CN116375887A - 一种蛋白质纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域,尤其涉及一种蛋白质纯化的方法，1)通过RF克隆，将目的基因与MiSBM标签基因插入表达载体中，构建重组质粒；2)将重组质粒转化至大肠杆菌中，筛选出阳性克隆，得到重组菌株；3)将筛选出的重组质粒的菌株进行培养，并进行目的融合蛋白的诱导表达；收集菌体，破碎后分离，收集含有目的融合蛋白的上清液；4)将上清液与由黄原胶与聚乙烯醇组成的填料接触；5)采用NaCl(优选溶液，可将蛋白从黄原胶基填料上洗脱纯化，得到纯化产物；或，采用MxeGyrA‑linker断裂反应液，将目的融合蛋白从黄原胶基填料上分离下来，得到纯化产物。

Description

一种蛋白质纯化的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域,尤其涉及一种黄原胶微球的制备方法及高效、高特异性蛋白质纯化系统的建立。
背景技术
蛋白质是生命的体现者，几乎所有生命现象都与蛋白质结构、功能的正常体现密切相关，市场上绝大部分药物的作用靶点也都是通过蛋白质发挥作用。运用基因重组技术生产重组蛋白研究蛋白质结构与功能的技术已较为成熟。但处于重组蛋白表达下游处理阶段的蛋白质的分离纯化技术仍为蛋白质研究应用中的瓶颈问题，因蛋白质存在于较为复杂的混合体中，其自身稳定性较差，不易于分离，在蛋白质的纯化工艺中，追求重组蛋白的高产量，高纯度，探求更加高效低廉，高通量的纯化技术是研究者致力的目标。
蛋白质进一步纯化方法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析等，其通常需要较高成本，而亲和层析法相对高效，该领域的主要进展之一是发现了融合伙伴(简称“标签”)，它可以是蛋白质结构域、小肽甚至是融合在目标蛋白质N端或C端的酶，以增强其表达、溶解度(即正确折叠)和纯化。融合标记的使用是目前最强大的策略之一，以获得大规模的高产量和纯度的重组蛋白，独立于使用的宿主表达系统。
标签介导的重组蛋白纯化存在一些瓶颈问题，如填料(如琼脂糖)价格昂贵、纯化效率低、配基制备困难，配基本身需要分离纯化，配基与载体偶联条件苛刻等缺陷，标签蛋白过大、机械强度低、稳定性差等问题。Soto-Rodríguez等提出12个氨基酸的Car9标签与造价昂贵的二氧化硅有亲和力结合。Olmez等发现19-氨基酸R5双功能标签显示了硅结合亲和力和二氧化硅沉淀活性，但纯化效率较低。Kinrade等发现22.5KDa的mhpa14标签对以葡聚糖为基础的尺寸排除色谱树脂具有亲和力。故亲和层析技术仍需要更深入的优化与发展。
黄原胶(XG)是一种价格低廉，性能优良的生物高分子酸性杂多糖，含有纤维素骨架和三糖侧链，是集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能较为优越的生物胶。以其为原料所制备的水凝胶亲水性强、无毒、可降解、生物相容性好，常作高吸水性树脂、药物载体和微胶囊等，在生物领域具有广阔的应用前景。
SBM是项目团队从黄原胶降解菌Microbacterium sp.XT11中分离纯化出的一种新型黄原胶裂解酶MiXly中C端无催化活性的黄原胶结合模块，能够特异性识别并结合黄原胶侧链中的葡萄糖醛酸-甘露糖支链，同时项目团队对黄原胶降解菌Microbacteriumsp.XT11进行了全基因测序，并对黄原胶生物降解基因簇的与识别元件进行挖掘，已获得黄原胶结合模块MiSBM的基因序列((MiSBM基因序列已申请专利《一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块CBM6B蛋白质及应用的制作方法》，专利申请号：CN202011356407.X，公开号：CN112481282A)，具备将其作为标签蛋白与目的基因融合并构建新型重组蛋白纯化系统的理论基础。可利用MiSBM与黄原胶的高亲和力和高结合特异性，采用聚乙烯醇交联黄原胶作为亲和填料，拟实现亲和层析法分离纯化带有MiSBM标签的目标蛋白质。
