CN116410878A - 一种表达大口黑鲈弹状病毒g蛋白的重组酵母及其制备疫苗应用 - Google Patents

一种表达大口黑鲈弹状病毒g蛋白的重组酵母及其制备疫苗应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母及其制备疫苗应用，特点是重组酵母为转化了pYD1‑G重组质粒的酿酒酵母，命名为EBY100/pYD1‑G，所述的pYD1‑G重组质粒能在酵母表面展示系统表达MSRV‑G蛋白，所述的MSRV‑G蛋白的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该重组酵母的制备方法包括以下步骤：(1)MSRV‑G的克隆与扩增；(2)重组质粒pYD1‑G的构建；(3)重组酵母EBY100/pYD1‑G的分子构建，该重组酵母在制备大口黑鲈弹状病毒疫苗中的应用，优点是高保护率且安全、有效、使用方便。

Description

一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母及其制备疫苗 应用
技术领域
本发明涉及水产动物疫苗领域，尤其是涉及一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母及其制备疫苗应用。
背景技术
大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV)是引起大口黑鲈的主要病原，其致病性强、传染性高，主要感染幼苗，发病后的鱼群死亡率最高可达100％。MSRV属于线性单股负链RNA病毒，病毒颗粒长300-500nm，直径为100-200nm，由核酸、核衣壳和囊膜构成。病毒核酸编码五种蛋白质，分别为：核蛋白(Nuclear protein，N)，磷蛋白(Phosphoprotein，P)，基质蛋白(Matrixprotein，M)，糖蛋白(Glycoprotein，G)和病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RNApolymerase，L)。G蛋白是嵌合在病毒粒子囊膜表面的唯一糖蛋白，含有与免疫相关的抗原决定簇，对MSRV血清学特征起决定性作用，是MSRV疫苗设计的主要靶标。
酵母表面展示技术是一种将异源蛋白展示于酿酒酵母细胞表面的真核表达系统。目的基因插入载体的Aga2基因下游，经过半乳糖诱导在酵母内大量表达目的蛋白-Aga2融合蛋白，在信号肽的作用下，该融合蛋白被运送至酵母细胞外。随后，Aga2亚基通过二硫键与酵母表面的Aga1亚基相结合，将目的蛋白间接的锚定在酵母细胞表面，最终将目的蛋白展示于酵母表面。与细菌、噬菌体表面展示系统相比，酵母表面展示系统可降低生物安全风险，具有易于大量制备、本身为食品级而对鱼没有副作用、可作为免疫佐剂、展示表达的蛋白更易被识别结合等特点。
现有的适用于鱼类免疫接种的方法主要有注射、口服、浸泡和后肠灌胃。注射免疫最常用的方式，具有注射计量精准、免疫效果强等特点，但易给鱼体造成损伤并且对鱼苗和较小的鱼类不适用。口服和浸泡免疫与注射免疫相比，在使用过程中对鱼体造成的机械损伤和刺激性均较小，不受鱼大小限制，适用于群体免疫。目前，MSRV引起的疾病频发，未有相关的疫苗上市，给养殖业造成了严重的经济损失。因此研发安全高效的针对MSRV的疫苗，对促进大口黑鲈养殖业的健康发展有重要作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母及其制备疫苗应用，该酵疫苗具有高保护率且安全、有效、使用方便。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母，所述的重组酵母为转化了pYD1-G重组质粒的酿酒酵母，命名为EBY100/pYD1-G，所述的pYD1-G重组质粒能在酵母表面展示系统表达MSRV-G蛋白，所述的MSRV-G蛋白的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述的酿酒酵母是Saccharomyces cerevisiae EBY100。
进一步，所述的pYD1-G重组质粒pYD1-G能融合表达MSRV-G蛋白基因片段与凝集素受体Aga2亚基；所述的Aga2亚基以C-末端与G蛋白融合，所述的酵母与凝集素受体Aga1亚基连接，所述的Aga1亚基与所述的pYD1-G重组质粒连接。
上述表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，包括以下步骤：
(1)MSRV-G的克隆与扩增；
(2)重组质粒pYD1-G的构建；
