CN116444630A - 一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其属于间接ELISA检测试剂盒，包括洗涤液、封闭液、样品稀释液、包被抗原、TMB底物液和终止液；其中包被抗原是将特异性识别猪δ冠状病毒抗体的表位多肽偶联于钥孔血蓝蛋白，钥孔血蓝蛋白可同时偶联多条表位多肽，使建立的PDCoV表位肽间接ELISA抗体检测方法具有高灵敏性。另外，该试剂盒是基于PDCoV所特有并高度保守的抗原表位N‑aa309‑317所建立，具有更高的特异性。该试剂盒操作方便快捷，省时省力，符合率高。本发明还公开了上述试剂盒的使用方法和应用，上述试剂盒可应用于PDCoV抗体的大规模筛查。

Description

一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，尤其是涉及一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)是一种新的猪冠状病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)，δ冠状病毒属(Deltacoronavirus)。2012年，PDCoV首次在猪粪便样本中被检测到，但直到2014年在美国引起猪腹泻时，才发现其致病作用，随后，加拿大、中国、韩国、泰国及日本等国相继报道了PDCoV的存在。PDCoV可感染各年龄的猪，但主要引起哺乳仔猪的呕吐、腹泻、脱水和死亡，影响全球养猪业的健康发展。此外，人工接种试验证明PDCoV还可感染牛、鸡和火鸡等多种动物。PDCoV可感染猪源细胞(LLC-PK、PK15、ST、IPEC和IPI-2I)、人源细胞(Huh7和Hela)及禽源细胞(LMH和DF-1)等多种细胞，证明PDCoV具有广泛的跨宿主传播风险。鉴于PDCoV对养猪业的危害和潜在的跨宿主传播风险，开展防控技术研究具有重要意义。
目前对PDCoV的检测常用方法为病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断包括电子显微镜技术(Electron Microscopy，EM)、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)及免疫组化技术((Immunohistochemistry，IHC)等。但病原学诊断方法需昂贵的设备，技术需求较高，因此临床上不能广泛应用。血清学诊断包括酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assays，ELISA)、间接免疫荧光试验(Indrect Immuno-fluorescenceAssay，IFA)及病毒中和试验(Virusneutralization Assay，VN assay)等。其中，间接ELISA操作简单、灵敏度高且不需要昂贵的仪器，适合大规模流行性病学调查。因此，建立高特异性、高灵敏性的间接ELISA方法是目前PDCoV疫病防控的迫切需要。
PDCoV基因组长度约25.4kb，包括5’UTR(Untranslated region，UTR)和3’UTR；5’端开放阅读框(Open Read Frame，ORF)编码两个多聚蛋白pp1a和pp1ab；其余ORF编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S蛋白)、小膜蛋白(sM或E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)和三个辅助蛋白NS6、NS7和NS7a。其中，N蛋白是重要的结构蛋白，于病毒复制初期产生，在病毒RNA的复制和生产过程中发挥显著作用。同时，在受感染细胞中，N蛋白是表达量最高的病毒蛋白之一且N蛋白的保守性高，常作为其他冠状病毒如猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等的诊断抗原。但研究表明，PEDV的N蛋白与TGEV及PDCoV的N蛋白存在血清交叉反应，猪冠状病毒的N蛋白中存在的保守抗原表位可能导致这种交叉反应，因此，避免保守抗原表位导致的交叉反应对PDCoV抗体检测方法的建立至关重要。本发明使用PDCoVN蛋白单克隆抗体4E-88细胞株，进一步利用截短表达抗原短肽和肽扫描技术鉴定出该抗体所识别的B细胞抗原表位。因此，以此抗原表位作为诊断靶标建立诊断方法，则可避免PDCoV和其他猪冠状病毒的交叉反应，为PDCoV的诊断提供特异性更好的新方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其属于间接ELISA检测试剂盒，包括20倍浓缩洗涤液、封闭液、样品稀释液、包被抗原、TMB底物液和终止液；其中包被抗原是将特异性识别猪δ冠状病毒抗体的表位多肽偶联于钥孔血蓝蛋白，钥孔血蓝蛋白可同时偶联多条表位多肽，使建立的PDCoV表位肽间接ELISA抗体检测方法具有高灵敏性。另外，该试剂盒是基于PDCoV所特有并高度保守的抗原表位N-aa309 -317所建立，具有更高的特异性。该试剂盒操作方便快捷，省时省力，符合率高。
本发明的目的之二是提供一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的应用。
本发明的目的之三是提供一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的使用方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种特异性识别猪δ冠状病毒抗体的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其属于间接ELISA检测试剂盒，包括洗涤液、封闭液、样品稀释液、包被抗原、TMB底物液和终止液；其中所述包被抗原是将上述的多肽偶联于钥孔血蓝蛋白。
