CN116392457A - 基于红细胞膜构建的仿生纳米材料、制备方法及其在制备治疗不兼容输血药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于红细胞膜构建的仿生纳米材料、制备方法及其在制备治疗不兼容输血药物中的应用，该仿生纳米材料，包括PLGA纳米颗粒、包裹在PLGA纳米颗粒表面的红细胞膜RBCM，该红细胞膜RBCM表面具有血型抗原；所述红细胞膜RBCM包裹PLGA纳米颗粒后形成红细胞仿生纳米颗粒；该应用中仿生纳米颗粒用于吸附血清中不兼容输血相关的免疫球蛋白；制备步骤包括获取新鲜或血库过期血源；提取红细胞膜RBCM；获取PLGA纳米颗粒；混合红细胞膜和PLGA纳米颗粒并水浴超声形成包裹，获得仿生纳米颗粒。本发明能够提供安全有效，适用于不兼容输血，尤其是缺少对应血型的紧急供血情况。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药，具体为基于红细胞膜构建的仿生纳米材料、制备方法及其在制备治疗不兼容输血药物中的应用。
背景技术
近年来，随着人口老龄化程度日益加重，血液制品供不应求的局面愈发严峻，特别是医院或地方血站库存血不足、血袋有效期短及保存不当等问题普遍存在。临床上许多危重病人需要进行输血治疗时常遇到某些困境，比如急需输血的病人是A型血，而医院血库或是血站只有B型血，或是急需输血的病人是B型血，而医院血库或血站只有A型血。面对这种情况，是否输注异型血成为挽救病人生命的关键。然而，强行输异型血及输血后可预见的不兼容溶血等症状将成为主要的临床挑战，同样危及病人生命安全。目前，国际上有几种策略试图用于解决不兼容输血：
①酶切法：利用酶将A/B型抗原转变为H抗原。然而该方法成本很高，不具有普适性；②预防注射糖皮质激素和免疫球蛋白：该策略目前疗效不确定，存在较大风险；③利用高分子特异性掩盖抗原表位：该策略存在化学污染风险，同时引起不兼容输血的抗体并未清除，再次输血的风险仍然较高。
基于此，开发安全有效的策略用于治疗不兼容输血具有重要的临床意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于红细胞膜构建的仿生纳米材料在制备治疗不兼容输血药物中的应用及其制备方法，能够提供安全有效，适用于不兼容输血，尤其是缺少对应血型的紧急供血情况。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种基于红细胞膜构建的仿生纳米材料，包括PLGA纳米颗粒、包裹在PLGA纳米颗粒表面的红细胞膜RBCM，该红细胞膜RBCM表面具有血型抗原；所述红细胞膜RBCM包裹PLGA纳米颗粒后形成红细胞仿生纳米颗粒；该红细胞仿生纳米颗粒用于吸附血清中针对血型抗原的免疫球蛋白。
该仿生纳米材料通过红细胞膜RBCM包裹PLGA纳米颗粒后形成仿生纳米颗粒即PLGA@RBCM，根据RBCM上的血型抗原不同，能够结合形成PLGA@RBCM-A（A型血抗原）、PLGA@RBCM-B（B型血抗原）等。通过利用PLGA@RBCM来吸附血清中针对A或B型血抗原的免疫球蛋白，此时能够允许不兼容血型的血液进入到体内而不出现溶血症状，作为紧急用血时能够提供一种不兼容血型的输血方式。
该方案可以作为一种药物进行使用，供给到人体血液中，对血清中不兼容输血相关免疫球蛋白进行吸附。当然，也可以是药物的其中一种成分，或主要的载体。
其中，红细胞膜可以通过新鲜血液或血库过期的血液进行提取，在提取之后制备获得PLGA@RBCM；PLGA@RBCM可以通过冻干长期保存，能够废物利用，因此原材料来源方便，不同血型的过期血液能够提取出具有对应血型抗原的红细胞膜及制备对应血型抗原的PLGA@RBCM。
优选的方案中，所述仿生纳米颗粒的RBCM膜蛋白：PLGA的质量比为1：2(w/w)。
上述方案为纳米材料本身的方案，以上述记载为基础，以下还提供一种基于红细胞膜构建的仿生纳米材料的制备方法。包括如下步骤