(3)重组酵母EBY100/pYD1-G的分子构建。
进一步，步骤(1)具体为：根据MSRV-G蛋白的基因片段分别设计引物，引物F-1和R-1中的酶切位点分别是BamH I和EcoR I，引物序列如下：F-1：5’-CGGGATCCCGATGCATCTCGCTGCGAAAGA-3’，R-1：5’-GAATTCGAATGCGGACAGCACGTCTGATTC-3’；利用特异性引物进行MSRV-G的扩增，扩增体系为：MSRV-G cDNA2.0μL、上游引物F-1 2.0μL、上游引物R-1 2.0μL、2×PrimeSTAR Max Premix 25.0μL、ddH2O 19.0μL，得到对PCR扩增产物进行纯化回收，得到SRV-G蛋白片段。
进一步，步骤(2)具体为：
A.表达质粒pYD1的提取
利用质粒提取试剂盒从DH5α/pYD1提取质粒，-20℃保存，待用；
B.PCR产物及pYD1质粒双酶切及胶回收
利用QuickCut BamH I、QuickCut EcoR I对纯化的PCR产物与pYD1质粒进行双酶切，反应体系如下：10×QuickCut Green buffer 5μL，QuickCut BamH I 1μL，QuickCutEcoR I 1μL，DNA0.2μL，ddH2O补足50μL，30℃酶切5min，37℃酶切5min；再通过琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，-20℃保存，待用；
C.MSRV-G与pYD1载体的连接与转化
利用T4 DNA Ligase将酶切后的MSRV-G序列插入到pYD1载体中，连接体系如下：10×ligation buffer 2μL、T4 DNA Ligase 1μL、pYD1载体DNA1μL、纯化的PCR产物5μL、灭菌水11μL，总体系20μL，4℃连接过夜，得到重组质粒pYD1-G。
进一步，步骤(3)具体为：利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pYD1-G；将重组质粒pYD1-G的电转化至EBY100感受态细胞，经阳性克隆的筛选鉴定得到重组酵母EBY100/pYD1-G。
上述表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母在制备大口黑鲈弹状病毒疫苗中的应用。
进一步，疫苗的制备方法包括以下步骤：将重组酵母株EBY100/pYD1-G接种于100mL YNB-CAA葡萄糖培养基中，30℃，200rpm，培养直至菌液OD600＝2～5；离心收集菌落并将其重悬于300mL YNB-CAA半乳糖培养基中诱导培养，诱导时间为72h，经免疫荧光鉴定大量诱导重组酿酒酵母EBY100/pYD1-G表达蛋白成功，即得到表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母疫苗。
进一步，利用EBY100/pYD1-G为有效成分制备成口服或者浸泡的大口黑鲈弹状病毒疫苗。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)安全性。pYD1作为大肠杆菌-酿酒酵母的穿梭质粒，含有的氨苄青霉素抗性标记只在中间宿主DH5α中发挥作用，当带有目标基因的pYD1整合到酿酒酵母EBY100的基因组时，抗性标记随即丢失。因此，通过pYD1构建的酿酒酵母表面展示系统是食品级的，这大口黑鲈弹状病毒口服疫苗的安全性奠定了坚实的物质基础。
(2)有效性。本研究选择了大口黑鲈弹状病毒的唯一糖蛋白-G蛋白，该蛋白是主要的免疫蛋白，通过在线分析G蛋白氨基酸序列，对其抗原性和空间结构进行预测，选择抗原集中的基因片段，从而实现提高在EBY100中的抗原表达水平，同时EBY100的细胞壁表面成分β-1,3-D-葡聚糖和甘露聚糖具有很强的佐剂功能，两者相互配合，能最大限度发挥疫苗的免疫原性。
(3)时效性。酵母表面展示技术可实现高效、快速和大规模制备。从载体构建到酵母的大规模培养，只需要10天就能完成。
综上所述，本研究发明了一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母及其制备疫苗应用，针对MSRV-G基因，选取合适的片段进行表达以制备高保护率的大口黑鲈弹状病毒疫苗，以酿酒酵母EBY100为出发菌株，构建了通过pYD1-G重组载体转化后利用Aga1-Aga2将MSRV-G蛋白展示在酵母表面，制成大口黑鲈弹状病毒疫苗，该酵母疫苗可以通过口服或浸泡的方法对大口黑鲈进行免疫，可有效预防大口黑鲈弹状病毒引起的疾病。本发明的疫苗安全、有效、使用方便，在大口黑鲈状病毒病的防控中应用前景良好。