发明内容
为了实现上述目的，解决标签介导的重组蛋白纯化存在的一些瓶颈问题。
本发明将提供一种黄原胶微球的制备方法作为亲和填料，同时将MiSBM作为亲和标签与目标蛋白质融合，利用亲和层析法分离纯化带有MiSBM标签的目标蛋白质，构建新型、高效、高特异性蛋白质纯化系统。且专利涉及的纯化体系具有可控自切割能力，在纯化阶段加入终浓度40mmol/L二硫苏糖醇缓冲液，诱导内含肽(即后文MxeGyrA-linker，内涵肽参考文献：Telenti A,Southworth M,Alcaide F,et al.The Mycobacterium xenopi GyrAprotein splicing element:
characterization of a minimal intein[J].Journal of Bacteriology,1997,179(20):6378-6382.)N端发生断裂反应，使标签蛋白与目的蛋白分离，标签蛋白吸附于黄原胶填料，经缓冲液洗脱从而得到目的蛋白。
所述方法包括三部分，分别为黄原胶亲和层析材料的制备，重组标签蛋白的构建与表达以及蛋白质纯化体系的建立。
一、黄原胶亲和层析材料的制备，包括以下步骤：
S1：将聚乙烯醇溶解在70-100℃的热水中，冷却至室温后，加入黄原胶搅拌5-16h，得到均匀的无气泡溶液，作为水相；
S2：将油相和乳化剂加入水相中，用搅拌器以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h；
S3：缓慢加入4×10-6-4×10-4％(占体系体积)戊二醛，及1-2mL 1M硫酸,继续用搅拌器以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h；
S4：用溶剂和蒸馏水洗涤3-5次，去除油相；
S5：然后将制备的微球在室温～50℃下干燥1-24h，得到黄原胶微球。
优选的，所述的S1中，黄原胶与聚乙烯醇质量含量为(1:1-1:4)，优选1：2，且总聚合物(聚乙烯醇与黄原胶质量之和)浓度为1-4％，w/v，g/mL。
优选的，所述的S2中，油相为液体石蜡，乳化剂为1-8％w/w(占油相)span 80，水相在体系中的体积不超过40％(1-40％)。
优选的，所述的S4中，清洗微球的溶剂可选择苯、乙醚、氯仿、二硫化碳、热乙醇(80-95℃)中的一种或二种以上。
优选的，若所述的S4中，选用热乙醇清洗可以直接得到干燥的黄原胶微球，可省略步骤S5。
二、重组蛋白的构建及表达，包括如下步骤：
(1)、活化甘油菌，对pET28a-CBM6B-GFP质粒进行提取，设计引物用于PCR扩增目的基因GFP、MiSBM。(CBM6B即本专利所指标签蛋白MiSBM)模板质粒pET28a-CBM6B-GFP来源：论文《黄原胶降解酶系中糖结合单元及分子作用机制的研究》中42-45页，3.2.11.1黄原胶裂解酶CBM突变体的载体构建，有详细描述。pET28a-CBM6B-GFP质粒由吉林省库美生物科技有限公司全基因合成，合成方式为pET28a载体多克隆位点Nco I、Xho I两处连接CBM6B-GFP。
(2)、通过RF克隆技术，将目的基因GFP与MiSBM标签插入质粒pET24a-GST-MxeGyrA-linker-AFP中，构建重组质粒。(使用GFP绿色荧光蛋白基因替换GST，使用MiSBM基因替换AFP使标签蛋白置于N端防止影响蛋白构象)模板质粒pET24a-GST-Mxe GyrA-PTlinker-AFP来源：论文《利用新型抗冻蛋白-内含肽标签高效纯化重组酶蛋白》中24-31页，2.3重组质粒的构建及鉴定，有详细描述。郑延蓉.利用新型抗冻蛋白-内含肽标签高效纯化重组酶蛋白[D].大连工业大
学,2021.DOI:10.26992/d.cnki.gdlqc.2021.000216.
