CN116426437A

CN116426437A - 长双歧杆菌lf04及其在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN116426437A
Application number: CN202310535527.3A
Authority: CN
Inventors: 张召; 郑康帝; 刘彦
Original assignee: Guangdong Yiyuan Lanxin Biotechnology Co ltd; Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yiyuan Lanxin Biotechnology Co ltd; Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2023-07-14

Abstract

本发明公开了长双歧杆菌LF04及其在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的长双歧杆菌LF04，其保藏编号为CGMCCNo.23316。长双歧杆菌LF04在体内炎症模型中，能够抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集；长双歧杆菌LF04能够抑制LPS诱导的炎症因子IL‑1β、IL‑6、TNF‑α含量增加；此为利用长双歧杆菌LF04开发预防或治疗炎症性疾病药物提供理论参考和指导依据。

Description

长双歧杆菌LF04及其在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及长双歧杆菌LF04及其在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用。

背景技术

炎症指的是具有血管系统的活体组织对于损伤因子所引起的防御反应。炎症过程的中心环节是血管反应，炎症主要表现为红，肿，热，痛和功能障碍，是机体对刺激的一种防御反应。根据炎症持续时间的不同，可以分为急性炎症和慢性炎症，急性炎症是以发红，肿胀，疼痛为主要症状。常见的致炎因子有生物性因子，物理性因子，化学性因子，异物，坏死组织，变态反应。针对炎症进行控制炎症的治疗方法，最常用的是激素，如糖皮质激素消肿，属于控制炎症。但最主要的是针对不同原发疾病引起的炎症治疗。治疗原发病，如果是细菌感染，使用抗菌素控制细菌，如果病毒引起的，使用抗病毒药。现有治疗炎症的药剂存在明显的副作用。益生菌作为一类对人体健康有益的微生物，当一定数量的活的益生菌定植于宿主肠道内时，能通过改变肠道微生态等途径发挥有益的健康效应。

因此，提供长双歧杆菌LF04及其在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了长双歧杆菌LF04及其在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用。

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞(粒细胞、巨噬细胞)会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，巨噬细胞和中性粒细胞募集到损伤部位。

用手术刀截断斑马鱼尾鳍，诱发急性损伤，促使斑马鱼中性粒细胞发生免疫应答。采用转基因中性粒细胞荧光鱼(呈绿色)，可在荧光显微镜下观察到尾鳍截断的斑马鱼创面中性粒细胞数量比正常斑马鱼明显增加。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)LF04，其保藏编号为CGMCC No.23316，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年08月30日，分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum。

进一步，所述的长双歧杆菌LF04在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用。

进一步，所述的长双歧杆菌LF04在制备抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集药物中的应用。

进一步，所述的长双歧杆菌LF04在制备抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α药物中的应用。

进一步，所述长双歧杆菌LF04为菌悬液。

在相同的浓度时，长双歧杆菌LF04在体内炎症模型中对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的抑制作用强于长双歧杆菌15708，表现出良好的预防或治疗炎症性疾病的功效。在相同的浓度时，长双歧杆菌LF04对LPS提高斑马鱼体内炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量的抑制作用均强于长双歧杆菌15708，具有预防或治疗炎症性疾病的潜能。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了长双歧杆菌LF04及其在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用，长双歧杆菌LF04是从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出来的。长双歧杆菌LF04在体内炎症模型中，能够抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集；长双歧杆菌LF04能够抑制LPS诱导的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量增加；此为利用长双歧杆菌LF04开发预防或治疗炎症性疾病药物提供理论参考和指导依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明长双歧杆菌LF04在BS琼脂平板上的菌落形态；

图2附图为本发明长双歧杆菌LF04对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的影响的直观图；

其中，A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：长双歧杆菌15708；E：长双歧杆菌LF04；

图3附图为本发明长双歧杆菌LF04对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的影响的统计图；

图4附图为本发明长双歧杆菌LF04对LPS提高斑马鱼体内炎症因子IL-1β含量的影响；

图5附图为本发明长双歧杆菌LF04对LPS提高斑马鱼体内炎症因子IL-6含量的影响；

图6附图为本发明长双歧杆菌LF04对LPS提高斑马鱼体内炎症因子TNF-α含量的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

斑马鱼为AB系和Tg(corola:eGFP)系斑马鱼。

白介素6(IL-6)酶联免疫试剂盒、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫试剂盒、白介素1β(IL-1β)酶联免疫试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司；脂多糖(LPS)购自Sigma公司；三卡因购自北京华威锐科化工有限公司；长双歧杆菌15708(ATCC 15708)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。

实施例1长双歧杆菌LF04分离、鉴定及保藏

(1)分离：

1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，用1mL无菌枪头充分吹打混匀，备用。

2)在6个无菌1.5mL离心管中各加入900μL的无菌生理盐水。

3)从第1个装有10^-1样品稀释液的离心管中，吸取100μL的液体加入第2个离心管(10^-2)，稀释到10^-2；

4)从第2个装有10^-2样品稀释液的离心管中，吸取100μL的液体加入第3个离心管(10^-3)，稀释到10^-3；

5)重复上个步骤，一直稀释到10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。

6)从装有10^-4样品稀释液的离心管中吸取100μL的样品稀释液分别接种于MRS固体培养基、BS固体培养基、BHI固体培养基中上，将100μL的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。

7)重复上个步骤，完成10^-5、10^-6、10^-7稀释梯度的稀释涂布。

8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。

9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至BS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。

10)将平板上的纯菌落接种于BS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。

(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。

其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。

实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16S rDNA鉴定，其中菌株LF04被鉴定为长双歧杆菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

TGCAAGTCGAACGGGATCCATCAGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTATGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACGCGGCGACGCGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTG AATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGAGCCGTCTAA；SEQ ID NO.3。

菌株LF04单菌落接种到BS固体培养基上，在37℃厌氧下生长良好，菌落乳白色、呈球形、边缘整齐，表面光滑(图1)。菌株BS已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年08月30日，分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏编号为CGMCC No.23316。

实施例2长双歧杆菌LF04菌悬液(菌体)的制备

将长双歧杆菌LF04活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×10⁶CFU/mL得到菌悬液(菌体)。

实施例3长双歧杆菌15708菌悬液(菌体)的制备

将长双歧杆菌15708活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×10⁶CFU/mL得到菌悬液(菌体)。

实施例4长双歧杆菌LF04对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的影响

挑选发育至3dpf(days post fertilization)的健康斑马鱼Tg(corola:eGFP)置于6孔细胞培养板中，25条/孔，正常组(未切尾)和模型组均加入PBS；阳性对照组(吲哚美辛)加入0.4μg/mL吲哚美辛；长双歧杆菌15708干预组(1×10⁶CFU/mL)加入1×10⁶CFU/mL长双歧杆菌15708；长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)加入1×10⁶CFU/mL长双歧杆菌LF04；每孔5mL，置于生化培养箱28℃孵育，每24h更换新溶液；孵育72h后，在体视显微镜下用手术刀将斑马鱼尾鳍切断，再置于6孔细胞培养板中，20条/孔，然后正常组(未切尾)和模型组均加入PBS，阳性对照组(吲哚美辛)加入0.4μg/mL吲哚美辛；长双歧杆菌15708干预组(1×10⁶CFU/mL)加入1×10⁶CFU/mL长双歧杆菌15708；长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)加入1×10⁶CFU/mL长双歧杆菌LF04，每孔5mL，置于生化培养箱28℃孵育，孵育6h后，用三卡因将斑马鱼麻醉，在荧光显微镜下观察中性粒细胞和巨噬细胞在尾鳍伤口处聚集情况并拍照记录。以离切口处150μm以内的区域为计数范围，统计中性粒细胞和巨噬细胞的数量。采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用

数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：^###P<0.005，与模型组相比：^***P<0.005。

由图2和图3可知，正常组的斑马鱼尾鳍处几乎没有中性粒细胞和巨噬细胞聚集(0.75±0.22个)。而在切尾6h时，模型组的斑马鱼尾鳍伤口处有大量中性粒细胞和巨噬细胞聚集；同时模型组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞数为23.45±1.64个，与正常组(0.75±0.22个)相比较差异性显著(P<0.005)，说明本次斑马鱼炎症模型建立成功。

由图2和图3可知，阳性对照组(吲哚美辛)的斑马鱼尾鳍伤口处仅有少量中性粒细胞和巨噬细胞聚集。同时阳性对照组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞数为10.20±0.61个，与模型组(23.45±1.64个)相比较差异性显著(P<0.005)。因此，吲哚美辛具有缓解炎症的作用，与临床结果一致，表明本次抗炎功效评价的试验有效。长双歧杆菌15708干预组(1×10⁶CFU/mL)斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞数为21.15±1.29个，与模型组(23.45±1.64个)相比无显著性差异(P>0.05)。另外，长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)的斑马鱼尾鳍伤口处也仅有少量中性粒细胞和巨噬细胞聚集，与阳性对照组(吲哚美辛)相似；长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞数为13.75±1.10个，与模型组(23.45±1.64个)相比较差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，长双歧杆菌LF04在体内炎症模型中对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的抑制作用强于长双歧杆菌15708，表现出良好的预防或治疗炎症性疾病的功效。

实施例5长双歧杆菌LF04对LPS提高斑马鱼体内炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β含量的影响