优选的，所述包被抗原的制备方法为：在所述猪δ冠状病毒N蛋白特异抗原表位多肽N端加入半胱氨酸，使其与钥孔血蓝蛋白上的半胱氨酸形成二硫键，以此将表位多肽偶联于钥孔血蓝蛋白。
优选的，所述包被抗原的包被条件为：包被温度为2-6℃，时间为10-14h，包被抗原的工作浓度为0.4-0.6μg/100L。
优选的，所述浓缩洗涤液为含有0.8％～1.2％Tween-20、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述封闭液为含有0.01g/mL牛血清白蛋白、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述样品稀释液为含有5mg/mL酪蛋白、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
优选的，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，其中阴性对照参与临界值的计算。
上述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的使用方法即PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA方法，包括以下步骤：
S1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用，液体试剂用前混匀；
S2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
S3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔；
S4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：50的比例稀释。
S5、加样：各孔分别按预先设定加100μL稀释的待测样本，加样过程时间跨度应尽量短。
S6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应1h；
S7、洗板：弃去反应液，每孔加250μL稀释后的洗涤缓冲液，浸泡30s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干；
S8、加酶：各孔加100μL辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；
S9、温育：置37℃温箱，反应1h；
S10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液250μL，浸泡30s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干；
S11、反应：显色每孔加入100μL底物工作液，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应10min；然后每孔加入显色终止液50μL，振荡混匀终止反应；其中底物工作液包括底物液A和底物液B，使用前等量混合，现用现配，底物液A配方为每100mL含2.72g醋酸钠、0.32g柠檬酸和60μL30％的过氧化氢溶液；底物液B配方为每100mL含0.04g EDTA-2Na、0.19g柠檬酸、10mL甘油和1mL含3％3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二甲基亚砜；
S12、读取结果：测定每孔的OD450nm值，加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值；
S13、检测结果的判定：
a、阴性对照OD450nm平均值≤0.15，否则无效；
b、阳性对照每个检测值在1.0～2.5之间，否则无效；
c、样品的判定：检测结果OD450≥0.262为阳性；OD450≤0.232时为阴性，介于0.232和0.262之间判定为可疑，需重新检测。
上述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒应用于临床血清中PDCoV抗体的检测。
本发明所述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒及其应用的优点和积极效果是：
1、本发明中将特异性识别猪δ冠状病毒抗体的表位多肽偶联于钥孔血蓝蛋白，钥孔血蓝蛋白可同时偶联多条表位多肽，使建立的PDCoV表位肽间接ELISA抗体检测方法具有高灵敏性。
2、本发明所述的试剂盒是基于PDCoV所特有并高度保守的抗原表位N-aa309-317所建立，具有更高的特异性。
3、本发明所述的试剂盒操作方便快捷，省时省力，符合率高，应用于PDCoV抗体的大规模筛查。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明中单克隆抗体与纯化PDCoV病毒液和PDCoV融合N蛋白的反应图；
图2为本发明中PDCoVN蛋白分段表达图；
图3为本发明中PDCoVN蛋白截短片段的SDS-PAGE分析结果；
图4为本发明中间接ELISA和dot-blot检测mAb4E88与截短蛋白的反应性，其中A为间接ELISA检测mAb4E88与截短蛋白的反应性结果，B为dot-blot检测mAb4E88与截短蛋白的反应性结果；