(3)、向上述RF构建过程得到的反应产物中加入Dpn I酶进行消化，将消化产物电击转化至大肠杆菌DH10B中，抗性平板筛选菌落并进行菌落PCR验证和酶切验证，验证正确送测序。
(4)、将测序正确的重组质粒热转至大肠杆菌BL21(DE3)热击感受态，得到重组菌株。
(5)、重组菌株的表达
a、活化重组菌株并制备种子液，在37℃摇床过夜测菌液OD值在吸光度600nm处为0.6-0.8时停止培养；
b、以种子液：发酵培养基等于1:50(v/v)的比例向LLB液体培养基(含有30μg/mLKan)中加入种子液；
c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，将菌液放到16℃，200rpm的条件下继续培养16-20h；
d、收获细菌并破碎，离心取上清液，进行SDS-PAGE；
三、特异性蛋白纯化体系的构建：
(1)、将上清液透析至pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液中，取制备的黄原胶填料置于纯化柱中，用PBS缓冲液平衡填料；
(2)、将上清液加入纯化柱中，使蛋白和填料室温结合6-24h；
(3)、通过流动泵，采用0.7mM-1.0mM NaCl(优选0.8 -0.9mM)溶液将蛋白从黄原胶基填料上洗脱下来，得到纯化产物。
或，可向纯化柱中加入断裂反应缓冲液(断裂反应缓冲液：40mmol/LDTT(二硫苏糖醇),1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，pH8.5的50mmol/LTris-HCl缓冲液)在25℃下孵育2-24h，将目的融合蛋白与标签蛋白MiSBM切割，得到切标签后的纯化产物。
本发明专用引物的序列为：
引物1：5′AAGAAGGAGATATACATATGATGAGTAAAGGAGAAGAAC 3′
引物2：5′CCCGTGATGCACATTCGCATTTTGTAGAGCTCATCCATGC 3′
引物3：5′GACCACCCCGACCCCGACCCCGACGACCGCTGCTGTCAGCACCAGGC 3′
引物4：5′GTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACTCGATGGCGGAGACCAGCTGAATG3′
引物5：5′TTAAGAAGGAGATATACATATGATGACCATGATTACGGATTCAC 3′
引物6：5′GTGATGCACATTCGCATTTATTTTTGACACCAGACCAACTG 3′
本发明具有如下优点：
其原料黄原胶价格低廉，性能稳定。所制备的黄原胶基微球粒径均一，表面光滑、绿色环保、无毒、可降解、生物相容性好，微球制备过程简单方便，无需多步重复步骤。本专利涉及方法纯化方法成本低、效率高、纯化特异性高、操作简单。
附图说明
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为黄原胶微球填料的扫描电镜图
图2为重组质粒pET24a-GFP-Linker-AFP酶切验证琼脂糖凝胶电泳图
图3为重组质粒pET24a-GFP-Linker-MiSBM酶切验证琼脂糖凝胶电泳图图4为GFP-linker-MiSBM基因表达的蛋白电泳(SDS-PAGE)
图5为GFP-linker-MiSBM蛋白、对照GFP蛋白在紫外光照下与填料结合情况对比图
图6为GFP-linker-MiSBM蛋白纯化前后、及切标签后蛋白电泳(SDS-PAGE)
图7为重组质粒pET24a-β-gal-Linker-MiSBM酶切验证琼脂糖凝胶电泳图图8为β-gal-linker-MiSBM基因表达的蛋白电泳(SDS-PAGE)
图9为β-gal-linker-MiSBM蛋白纯化前后、及切标签后蛋白电泳(SDS-PAGE)
具体实施方式
实施例1
一、黄原胶亲和层析材料(填料)的制备
1、将聚乙烯醇溶解在100℃的热水中，冷却至室温后，加入黄原胶(聚乙烯醇与黄原胶质量比1:1，总聚合物(聚乙烯醇和黄原胶之和)浓度为4％，w/v，g/mL)搅拌12h，得到均匀的无气泡溶液，作为水相；
2、将油相液体石蜡和8％w/w(液体石蜡质量的8％w/w)的乳化剂span80加入水相中(油相在水相油相混合物的体系中的体积20％)，将制备的油相加入水相中，用搅拌器以800rpm/min搅拌40min，缓慢加入0.15μL戊二醛(交联剂，占体系体积4×10-5％)和1ml 1MH2SO4用搅拌器以800rpm/min搅拌4h；
3、用热乙醇洗涤3次(使用90℃热乙醇，每次200mL)，去除油相，得到干燥的黄原胶微球。