获取新鲜或血库过期血源；
提取红细胞膜RBCM；
获取PLGA纳米颗粒；
混合红细胞膜RBCM和PLGA纳米颗粒并水浴超声形成包裹，获得PLGA@RBCM仿生纳米颗粒。
以上方案中，主要突出的是红细胞膜的来源可以是从血库的过期血源中进行提取，能够废物利用，减少浪费。
基于以上记载，本方案还提供一种应用方式，基于红细胞膜构建的仿生纳米材料在制备治疗不兼容输血药物中的应用，该仿生纳米材料由表面具有血型抗原的红细胞膜RBCM包裹PLGA纳米颗粒形成，且该仿生纳米颗粒用于吸附血清中针对血型抗原的免疫球蛋白。同时，制备的PLGA@RBCM可以冻干后长期保存在-80度冰箱或液氮中，复溶后不影响结合免疫球蛋白的效果，能够更高效、更长效的利用血液，有利于临床转化应用。
优选的，所述表面具有血型抗原的红细胞膜RBCM来源于血库过期血液或新鲜血液，且制备的PLGA@RBCM在冻干复溶后不影响其吸附血清中针对血型抗原免疫球蛋白的能力。
本发明的有益效果：能够通过仿生纳米材料中红细胞膜上的抗原先对血清中不兼容输血相关的免疫球蛋白进行吸附，使其无法与后续引入的不兼容血液结合导致溶血等问题。该吸附作用可以在体内进行，对全身血液中的免疫球蛋白处理完成后即可实现不兼容血液输血，在无法即时获取正确配型输血血液的情况下，能够提供一种应急解决方案，提高抢救成功率。而且制备的材料可以部分来源于血库中过期的血液，能够实现废物利用，减少成本，并且具有大量的回收空间。同时，制备的PLGA@RBCM可以冻干后长期保存在-80度冰箱或液氮中，复溶后也不影响结合免疫球蛋白的效果，能够更高效、更长效的利用血液，有利于临床应用。除此之外，本发明还能够适用于Rh血型等其他临床主要血型不兼容输血，通过获取过期或新鲜的Rh血型血液的红细胞膜进行制备，进而输入体内吸附针对Rh血型抗原的IgG抗体，实现紧急供血，可以延长正确配型Rh血型的时间，实现紧急供血的同时延长获取对应血液的时间。
附图说明
图1为PLGA@RBCM仿生纳米颗粒的基本表征；
图2为自定义不同血浆体积与RBC的不同反应凝集度评分标准；
图3为抗A血清与RBC-A（A型红细胞）的凝集反应曲线；
图4为抗B血清与RBC-B（B型红细胞）的凝集反应曲线；
图5为PLGA@RBCM-A对抗A血清的中和效果；
图6为PLGA@RBCM-B对抗B血清的中和效果；
图7为PLGA@RBCM-A减轻A型红细胞输注B型全血的凝集度；
图8为PLGA@RBCM-B减轻B型红细胞输注A型全血的凝集度；
图9为新鲜红细胞与过期红细胞制备的PLGA@RBCM-A对抗A血清的中和效果；
图10为过期红细胞制备的PLGA@RBCM-A在冻干复溶前后对抗A血清的中和效果。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
本发明采用仿生纳米技术将不同血型红细胞的细胞膜（Red blood cellmembrane，RBCM）包裹至聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）纳米颗粒表面构建不同红细胞血型的仿生纳米体系（记作PLGA@RBCM仿生纳米颗粒）用于吸附血清中针对相应血型抗原的抗体。比如利用A型红细胞膜制备的PLGA@RBCM-A仿生纳米颗粒吸附B型血患者血液中的抗A的IgM抗体，同理也可以利用B型红细胞膜制备的PLGA@RBCM-B仿生纳米颗粒吸附A型血患者血液中的抗B的IgM抗体。
上述举例为IgM抗体，当然也可以适应IgG、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白，只需要调整为具有对应抗原的红细胞膜即可。