图5为本发明中合成的多肽片段；
图6为本发明中间接ELISA以及dot-blot鉴定mAb4E88所识别最小肽段，其中A为间接ELISA的分析结果，B为dot-blot的分析结果；
图7为本发明中N-aa309-317氨基酸序列与25株PDCoV病毒株(A)、15株δ冠状病毒株(B)、10株猪冠状病毒株(C)同源性分析的比较；
图8为本发明中临界值的测定；
图9为本发明中特异性的测定；
图10为本发明中灵敏性的测定；
图11为本发明中四川不同地区(A)及不同时间(B)采集的临床血清中PDCoV的检出率。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
一种特异性识别猪δ冠状病毒抗体的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其属于间接ELISA检测试剂盒，包括20倍浓缩洗涤液、封闭液、样品稀释液、包被抗原、TMB底物液和终止液；其中所述包被抗原是将上述的多肽偶联于钥孔血蓝蛋白。
包被抗原的制备方法为：在所述猪δ冠状病毒N蛋白特异抗原表位多肽N端加入半胱氨酸，使其与钥孔血蓝蛋白上的半胱氨酸形成二硫键，以此将表位多肽偶联于钥孔血蓝蛋白。
包被抗原的包被条件为：包被温度为2-6℃，时间为10-14h，包被抗原的工作浓度为0.4-0.6μg/100L。
浓缩洗涤液为含有0.8％～1.2％Tween-20、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
封闭液为含有0.01g/mL牛血清白蛋白、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
样品稀释液为含有5mg/mL酪蛋白、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
终止液为2mol/L的硫酸溶液。
试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，其中阴性对照参与临界值的计算。
上述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的使用方法即PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA方法包括以下步骤：
S1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用，液体试剂用前混匀；
S2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
S3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔；
S4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：50的比例稀释。
S5、加样：各孔分别按预先设定加100μL稀释的待测样本，加样过程时间跨度应尽量短。
S6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应1h；
S7、洗板：弃去反应液，每孔加250μL稀释后的洗涤缓冲液，浸泡30s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干；
S8、加酶：各孔加100μL辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；
S9、温育：置37℃温箱，反应1h；
S10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液250μL，浸泡30s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干；
S11、反应：显色每孔加入100μL底物工作液，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应10min；然后每孔加入显色终止液50μL，振荡混匀终止反应；其中底物工作液包括底物液A和底物液B，使用前等量混合，现用现配，底物液A配方为每100mL含2.72g醋酸钠、0.32g柠檬酸和60μL30％的过氧化氢溶液；底物液B配方为每100mL含0.04g EDTA-2Na、0.19g柠檬酸、10mL甘油和1mL含3％3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二甲基亚砜；
S12、读取结果：测定每孔的OD450nm值，加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值；
S13、检测结果的判定：
a、阴性对照OD450nm平均值≤0.15，否则无效；
b、阳性对照每个检测值在1.0～2.5之间，否则无效；
c、样品的判定：检测结果OD450≥0.262为阳性；OD450≤0.232时为阴性，介于0.232和0.262之间判定为可疑，需重新检测。
一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒应用于临床血清中PDCoV抗体的检测。
实施例中所需的试验材料和主要试剂为：
试验材料：稳定分泌抗PDCoV N蛋白的杂交瘤细胞株4E88；PDCoV四川分离株CHN-SC2015(No.MK355396)；表达载体pET32a(+)；猪PDCoV阳性高免血清；猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等阳性血清；413份临床血清样品，采集自2012年及2016-2018年四川地区。以上材料均由四川农业大学猪病研究中心保存并提供。