4、使用扫描电镜对微球进行表面形貌表征，见图1。得到了粒度分布均匀，微球一致性好，体积平均粒径为205.422μm，比表面积平均粒径为199.199μm的黄原胶基微球。
二、重组标签蛋白的构建与表达(一)、PCR技术扩增目的基因GFP(GFP报告基因，NCBI数据库有基因序列，可以获得)、MiSBM甘油菌活化与pET28a-CBM6B-GFP质粒(吉林省库美生物科技有限公司)提取：将含有pET28a-CBM6B-GFP的甘油菌(可参考下述文献记载获得该质粒：大连工业大学郭小宇博士毕业论文，篇名《黄原胶降解酶系中糖结合单元及分子作用机制的研究》32-45页)应用平板划线法分别在LB固体培养基(含有30μg/mL卡那霉素kan)上活化，在37℃条件下培养12h；而后挑取单菌落至LB液体培养基中(含有30μg/mL卡那霉素kan)，在37℃，200rpm条件下培养12h，使用大连TaKaRa公司(宝生物工程(大连)有限公司)的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒从菌液中提取质粒(pET28a-CBM6B-GFP)。
(二)、利用RF克隆(分子克隆)技术将目的基因GFP与MiSBM标签插入质粒pET24a-GST-MxeGyrA-linker-AFP中(可参考下述文献记载获得该质粒：大连工业大学郑延蓉硕士毕业论文，篇名《利用新型抗冻蛋白-内含肽标签高效纯化重组酶蛋白》)，构建重组质粒，具体反应体系及反应条件如下：
1、设计引物
其中引物1和引物2分别为用于扩增GFP的上下游引物，引物3和引物4分别为用于扩增MiSBM的上下游引物。大字母代表分别与GFP、MiSBM互补的序列，小写字母代表GFP、MiSBM同源臂互补的序列。具体序列如下：
引物1：
5′aagaaggagatatacatatgATGAGTAAAGGAGAAGAAC 3′
引物2：
5′cccgtgatgcacattcgcatTTTGTAGAGCTCATCCATGC 3′
引物3：
5′gaccaccccgaccccgaccccgACGACCGCTGCTGTCAGCACCAGGC 3′
引物4：
5′gtggtggtggtgctcgagttaCTCGATGGCGGAGACCAGCTGAATG 3′
2、以上述DNA(pET28a-CBM6B-GFP)(步骤(一)提取获得的质粒)为模板，进行RF克隆：
①GFP扩增方案如下：
RF I反应体系(250μL)为：160μL无菌水，50μL 5×Primer STAR buffer，20μLdNTPs，引物1和2各10μL，500ng模板(pET28a-CBM6B-GFP)，2.5μL PrimeSTAR聚合酶(宝日医生物技术(北京)有限公司，编号R045Q)；
RF I反应条件：95℃5 min，95℃30 s，59.5℃30 s，72℃1 min(30个循环)，72℃10min，16℃结束反应。
②MiSBM扩增方案如下：
RF I反应体系(250μL)为：160μL无菌水，50μL 5×Primer STAR buffer，20μLdNTPs，引物3和4各10μL，500ng模板(pET28a-CBM6B-GFP)，2.5μL PrimeSTAR聚合酶；
RF I反应条件：95℃5 min，95℃30 s，59.5℃30 s，72℃1 min(30个循环)，72℃10min，16℃结束反应。
PCR产物经质量浓度1％琼脂糖电泳初步确证后，利用购自大连TaKaRa公司的DNA胶回收试剂盒进行纯化(此RF IPCR产物作为下步RFⅡ的引物)。(三)、表达载体pET24a-GFP-Linker-MiSBM的构建
1、上步纯化获得高纯度的PCR产物并以此作为RF II的引物，以质粒pET24a-GST-MxeGyrA-linker-AFP为模板进行RF II反应，构成表达载体pET24a-GFP-linker-AFP。测序正确后将其作为模板，以RF I胶回收的高纯度产物(MiSBM)做为RF II反应的引物，构成表达载体pET24a-GFP-linker-MiSBM。
(1)pET24a-GFP-linker-AFP扩增方案：
RF II反应体系(25μL)为：无菌水14.65μL，5μL 5×Primer STAR buffer，2.5μLRF I扩增产物(GFP,144ng/μL)，2.0μL dNTPs，0.6μL模板(pET24a-GST-MxeGyrA-linker-AFP,175ng/μL)，0.25μL PrimeSTAR聚合酶；
RF II反应条件为：98℃ 10s，65℃ 15s(每循环降温1℃)，72℃ 9min，20个循环，继续98℃ 10s，50℃ 15s，72℃ 9min，15个循环，16℃反应结束。
