CN116376125A - 一种透明质酸基水凝胶及其制备方法 - Google Patents
一种透明质酸基水凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116376125A CN116376125A CN202310283831.3A CN202310283831A CN116376125A CN 116376125 A CN116376125 A CN 116376125A CN 202310283831 A CN202310283831 A CN 202310283831A CN 116376125 A CN116376125 A CN 116376125A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- based hydrogel
- formula
- cross
- linking agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 91
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 70
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 54
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 54
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 43
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 41
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 28
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 8
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 6
- -1 2-formylphenyl pinacol Chemical compound 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 abstract description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 9
- DGUWACLYDSWXRZ-UHFFFAOYSA-N (2-formylphenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1C=O DGUWACLYDSWXRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 7
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical group CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 4
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 4
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- IVDFJHOHABJVEH-UHFFFAOYSA-N pinacol Chemical compound CC(C)(O)C(C)(C)O IVDFJHOHABJVEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCRQAWQJSSKCFN-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-5-hydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(Br)C(C=O)=C1 SCRQAWQJSSKCFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- NXQGGXCHGDYOHB-UHFFFAOYSA-L cyclopenta-1,4-dien-1-yl(diphenyl)phosphane;dichloropalladium;iron(2+) Chemical compound [Fe+2].Cl[Pd]Cl.[CH-]1C=CC(P(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1.[CH-]1C=CC(P(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 NXQGGXCHGDYOHB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- XBPOBCXHALHJFP-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-bromobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCBr XBPOBCXHALHJFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
- C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2371/00—Characterised by the use of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Derivatives of such polymers