主要试剂：
PrimeScript RT reagent Kit、XhoI、BamH I、T4 DNA ligase、普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)、质粒提取试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG、HRP-兔抗猪IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记的山羊抗鼠、鼠抗His标签单抗、胎牛血清(FBS)、DMEM培养基均为常规市售产品。
实施例
细胞的复苏与鉴定
将实验室保存的稳定分泌抗PDCoV N蛋白的杂交瘤细胞株4E88进行复苏，并进行连续传代，留取细胞上清。
使用Western blot方法对复苏的杂交瘤细胞上清进行鉴定，结果如图1所示，4E88能够较好的识别重组N蛋白以及高速离心纯化后的PDCoV全病毒，大小分别为44kDa以及38kDa。
使用Western-blot方法对单抗上清进行鉴定，以原核表达纯化的N蛋白及超速离心后浓缩的PDCoV全病毒进行SDS-PAGE电泳，将分离胶部分转印至PVDF膜上，25V转印30min，然后将PVDF膜放入5％的脱脂乳中37℃作用2h，取出PVDF膜用PBST洗涤三次，4min/次，然后以4E88细胞培养上清中作为一抗进行孵育，4℃过夜。取出PVDF膜用PBST洗涤三次，4min/次，然后放入用经3％脱脂乳按1：5000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG中，进行二抗孵育，室温作用30min，取出PVDF膜用PBST洗涤三次，4min/次，用TMB显色液室温显色，观察结果。
抗原表位鉴定
为了鉴定mAb4E88所识别的表位，将N蛋白进行截短，如图2所示。首先将N蛋白截短为N1、N2及N3三部分进行原核表达，每段之间有部分氨基酸重叠，并且每对引物上游插入BamHⅠ位点，下游插入Xho I位点。经PCR扩增纯化及酶切后与pET32a(+)载体连接，将质粒转化入Transetta DE3感受态细胞，进行表达，其中N1、N2及N3片段PCR扩增的引物序列如SEQID NO.3-8所示。经过间接ELISA以及dot-blot鉴定后发现mAb4E88识别N3部分，为了进一步定位被mAb 4E88识别的N3上的表位，构建了N3的三个截短部分N3-1、N3-2和N3-3，并进行表达，其中N3-1、N3-2及N3-3片段PCR扩增的引物序列如SEQ ID NO.9-14所示。间接ELISA和dot-blot结果显示，mAb4E88仅与N3-3片段反应。构建N3-3的截短部分N3-3-1、N3-3-2、N3-3-3和N3-3-4，并进行表达，其中N3-3-1、N3-3-2、N3-3-3和N3-3-4片段PCR扩增的引物序列如SEQ ID NO.15-22所示。结果表明mAb4E88与N3-3-2反应，包含大部分N3-3-1区域的N3-3-3和N3-3-4均与mAb4E88反应。图3中A和图3中B为SDS-PAGE对表达的蛋白进行鉴定的结果，图4中A为间接ELISA检测mAb4E88与截短蛋白的反应性结果，图4中B为dot-blot检测mAb4E88与截短蛋白的反应性结果。初步确定抗原表位大小为11个氨基酸，即aa308-318，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
抗原表位进一步鉴定即MAb4E88的最小识别肽段
为了确定mAb4E88的最小识别肽段，将aa308-318分别从左右两边进行缩短并合成6条多肽P1、P2、P3、P4、P5和P6，6条多肽如图5所示，6条多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-28所示。使用间接ELISA和dot-blot进行分析，结果如图6所示，其中图6中A为间接ELISA的分析结果，图6中B为dot-blot的分析结果，mAb4E88与P1反应最强，与P2、P3和P6有微弱反应，而与P4和P5没有反应，表明MAb4E88的最小识别肽段为aa309-317，命名为N-aa309-317，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
表位多肽aa309-317与其它病毒株序列的同源性分析
mAb4E88鉴定出最小抗原表位为N-aa309-317，将鉴定的表位与25株PDCoV病毒株，如表1所示，15株δ冠状病毒株，如表2所示，以及10株猪冠状病毒株，如表3所示，进行同源性分析。使用软件MAFFTv7.037将鉴定的抗原表位与GenBank中25个PDCoV病毒株以及15株δ冠状病毒株和10株猪冠状病毒株的相同位置氨基酸序列进行序列比对并将结果进行分析。
表1用于比对N-aa309-317序列在猪δ冠状病毒间同源性的毒株
表2用于比对N-aa309-317序列在猪δ冠状病毒间同源性的毒株
表3用于比对N-aa309-317序列在猪δ冠状病毒间同源性的毒株