(2)pET24a-GFP-linker-MiSBM方案：
RF II反应体系(25μL)为：无菌水2.35μL，5μL 5×Primer STAR buffer，14μL RFI扩增产物(MiSBM,20ng/μL)，2.0μL dNTPs，1.4μL模板(pET24a-GFP-MxeGyrA-linker-AFP，81ng/)，0.25μL PrimeSTAR聚合酶；
RF II反应条件为：98℃ 10s，65℃ 15s(每循环降温1℃)，72℃ 9min，20个循环，继续98℃ 10s，50℃ 15s，72℃ 9min，15个循环，16℃反应结束。
2、为降解DNA甲基化的母本质粒，分别取上述RF II反应产物8.5μL加入1.5μL DpnI(20U/μL)(甲基化模板消化酶)，37℃消化10h。
3、分别取3μL消化产物电击转化至E.coli DH10B(大肠杆菌DH10B化学感受态细胞)中，在含卡那霉素抗性的LB固体培养基(卡那霉素的终浓度30μg/mL)上37℃培养12h，挑取阳性转化子，挑取单菌落接种至含卡那霉素抗性的LB液体培养基(卡那霉素的终浓度30μg/mL)中，37℃，200rpm，过夜培养。
4、分别提取(采用大连TaKaRa公司的DNA胶回收试剂盒和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒提取与胶回收的过程)
pET24a-GFP-linker-AFP、GFP-linker-MiSBM质粒进行酶切鉴定，
(1)重组质粒pET24a-GFP-linker-AFP的双酶切验证
用限制性酶Q.cutHpaⅠ、Q.cutBamHⅠ对重组质粒pET24a-GFP-linker-AFP进行酶切验证，酶切结果利用琼脂糖凝胶电泳(1％)验证(见图2)，条带大小与理论大小(1854bp、4955bp)相同的样品送至吉林省库美生物科技有限公司测序。
双酶切验证体系：9μL无菌水，1μg质粒，10×Q.cut buffer 1μL，Q.cut HpaⅠ1μL，Q.cutBamHⅠ1μL，37℃下反应15min。
(2)重组质粒pET24a-GFP-linker-MiSBM的酶切验证
用限制性酶Q.cutEcoRⅤ、Q.cutPstⅠ对重组质粒pET24a-GFP-linker-MiSBM进行酶切验证，酶切结果利用琼脂糖凝胶电泳(1％)验证(见图3)，条带大小与理论大小(2873bp、4155bp)相同的样品送至吉林省库美生物科技有限公司测序。
双酶切验证体系：9μL无菌水，1μg质粒，10×Q.cut buffer 1μL，Q.cutEcoRⅤ1μL、Q.cutPstⅠ1μL，37℃下反应15min。
测序结果显示序列正确，表达载体pET24a-GFP-Linker-MiSBM构建成功。(四)、重组质粒在大肠杆菌中的表达
1、将测序结果正确的质粒(表达载体pET24a-GFP-Linker-MiSBM)热击转化至大肠杆菌BL21(DE3)的热击感受态细胞中，涂布于kan抗性平板(卡那霉素抗性的LB固体培养基)(卡那霉素的终浓度30μg/mL)，筛选阳性克隆，提取(采用大连TaKaRa公司的DNA胶回收试剂盒和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒提取与胶回收的过程)质粒并进行酶切验证；
2、将筛选出的重组质粒的菌株(平板上挑取单菌落)接种于10mL LB液体培养基(含卡那霉素抗性，30μg/mL)锥形瓶中，37℃，200rpm摇床培养至OD600nm＝0.6，制备种子液；
3、随后进行扩培诱导，以种子液：发酵培养基等于1:50(v/v)的比例向800mL LLB液体培养基(含有30μg/mL卡那霉素Kan)中加入16mL种子液，在37℃，200rpm的条件下扩大培养至OD600nm＝0.6时，取出发酵液，向其中添加终浓度为0.5mmol/L(浓度可优化)的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)进行诱导蛋白质的表达，并将菌液放到16℃，200rpm的条件下发酵16-20h(在此为18h)；
4、收集菌液，将发酵液取出后装入250mL的离心杯中，在8000g的条件下离心5min以收集菌体，完成后弃上清。再以相同离心条件进行水洗离心，以及Native purificationbuffer缓冲液(配制方法：7g NaH2PO4，29.2g NaCl，dd H2O定容至1L)重悬，取50mL重悬液进行功率为500W，工作时间5s，间歇时间2s，总时间5-15min(在此为12min)的超声破碎(工作和间歇交替进行)；