- C08J2371/02—Polyalkylene oxides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Description
技术领域
本发明属于多糖类高分子材料技术领域,尤其涉及一种透明质酸基水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶是通过化学或者物理相互作用的交联方式所形成的具有三维网状结构的一类特殊材料。其特殊之处在于,兼具了固态和液态两种性能。由于其内部的交联网络,可以在水中或者湿润的条件下一定时间内只溶胀而不溶解。水凝胶的网络中充满了大量的水分,从而具有一定的流体性质;溶解于水或体液中的低分子量物质可以通过渗透扩散的方式在水凝胶中传递,使其具有膜的特性。水凝胶吸水膨胀的特性以及对小分子的渗透扩散使其具有良好的生物相容性,且水凝胶材料具有良好的柔韧性和高弹性,可以极大的减少对细胞的损伤。除此以外,水凝胶因其与细胞外基质类似的理化性质,被广泛应用于药物释放,3D细胞培养,组织修复等生物医用领域,应用前景广泛。
透明质酸是一种天然高分子,广泛存在于人体细胞外基质中。此外还存在于许多器官和组织中,起到润滑的作用。因此其生物相容性良好并具有生物可降解性,使其在生物医学领域被广泛使用。由于未改性的透明质酸能够被细胞或者是血清中的透明质酸酶降解,使其在生物体内的存留过短,应用范围被大大限制。目前主要通过改性和交联两种方法来提高机械性能和延缓降解速率。由于物理交联形成的透明质酸基水凝胶稳定性差,降解速率不可控等缺点,化学交联的方法更为常见。但是现有技术制备的化学交联透明质酸基水凝胶存在成胶速度慢,合成条件苛刻,使用复杂等缺点,限制了其在生物医用领域的广泛应用。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种透明质酸基水凝胶及其制备方法,本发明提供的透明质酸基水凝胶具有制备条件温和、使用简单、成胶速度快等优点。
本发明提供了一种透明质酸基水凝胶,由交联剂与透明质酸衍生物在水性介质中混合制得;
所述交联剂包含式(I)结构重复单元和(II)结构端基;
所述透明质酸衍生物具有式(IV)所示的化学结构;
其中,x、y为聚合度。
优选的,所述交联剂具有式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)和式(IIIe)结构中的任一种;
其中,a、b、c、d、e为聚合度,R为式(II)结构端基。
优选的,1≤a≤1000;1≤b≤333;1≤c≤250;1≤d≤166;1≤e≤125。
优选的,12.5≤x+y≤250;所述透明质酸衍生物中已二酸二酰肼的接枝率为15~25%。
优选的,所述交联剂与透明质酸衍生物的质量比为(0.1~10):1。
优选的,所述水性介质为水、生理盐水或者缓冲溶液。
本发明提供了一种上述技术方案所述的透明质酸基水凝胶的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
将透明质酸衍生物、交联剂与水性介质混合,得到透明质酸基水凝胶。
优选的,所述交联剂按照以下步骤制备得到:
a)聚乙二醇与含有羧基的2-甲酰基苯硼酸频哪醇酯小分子在缩合剂和催化剂的作用下进行反应,得到中间产物;
b)所述中间产物在水中透析,冻干,得到交联剂。
优选的,所述制备方法具体包括以下步骤:
i)将透明质酸衍生物与水性介质混合,得到溶液A;将交联剂与水性介质混合,得到溶液B;
ii)将所述溶液A和溶液B混合,得到透明质酸基水凝胶。
优选的,所述透明质酸衍生物在溶液A中的质量-体积浓度为5~100mg/mL;所述交联剂在溶液B中的质量-体积浓度为5~100mg/mL。
与现有技术相比,本发明提供了一种透明质酸基水凝胶及其制备方法。本发明提供的透明质酸基水凝胶由交联剂与透明质酸衍生物在水性介质中混合制得;所述交联剂包含式(I)结构重复单元和(II)结构端基;所述透明质酸衍生物具有式(IV)所示的化学结构。本发明提供的透明质酸基水凝胶具有制备条件温和、使用简单、成胶速度快等优点,组成水凝胶的各组分都具有良好的生物相容性,可以担载药物、生长因子等各种生物活性成分,在组织修复、药物释放、3D细胞培养等领域具有良好的应用前景。此外,本发明提供的水凝胶还具有较高的可调空间,可通过调节透明质酸的分子量、己二酸二酰肼接枝率、交联剂的分子量等方式调控水凝胶的物理化学性能,以满足不同场景的使用需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的透明质酸-接枝-己二酸二酰肼的核磁共振氢谱图;
图2为本发明实施例2提供的4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸的核磁共振氢谱图;
图3为本发明实施例3提供的端基是2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇的核磁共振氢谱图;
图4是本发明实施例6提供的喷涂到皮肤表面的透明质酸基水凝胶实拍图;
图5为本发明实施例7提供的透明质酸基水凝胶的降解曲线图;
图6是是本发明实施例8提供的未处理和用水凝胶治疗7天和14天的SD大鼠烫伤皮肤伤口的照片图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种透明质酸基水凝胶,由交联剂与透明质酸衍生物在水性介质中混合制得。
在本发明提供的透明质酸基水凝胶中,所述交联剂包含式(I)结构重复单元和(II)结构端基;
在本发明提供的透明质酸基水凝胶中,所述交联剂是一种聚乙二醇衍生物,该聚乙二醇衍生物既可以为线性聚乙二醇衍生物,也可以为多臂聚乙二醇衍生物。