从GenBank中找出的25株PDCoV病毒株，利用DNAStar进行序列比对，如图7中A所示，结果表明，N-aa309-317在25株PDCoV病毒株中高度保守，序列相似性为100％。选择δ冠状病毒属中的15株病毒株进一步的序列比对，如图7中B所示，结果表明，麻雀冠状病毒(HKU17)和亚洲豹猫冠状病毒(ALCCoV)与N-aa309-317具有100％的序列相似性。新发现的鹌鹑δ冠状病毒(UAE-HKU30)和麻雀δ冠状病毒(SpDCoV)与N-aa309-317具有90％的序列相似性，其他δ冠状病毒与N-aa309-317具有30-60％的序列相似性，PDCoV是唯一的猪δ冠状病毒，利用与其他猪源冠状病毒(PEDV，TGEV，PRCV，SADS-CoV，PHEV)进行序列比对，结果显示序列相似性非常低，小于22.2％，如图7中C所示。
包被抗原的制备与鉴定
KLH(Keyhole limpet hemocyanin)，即血蓝蛋白，是一种半抗原，常用作载体蛋白。根据PDCoV N蛋白特异抗原表位N309-317氨基酸序列合成表位多肽，通过在表位多肽N端加入半胱氨酸，使其与KLH蛋白上的半胱氨酸形成二硫键，以此将表位多肽偶联于KLH蛋白，蛋白纯度>95％，将其命名为KLH-N309-317，通过质谱及western blot进行鉴定。
反应条件的优化
(1)包被抗原浓度和血清稀释度确定：通过棋盘法对最佳包被抗原浓度以及血清稀释度进行摸索，对抗原浓度按照：0.25μg/100μL、0.5μg/100μL、1μg/100μL、2.0μg/100μL、4.0μg/100μL、8.0μg/100μL这六个浓度梯度进行稀释并包被酶标板，每个浓度重复三次。将阳性血清以及阴性对照血清按照1:50、1:100、1:200、1:400和1:800的比例进行稀释，作为一抗进行孵育，其余步骤按照常规间接ELISA方法进行，以P/N值最大的抗原包被浓度和血清稀释度作为最佳条件，如表4所示。
表4包被抗原和血清最佳工作浓度的确定
结果表明，抗原包被浓度为0.5μg/100μL，待检血清稀释倍数为1：50时，P/N值为6.101，为最佳检测效果。
(2)最佳包被条件的确定：基于以上最佳抗原包被浓度和一抗血清稀释浓度，摸索最佳包被条件，把蛋白包被时间设置为：37℃1h、37℃2h、4℃12h，做三个重复，最后结果以P/N最大的条件为最佳，如表5所示。
表5最佳包被条件的确定
结果表明，当抗原在4℃孵育12h后，P/N值为9.584，效果最佳。
(3)最优封闭液确定：对封闭液进行选择，分别使用5％的脱脂牛奶、1％BSA以及2％BSA进行封闭，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，做三个重复，结果以P/N值最大的条件为最佳，如表6所示。
表6最佳封闭液的确定
结果表明，当选择1％BSA作为封闭液时效果最优，P/N为9.858。
(4)最优封闭条件的确定：按照已确定的条件为基础，优化封闭条件，分别使用：37℃30min，37℃60min和37℃120min三个时间点，每个时间点做三个重复。结果以P/N值最大条件为最优。
表7最优封闭条件的确定
结果表明，当封闭条件为37℃120min时效果最优，P/N为9.706。
(5)一抗最佳孵育时间确定：按照已确定的条件为基础，进一步优化一抗血清最佳孵育时间，分别使用：37℃30min，37℃60min和37℃90min三个时间点，每次做三个重复，以P/N值最大条件为最优，如表8所示。
表8一抗最佳孵育时间确定
结果表明，当一抗血清孵育时间为120min时，P/N为9.288最优。
(6)二抗最佳稀释度确定：按照已确定的条件为基础，进一步优化二抗最优稀释度，使用HRP标记的兔抗猪IgG，分别设置：1:2500,1:5000和1:7500三个稀释浓度，每次做三个重复，以P/N值最大条件为最优，如表9所示。
表9二抗最佳稀释度确定
结果表明，当二抗稀释浓度为1:5000时，P/N为11.882最优。
(7)二抗最佳孵育时间确定：按照已确定的条件为基础，进一步优化二抗最佳孵育时间，分别使用:37℃30min，37℃60min和37℃90min三个时间点，每次做三个重复，以P/N值最大条件为最优，如表10所示。
表10二抗最佳孵育时间确定
结果表明，当二抗作用时间为60min时，P/N为12.346最优。
(8)显色液TMB作用时间的确定：按照已确定的条件为基础，进一步优化底物显色时间，分别使用：5min、10min、15min三个时间点，每次做三个重复，以P/N值最大条件为最优，如表11所示。
表11显色液TMB作用时间的确定
结果表明，当显色液TMB作用时间为10min时，P/N为13.664最佳。
(9)临界值的确定：按照已确定的条件为基础，进一步确定临界值。检测48份PDCoV猪阴性血清，并测定OD450值。如图8所示，计算出阴性血清平均值为X＝0.187，标准方差为S＝0.025，则X+3S＝0.262。当检测结果OD450≥0.262为阳性；当OD450≤X+2SD＝0.237时为阴性，介于0.237和0.262之间判定为可疑，重新检测。
基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的组装
定试剂盒各组分：阳性、阴性血清各1管，每管1mL；20×浓缩洗涤液1瓶，每瓶30mL；10×样品稀释液1瓶，每瓶10mL；酶标抗体1管，每管20μL；TMB底物液1瓶，每瓶20mL；终止液1瓶，每瓶20mL；96孔反应板2块；96孔稀释板2块；说明书1份。试剂盒外包装采用硬质纸板一次性固压成型，正面贴标签，标注试剂盒名称、生产日期及保存条件等。
基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的性能评价检验
(1)特异性试验：按已建立起的PDCoV N蛋白表位肽间接ELISA方法步骤：
对本实验室保存中的PEDV、PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、TGEV的标准阳性血清进行检测，猪阴性血清作为对照，如图9所示，结果表明所建立的间接ELISA检测方法对检测PDCoV特异性较强，无血清交叉反应。
(2)灵敏性试验：按已建立起的PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA方法步骤检测从1:100倍比稀释到1:6400的PDCoV阳性血清，如图10所示，结果表明当稀释度为1:3200时，为PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA方法能识别到的最高稀释浓度。
(3)批内重复性试验：利用建立起的PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA抗体检测方法，用同批次抗原和试剂对随机选取的6份血清进行批内重复性检测，如表12所示，计算得出其变异系数在5.25％-7.95％＜10％，表明其批内重复性较好。
表12批内重复性试验
(4)批间重复性试验：利用建立起的PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA抗体检测方法，用不同批次抗原和试剂对随机选取的6份血清进行批间重复性检测，如表13所示，计算得出其变异系数在4.91％-9.74％＜10％，表明其批间重复性较好。
表13批间重复性试验
(5)稳定性测定：将制备的PDCoV N蛋白表位肽间接ELISA试剂盒储存于4℃下，每月进行阴性、阳性血清检测。如表14所示，结果显示，该试剂盒储存于4℃6个月后，其P/N值并未明显改变，说明该试剂盒比较稳定。
表14稳定性测定
(6)符合率测定：本试验检测了20份临床血清，经中和试验检测10份阴性，10份阳性，使用建立起的PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA抗体检测方法检测血清，阳性血清为9份，阴性血清为11份；相比于中和试验，EP-4E88表位间接ELISA阳性符合率为88.89％；阴性符合率为81.82％。计算出总符合率为85％。如表15所示，表明所建立的表位间接ELISA具有较高的符合率。
表15符合率测定
基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的临床应用
收集四川地区不同规模猪场血清，按照采集地和采集时间先后顺序及猪的类型进行编号，-80℃保存。根据PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA检测试剂盒的方法，对收集的临床血清进行检测；统计各地PDCoV阳性血清检出率，分析PDCoV分类统计结果，绘制PDCoV在四川地区感染现状的流行分布图，掌握该病在四川地区的流行动态。
共收集了2012、2016-2018年四川省13个地区的413份血清，并使用PDCoVN蛋白表位肽间接ELISA抗体检测试剂盒进行了检测。结果显示，52％(215/406)的血清样本呈PDCoV抗体阳性，如图11中A和表16所示，且早在2012年的血清样本中检测到4份PDCoV阳性血清，如图11中B和表17所示，表明PDCoV在2012年及之前已在四川地区流行。
表16四川不同地区临床血清中PDCoV阳性检出率
表17不同时间的临床血清中PDCoV阳性检出率
因此，本发明采用上述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其属于间接ELISA检测试剂盒，包括洗涤液、封闭液、稀释液、包被抗原、TMB底物液和终止液；其中包被抗原是将特异性识别猪δ冠状病毒抗体的表位多肽偶联于钥孔血蓝蛋白，钥孔血蓝蛋白可同时偶联多条表位多肽，使建立的PDCoV表位肽间接ELISA抗体检测方法具有高灵敏性。另外，该试剂盒是基于PDCoV所特有并高度保守的抗原表位N-aa309-317所建立，具有更高的特异性。该试剂盒操作方便快捷，省时省力，符合率高，可应用于PDCoV抗体的大规模筛查。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种特异性识别猪δ冠状病毒抗体的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其特征在于：其属于间接ELISA检测试剂盒，包括洗涤液、封闭液、样品稀释液、包被抗原、TMB底物液和终止液；其中所述包被抗原是将如权利要求1所述的多肽偶联于钥孔血蓝蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的制备方法为：在所述猪δ冠状病毒N蛋白特异抗原表位多肽N端加入半胱氨酸，使其与钥孔血蓝蛋白上的半胱氨酸形成二硫键，以此将表位多肽偶联于钥孔血蓝蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗原的包被条件为：包被温度为2-6℃，时间为10-14h，包被抗原的工作浓度为0.4-0.6μg/100μL。
5.根据权利要求2所述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为含有0.8％～1.2％Tween-20、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求2所述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含有0.01g/mL牛血清白蛋白、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求2所述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为含有5mg/mL酪蛋白、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