破碎后10,000rpm，4℃，离心30min，收集上清液，得到含有目的蛋白的粗酶液。
5、测定含有目的蛋白的粗酶液中蛋白质的浓度并进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE))，如图4(泳道M为蛋白maker，A泳道为粗酶液，B泳道为纯化结果)。结果表明，重组蛋白GFP-Linker-MiSBM正确表达，大小为65KDa。
三、蛋白质纯化体系的建立
1、平衡填料：将上清液(粗酶液)透析至pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液中(将上清液装入透析袋中(截留分子量3500Da)，用缓冲液进行透析)，得到透析袋中蛋白溶液；
取5mL上述步骤一中制备的黄原胶填料置于直径为1cm的10mL纯化柱中用300mL(可为100mL～500mL)PBS缓冲液平衡填料；
2、填料与重组蛋白结合进行纯化：打开纯化柱的下部，缓慢将填料柱上表面以上的缓冲液放出至填料上表面露出，沿着纯化柱内壁用移液枪枪头缓慢加入透析后透析袋中蛋白溶液(含20mg蛋白，其体积＜2mL)再次打开纯化柱下部，待蛋白溶液完全进入填料中以后，室温结合2-24h(在此为12h)；
3、采用以下二种方式获得纯化产物：
第一种：采用流动泵，配制0.9mMNaCl(可为0.7mM-1.0mM，优选0.8 -0.9mM)溶液，以2ml/min的流动速度对已与填料结合的蛋白进行洗脱，洗脱10个柱体积，(柱体积为10mL)，可将蛋白从黄原胶基填料上洗脱纯化，得到纯化后产物，蛋白GFP-Linker-MiSBM。
第二种：在此或者也可采用可控自断裂反应将蛋白进行切割：配制断裂反应缓冲液：含终浓度40mmol/L DTT(二硫苏糖醇)、终浓度1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的pH8.5的50mmol/L Tris-HCl缓冲液。采用流动泵，以2ml/min的流动速度将断裂反应液泵入纯化柱中，其加入体积为：将加入纯化柱中上述步骤2中透析后透析袋中蛋白溶液：断裂反应缓冲液＝4：1(v/v)，在25℃下孵育6-24h(在此为24h)将目的融合蛋白与标签蛋白切割，最后冲10个柱体积PBS缓冲液，得到断裂后纯化产物，蛋白GFP；
4、纯化效果的验证：
(1)初步验证：通过紫外灯光照射上述步骤2中产物，获取填料与蛋白的结合情况，若蛋白GFP-Linker-MiSBM与填料结合则填料呈现绿色荧光，若无结合则呈现填料本身颜色白色，(理论现象和结果)如图5；结果表明：看到了绿色荧光，说明蛋白GFP-Linker-MiSBM与填料相结合了；
(2)将步骤1中透析袋中蛋白溶液与步骤3中纯化蛋白GFP-Linker-MiSBM及切标签后蛋白GFP分别进行SDS-PAGE，对比验证纯化效果，如图6，泳道M为蛋白maker，A泳道为粗酶液，B泳道为纯化结果，C为切标签后结果，得到纯化后的蛋白GFP-Linker-MiSBM(理论大小65KDa)，以及切标签后的目的蛋白GFP(理论大小27KDa)该结果表明，该纯化方法具有良好的纯化效果，且标签可自由去除。
(3)纯化效率的计算：测定可溶性上清蛋白浓度，与黄原胶基微球结合后，测定纯化后蛋白浓度，并根据公式
Figure BDA0004226125720000151
(qe为达到吸附平衡状态时对蛋白质的吸附量，mg/g；co为蛋白质溶液的初始浓度，mg/mL；
ct为达到吸附平衡状态时蛋白质溶液的浓度，mg/mL；v为用于吸附的蛋白质溶液体积，μL；
mi为黄原胶基微球的质量，mg；)。计算得到60mg/g的吸附量，结果表明，该自制填料对含标签的目的蛋白具有良好的吸附性，该纯化方法具有良好的纯化效果。
实施例2
选取β-半乳糖苷酶(116.48KDa)作为目的蛋白，构建重组质粒pET24a-β-gal-Linker-MiSBM，并于大肠杆菌中表达，再使用本专利的纯化系统进行纯化以验证系统纯化效率。
过程和条件同实施例1，与实施例1的不同之处在于重组质粒的构建部分，具体为：
1、利用RF克隆技术将目的基因GFP替换成β-gal(β-gal报告基因，NCBI数据库有基因序列，可以获得)构建重组质粒，需要活化甘油菌，提取β-gal-T质粒。(对应实施例1中步骤二中的(二)、1)
2、设计引物
大字母代表分别与β-gal互补的序列，小写字母代表β-gal同源臂互补的序列。具体序列如下：
引物55′ttaagaaggagatatacatatgATGACCATGATTACGGATTCAC 3′