在本发明的一些具体实施方式中,所述交联剂具有式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)和式(IIIe)结构中的任一种;
其中,a、b、c、d、e为聚合度,R为式(II)结构端基。
在本发明提供的具有上述结构的交联剂中,a的取值范围优选为1~1000;b的取值范围优选为1~333;c的取值范围优选为1~250,具体可为57;d的取值范围优选为1~166;e的取值范围优选为1~125。
在本发明提供的具有上述结构的交联剂中,R优选为式(IIa)结构的端基:
在本发明提供的透明质酸基水凝胶中,所述透明质酸衍生物具有式(IV)所示的化学结构;
其中,x、y为聚合度;优选的,12.5≤x+y≤250;更优选的,25≤x+y≤100;最优选的,x+y=50;所述透明质酸衍生物中已二酸二酰肼在的接枝率优选为15~25%。
在本发明提供的透明质酸基水凝胶中,所述交联剂与透明质酸衍生物的质量比优选为(0.1~10):1,更优选为(0.5~10):1,最优选为(0.5~5):1,最最优选为1:1。
在本发明提供的透明质酸基水凝胶中,所述水性介质优选为水、生理盐水或者缓冲溶液;所述缓冲溶液优选为PBS缓冲液。
在本发明提供的透明质酸基水凝胶中,所述交联剂与透明质酸衍生物的合计质量与水性介质体积的比优选为(5~100)mg:1mL,更优选为(10~50)mg:1mL,具体可为10mg:1mL、20mg:1mL、30mg:1mL、40mg:1mL或50mg:1mL。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的透明质酸基水凝胶的制备方法,包含以下步骤:
将所述透明质酸衍生物、交联剂与水性介质混合,得到透明质酸基水凝胶。
在本发明提供制备方法中,所述透明质酸衍生物优选按照以下步骤制备得到:
将透明质酸钠、己二酸二酰肼、活化剂与水混合,随后将混合体系的pH值调节至反应pH值进行酰胺化反应,得到透明质酸-接枝-己二酸二酰肼,即所述透明质酸衍生物。
在本发明提供的上述透明质酸衍生物制备步骤中,所述制备步骤更具体包括:
A)先将透明质酸钠、己二酸二酰肼与水混合,然后在搅拌条件下加入活化剂,随后将混合体系的pH值调节至反应pH值,进行酰胺化反应;
B)将反应后的产物进行透析处理,得到所述透明质酸衍生物。
在本发明提供的上述透明质酸衍生物制备步骤中,所述透明质酸钠的数均分子量优选为10000~200000Da,更优选为20000~80000Da,最优选为40000Da。
在本发明提供的上述透明质酸衍生物制备步骤中,所述活化剂优选包含两种组分,其中第一种组分为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺中的一种或多种;第二种组分为1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或多种;所述活化剂更优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺,或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑;所述活化剂最优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑的质量比优选为(250~300):670,更优选为282:670。
在本发明提供的上述透明质酸衍生物制备步骤中,所述透明质酸钠、己二酸二酰肼和活化剂的摩尔比优选为1:(0.1~30):(0.1~1.5),更优选为1:(1~20):(0.2~1.0),最优选为1:(1~20):(0.2~0.8);所述透明质酸钠和水的质量比优选为1:(100~1000),更优选为1:(100~500),最优选为1:(200~300)。
在本发明提供的上述透明质酸衍生物制备步骤中,所述反应pH值优选为4~8,更优选为4.5~5,最优选为4.7;所述反应的温度优选为10~40℃,更优选为20~30℃,最优选为25℃(室温);所述反应的时间优选为12~96h,更优选为48~72h,最优选为60h。
在本发明提供的上述透明质酸衍生物制备步骤中,所述透析处理所使用的透析袋的截留分子量优选为5000~10000Da,更优选为7000Da;所述透析处理的时间优选为12~96h,更优选为48~72h。
在本发明提供制备方法中,所述交联剂优选按照以下步骤制备得到:
a)聚乙二醇与含有羧基的2-甲酰基苯硼酸频哪醇酯小分子在缩合剂和催化剂的作用下进行反应,得到中间产物;
b)所述中间产物在水中透析,冻干,得到交联剂。
在本发明提供的上述交联剂制备步骤中,步骤a)中,所述聚乙二醇可以是线性聚乙二醇,也可以是多臂聚乙二醇,例如三臂聚乙二醇、四臂聚乙二醇、六臂聚乙二醇或八臂聚乙二醇;所述聚乙二醇的数均分子量优选为44~44000,更优选为5000~20000,最优选为10000。
在本发明提供的上述交联剂制备步骤中,步骤a)中,所述含有羧基的2-甲酰基苯硼酸频哪醇酯小分子具体可为4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸;所述含有羧基的2-甲酰基苯硼酸频哪醇酯小分子的摩尔当量优选为聚乙二醇中羟基的1.2~5倍,更优选为2倍。
在本发明提供的上述交联剂制备步骤中,步骤a)中,所述缩合剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐;所述缩合剂的用量优选为所述缩合剂的摩尔当量优选为聚乙二醇中羟基的5~10倍,更优选为6倍;所述催化剂优选为4-二甲氨基吡啶;所述催化剂的用量优选为所述催化剂的摩尔当量优选为聚乙二醇中羟基的2~5倍,更优选为3倍。