8.根据权利要求2所述的一种基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，其中阴性对照参与临界值的计算。
9.一种如权利要求2-8任一项所述的基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用，液体试剂用前混匀；
S2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
S3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔；
S4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：50的比例稀释；
S5、加样：各孔分别按预先设定加100μL稀释的待测样本，加样过程时间跨度应尽量短；
S6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应1h；
S7、洗板：弃去反应液，每孔加250μL稀释后的洗涤缓冲液，浸泡30s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干；
S8、加酶：各孔加100μL辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；
S9、温育：置37℃温箱，反应1h；
S10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液250μL，浸泡30s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干；
S11、反应：显色每孔加入100μL底物工作液，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应10min；然后每孔加入显色终止液50μL，振荡混匀终止反应；其中底物工作液包括底物液A和底物液B，使用前等量混合，现用现配，底物液A配方为每100mL含2.72g醋酸钠、0.32g柠檬酸和60μL30％的过氧化氢溶液；底物液B配方为每100mL含0.04g EDTA-2Na、0.19g柠檬酸、10mL甘油和1mL含3％3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二甲基亚砜；
S12、读取结果：测定每孔的OD450nm值，加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值；
S13、检测结果的判定：
a、阴性对照OD450nm平均值≤0.15，否则无效；
b、阳性对照每个检测值在1.0～2.5之间，否则无效；
c、样品的判定：检测结果OD450≥0.262为阳性；OD450≤0.232时为阴性，介于0.232和0.262之间判定为可疑，需重新检测。
10.一种如权利要求2-8任一项所述的基于猪δ冠状病毒N蛋白表位肽的抗体检测试剂盒应用于临床血清中PDCoV抗体的检测。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109655621A (zh) * 2018-12-21 2019-04-19 广西壮族自治区兽医研究所 猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法及其试剂盒
CN114487397A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 浙江大学 一种用于检测猪丁型冠状病毒的间接elisa检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109655621A (zh) * 2018-12-21 2019-04-19 广西壮族自治区兽医研究所 猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法及其试剂盒
CN114487397A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 浙江大学 一种用于检测猪丁型冠状病毒的间接elisa检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INTERNATIONAL JOURNAL OF MOECULAR SCIENCES: "Identification of a novel linear B-cell Epitope on the nucleocapsid protein of porcine deltacoronavirus", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOECULAR SCIENCES, vol. 21, pages 648 *
张秀美: "兽医科学用药手册", 30 June 2018, 山东科学技术出版社, pages: 58 - 64 *
沈关心等: "现代免疫学实验技术", 31 October 1998, 湖北科学技术出版社 , pages: 6 - 12 *

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