盐单胞菌的菌群。
3.包括权利要求1所述的盐单胞菌或权利要求2所述的菌群的菌剂。
4.权利要求1所述的盐单胞菌、权利要求2所述的菌群、和/或权利要求3所述的菌剂在制备除氮产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述除氮为在高盐废水中除氮。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述除氮过程中实现同步硝化反硝化。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述高盐度废水的盐度为15～100g/L。
8.除氮产品，其特征在于，其原料包括权利要求1所述的盐单胞菌、权利要求2所述的菌群、和/或权利要求3所述的菌剂。
9.除氮方法，其特征在于，采用权要求8所述的除氮产品。
10.根据权利要求9所述的除氮方法，其特征在于，所述除氮产品的体积为高盐废水体积的1～10％。
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