引物65′gtgatgcacattcgcat TTATTTTTGACACCAGACCAACTG 3′
(对应实施例1中步骤二、(二)、1)
3、RFⅠ反应体系：100ng模板β-gal-T，引物1与引物2各4μL，Prime STAR聚合酶1μL，5×PS Buffer 20μL，dNTPs 8μL，ddH2O补齐至100μL。RF I反应条件：95℃5 min，95℃30 s，退火温度℃30 s，72℃3 min(30个循环)，72℃10 min，16℃结束反应。(对应实施例1中步骤二、(二)、2)4、RF II反应体系：模板pET24a-GFP-Linker-MiSBM，高纯度的PCR产物PrimeSTAR聚合酶0.25μL，5×PS Buffer 5μL，dNTPs 2μL，ddH2O补齐至25μL。
RF II反应条件：95℃ 5min，94℃ 1min，65℃ 1min(每循环降温1℃)，68℃延伸时间min，15个循环，继续94℃ 1min，55℃ 1min，68℃ 1-min，20个循环，68℃ 15min，16℃反应结束。(对应实施例1中步骤二、(三)、1)
提取质粒进行酶切鉴定，酶切体系(10μL)：质粒DNA 2μL，限制性内切酶EcoRⅤ、Pst I各0.5μL，10×Q.cut buffer 1μL，补水至10μL，37℃条件下下孵育15min。经琼脂糖凝胶电泳分析检验样品的酶切产物，酶切后的正确大小为1134bp和8255bp(见图7)。将酶切正确的质粒进行测序鉴定(由吉林库美生物进行)，测序结果显示序列正确，表达载体pET24a-β-gal-Linker-MiSBM构建成功。(对应实施例1中步骤二、(三)、4)并诱导表达得到目的蛋白粗酶液β-gal-Linker-MiSBM，理论大小：157KDa，如图8(泳道M为蛋白maker，A泳道为粗酶液，B泳道为纯化结果)(对应实施例1中步骤二、(四)、4)
5、纯化效果的验证：将纯化后并且切除标签的蛋白与上清液进行SDS-PAGE，对比验证纯化效果，如图9(，泳道M为蛋白maker，A泳道为粗酶液，B泳道为纯化结果，C泳道为切标签后结果)。得到纯化后的蛋白β-gal-Linker-MiSBM(理论大小157KDa)，以及切标签后的目的蛋白β-gal(理论大小117KDa)该结果表明，该纯化方法具有良好的纯化效果，且标签可自由去除。(对应实施例1中步骤三、4、(2))。
对比例1
过程和条件同实施例1，与实施例1的不同之处在于，填料的材料和制备过程不同，具体过程为：向容器中加入5g黄原胶、10g蒸馏去离子水混匀，配制4mL 50％的NaOH水溶液(w/w)和6mL ECH(环氧氯丙烷)的混合物；再加入50mL含有3g聚乙醇-聚丙二醇-聚乙二醇的氯苯，用机械搅拌(240rpm/min)制成W/O悬浮体系。将体系在70℃恒温水浴中2h，然后将温度上升到90℃，再持续5h。0.22μm滤膜抽滤过滤，用乙醇和去离子水清洗。最后，将微球在40℃的真空箱中干燥24h。
制备的微球无法吸附带有MiSBM标签的蛋白。
结果：产物呈不规则微球，且本方案中含有氯苯，是有毒性的危化品，不如本专利方案所用材料绿色。按照实施例1中的，三、4、(1)所述方法用紫外灯对材料照射，结果显示该填料进行不能够吸附目标蛋白，即本专利所用含绿色荧光的蛋白无法吸附于该填料表面，不呈现绿色荧光。
对比例2
过程和条件同实施例1，与实施例1的不同之处在于，填料的材料和制备过程不同，具体过程为：取黄原胶取0.4g、7wt％SDS(十二烷基硫酸钠)溶解于0.9M 10mL NaCl溶液中，剧烈搅拌12h至完全溶解；称量4.0gAM(聚丙烯酰胺)和0.381gSMA(甲基丙烯酰酸硬脂)加入该混合溶液中，于45℃下搅拌1h后再加入0.044gAPS(过硫酸铵)和0.0184gCaSO4·2H2O后，将溶液倒入模具70℃下放置48h以进行聚合。
制备的物质呈块状，不能形成微球，载量不高。
结果：产物为有高弹性的白色海绵块状物，按照实施例1中的，三、4、(1)所述方法用紫外灯对材料照射，目的蛋白(带绿色荧光)仅吸附在块状物表面，且在水中轻晃即散，可见结合不够牢靠，按照实施例1，三、4、(3)所述方法计算其吸附能力仅为0.1mg/g不能达到本专利微球对蛋白的吸附量。
对比例3
过程和条件同实施例1，与实施例1的不同之处在于，填料的材料和制备过程不同，具体过程为：将0.2g黄原胶溶解在蒸馏水中过夜搅拌，向其中加入0.568g丙烯酰胺搅拌至溶解，再加入5.7mg过硫酸铵。将所得溶液使用微波炉微波辐照，丙酮处理黄原胶，并用甲醇和水的混合物洗涤，然后将其在40℃的烘箱中干燥培养24h。