在本发明提供的上述交联剂制备步骤中,步骤a)中,所述反应的温度优选为10~40℃,更优选为25℃(室温);所述反应的时间优选为24~72h,更优选为48h。
在本发明提供的上述交联剂制备步骤中,步骤a)中,所述反应在有机溶剂中进行;所述有机溶剂优选为无水的二氯甲烷;反应结束后,抽干溶剂。
在本发明提供的上述交联剂制备步骤中,步骤b)中,优选并不将所述中间产物直接进行透析,而是先将所述中间产物在水中溶解,过滤,再对得到的滤液进行透析;所述透析的时间优选为1~5天,更优选为3天。
在本发明提供制备方法中,所述透明质酸衍生物、交联剂与水性介质的用量配比在上文中已经介绍,在此不再赘述。
在本发明提供制备方法中,所述透明质酸基水凝胶的具体制备过程优选包括:
i)将透明质酸衍生物与水性介质混合,得到溶液A;将交联剂与水性介质混合,得到溶液B;
ii)将所述溶液A和溶液B混合,得到透明质酸基水凝胶。
在本发明提供的上述具体制备过程中,步骤i)中,所述透明质酸衍生物在溶液A中的质量-体积浓度优选为5~100mg/mL,更优选为10~50mg/mL,具体可为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL或50mg/mL;所述交联剂的在溶液B中的质量-体积浓度优选为5~100mg/mL,更优选为10~50mg/mL,具体可为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL或50mg/mL。
在本发明提供的上述具体制备过程中,步骤ii)中,所述溶液A和溶液B优选利用双筒注射器进行混合,混合后得到的透明质酸基水凝胶再经由双筒注射器喷涂出。
本发明提供的透明质酸基水凝胶具有制备条件温和、使用简单、成胶速度快等优点,组成水凝胶的各组分都具有良好的生物相容性,可以担载药物、生长因子等各种生物活性成分,在组织修复、药物释放、3D细胞培养等领域具有良好的应用前景。此外,本发明提供的水凝胶还具有较高的可调空间,可通过调节透明质酸的分子量、己二酸二酰肼接枝率、交联剂的分子量等方式调控水凝胶的物理化学性能,以满足不同场景的使用需求。
为更清楚起见,下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
称取透明质酸钠(数均分子量40000Da)2.0g,己二酸二酰肼8.6g,加入400mL灭菌注射水中,搅拌直至完全溶解;溶解后,称取670mg 1-羟基苯并三唑、282mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐;用精确pH试纸测试pH值,并用0.01M的稀盐酸溶液调节体系pH至4.7,在室温下反应60小时,得到的产物用透析袋(截留分子量为7000Da)透析72h,得到产物透明质酸-接枝-己二酸二酰肼(化学结构如式IV所示,x+y=50,己二酸二酰肼接枝率为20%)。
对本实施例制备的透明质酸-接枝-己二酸二酰肼进行核磁共振氢谱分析,结果如图1所示,图1为本发明实施例1提供的透明质酸-接枝-己二酸二酰肼的核磁共振氢谱图。
实施例2
合成4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸,具体制备过程如下:
1)将2-溴-5-羟基苯甲醛(4.0g)和4-溴丁酸乙酯(4.7g)溶于40mL无水二甲基甲酰胺中,加入碳酸钾(4.1g),室温反应12h;反应结束后,将反应液与500mL正己烷/乙酸乙酯(1/1,v/v)混合,用水洗涤三次,有机相用无水硫酸钠干燥;粗产物通过硅胶柱层析进行提纯,洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯(9/1,v/v),得到4-(4-溴-3-甲酰基苯氧基)丁酸乙酯的无色粘稠液体(5.7g,产率90%);
2)将4-(4-溴-3-甲酰基苯氧基)丁酸乙酯(3.2g),联硼酸频那醇酯(2.8g),(1,1’-双(二苯基膦)二茂铁)二氯化钯(0.22g)和乙酸钾(2.9g)分散溶解在40mL无水二氧六环中,100℃回流反应2h;反应结束后,抽干溶剂,剩余物溶于二氯甲烷,用水洗涤三次,无水硫酸钠干燥;粗产物通过硅胶柱层析进行提纯,洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯(9/1,v/v),得到4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸乙酯的无色粘稠液体(3.0g,产率83%);
3)将4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸乙酯(1.5g)与1mL三氟乙酸、9.5mL水搅拌混合均匀,90℃反应3h;反应结束后,抽干溶剂,粗产物通过硅胶柱层析进行提纯,洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(19/1,v/v),得到4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸的无色粘稠液体(0.60g,产率44%)。
对本实施例制备的4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸进行核磁共振氢谱分析,结果如图2所示,图2为本发明实施例2提供的4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸的核磁共振氢谱图。
实施例3
按照如下化学反应路线合成端基是2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇:
其中,x表示聚合度,y表示多臂聚乙二醇的臂数量;本实施例中x=57,y=4。
具体制备过程如下:
将四臂聚乙二醇(数均分子量10000,1.5g)和实施例2制备所得的4-(3-甲酰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)丁酸(0.6g)溶于20mL二氯甲烷中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.69g)、4-二甲氨基吡啶(0.22g),室温反应48h;反应结束后,抽干溶剂,剩余物用水溶解,过滤,滤液在去离子水中透析三天,冷冻干燥,得到端基是2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇。
对本实施例制备的端基是2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇进行核磁共振氢谱分析,结果如图3所示,图3为本发明实施例3提供的端基是2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇的核磁共振氢谱图。
实施例4
称取10.0mg实施例1中制备所得的透明质酸-接枝-己二酸二酰肼固体加入1.0mLpH=7.4的PBS溶液搅拌至完全溶解,得到溶液A;称取10.0mg实施例3中制得的端基为2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇固体加入1.0mL pH=7.4的PBS溶液搅拌至完全溶解,得到溶液B;将两种溶液分别装入双筒注射器的两个注射筒内,混合,即可制备可喷涂透明质酸基水凝胶。
实施例5
称取20.0mg实施例1中制备所得的透明质酸-接枝-己二酸二酰肼固体加入1.0mLpH=7.4的PBS溶液搅拌至完全溶解,得到溶液A;称取20.0mg实施例3中制得的端基为2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇固体加入1.0mL pH=7.4的PBS溶液搅拌至完全溶解,得到溶液B;将两种溶液分别装入双筒注射器的两个注射筒内,混合,即可制备可喷涂透明质酸基水凝胶。
实施例6
称取50.0mg实施例1中制备所得的透明质酸-接枝-己二酸二酰肼固体加入1.0mLpH=7.4的PBS溶液搅拌至完全溶解,得到溶液A;称取50.0mg实施例3中制得的端基为2-甲酰基苯硼酸的四臂聚乙二醇固体加入1.0mL pH=7.4的PBS溶液搅拌至完全溶解,得到溶液B;将两种溶液分别装入双筒注射器的两个注射筒内,混合后喷涂到皮肤表面,效果如图4所示,图4是本发明实施例6提供的喷涂到皮肤表面的透明质酸基水凝胶实拍图。
实施例7
采用实施例6中制备水凝胶的方法,制备2组体积为200μL的可喷涂透明质酸基水凝胶,分别浸泡入1mL的PBS溶液和1mL含有10U透明质酸酶的PBS溶液中,浸泡的溶液一天更换一次,并每天称重记录,观察透明质酸基水凝胶的降解行为。
实验结果如图5所示,图5为本发明实施例7提供的透明质酸基水凝胶的降解曲线图。由图5可知,透明质酸酶的加入可以加快透明质酸基水凝胶的降解(圆形),因此可以通过透明质酸酶来控制透明质酸基水凝胶的降解行为。
实施例8
选取16只8周龄健康SD雄性大鼠,平均体重200g;将大鼠背部脱毛,用沸水加热金属块至100℃,将金属块接触大鼠背部,制造一个直径2cm圆形深二度烫伤伤口;随机抽取8只为未处理组,另外8只在伤口处喷涂实施例6中制备的水凝胶作为治疗组;实验当天记为第1天,第7、14天对伤口情况进行拍照记录。
实验结果如图6所示,图6是是本发明实施例8提供的未处理和用水凝胶治疗7天和14天的SD大鼠烫伤皮肤伤口的照片图。通过图6可以看出,透明质酸基水凝胶处理过的大鼠伤口相比与未处理的,伤口愈合更快。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
3.根据权利要求2所述的透明质酸基水凝胶,其特征在于,1≤a≤1000;1≤b≤333;1≤c≤250;1≤d≤166;1≤e≤125。
4.根据权利要求1所述的透明质酸基水凝胶,其特征在于,12.5≤x+y≤250;所述透明质酸衍生物中已二酸二酰肼的接枝率为15~25%。
5.根据权利要求1所述的透明质酸基水凝胶,其特征在于,所述交联剂与透明质酸衍生物的质量比为(0.1~10):1。
6.根据权利要求1所述的透明质酸基水凝胶,其特征在于,所述水性介质为水、生理盐水或者缓冲溶液。
7.一种权利要求1所述的透明质酸基水凝胶的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
将透明质酸衍生物、交联剂与水性介质混合,得到透明质酸基水凝胶。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述交联剂按照以下步骤制备得到:
a)聚乙二醇与含有羧基的2-甲酰基苯硼酸频哪醇酯小分子在缩合剂和催化剂的作用下进行反应,得到中间产物;
b)所述中间产物在水中透析,冻干,得到交联剂。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
i)将透明质酸衍生物与水性介质混合,得到溶液A;将交联剂与水性介质混合,得到溶液B;
ii)将所述溶液A和溶液B混合,得到透明质酸基水凝胶。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述透明质酸衍生物在溶液A中的质量-体积浓度为5~100mg/mL;所述交联剂在溶液B中的质量-体积浓度为5~100mg/mL。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310283831.3A CN116376125A (zh) | 2023-03-22 | 2023-03-22 | 一种透明质酸基水凝胶及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310283831.3A CN116376125A (zh) | 2023-03-22 | 2023-03-22 | 一种透明质酸基水凝胶及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116376125A true CN116376125A (zh) | 2023-07-04 |