PLGA@RBCM仿生纳米颗粒具有良好的临床转化潜力，主要优势包括：1）纳米体系表面的RBCM可来源于患者本身，具有极高的生物相容性及安全性；2）PLGA是经美国FDA批准能用于临床的、可降解的高分子化合物，具有良好的生物相容性；3）RBCM@PLGA仿生纳米颗粒制备简便、冻干后可长期有效保存；4）除了ABO血型输血治疗，该体系还能应用于其他同种异型输血产生抗体的中和治疗，比如针对Rh血型产生抗体的相关疾病的治疗。
将红细胞膜包裹PLGA（约180 nm）构建粒径大小约200 nm的PLGA@RBCM仿生纳米颗粒。利用A型红细胞膜制备的PLGA@RBCM-A仿生纳米颗粒应用于吸附B型血患者血液中的抗A的IgM抗体，利用B型红细胞膜制备的PLGA@RBCM-B仿生纳米颗粒应用于吸附A型血患者血液中的抗B的IgM抗体，实现A型血和B型血的相互兼容输血。在本发明的PLGA@RBCM仿生纳米颗粒中，RBCM（膜蛋白）：PLGA的质量比为1：2(w/w)。
1. 不同血型红细胞膜（RBCM）的制备
不同血型红细胞来源于血库过期的血袋，提取红细胞膜过程如下：全血于3500rpm离心10-15min，去除血清、白细胞及血小板。将100-200μL的纯红细胞加入到离心管中，再加入950μL超纯水，冰浴10-30min后加入20× PBS调整渗透压至1×，再13300rpm离心10min。弃去上清，重新加入950μL超纯水重悬沉淀，调整渗透压，离心，重复以上步骤至上清澄清，收集沉淀。该沉淀即为红细胞膜（RBCM）。通过BCA法测定RBCM中膜蛋白的浓度。
2. PLGA纳米颗粒的制备。
称取20mgPLGA（50:50. Lactid: Glycolide, 0.67 dL/g）溶解于1mL丙酮中，将2mL超纯水匀速加入D到20mg/mL的PLGA丙酮溶液中，500rpm搅拌，30min，挥发丙酮获得粒径约为180nm的PLGA纳米颗粒。
3. PLGA@RBCM仿生纳米颗粒的制备。
将制备好的RBCM和PLGA纳米颗粒按照质量比RBCM（膜蛋白）：PLGA=1：2(w/w)加入玻璃瓶中混匀，于100 W水浴超声5min，利用粒度电位仪和透射电子显微镜检测PLGA@RBCM仿生纳米颗粒的水力学尺寸大小（图1A）、表面电位（图1B）以及表面形貌（图1C）。
4. PLGA@RBCM仿生纳米颗粒对于不同血型IgM抗体的结合能力
采用临床上对于血清抗体滴度测定的金标准——试管法，测定血浆中IgM抗体滴度。为了方便确认PLGA@RBCM仿生纳米颗粒对于IgM的结合能力，本发明自定义不同血浆体积与50μL的5%（v/v）RBC的不同反应凝集度，设定评分标准，分别从0到4（图2）。
基于此，检测不同体积抗A血清加入到50μL的5%（v/v）RBC-A（A型红细胞）的凝集反应曲线（图3），以及不同体积抗B血清加入到50μL的5%（v/v）RBC-B（B型红细胞）的凝集反应曲线（图4）。结果显示，随着血浆体积升高，RBC的凝集度也越高。最终，将导致50μL的5%（v/v）RBC（无论A或B型红细胞）产生4+凝集度的相对应血清体积（V）作为阳性对照组，用于确定PLGA@RBCM仿生纳米颗粒对相应血清抗体的吸附中和效果。
在固定V体积的抗A血清中加入等体积不同膜浓度的PLGA@RBCM-A，室温（25℃）下孵育20min，再加入RBC-A孵育20min。2000rpm离心1min后轻晃试管，观察RBC-A的凝集程度，并评分统计（图5）。同理，在固定V体积的抗B血清中加入等体积不同膜浓度的PLGA@RBCM-B，室温（25℃）下孵育20min，再加入RBC-B孵育20min。2000rpm离心1min后轻晃试管，观察RBC-B的凝集程度，并评分统计（图6）。结果显示，随着PLGA@RBCM浓度的提高，血清对于红细胞的凝集度也逐渐下降，表明PLGA@RBCM能够中和对应的抗血清（PLGA@RBCM-A中和抗A血清，PLGA@RBCM-B中和抗B血清）。