结果：制备的物质呈胶状，不能形成微球，不能作为填料使用。
对比例4
过程和条件同实施例1，与实施例1的不同之处在于，填料的材料和制备过程不同，具体过程为：向容器中加入5g黄原胶、10g蒸馏去离子水混匀，配制4mL50％的NaOH水溶液(w/w)和6mL ECH(环氧氯丙烷)的混合物；再加入50mL含有3g span的氯苯，用机械搅拌(240rpm/min)制成W/O悬浮体系。将体系在70℃恒温水浴中2h，然后将温度上升到90℃，再持续5h。0.22μm滤膜抽滤过滤，用乙醇和去离子水清洗。最后，将微球在40℃的真空箱中干燥24h。
制备的微球无法吸附带有MiSBM标签的蛋白，且使用的氯苯有毒性。结果：按照实施例1中的，三、4、(1)所述方法用紫外灯对材料照射，结果显示该填料进行不能够吸附目标蛋白，即本专利所用含绿色荧光的蛋白无法吸附于该填料表面，不呈现绿色荧光。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (4)

1.一种蛋白质纯化的方法，其特征在于：
1)通过RF克隆，将目的基因(可编码目的融合蛋白)与MiSBM标签基因(可编码标签蛋白MiSBM)插入表达载体中，构建重组质粒；重组质粒中目的基因GFP与标签蛋白MiSBM间通过MxeGyrA-linker连接；
2)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的热击感受态细胞中，筛选出阳性克隆，得到重组菌株；
3)将筛选出的重组质粒的菌株进行培养，并进行目的融合蛋白的诱导表达；
收集菌体，破碎后分离，收集含有目的融合蛋白的上清液；
4)将上清液与由质量比为(1:1-1:4，优选1：1-2)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料接触，室温结合1-24h，优选1-2h；
5)采用0.7mM-1.0mM NaCl(优选0.8-0.9mM)溶液，可将蛋白从黄原胶基填料上洗脱纯化，得到纯化产物；
或，采用MxeGyrA-linker断裂反应液，将目的融合蛋白与标签蛋白MiSBM切割，从黄原胶基填料上分离下来目的融合蛋白，得到纯化产物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
质量比为(1:1-1:4)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料的制备过程，包括以下步骤：
S1：将聚乙烯醇溶解在70-100℃的热水中，冷却至室温后，加入黄原胶搅拌5-16h，得到均匀的无气泡溶液，作为水相；
黄原胶与聚乙烯醇质量比为(1:1-1:4)(优选1：1-2)；且水相中总聚合物(聚乙烯醇与黄原胶质量之和)浓度为1-4％(优选4％)，w/v，g/mL；
S2：将油相和乳化剂加入水相中，用搅拌器以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h；
油相为液体石蜡、甲苯、环己烷中的一种或二种以上，乳化剂为1-8％(优选8％)w/w(占油相)span 80；水相在体系中的体积(1-40％，优选30％)；
S3：缓慢加入4×10-6-4×10-4％(占体系体积)戊二醛，及1-2mL 1-2M硫酸，继续以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h；
S4：用80-95℃热乙醇洗涤，去除油相，得到黄原胶微球；
或，用溶剂和蒸馏水分别洗涤，去除油相；然后将制备的微球在室温～50℃(优选25℃)下干燥1-24h(优选1h)，得到黄原胶微球；
所述清洗微球的溶剂可选择苯、乙醚、氯仿、二硫化碳中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
表达载体可为下述载体中的一种或二种以上，
pColdⅡ大肠杆菌表达载体、pET-21a(+)大肠杆菌表达载体、pET-22b(+)大肠杆菌表达载体、pET-24a(+)大肠杆菌表达载体、pET-28a(+)大肠杆菌表达载体、pET-30a(+)大肠杆菌表达载体、pET-32a(+)大肠杆菌表达载体。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
大肠杆菌BL21(DE3)可采用如下所述菌中的一种或二种以上替代；Rosetta(DE3)、T7Express、BLR(DE3)、Tuner(DE3)、Lemo21(DE3)。
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