CN116426387A - 微生物单菌的分离和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了微生物单菌的分离和培养方法。本发明将待分离的微生物样品通过特定培养基和功能基因引物富集靶向功能微生物群，与琼脂糖等混合后制备微球，将微球置入透析袋后放入原位或模拟环境后进行靶标微生物培养，减少了培养基成分配制的繁琐步骤，避免了传统培养基无法提供的未知营养因子与信号分子。最后通过基因测序鉴定单菌纯菌并分析单菌的种类与功能。本发明方法可以分离复杂环境中的微生物，提高难培养或稀有微生物的分离效率30％以上；与Ichip等分离装置相比，本发明方法分离的通量提升了10‑100倍。经试验证实，本发明方法可以从复杂瘤胃环境中分离相对丰度低的微生物，将难培养和稀有微生物的分离效率提高了30％以上。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的分离培养方法，尤其涉及微球结合原位共培养微生物单菌的分离方法，属于微生物单菌的分离培养领域。
背景技术
微生物是地球上已知的最早生命形式，它们的多样性很高，存在于几乎所有的环境，如土壤、海洋等，以及宿主体内，它们与宿主共同进化并与宿主的健康和相关功能紧密关联。微生物具有巨大代谢和生理多样性，在地球上几乎所有生物化学循环过程中都是必不可少的。宏基因组测序技术让人们对地球上微生物的多样性有了更深入的了解，但分离培养是研究微生物的生理代谢功能并解析其生态作用的关键。目前环境中的大多数微生物(>90％)仍未被分离培养。
在过去十年中，分离和培养微生物的进展缓慢，是因为人们对大多数微生物生长所需的复杂因素仍不了解，导致无法在实验室进行分离培养。微生物生长的自然环境通常是复杂的，并且不同微生物物种生长的最适pH值、温度、压力以及未知生长因子等参数各不相同，因此很难模拟其营养需求。此外，有些微生物在自然界中以休眠状态存在，导致在实验室中难以分离培养。在自然环境中，有些微生物需要交叉喂养或与宿主及其他群落成员进行相互作用。目前环境中的大多数微生物仍未被分离培养。因此，开发新的分离方法将微生物(尤其是难培养或稀有微生物)从复杂样本中或从不同环境中高效分离出来并进行富集培养，仍然是当前亟待需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供微生物单菌的分离和培养方法，主要用于分离不同环境中的微生物，提高难培养及包含未知生长因子微生物的分离效率。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：
一种微生物单菌的分离和培养方法，包括：
(1)采集并富集含有微生物的样品，将微生物样品利用稀释液进行梯度稀释得到系列稀释液，从中筛选富集富含微生物样品的稀释液；
(2)将琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液高温灭菌后置于待分离的微生物最适生长温度下进行冷却；
(3)将步骤(1)得到的富含微生物的样品的稀释液进行梯度稀释，从中选取稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液混合得到混合液，将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物单菌的微球；
(4)将包裹微生物单菌的微球置于透析袋或半透膜中封闭后放回微生物原来栖息的自然环境或模拟生境中进行原位共培养；
(5)原位共培养完成后取出微球，释放微球中的微生物并进行单菌鉴定，将鉴定为单菌的微生物进行物种鉴定。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(1)将样品利用稀释液进行梯度稀释得到稀释度为10-1-10-12的系列稀释液。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(1)中将稀释液利用待分离的微生物的靶标功能基因进行富集来确定是否为富含微生物的样品。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(3)中，按照体积比计，稀释度为10-9-10-10的稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液的比例为1:10；步骤(3)中从系列稀释液中选取稀释液的方法包括：将系列的稀释液与微生物培养液混合均匀后，分装至96孔板，提取微生物的DNA，扩增微生物的功能基因，根据功能基因的扩增结果挑选合适稀释度的稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液混合得到混合液，将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹一个微生物单菌的微球；更优选的，所述的合适稀释度的稀释液是稀释度为10-3-10-6的稀释液。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(3)中利用注射泵、蠕动泵或注射器将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物的微球。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(5)中鉴定单菌的方法包括：对微生物的16S rRNA扩增后Sanger测序，若测序峰图无杂峰则为单菌。