附图说明
图1为重组酵母EBY100/pYD1-G展示抗原的结构示意图；
图2为攻毒后病毒载量检测；(a)口服免疫攻毒48h与72h后肝脏病毒滴度；(b)口服免疫攻毒48h与72h后脾脏病毒滴度；(c)浸泡免免疫攻毒48h与72h后肝脏病毒滴度；(d)浸泡免疫攻毒48h与72h后脾脏病毒滴度；
图3为疫苗的保护率分析；(a)口服免疫的存活率；(b)浸泡免疫的存活率。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
根据下述实施例，可以更为清楚地理解本发明。本发明所述技术步骤，如未特殊说明，均为本领域的常规技术手段，或为商业化或是已公开的试剂材料。
一、实验试剂
1、材料
PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR Max DNAPolymerase、QuickCut BamH I、QuickCut EcoR I、T4 DNA Ligase、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker DL2000、RNAiso Plus购自TaKaRa公司；质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TianGen公司；核酸染料购自全式金生物公司。
三氯甲烷(氯仿)，异丙醇，无水乙醇购自上海国药集团，山梨醇，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)，酵母提取物(Yeast Extract)，胰蛋白胨(Tryptone)，琼脂(Agar)，无氨基酵母氮源(Yeast Nitrogen Base Without Amino acids)，甘油，氨苄青霉素(Ampicillin)，酪蛋白氨基酸(Casamino acids)，半乳糖(galactose)，葡萄糖(dextrose)，亮氨酸(leucine)，氯化钠(NaCl)，核酸染料，乙酸，醋酸锂(LiAc)，DEPC水均购自上海生工。
2、菌株及质粒
感受态E.coil DH5α、pYD1质粒、酿酒酵母EBY100。
3、培养基及试剂的配制
(1)LB液体培养基：称取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、1g NaCl，蒸馏水定容至100mL，高压灭菌121℃，15min，4℃保存，待用。
(2)LB固体培养基：称取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、1g NaCl，1.5g琼脂，蒸馏水定容至100mL，高压灭菌121℃，15min，铺板，4℃保存，待用。
(3)氨苄青霉素(100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素于50mL的容量瓶中，加入灭菌水定容至10mL，搅匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灭菌的EP管分装后，置于-20℃冰箱保存，待用。
(4)YPD酵母液体完全培养基：称取1g酵母提取物和2g胰蛋白胨，蒸馏水定容至90mL，搅匀，高压灭菌121℃，15min，冷却至60℃左右，向其中添加10mL质量百分数为20％的葡萄糖溶液混匀，4℃保存，待用。
(5)YPD酵母固体完全培养基：称取1g酵母提取物、2g胰蛋白胨和2g琼脂，蒸馏水定容至90mL，高压灭菌121℃，15min，冷却至60℃左右，向其中添加10mL质量百分数为20％的葡萄糖溶液混匀，铺板，4℃保存，待用。
(6)酿酒酵母MD固体培养基：称取4.0g琼脂粉、1.34g无氨基酵母氮源，1g酪蛋白氨基酸加入180mL超纯水中，灭菌后冷却至60℃左右，加入20mL含质量百分数20％葡萄糖和0.01％亮氨酸溶液混匀，铺板，4℃保存，待用。
(7)YNB-CAA葡萄糖培养基：称取0.67g无氨基酵母氮源，0.5g酪蛋白氨基酸，蒸馏水定容至90mL，高压灭菌121℃，15min，冷却至60℃左右，向其中添加10mL质量百分数为20％的葡萄糖溶液混匀，4℃保存，待用。
(8)YNB-CAA半乳糖培养基：称取0.67g无氨基酵母氮源，0.5g酪蛋白氨基酸，蒸馏水定容至90mL，高压灭菌121℃，15min，冷却至60℃左右，向其中添加10mL质量百分数为20％的半乳糖溶液混匀，4℃保存，待用。
(9)TAE贮存液/L(50×)：称取242g Tris；37.2g Na2EDTA·2H2O；57.1mL冰乙酸；充分搅拌后定容至1000mL。
(10)琼脂糖凝胶(1％)：以25mL的1×TAE为溶剂，加入0.25g琼脂糖，微波炉加热溶胶，待冷却至50℃左右，加入2μL核酸染料，混匀，倒入胶槽，插上梳子，自然凝固。
二、具体实施例
实施例1
重组质粒pYD1-G的构建
1、MSRV-G的克隆与扩增
1.1MSRV-G克隆模板的获取
EPC细胞为MSRV的敏感细胞株，故使用MSRV感染EPC细胞，待细胞病变达50％时收获细胞，提取细胞总RNA，方法如下：
(1)在离心收集后的细胞中加入1mL RNAiso Plus，室温静置5min；
(2)加入200μL氯仿，振荡混匀1min，室温静置5min，4℃，13000rpm，离心15min，将上清收集至RNA-free管；
(3)加入500μL异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，4℃，13000rpm，离心10min，弃上清；
(4)向沉淀中加入1mL DEPC水配置的75％乙醇以清洗沉淀，4℃，14000rpm，离心5min，弃上清，保留沉淀，于通风橱充分干燥5-10min；
(5)向沉淀中加入15μL DEPC水，反复吹打至完全溶解，使用Nanodrop 2000分光光度计检测浓度和吸光值(OD260/OD280和OD260/OD230)并记录，留作备用。
依照PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit进行cDNA合成MSRV-GcDNA合成：将通用引物(Oligo dT Primer)1μL、dNTP混合物1μL、模板RNA 2μL、无核酸酶的水(RNase Free dH2O)6μL，65℃保温5min，然后在冰上迅速冷却；将上述变形后的反应液中加入5×PrimeScriptⅡBuffer 6μL、RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)0.5μL、PrimeScriptⅡRTase 1μL、RNase Free dH2O 4.5μL，42℃反应30min，95℃反应5min后，冰上冷却得到cDNA。
1.2MSRV-G克隆引物的设计
从NCBI下载MSRV-YH01分离株(NCBI登录号：MK397811.2)G蛋白的基因片段序列(3645bp-4778bp)，编码优化蛋白G核苷酸片段序列(SEQ ID NO.1)如下CATCTCGCTGCGAAAGATCATTATGAAGTAAAAGGGACAATCTGTCATAAGACCACCTGGGTGAAARACTTGTGACCTCAGATGGTATGGACCTAAATATATCACGACCAAGATTTCGTACACACATAACCGGATTAGAATGTCAACAGGCAATAGTTAAAGCATCTAAAGATGAGCTAGAGACACCATACATGCCAGAAGATAACTGCGATTGGGCTACAATCAGCGATAATGAAAAGACATTTATCACCGTCCAAAAGAGCAACATCTTCATGGACCCGTACAACATGGTCTATGTAAGCACAGTCTTAAAAGGAGGAAAATGTGCAAGTACCGTTTGCCCACTCGAAATGCATGGAGGAATTTGGATACCCAGTGAGGCACCCAGGGAGAGTTGCCAACTGGGCAGCAGCATCACCAGCCACATCAATCCCAACAACGCATCCAGGTTAATATCAGAGGAAAGTTATTTGGTCACAGAGTATCATAGACAACTGCCGTTCTTGGGAGCTTGTAGGATGTCAATGTGCGGAGAGGTGGGAATGAGGTTTAAGTCCGGAGAATGGTACAAAATTGAGTCAAGCGACGGACGGGTGCTGTCCTTTCTCAGTAGTGTTCCAATGTGTGATGGAGAGTTGACTGTCTCCATCCATGACGGCTCAGCTACGTATCACAAATTGAGCCAGGAAATCCTTGATCTGTCCGCACAAATCGCCTGCATATCCGAATTACGAAGAGCCCGAGAGAAAAATGCAGTTAGCAATTACCTCTTGAGTTTTTTAACACCAAATCATGGAGGGTTCGGGACGGCATACCGGGTGCTCAACGGACAGTTGCAATCTTCTAAGGCCACTTATGTGAGAGTGAAACTCGGTGCTCTCTCCACCGCGACAAATTGGGGACAACTAGATGACGGCAGTGCATACTCTTCGGAAGATGTCACTGGCAAGATAGTTGATGGACCGCTATTCAATGGGAATCGGATGGACAATGGGACTCTTAGGGTCGTTCAGAATGCAATATTGGGCCAGACACTAGAAGATGAAGATTTGTATGAACACTCAGCAAAAGAGATTCTCCATCCGCATCTGACAGTCCTGAGTAGCAATGAATCAGACGTGCTGTCCGCATTC。
利用Primer Premier 5软件在MSRV-G上下游分别设计引物，引物F-1和R-1中的酶切位点分别是BamH I和EcoR I，引物序列见表1。
表1.G基因的PCR引物
Figure BDA0004148639560000071
1.3目的基因的扩增
以1.1中得到的cDNA与1.2中的特异性引物进行MSRV-G的扩增，扩增体系为：MSRV-G cDNA 2.0μL、上游引物F-1 2.0μL、上游引物R-1 2.0μL、PrimeSTAR Max Premix(2×)25.0μL、ddH2O 19.0μL。PCR扩增反应程序如下：
表2.PCR扩增反应程序
Figure BDA0004148639560000081
1.4PCR产物电泳及回收
利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收。实验步骤如下：
用1.5％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析，电泳完成后，取出凝胶块置于凝胶成像仪中进行成像分析，可在凝胶成像系统中可清晰的见到与预测大小相同的条带，表明G基因扩增成功。切下目的条带进行胶回收，胶回收程序如下：
(1)将吸附柱CA2放入收集管中，向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱CA2重新放回收集管；
(2)将回收胶放入离心管中，称取重量，加入等倍体积的PN溶液，50℃水浴至凝胶完全溶解；
(3)将上一步得到的溶液加入到吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
(4)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃废液；
(5)重复操作步骤(4)后再12000rpm离心2min，除残液，室温放置5min以彻底晾干；
(6)将吸附柱CA2置于无菌EP管中，在吸附膜中间位置滴入30μL EB洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心2min以收集纯化的PCR产物；
(7)使用Nanodrop 2000分光光度计检测浓度和吸光值(OD260/OD280和OD260/OD230)并记录，留作备用。
2、重组质粒pYD1-G的构建
2.1表达质粒pYD1的提取
利用质粒提取试剂盒从DH5α/pYD1提取质粒，-20℃保存，待用。实验步骤如下：
(1)取存于-80℃超低温冰箱中的DH5α菌种，划线于LB培养基中，37℃，倒置培养过夜；
(2)挑取单个菌落于10mL LB液体培养基，37℃，220r/min恒温震荡培养10h；
(3)将菌液装入干净的离心管，12000rpm，离心15min，弃上清；
(4)向沉淀中加入150μL溶液P1，吹打沉淀至沉淀彻底悬浮；
(5)向离心管加入150μL溶液P2，温和上下翻动6-8次，使菌体充分裂解；
(6)向离心管加入350μL溶液P5，快速上下颠倒12-20次，混匀，可见絮状沉淀；
(7)12000rpm，离心2min，吸取上清至吸附柱CP3中，避免吸到沉淀，12000rpm，离心30sec，倒掉废液，吸附柱CP3放回收集管中；
(8)向吸附柱CP3加入300μL漂洗液PWT，12000rpm，离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(9)12000rpm，离心1min，除去吸附柱CP3中残留的漂洗液；
(10)吸附柱CP3放入干净的离心管，向吸附膜中间悬空加入20μL洗脱液TB，12000rpm，离心30秒，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存，待用。
2.2 PCR产物及pYD1质粒双酶切及胶回收
利用QuickCut BamH I、QuickCut EcoR I对纯化的PCR产物与pYD1质粒进行双酶切，反应体系如下：10×QuickCut buffer 5μL，BamH I 1μL，EcoR I 1μL，DNA0.2μL，ddH2O补足50μL，30℃酶切5min，37℃酶切5min；再通过琼脂糖凝胶电泳检测并纯化(步骤参考实施例1，1.4)，-20℃保存，待用。
2.3 MSRV-G与pYD1载体的连接与转化
利用T4 DNA Ligase将酶切后的MSRV-G序列插入到pYD1载体中，连接体系如下：10×ligation buffer 2μL、T4 DNA Ligase 1μL、pYD1载体DNA 1μL、纯化的PCR产物5μL、灭菌水11μL；总体系20μL，4℃连接过夜，实验步骤如下：
(1)将连接体系加到50μL DH5α大肠杆菌感受态中，混匀后冰上孵育30min；
(2)42℃热激90s，热击后立即转移至冰上冷却3-5min；
(3)加入930μL无抗LB液体培养基混匀，将1mL菌液置于摇床；
(4)离心6000rpm，1min，弃800μL的上清，管内余液用移液枪吹打混匀；
(5)取剩余的200μL涂布于含氨苄霉素抗性(Amp抗性)的LB平板上，37℃培养过夜；
(6)挑单菌落，PCR鉴定后测序，重组质粒命名为pYD1-G。
实施例2
重组酵母EBY100/pYD1-G的分子构建
1、重组质粒pYD1-G的抽提
利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，步骤参考实施例1，2.1。
2、重组质粒pYD1-G的转化
(1)取EBY100酵母种，划线于YPD固体培养基，30℃培养；
(2)挑取单菌落于10mL YPD液体培养基，30℃培养过夜(250r/min)；
(3)测定EBY100吸光度(OD600)，收集细胞，转入50mL新鲜YPD液体培养液，30℃，250rpm继续培养4-5h；
(4)4℃，3000rpm离心5min，无菌水反复洗涤；
(5)菌体重悬于1mL的醋酸锂(0.1mol/L)，离心4000rpm，3min；
(6)弃上清，沉淀重悬于0.5mL的醋酸锂(0.1mol/L)中，取2个EP管，将重悬后的感受态细胞分装于其中；
(7)取分装好的EBY100感受态细胞，5-10μg的pYD1-G质粒进行电转化；
(8)用1mL预冷的1M山梨醇冲洗电击杯；
(9)30℃孵育1h后，将山梨醇(含pYD1-G质粒)涂布于MD平板中。
3、阳性克隆的筛选鉴定
挑取单菌落，注明序号，用10μL的无菌水溶解菌体，采用反复冻融和水煮的方法对其破壁。取1μL处理后的菌液进行PCR鉴定，根据电泳结果，挑选出条带大小相符的阳性转化子，命名为EBY100/pYD1-G进行诱导表达，本发明重组酵母EBY100/pYD5-G展示抗原的结构如图1所示。将挑取的阳性单菌落接种于YNB-CAA葡萄糖培养基中，30℃培养，OD600＝2～5时，离心收集菌落(5min，3000r/min)并将其重悬于YNB-CAA半乳糖培养基中，20℃诱导表达蛋白。当菌液OD600＝0.5～1，分别在0～72h内，每24h取2mL样品4℃保存。
4、免疫荧光抗体检测
进行间接免疫荧光分析。实验步骤如下：
(1)取诱导表达0h、24h、48h、72h的酵母细胞，各1mL，4℃，1200rpm离心5min离心，弃上清；
(2)无菌PBS洗沉淀3遍，4℃，5000rpm离心5min，弃上清；
(3)加入1mL 1：500稀释的小鼠抗6×His单克隆抗体作为一抗，混匀后，置四维旋转混合仪上4℃过夜孵育；
(4)重复步骤(2)；
(5)加入1mL 1：500稀释的Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG(H+L)作为二抗，避光室温孵育30min；
(6)重复步骤(2)，全程避光；
(7)加入105μL无菌PBS，取5μL菌液制片，荧光显微镜下进行观察。
利用Image J软件分析免疫荧光镜检视野(n＝10)中阳性酵母细胞比例。荧光显微镜观察结果显示，转化了重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性红色荧光，而未转化重组质粒的酵母细胞表面并未见红色荧光。上述结果表明，转化了重组质粒酵母细胞成功表达并且表面展示了目的蛋白。
实施例3
酵母疫苗的制备
1、诱导重组酿酒酵母EBY100/pYD1-G表达。诱导表达步骤：
(1)重组酵母株(EBY100/pYD1-G)接种于100mL YNB-CAA葡萄糖培养基中，30℃，200rpm，培养直至菌液OD600＝2～5；
(2)离心收集菌落(4℃，5000rpm离心5min)并将其重悬于300mL YNB-CAA半乳糖培养基中诱导培养，诱导时间为72h；
(3)利用紫外分光光度计测定菌液浓度。
2、免疫荧光鉴定
取1mL诱导表达72h的菌液，4℃，1200rpm离心5min，弃上清；其余步骤参考实施例2，4。免疫荧光结果显示，大量诱导重组酿酒酵母EBY100/pYD1-G表达蛋白成功。
实施例4
大口黑鲈弹状病毒酵疫苗在抗MSRV中的应用
1、疫苗免疫实验
1.1口服免疫实验
将5-6cm大小的大口黑鲈暂养于设置有恒温与循环水系统的水箱中，14d后随机挑选出体型无明显差别，健康的幼龄鲈鱼，将其分为3组(每组包含3个平行组)，分别为EBY100/pYD1-G组、EBY100/pYD1组和PBS组，免疫程序如下：
(1)口服免疫EBY100-pYD1-G组：首次免疫连续免疫7d，每天免疫1次，间隔7d，进行加强免疫，连续免疫7d，每次口服灌喂酵疫苗EBY100-pYD1-G 100μL(菌液浓度：1×109CPU/mL)。
(2)口服免疫EBY100-pYD1组：首次免疫连续免疫7d，每天免疫1次，间隔7d，进行加强免疫，连续免疫7d，每次口服灌喂EBY100-pYD1 100μL(菌液浓度：1×109CPU/mL)。
(3)口服免疫PBS组：首次免疫连续免疫7d，每天免疫1次，间隔7d，进行加强免疫，连续免疫7d，每次口服灌喂PBS缓冲液100μL。
1.2浸泡免疫实验
参考以上分组，免疫程序如下：
(1)浸泡免疫EBY100-pYD1-G组：首次浸泡免疫2h后换水，间隔14d进行加强免疫，浸泡免疫2h后换水，每次浸泡免疫控制EBY100-pYD1-G，菌液浓度：2×107CPU/mL。
(2)浸泡免疫EBY100-pYD1组：首次浸泡免疫2h后换水，间隔14d进行加强免疫，浸泡免疫2h后换水，每次浸泡免疫控制EBY100-pYD1，菌液浓度：2×107CPU/mL。
(3)浸泡免疫PBS组：首次浸泡免疫2h后换水，间隔14d进行加强免疫，浸泡免疫2h后换水，使用PBS缓冲液进行浸泡。
2、重组酵母的免疫效果评价
于末次免疫后的第30d，分别从口服和浸泡各实验组挑选出90尾大口黑鲈(包含3个平行组，每个平行组30尾)进行攻毒试验，腹腔注射50μL TCID50/mL MSRV(病毒原液滴度为105.28TCID50/mL)。
2.1免疫后病毒载量检测
为了进一步研究本发明疫苗对病毒载量的影响，于攻毒后的48h和72h随机选择每组幸存的大口黑鲈幼鱼，解剖取肝脏和脾脏，-80℃保存待用。
利用提取法Trizol提取mRNA，用PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesisKit合成cDNA，利用RT-qPCR检测MSRV-G基因相对表达量，以18s rRNA为内参，引物序列见表3；反应体系为：TB
Figure BDA0004148639560000132
Premix Ex Taq缓冲液15μL，cDNA模板总量100ng，上下游引物(10μmol/L)各1.2μL，以ddH2O补足至30μL；反应程序为：94℃预变性30s；95℃，5s；60℃，30s；40个循环；RT-qPCR检测结果使用2-ΔΔCt方法分析，分析不同组的MSRV的拷贝量关系。
表3MSRV-G和18s rRNA定量引物
Figure BDA0004148639560000131
。
2.2攻毒保护性试验
攻毒结束后，连续观察15d，记录实验鱼的死亡情况，同时计算存活率和相对免疫保护率。计算公式为RPS％＝[(对照组死亡率％-免疫组死亡率％)/对照组死亡率％]×100％。
3、实验结果
3.1攻毒后病毒载量检测
如图2所示，在肝脏和脾脏组织中均检测到MSRV，且病毒拷贝数随着时间的增长而增加。与PBS和EBY100/pYD1组相比，口服EBY100/pYD1-G组的MSRV拷贝数在48h和72h均被抑制(图2a和b)。同样的趋势在浸泡免疫实验中也被观察到(图2c和d)。这表明，EBY100/pYD1-G口服和浸泡免疫均可有效抑制MSRV的复制。
3.2疫苗的保护率分析
于免疫后的30d分别对口服和浸泡组大口黑鲈幼鱼进行攻毒实验，连续观察15d。攻毒后大口黑鲈大量死亡，患病幼鱼行动迟缓，身体平衡力降低，鳃和腹部出血，泄殖腔红肿。PBS和EBY100/pYD1组死亡率均先后达到100％，以其作为参比计算口服免疫EBY100/pYD1-G组的相对保护率为66.7％，浸泡免疫EBY100/pYD1-G组的相对保护率为58.6％(图3)。该结果表明本发明构建的酵母疫苗采用口服或浸泡免疫均能增强大口黑鲈抗MSRV的能力。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母，其特征在于：所述的重组酵母为转化了pYD1-G重组质粒的酿酒酵母，命名为EBY100/pYD1-G，所述的pYD1-G重组质粒能在酵母表面展示系统表达MSRV-G蛋白，所述的MSRV-G蛋白的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母，其特征在于：所述的酿酒酵母是Saccharomyces cerevisiae EBY100。
3.根据权利要求1所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母，其特征在于：所述的pYD1-G重组质粒pYD1-G能融合表达MSRV-G蛋白基因片段与凝集素受体Aga2亚基；所述的Aga2亚基以C-末端与G蛋白融合，所述的酵母与凝集素受体Aga1亚基连接，所述的Aga1亚基与所述的pYD1-G重组质粒连接。
4.一种权利要求1所述的表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)MSRV-G的克隆与扩增；
(2)重组质粒pYD1-G的构建；
(3)重组酵母EBY100/pYD1-G的分子构建。
5.根据权利要求4所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于步骤(1)具体为：根据MSRV-G蛋白的基因片段分别设计引物，引物F-1和R-1中的酶切位点分别是BamH I和EcoR I，引物序列如下：
F-1：5’-CGGGATCCCGATGCATCTCGCTGCGAAAGA-3’，R-1：5’-GAATTCGAATGCGGACAGCACGTCTGATTC-3’；利用特异性引物进行MSRV-G的扩增，扩增体系为：MSRV-G cDNA 2.0μL、上游引物F-1 2.0μL、上游引物R-1 2.0μL、2×PrimeSTAR Max Premix25.0μL、ddH2O 19.0μL，得到对PCR扩增产物进行纯化回收，得到SRV-G蛋白片段。
6.根据权利要求4所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于步骤(2)具体为：
A.表达质粒pYD1的提取
利用质粒提取试剂盒从DH5α/pYD1提取质粒，-20℃保存，待用；
B.PCR产物及pYD1质粒双酶切及胶回收
利用BamH I、EcoR I对纯化的PCR产物与pYD1质粒进行双酶切，反应体系如下：10×QuickCut buffer 5μL，BamH I 1μL，EcoR I 1μL，DNA0.2μL，ddH2O补足50μL，30℃酶切5min，37℃酶切5min；再通过琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，-20℃保存，待用；
C.MSRV-G与pYD1载体的连接与转化
利用T4 DNALigase将酶切后的MSRV-G序列插入到pYD1载体中，连接体系如下：10×ligation buffer 2μL、T4 DNALigase 1μL、pYD1载体DNA1μL、纯化的PCR产物5μL、灭菌水11μL，总体系20μL，4℃连接过夜，得到重组质粒pYD1-G。
7.根据权利要求4所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于步骤(3)具体为：利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pYD1-G；将重组质粒pYD1-G的电转化至EBY100感受态细胞，经阳性克隆的筛选鉴定得到重组酵母EBY100/pYD1-G。
8.一种权利要求1所述的表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母在制备大口黑鲈弹状病毒疫苗中的应用。
9.根据权利要求7所述的表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母在制备大口黑鲈弹状病毒疫苗中的应用，其特征在于疫苗的制备方法包括以下步骤：将重组酵母株EBY100/pYD1-G接种于100mL YNB-CAA葡萄糖培养基中，30℃，200rpm，培养直至菌液OD600＝2～5；离心收集菌落并将其重悬于300mL YNB-CAA半乳糖培养基中诱导培养，诱导时间为72h，经免疫荧光鉴定大量诱导重组酿酒酵母EBY100/pYD1-G表达蛋白成功，即得到表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母疫苗。
10.根据权利要求7所述的表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母在制备大口黑鲈弹状病毒疫苗中的应用，其特征在于利用EBY100/pYD1-G为有效成分制备成口服或者浸泡的大口黑鲈弹状病毒疫苗。
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