Family
ID=86978025
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310283831.3A Pending CN116376125A (zh) | 2023-03-22 | 2023-03-22 | 一种透明质酸基水凝胶及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116376125A (zh) |
-
2023
- 2023-03-22 CN CN202310283831.3A patent/CN116376125A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11337930B2 (en) | Modified alginates for cell encapsulation and cell therapy | |
AU733716B2 (en) | Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates | |
RU2523182C2 (ru) | Способ получения функционализованных производных гиалуроновой кислоты и образования их гидрогелей | |
JP4558213B2 (ja) | 疎水性および親水性の成分を有する水性ゲル形成システム | |
KR100293043B1 (ko) | 광경화성글리코사미노글리칸유도체,가교결합된글리코사미노글리칸및이의제조방법 | |
AU2007296939B9 (en) | Hyaluronic acid derivatives obtained via "click chemistry" crosslinking | |
RU2230073C2 (ru) | Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов | |
US5827937A (en) | Polysaccharide gel composition | |
JP5818969B2 (ja) | 架橋ヒアルロン酸ベースの両性材料,その調製法,活性剤を封入した材料,その調製法,及び前記材料の使用 | |
WO2009006780A1 (fr) | Procédé pour la formation d'un hydrogel biocompatible à gélification rapide et préparation d'un agent de pulvérisation | |
KR100977788B1 (ko) | 포스포릴콜린기 함유 다당류 및 그 제조 방법 | |
Li et al. | In vitro and in vivo evaluation of 3D biodegradable thermo/pH sensitive sol-gel reversible hydroxybutyl chitosan hydrogel | |
JP2012082428A (ja) | セミ相互貫入高分子網目の組成物 | |
CN110790951A (zh) | 一种原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶及其制备方法和应用 | |
CN112812329B (zh) | 巯基改性高分子化合物的水凝胶及其制备方法和用途 | |
JP2007516323A (ja) | 分解時間を調整可能なステレオコンプレックスヒドロゲル | |
WO1996003147A1 (en) | Synthesis of chemical gels from polyelectrolyte polysaccharides by gamma-irradiation | |
CN116870243B (zh) | 一种具有止血抗炎作用的水凝胶及其制备方法和应用 | |
CN113929792A (zh) | 一种醛基化修饰的透明质酸(钠)及其合成方法和应用 | |
CN116376125A (zh) | 一种透明质酸基水凝胶及其制备方法 | |
de Azevedo | Aldehyde-functionalized chitosan and cellulose: chitosan composites: application as drug carriers and vascular bypass grafts | |
JP7325831B2 (ja) | 新規な構造を有する高分子、その製造方法、高分子から合成されたナノファイバ及びその製造方法 | |
CN112220963B (zh) | 一种非溶胀uv交联壳聚糖可注射水凝胶及其合成方法 | |
Kuroyanagi et al. | Preparation of graft polypeptide binding bleomycin derivative | |
CN116217917A (zh) | 一种聚乙二醇衍生物、其制备方法及聚乙二醇水凝胶及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |