CN116439228A - 一种无dmso的冷冻保存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种无DMSO的冷冻保存液，包括：麦芽糖醇、氯化镁、葡聚糖、蔗糖、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钙、山梨醇、磷酸氢二钾、碳酸钾、葡萄糖、水溶性维生素E、谷胱甘肽、氢氧化钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠，该保存液能达到与商业化冷冻保存液(含有15％DMSO)同等甚至更高的细胞、组织存活率和功能表达稳定性，具有较高的保存效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种无DMSO的冷冻保存液及其应用。
背景技术
细胞培养技术是生物学研究过程中最基本的操作，其被广泛应用于临床及科研领域。在细胞培养过程中，随着传代次数的增加和细胞周围环境的变化，细胞产生新的生物学特性。因此，为保证细胞的生物学特性前后的一致，细胞冻存技术就显得尤为重要。
细胞冻存是指将细胞存放于-196℃液氮的低温环境当中，通过降低细胞代谢，从而达到长期储存的一种技术。在细胞冻存过程中，如未添加低温保护剂，则细胞会因胞内外环境中的水结晶而造成一系列的细胞损伤，最终导致细胞死亡。目前，实验室常用的细胞冻存液是由90％的新鲜胎牛血清加10％的二甲基亚砜(DMSO)或50％基础培养基加40％新鲜胎牛血清加10％ DMSO构成。DMSO是一种常见的低温保护剂，其可以迅速进入到胞内，并与胞内的水分子结合，从而降低细胞内水分子的冰点。在缓慢冻存的条件下，DMSO能有效减少结晶水的产生，从而避免细胞在低温环境中的死亡。但是，DMSO在常温环境中具有细胞毒性，能够使细胞内的多种蛋白质结构发生改变，导致酶的失活。因此，发明一种经济、安全、高效、实用的细胞冻存液显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种棘无DMSO的冷冻保存液，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种无DMSO的冷冻保存液，其以每100mL体积计，含有麦芽糖醇500-1000mg，氯化镁150-300mg，葡聚糖10000-12000mg，蔗糖1200-1500mg，4-羟乙基哌嗪乙磺酸1000-1200mg，氯化钙2-3mg，山梨醇500-800mg，磷酸氢二钾150-200mg，碳酸钾120-150mg，葡萄糖180-200mg，水溶性维生素E15-30 mg，谷胱甘肽180-200mg，氢氧化钾200-240mg，磷酸二氢钾120-150mg，氢氧化钠700-800mg。
无DMSO的冷冻保存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取各组分加入到100ml去离子水中，将ph值调至7.2，搅拌溶解，溶液过滤，备用；
(2)过滤后的溶液中加入10％的丙二醇，搅拌混合后，得到冻存液。
所述的搅拌采用磁力搅拌机进行搅拌，搅拌时间为6h；所述的溶液过滤采用0.22um孔径的滤膜进行过滤处理。
无DMSO的冷冻保存液在细胞冻存过程中的应用，将待冻存的细胞进行预处理，调整好细胞密度后向其中添加适量冻存液，每管1-1.5ml，梯度降温至-80℃，保温放置24h，最后移入液氮容器内保存。
所述细胞进行预处理具体为：首先移除培养皿中的旧培养基，使用1×PBS清洗细胞；然后加入适量胰蛋白酶消化单层生长的细胞1-3分钟，加入适量新鲜培养基中止消化，离心处理后去除胰蛋白酶，备用。
所述细胞密度为1×106–1.5×107个/ml，所述梯度降温的降温速率为-1℃/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、避免了DMSO的使用，有效防止了DMSO在常温环境下对酶等蛋白质的损伤作用；
2、使用本发明的冻存细胞，复苏时细胞存活率提高；
3、有效降低了冻存液的经济成本，未使用价格高昂的新鲜胎牛血清；
附图说明
图1为传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液冻存的3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)冻存4个月后细胞复苏存活率结果图；
图2为传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液冻存的293T细胞(人胚肾细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率结果图；
图3为传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液冻存的HT-22细胞(小鼠海马神经元细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率结果图；
图4为传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液冻存的MCF-7(人乳腺癌细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率结果图；
图5为传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液冻存的SGC-7901(人胃腺癌细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率结果图。
具体实施方式
实施例1无DMSO冻存液冻存的3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)冻存4个月后细胞复苏存活率研究
取3T3细胞，按照常规细胞培养操作流程，取对数生长期的3T3细胞，移除培养皿中的旧培养基，使用1×PBS溶液清洗细胞，然后加入适量胰蛋白酶消化，1分钟后加入适量完全培养基中止消化，1000rpm离心5min后去除胰蛋白酶，各加入1ml配置好的传统冻存液或本发明的无DMSO冻存液，轻轻吹打使细胞均匀，计数两种冻存液中的细胞密度为1.3×107个/ml。将含有细胞的冻存液移入冻存管后放置在程序降温盒中，于-80℃冰箱缓慢降温，72h后转移至液氮罐中冻存。在细胞冻存4个月后复苏细胞，在复苏后0h、24h和72h对细胞进行计数，统计复苏细胞的存活率。在细胞复苏0h、24h和72h时，传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液的细胞存活率分别为70.7％、21.4％、7.1％和40.8％、7.4％和47.4％。由此可见，在长时间(4个月)冻存3T3细胞时，本申请的无DMSO冻存液极大提高了72h内细胞的存活率，且未见明显细胞毒性。
实施例2 293T细胞(人胚肾细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率结果研究
取293T细胞，按照常规细胞培养操作流程，详细流程参照案例1。计数调节两种冻存液中的细胞密度为1.4×107个/ml。在细胞冻存1个月后复苏细胞，在复苏后0h、24h和72h对细胞进行计数，统计复苏细胞的存活率。在细胞复苏0h、24h和72h时，传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液的细胞存活率分别为29.8％、65.2％、85.2％和9.9％、83.3％和95.2％。由此可见，冻存293T细胞时，本申请的无DMSO冻存液极大提高了72h内细胞的存活率，且未见明显细胞毒性。
实施例3HT-22细胞(小鼠海马神经元细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率研究
取HT-22细胞，按照常规细胞培养操作流程，详细流程参照案例1。计数调节两种冻存液中的细胞密度为1.6×106个/ml。在细胞冻存1个月后复苏细胞，在复苏后0h、24h和72h对细胞进行计数，统计复苏细胞的存活率。在细胞复苏0h、24h和72h时，传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液的细胞存活率分别为25.9％、40.6％、82％和13.3％、10.3％和98.5％。由此可见，冻存HT-22细胞时，本申请的无DMSO冻存液极大提高了72h内细胞的存活率，且未见明显细胞毒性。
实施例4MCF-7(人乳腺癌细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率研究
取MCF-7细胞，按照常规细胞培养操作流程，详细流程参照案例1。计数调节两种冻存液中的细胞密度为3.6×106个/ml。在细胞冻存1个月后复苏细胞，在复苏后0h、24h和72h对细胞进行计数，统计复苏细胞的存活率。在细胞复苏0h、24h和72h时，传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液的细胞存活率分别为75.6％、33.7％、59.7％和12.2％、80％和82.5％。由此可见，冻存MCF-7细胞时，本申请的无DMSO冻存液极大提高了72h内细胞的存活率，且未见明显细胞毒性。
实施例5SGC-7901(人胃腺癌细胞)冻存1个月后细胞复苏存活率研究
取SGC-7901细胞，按照常规细胞培养操作流程，详细流程参照案例1。计数调节两种冻存液中的细胞密度为1.5×106个/ml。在细胞冻存1个月后复苏细胞，在复苏后0h、24h和72h对细胞进行计数，统计复苏细胞的存活率。在细胞复苏0h、24h和72h时，传统冻存液和本发明的无DMSO冻存液的细胞存活率分别为56.6％、38.6％、98.3％和13.7％、38.3％和56％。由此可见，冻存SGC-7901细胞时，本申请的无DMSO冻存液极大提高了72h内细胞的存活率，且未见明显细胞毒性。
综合实施例1-5的试验结果，本申请的一种无DMSO的冻存液能够使细胞长时间的于液氮中保存，并且72h内复苏细胞存活率显著高于传统冻存液。此外，由于本申请的细胞冻存液未使用DMSO和新鲜胎牛血清，因此该冻存液拥有比传统冻存液更高的安全性和更低的经济成本。
Claims (6)
1.一种无DMSO的冷冻保存液，其特征在于：以每100mL体积计，含有麦芽糖醇500-1000mg，氯化镁150-300mg，葡聚糖10000-12000mg，蔗糖1200-1500mg，4-羟乙基哌嗪乙磺酸1000-1200mg，氯化钙2-3mg，山梨醇500-800mg，磷酸氢二钾150-200mg，碳酸钾120-150mg，葡萄糖180-200mg，水溶性维生素E15-30 mg，谷胱甘肽180-200mg，氢氧化钾200-240mg，磷酸二氢钾120-150mg，氢氧化钠700-800mg。
2.权利要求1所述的冷冻保存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)称取各组分加入到100ml去离子水中，将ph值调至7.2，搅拌溶解，溶液过滤，备用；
(2)过滤后的溶液中加入10％的丙二醇，搅拌混合后，得到冻存液。
3.如权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：所述的搅拌采用磁力搅拌机进行搅拌，搅拌时间为6h；所述的溶液过滤采用0.22um孔径的滤膜进行过滤处理。
4.权利要求1或2所述的冷冻保存液在细胞冻存过程中的应用，其特征在于，将待冻存的细胞进行预处理，调整好细胞密度后向其中添加适量冻存液，每管1-1.5ml，梯度降温至-80℃，保温放置24h，最后移入液氮容器内保存。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞进行预处理具体为：首先移除培养皿中的旧培养基，使用1×PBS清洗细胞；然后加入适量胰蛋白酶消化单层生长的细胞1-3分钟，加入适量新鲜培养基中止消化，离心处理后去除胰蛋白酶，备用。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞密度为1×106–1.5×107个/ml，所述梯度降温的降温速率为-1℃/min。
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2022
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