挑选发育至3dpf(days post fertilization)的健康AB系斑马鱼置于6孔细胞培养板中，40条/孔，每组设置6个复孔；正常组加入PBS；模型组加入5μg/mL LPS溶液；阳性对照组加入终浓度为0.4μg/mL吲哚美辛和5μg/mL LPS溶液；长双歧杆菌15708干预组(1×10⁶CFU/mL)加入终浓度为1×10⁶CFU/mL长双歧杆菌15708和5μg/mL LPS溶液；长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)加入终浓度为1×10⁶CFU/mL长双歧杆菌LF04和5μg/mL LPS溶液，每孔5mL，置于生化培养箱28℃孵育，每24h更换新溶液；孵育72h后，用PBS将每孔斑马鱼清洗3遍，再收集每孔斑马鱼至1.5mL离心管，每管40条斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入100μL的PBS，用S-18KS手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，12000×g，4℃离心10min收集上清液，用酶联免疫试剂盒检测上清液IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用

数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：^###P<0.005，与模型组相比：^**P<0.01，^***P<0.005。

由图4可知，与正常组(70.76±5.26pg/mL)相比，模型组的斑马鱼体内炎症因子IL-1β含量(120.06±6.68pg/mL)显著增加(P<0.005)，说明本次LPS诱导炎症模型建立成功。由图4可知，阳性对照组(吲哚美辛)的斑马鱼体内炎症因子IL-1β含量为79.46±5.33pg/mL，与模型组(120.06±6.68pg/mL)相比差异性显著(P<0.005)。因此，吲哚美辛具有缓解炎症的作用，与临床结果一致，表明本次抗炎功效评价的试验有效。长双歧杆菌15708干预组(1×10⁶CFU/mL)的斑马鱼体内炎症因子IL-1β含量为109.98±5.57pg/mL，与模型组(120.06±6.68pg/mL)相比无显著性差异(P>0.05)。另外，长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)的斑马鱼体内炎症因子IL-1β含量为88.05±3.99pg/mL，与模型组(120.06±6.68pg/mL)相比差异性显著(P<0.01)。

由图5可知，与正常组(10.87±1.14pg/mL)相比，模型组的斑马鱼体内炎症因子IL-6含量(19.79±1.18pg/mL)显著增加(P<0.005)，说明本次LPS诱导炎症模型建立成功。由图5可知，阳性对照组(吲哚美辛)的斑马鱼体内炎症因子IL-6含量为11.70±1.14pg/mL，与模型组(19.79±1.18pg/mL)相比差异性显著(P<0.005)。因此，吲哚美辛具有缓解炎症的作用，与临床结果一致，表明本次抗炎功效评价的试验有效。长双歧杆菌15708干预组(1×10⁶CFU/mL)的斑马鱼体内炎症因子IL-6含量为18.78±1.38pg/mL，与模型组(19.79±1.18pg/mL)相比无显著性差异(P>0.05)。另外，长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)的斑马鱼体内炎症因子IL-6含量为13.28±1.15pg/mL，与模型组(19.79±1.18pg/mL)相比差异性显著(P<0.01)。

由图6可知，与正常组(15.95±1.44pg/mL)相比，模型组的斑马鱼体内炎症因子TNF-α含量(34.11±2.58pg/mL)显著增加(P<0.005)，说明本次LPS诱导炎症模型建立成功。由图6可知，阳性对照组(吲哚美辛)的斑马鱼体内炎症因子TNF-α含量为19.70±1.52pg/mL，与模型组(34.11±2.58pg/mL)相比差异性显著(P<0.005)。因此，吲哚美辛具有缓解炎症的作用，与临床结果一致，表明本次抗炎功效评价的试验有效。长双歧杆菌15708干预组(1×10⁶CFU/mL)的斑马鱼体内炎症因子TNF-α含量为31.82±1.88pg/mL，与模型组(34.11±2.58pg/mL)相比无显著性差异(P>0.05)。另外，长双歧杆菌LF04干预组(1×10⁶CFU/mL)的斑马鱼体内炎症因子TNF-α含量为22.09±1.71pg/mL，与模型组(34.11±2.58pg/mL)相比差异性显著(P<0.01)。

因此，上述结果表明，在相同的浓度时，长双歧杆菌LF04对LPS提高斑马鱼体内炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量的抑制作用均强于长双歧杆菌15708，具有预防或治疗炎症性疾病的潜能。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)LF04，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.23316。

2.权利要求1所述的长双歧杆菌LF04在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的长双歧杆菌LF04在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用，其特征在于，所述长双歧杆菌LF04为菌悬液。

4.权利要求1所述的长双歧杆菌LF04在制备抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的长双歧杆菌LF04在制备抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集药物中的应用，其特征在于，所述长双歧杆菌LF04为菌悬液。

6.权利要求1所述的长双歧杆菌LF04在制备抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的长双歧杆菌LF04在制备抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α药物中的应用，其特征在于，所述长双歧杆菌LF04为菌悬液。