作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(5)中所述的物种鉴定的方法包括：鉴定为单菌后，进行基因组测序与分析进行物种鉴定；譬如：对单菌的DNA通过DNA纯化试剂盒进行纯化，开展二代测序，利用trimmomatic和fastqc软件去除原始序列的接头并进行质控。过滤后的序列利用MetaHIT软件拼接。利用CheckM检查拼接基因组的质量,选取完整度>90％，污染度<5％的基因组，利用GTDB-Tk软件进行微生物物种鉴定。
本发明进一步的提供了一种从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法，包括：
(1)利用厌氧稀释液对瘤胃液样品进行梯度稀释得到瘤胃液样品稀释液；将稀释度为10-3-10-6的稀释液混合在一起得到富集尿素分解菌样品的混合稀释液；
(2)将琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液高温灭菌后冷却至40℃；
(3)将步骤(1)得到的富集尿素分解菌样品的混合稀释液采用厌氧稀释液进行稀释；选取稀释度为10-9-10-10的稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液混合得到混合液，将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物的微球；
(4)将包裹微生物的微球置于透析袋或半透膜中封闭后置于模拟瘤胃环境的培养基中进行原位共培养；
(5)原位共培养完成后取出微球，释放微球中的微生物并进行单菌尿素分解菌鉴定，将鉴定为单菌的尿素分解菌再进行物种鉴定。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，步骤(1)利用厌氧稀释液对瘤胃液样品进行梯度稀释得到稀释度为100-10-7的稀释的瘤胃液样品液。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的厌氧稀释液的组成成分为每1L厌氧稀释液包含无机盐溶液1 35ml，无机盐溶液2 35ml，NaHCO3 8g，质量百分比浓度为1％的刃天青1ml，盐酸半胱氨酸盐0.5g；其制备方法包括：将各成分混合均匀后用蒸馏水定容连续通CO2气体3h除氧，pH调整为6.8，然后125℃灭菌处理15分钟。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，步骤(1)中将尿素培养基与稀释度为10-4的瘤胃液样品稀释液混合在一起得到富集尿素分解菌样品的混合液。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，步骤(3)中利用注射泵和10ml带针头的注射器将混合液逐滴滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物的微球，该微球直径为3.4±0.1mm(±SD)；待所有培养基制备成微球后，将微球从矿物油中取出，用厌氧稀释液冲洗去除微球表面的矿物油。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，按照体积份计，步骤(3)中所述模拟瘤胃环境的培养基的组成为：瘤胃液30份，厌氧稀释液70份以及牛饲料1.5g/100ml；其中，所述的牛饲料组成为：36％的玉米青贮、23％的玉米粉、7.9％的豆粕、8.7％的大豆壳、8.3％的大麦、9.0％的燕麦草、4.0％的苜蓿干草、0.8％的CaHPO4、0.5％的NaHCO3、0.2％的NaCl、0.2％的CaCO3、0.1％的C5H14ClNO、0.1％的脂肪酸钙和1.2％的尿素。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，步骤(3)中所述原位共培养的培养温度为39℃。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，步骤(5)所述单菌尿素分解菌鉴定的方法包括：提取尿素分解菌的DNA，利用27F/1492R引物扩增尿素分解菌16S rRNA基因，扩增产物进行Sanger测序，根据测序峰图无杂峰确定微球中的菌落是否为单菌尿素分解菌。
作为上述从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法的一种优选的具体实施方案，步骤(5)所述物种鉴定的方法包括：对单菌尿素分解菌的DNA进行纯化开展二代测序；利用trimmomatic和fastqc软件去除原始序列的接头并进行质控；过滤后的序列利用MetaHIT软件拼接；利用CheckM检查拼接基因组的质量，选取完整度>90％，污染度<5％的基因组，利用GTDB-Tk软件进行微生物物种鉴定。
采用本发明的上述分离和培养方法从瘤胃液样品中分离了976个单菌，挑选其中52株进行全基因组测序，其中28株含脲酶基因，分离效率高达53.85％，与以往的研究相比，本发明分离的尿素分解菌菌种数量最多，且没有交叉。与之前分离的所有瘤胃尿素分解菌相比，本发明新分离的尿素分解菌数量增加了34.38％，有效扩增了现有的生物资源库。
本发明将微生物样品稀释后包裹到微球中，确定一个合适的稀释度，确保每个微球中仅包含一个细胞；包裹微生物的微球放入透析袋或半透膜封闭，最终将其放回原来所栖息的自然环境或模拟生境中进行培养。由于透析袋和半透膜的选择性，袋或膜内外的微生物细胞无法进出，但自然环境中的某些信号分子或关键营养因子能穿透透析袋和半透膜，被微生物所利用。同时，微球隔绝了袋和膜内微生物之间互相污染，进而促进微球中微生物的生长，以这种方式模仿环境原位生长条件，减少了培养基成分配制的繁琐步骤，特别是避免了传统培养基无法提供的未知营养因子与信号分子。经试验证实，本发明的分离和培养方法可以分离复杂环境中的微生物，提高难培养或稀有微生物的分离效率30％以上；与Ichip等分离装置相比，本发明方法分离的通量提升了10-100倍。
附图说明
图1为琼脂糖微球直径分布范围。
图2为尿素分解菌富集稀释度优化结果。
图3为包裹微生物微球的比例随样品稀释度的变化。
图4为包裹单菌微球的比例随样品稀释度的变化。
图5为分离单菌数量统计结果。
图6本发明和以前的研究中分离出的尿素分解菌的数量比较结果。
图7本发明尿素分解菌与以往研究及Hungate1000项目进行比较结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1利用微球共培养方法分离瘤胃中尿素分解菌
1.试验方法
(1)瘤胃液样品采集：取奶牛瘤胃液，混合均匀，经四层纱布过滤。过滤后的瘤胃液一部分分装到离心管中用于配置培养基，一部分使用注射器转移到含有甘油(30％)的厌氧血清瓶中用于微生物分离培养，所有样品带回试验室于-80℃冻存。
(2)配置尿素培养基：将离心管中的瘤胃液样品在室温下解冻，13,000×g，4℃离心5min，收集瘤胃上清液。将尿素培养基(具体成分见表1)连续通CO2气体3h除氧，pH调整为6.8，然后125℃灭菌处理15分钟。
表1尿素培养基成分表
(3)尿素分解菌富集：冻存于厌氧血清瓶的瘤胃液样品，于室温下解冻。在厌氧培养箱中，利用厌氧稀释液(厌氧稀释液的组成成分为每1L厌氧稀释液包含无机盐溶液135ml，无机盐溶液2 35ml，NaHCO3 8g，质量百分比浓度为1％的刃天青1ml，盐酸半胱氨酸盐0.5g；其制备方法包括：将各成分混合均匀用蒸馏水定容后连续通CO2气体3h除氧，pH调整为6.8，然后125℃灭菌处理15分钟)对瘤胃液样品进行梯度稀释(100-10-7)。将尿素培养基与稀释后的瘤胃液样品混合均匀，分装至96孔板，39℃培养24h。孵育完后，利用裂解液裂解细胞提取DNA。每个孔取10μl细菌培养液，添加16.6μl裂解液(25mM NaOH,0.2mM Na2-EDTA,pH 12)，95℃孵育30min，孵育完成后添加16.6μl Tris-HCl(40mM,pH 7.5)。利用UreC-F/UreC-R引物(ureC-F5′-TGGGCCTTAAAATHCAYGARGAYTGGG-3′,ureC-R5′-GGTGGTGGCACACCATNANCATRTC-3′)扩增脲酶基因，挑选最适稀释度(最适稀释度的确定是为了最大程度上减少非目标菌的丰度，提高靶标菌群的丰度，最终达到提高分离效率的目的，主要是通过将稀释样品利用靶标功能基因进行富集来确定最适稀释度)的稀释液合并在一起得到富集尿素分解菌的稀释液；根据图2可见，随稀释度的增加，含脲酶基因微孔的比例降低。当稀释度大于10-6时，含脲酶基因微孔的比例为0。通过试验确定将稀释度为10-3-10-6的含尿素分解菌群的稀释液混合在一起作为分离尿素分解菌的接种剂(即步骤(5)中的“富集的尿素分解菌混合液)能够有效将尿素分解菌进行富集，其中，稀释度为10-4的含尿素分解菌群的稀释液混合在一起作为分离尿素分解菌的接种剂能够最有效将尿素分解菌进行富集。
(4)配置全营养培养基：将离心管中的瘤胃液样品在室温下解冻，13,000×g，4℃离心5min，收集瘤胃上清液。具体成分见表2-表5。
表2全营养培养基成分表
表3无机盐溶液1
表4无机盐溶液2
将配制好的全营养培养基连续通CO2气体3h除氧，pH调整为6.8，然后125℃灭菌处理15分钟，置于40℃水浴锅冷却。
(5)微球包裹微生物的制备：在厌氧培养箱中，利用厌氧稀释液对步骤(3)所富集的尿素分解菌混合液进行梯度稀释(稀释度为10-1-10-12)，取稀释度为10-9-10-10的稀释样品混合得到混合稀释样品(本试验根据包裹微生物微球的比例挑选合适的稀释度，根据图4的筛选结果可确定微球包裹单菌的最佳稀释度为10-9-10-10)，将1ml混合稀释样品与冷却至40℃的10ml琼脂糖溶液混合均匀得到混合溶液，利用注射泵和10ml带针头的注射器将该混合溶液逐滴滴入冰冷的灭菌矿物油中，形成包裹微生物的微球，微球直径为3.4±0.1mm(±SD)。待所有培养基制备成微球后，利用漏勺将微球从矿物油中取出，用厌氧稀释液冲洗至少3次去除微球表面的矿物油。
(6)原位共培养：清洗完成的微球放入装有稀释液的透析袋内，透析袋置于含30％瘤胃液，70％厌氧稀释液，同时添加牛饲料1.5g/100ml的模拟瘤胃环境中39℃培养。
(7)单菌验证：在培养24h后，将微球取出，分装至96孔板，压碎置于全营养培养基39℃培养48h。孵育完后，利用裂解液裂解细胞提取DNA。然后，利用27F/1492R引物(27-F5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492-R：5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)扩增16S rRNA基因，扩增产物进行Sanger测序。根据测序峰图无杂峰验证微球中的菌落为单菌，挑取单菌用于后续分析。
(8)基因组测序与鉴定：对单菌的DNA通过DNA纯化试剂盒进行纯化，开展二代测序。利用trimmomatic和fastqc软件去除原始序列的接头并进行质控。过滤后的序列利用MetaHIT软件拼接。利用CheckM检查拼接基因组的质量,选取完整度>90％，污染度<5％的基因组，利用GTDB-Tk软件进行微生物物种鉴定。
2.试验结果
图1为琼脂糖微球直径分布范围。
图2为尿素分解菌富集稀释度优化结果；根据图2可见，随稀释度的增加，含脲酶基因微孔的比例降低。当稀释度大于10-6时，含脲酶基因微孔的比例为0。为了富集尿素分解菌，减少非目标菌的丰富，选择10-4稀释度中脲酶基因检测阳性孔的培养液混合均匀作为后续尿素分解菌分离的接种剂。
图3为包裹微生物微球的比例随样品稀释度的变化结果；根据图3的结果可见，随样品稀释度的增加，包裹微生物微球的比例降低。
图4为包裹单菌微球的比例随样品稀释度的变化结果；根据图4的结果可见，随样品稀释度的增加，包裹单细胞微球的比例增加。当稀释度≥10-9时，包裹单细胞微球的比例为100％。根据泊松分布规律，含有部分空白微球(即未包裹微生物的微球)，可提高微球包裹单菌的比例。为了提高分离效率，确定稀释度为10-9-10-10作为后续单菌分离的最佳稀释度。
图5为分离单菌数量统计结果；根据图5的试验结果可见，本发明共分离到976个单菌落，其中非冗余菌落为404株，对16S rRNA基因以98％相似性进行聚类得到52株，对这52株菌进行全基因组测序，其中含脲酶基因的有28株。
图6为本试验和以前的研究中分离出的尿素分解菌的数量比较；图7为本试验尿素分解菌与以往研究及Hungate1000项目进行比较结果。
本试验共分离了976个单菌，挑选其中52株进行全基因组测序，其中28株含脲酶基因，分离效率高达53.85％，这28株尿素分解菌基因组特征见表6。与以往的研究相比，本发明分离到的尿素分解菌菌种数量最多，且没有交叉。与之前分离的所有瘤胃尿素分解菌相比，本发明新分离的尿素分解菌数量增加了34.38％，扩增了现有的生物资源库。
表6 28株尿素分解菌基因组特征
Claims (10)
1.一种微生物单菌的分离和培养方法，其特征在于，包括：
(1)采集并富集含有微生物的样品，将微生物样品利用稀释液进行梯度稀释得到系列稀释液，从中筛选富集富含微生物样品的稀释液；
(2)将琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液高温灭菌后置于待分离的微生物最适生长温度下进行冷却；
(3)将步骤(1)得到的富含微生物样品的稀释液进行梯度稀释，从中选取稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液混合得到混合液，将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物单菌的微球；
(4)将包裹微生物单菌的微球置于透析袋或半透膜中封闭后放回微生物原来栖息的自然环境或模拟生境中进行原位共培养；
(5)原位共培养完成后取出微球，释放微球中的微生物并进行单菌鉴定，将鉴定为单菌的微生物进行物种鉴定。