为了更接近于临床现实，将固定V体积的抗A血清与RBC-B混合（模拟RBC-B全血），随后加入等体积不同膜浓度的PLGA@RBCM-A，室温（25℃）下孵育20min，再加入RBC-A孵育20min。2000rpm离心1min后轻晃试管，观察RBC-A的凝集程度，并评分统计（图7）。同样的，将固定V体积的抗B血清与RBC-A混合（模拟RBC-A全血），随后加入等体积不同膜浓度的PLGA@RBCM-B，室温（25℃）下孵育20min，再加入RBC-B孵育20min。2000rpm离心1min后轻晃试管，观察RBC-A的凝集程度，并评分统计（图8）。结果显示，在RBC-B全血中，含有的抗A血清被PLGA@RBCM-A中和RBC-B全血后能够和RBC-A红细胞兼容；同理，在RBC-A全血中，含有的抗B血清被PLGA@RBCM-B中和RBC-A全血后能够和RBC-B红细胞兼容。该结果表明，基于PLGA@RBCM的体系有望用于清除相对应的血清抗体，从而用于临床上不兼容的输血治疗。
在上述基础上，本发明进一步检测新鲜红细胞膜与过期红细胞膜构建的PLGA@RBCM对血清中不兼容抗体的中和效果比较。获取A型血患者的新鲜血及存放超过保质期的过期血分别提取红细胞膜制备PLGA@RBCM-A。从图5中选择一个仿生纳米颗粒的浓度（2.84mg/mL）与V体积的抗A血清在室温（25℃）下孵育20min，再加入RBC-A孵育20min。2000rpm离心1min后轻晃试管，观察RBC-A的凝集程度，并评分统计（图9）。同理，本发明进一步比较过期红细胞膜制备的PLGA@RBCM在冻融前后对血清中不兼容抗体的中和效果比较。获取A型血患者存放超过保质期的过期血提取红细胞膜制备PLGA@RBCM-A。利用12%蔗糖（w/v）冷冻液分散PLGA@RBCM-A并冻干，待检测时复溶。随后，检测新鲜制备与冻干后复溶的PLGA@RBCM-A对抗A血清的中和效果。同样的，从图5中选择一个仿生纳米颗粒的浓度（2.84 mg/mL）与V体积的抗A血清在室温（25℃）下孵育20min，再加入RBC-A孵育20min。2000rpm离心1min后轻晃试管，观察RBC-A的凝集程度，并评分统计（图10）。以上结果表明，新鲜血和过期血制备的PLGA@RBCM并不影响吸附不兼容输血抗体的效果，同时冻干复溶前后的PLGA@RBCM也不影响吸附不兼容输血抗体的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种基于红细胞膜构建的仿生纳米材料，其特征在于，包括PLGA纳米颗粒、包裹在PLGA纳米颗粒表面的红细胞膜RBCM，该红细胞膜RBCM表面具有血型抗原；所述红细胞膜RBCM包裹PLGA纳米颗粒后形成红细胞仿生纳米颗粒；该红细胞仿生纳米颗粒用于吸附血清中针对血型抗原的免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所述的基于红细胞膜构建的仿生纳米材料，其特征在于，所述仿生纳米颗粒的RBCM膜蛋白：PLGA的质量比为1：2(w/w)。
3.一种基于红细胞膜构建的仿生纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
获取新鲜或血库过期血源；
提取红细胞膜RBCM；
获取PLGA纳米颗粒；
混合红细胞膜RBCM和PLGA纳米颗粒并水浴超声形成包裹，获得PLGA@RBCM仿生纳米颗粒。
4.基于红细胞膜构建的仿生纳米材料在制备治疗不兼容输血药物中的应用，其特征在于，该仿生纳米材料由表面具有血型抗原的红细胞膜RBCM包裹PLGA纳米颗粒形成，且该仿生纳米颗粒用于吸附血清中针对血型抗原的免疫球蛋白。
5.根据权利要求4所述的基于红细胞膜构建的仿生纳米材料在制备治疗不兼容输血药物中的应用，其特征在于，所述表面具有血型抗原的红细胞膜RBCM来源于血库过期血液或新鲜血液。
Priority Applications (1)
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