2.根据权利要求1所述的分离和培养方法，其特征在于，步骤(1)将样品利用稀释液进行梯度稀释得到稀释度为10-1-10-12的系列稀释液。
3.根据权利要求1所述的分离和培养方法，其特征在于，步骤(3)中选取稀释液的方法包括：将系列的稀释液与微生物培养液混合均匀后，分装至96孔板，提取微生物的DNA，扩增微生物的功能基因，根据功能基因的扩增结果挑选稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液混合得到混合液，再将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹一个微生物单菌的微球；其中，所述的稀释液的稀释度为10-3-10-6的稀释液。
4.根据权利要求1所述的分离和培养方法，其特征在于，步骤(3)中利用注射泵、蠕动泵或注射器将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物的微球。
5.根据权利要求1所述的分离和培养方法，其特征在于，步骤(5)中鉴定单菌的方法包括：对微生物的16S rRNA扩增后Sanger测序，若测序峰图无杂峰则为单菌；
步骤(5)中所述的物种鉴定的方法包括：鉴定为单菌后进行基因组测序与分析进行物种鉴定。
6.一种从瘤胃液样品中分离和培养尿素分解菌的方法，其特征在于，包括：
(1)对瘤胃液样品进行梯度稀释得到稀释的瘤胃液样品稀释液；将稀释度为10-3-10-6的稀释液混合在一起得到富集尿素分解菌样品的混合稀释液；
(2)将琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液高温灭菌后冷却至40℃；
(3)将步骤(1)得到富集尿素分解菌样品的混合稀释液用厌氧稀释液进行梯度稀释；选取稀释度为10-9-10-10的稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液混合得到混合液，将该混合液滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物的微球；
(4)将包裹微生物的微球置于透析袋或半透膜中封闭后置于模拟瘤胃环境的培养基中进行原位共培养；
(5)原位共培养完成后取出微球，释放微球中的微生物并进行单菌尿素分解菌鉴定，将鉴定为单菌的尿素分解菌再进行物种鉴定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)利用厌氧稀释液对瘤胃液样品进行梯度稀释得到稀释度为100-10-7的稀释的瘤胃液样品液；所述的厌氧稀释液的组成成分为每1L厌氧稀释液包含无机盐溶液135ml，无机盐溶液2 35ml，NaHCO3 8g，浓度为1％的刃天青1ml，盐酸半胱氨酸盐0.5g；其制备方法包括：将各成分混合均匀后连续通CO2气体除氧，pH调整为6.8，然后灭菌处理，即得；
步骤(1)中将尿素培养基与稀释度为10-4的瘤胃液样品稀释液混合在一起得到富集尿素分解菌样品的混合液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，按照体积比计，稀释度为10-9-10-10的稀释液与冷却后的琼脂、琼脂糖或海藻酸钙溶液的比例为1:10；
步骤(3)中利用注射泵和带针头的注射器将混合液逐滴滴入冰冷的灭菌矿物油中形成包裹微生物的微球；待所有培养基制备成微球后，将微球从矿物油中取出，用厌氧稀释液冲洗去除微球表面的矿物油。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，按照体积份计，步骤(3)中所述模拟瘤胃环境的培养基的组成为：瘤胃液30份，厌氧稀释液70份以及牛饲料1.5g/100ml；优选的，所述的牛饲料组成为：玉米青贮36％、玉米粉23％、豆粕7.9％、大豆壳8.7％、大麦8.3％、燕麦草9.0％、苜蓿干草4.0％、CaHPO40.8％、NaHCO30.5％、NaCl0.2％、CaCO30.2％、C5H14ClNO0.1％、脂肪酸钙0.1％、尿素1.2％；
步骤(3)中所述原位共培养的培养温度为39℃。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述单菌尿素分解菌鉴定的方法包括：提取微生物尿素分解菌的DNA，扩增16SrRNA基因，扩增产物进行Sanger测序，根据测序峰图无杂峰确定微球中的菌落是否为单菌尿素分解菌；
步骤(5)所述物种鉴定的方法包括：对单菌的DNA进行纯化开展二代测序；利用trimmomatic和fastqc软件去除原始序列的接头并进行质控；过滤后的序列利用MetaHIT软件拼接；利用CheckM检查拼接基因组的质量，选取完整度>90％，污染度<5％的基因组，利用GTDB-Tk软件进行微生物尿素分解菌物种鉴定。
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