CN116375819A - 一种鸡传染性支气管炎s蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

一种鸡传染性支气管炎s蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，公开一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。本发明通过截取鸡传染性支气管炎病毒保护性抗原S蛋白的胞外区，构建含有S胞外区基因的穿梭载体，转染sf9昆虫细胞，拯救重组病毒，并通过hi5细胞进行分泌表达，通过亲和层析进行纯化，获得S蛋白抗原。本试剂盒使用昆虫细胞表达系统表达的蛋白包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场应用前景。

Description

一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，AIB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，引起呼吸道、肾脏和生殖道等部位产生病理变化，致使感染发病鸡饲料报酬比降低、产蛋率低而造成巨大经济损失。IBV对所有品种、各年龄段和不同性别的鸡均有易感性，特别是4周龄前的雏鸡最易发病。
IBV是一种变异性很强的冠状病毒，传播迅速，血清型众多，不同血清型之间缺乏交叉保护作用。IBV基因组由结构蛋白和非结构蛋白组成，结构蛋白分别由纤突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、小包膜蛋白(Small Envelope，E)和核蛋白(Nucleocapsid，N)组成，这些结构蛋白在病毒吸附、复制和转录过程发挥不同的作用。S蛋白由S1和S2两种蛋白组成，S1蛋白暴露后可诱导机体产生中和病毒的抗体以及血凝抑制抗体，因此，S1蛋白是IBV最主要的免疫原。
疫苗免疫是预防和控制IB发生的最有效方法，主要以接种灭活和弱毒疫苗为主，弱毒疫苗的免疫效果优于灭活疫苗，而免疫后抗体水平的高低可直接对疫苗的免疫效果进行评价，并直接关系到免疫鸡群对鸡传染性支气管炎病毒的抵抗力。因此，快速准确的检测鸡群中抗体水平，对了解鸡群中IB的流行情况、适时调整免疫程序，有效预防IB的流行具有重要意义。
在IBV抗体检测上，酶联免疫吸附试验(ELISA)因其简单、敏感、高效、经济、适于大规模使用等特点广泛被应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白S抗原作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测鸡血清中是否含有鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体。
本发明提供一种鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原，所述结构蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供，编码上述结构蛋白抗原的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供含有上述核苷酸序列的生物材料，所述生物材料包括表达盒、重组载体、昆虫细胞；所述重组载体为质粒或病毒载体。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述的结构蛋白抗原或上述的核苷酸序列或上述的生物材料在检测鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体或制备鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白检测试剂盒中的应用。
本发明提供一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗；所述酶联反应板包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述鸡传染性支气管炎病毒S蛋白溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100ng抗原，2～8℃放置8～12小时，使抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
所述阳性对照血清为所述鸡传染性支气管炎病毒人工感染后采集的鸡血清；所述阴性对照血清为无特定病原体(SPF)(无鸡传染性支气管炎病毒病原体)的鸡血清。
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡IgG抗体。
在本发明提供的鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒中，所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为四甲基联苯胺溶液，使用时，底物液A与底物液B以1:1的比例混合；所述终止液为硫酸溶液。
具体地，所述底物液A为含0.06％(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明还提供上述鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括：平衡、配液、设定、待测标本预稀释、加样、温育、洗板、加酶、温育、洗板和显色。
在本发明提供的使用方法中，阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效；阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效；临界值＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值；
待测样本测定的OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检样本测定的OD450nm值<临界值者判为阴性。
本发明还提供鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原的制备方法，本发明所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备鸡传染性支气管炎病毒的保护性抗原。本发明所述的昆虫细胞为sf9和hi5细胞。
本发明所提供的制备方法，包括：将SEQ ID NO.2所述的基因序列进行人工合成目的基因片段，通过同源重组方式连至pFastBac1载体中，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性穿梭载体，将穿梭载体转化到DH10Bac感受态细胞，蓝白斑筛选阳性重组Bacmid；
阳性Bacmid转染无血清悬浮培养的sf9细胞，收获培养上清，即为P0代病毒；向sf9细胞按1％-1‰比例接种P0代重组杆状病毒，获得P4或P5代病毒；向hi5细胞按1％-1‰比例接种P4或P5代病毒；
收集细胞上清，水性滤膜过滤，细胞上清结合His柱，洗脱后获得鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原；
作为本发明的一个具体实施方式，本发明提供的鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原的制备方法，包括：
(1)截取其胞外区21-569位氨基酸基因序列，所得序列如SEQ IDNO.2所述，将SEQID NO.2所述的基因序列进行人工合成，合成的目的基因片段，通过同源重组方式连至pFastBac1载体中，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性穿梭载体。将穿梭载体转化到DH10Bac感受态细胞，蓝白斑筛选阳性重组Bacmid。接种白斑到含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB液体培养基中过夜培养。收集菌液，提取重组穿梭质粒Bacmid DNA并对重组Bacmid进行测序鉴定。
(2)取无血清悬浮培养的sf9细胞，细胞密度为2.5×106cells/ml，铺6孔板，用阳性Bacmid进行转染，转染后72-96h当细胞活率降至20％时收获培养上清，即为P0代病毒。用sf9无血清悬浮培养基将sf9细胞培养至5×106cells/ml，用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.5×106cells/ml，按1％-1‰比例接种重组杆状病毒，培养至72-96h收获上清，按同样方法连续传4-5代。取无血清悬浮培养的hi5细胞，细胞密度为2.5×106cells/ml，按1％-1‰比例接种重组杆状病毒，培养至72-96h收获上清。
(3)将收获的上清结合His亲和层析柱，结合完毕后用洗脱液洗脱，将洗脱的样品制样进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白纯度，并通过分光光度计测定洗脱蛋白的浓度。
本发明还请求保护使用上述鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒进行鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体检测的方法。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用生物信息学方法对鸡传染性支气管炎具有免疫原性的结构蛋白S基因进行精确分析，截取相应氨基酸的核苷酸序列，并进行密码子优化。本发明所提供的氨基酸序列为IBV的免疫原性抗原区域，具有灵敏性高、特异性强的优点。
(2)本发明所提供试剂盒中使用的包被抗原是昆虫细胞表达纯化的蛋白，杂蛋白含量少，纯度高，进一步提高了检测鸡传染性支气管炎结构蛋白抗体的效率。
(3)本发明所提供的试剂盒采用昆虫细胞表达系统表达IBV S结构蛋白作为抗原包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测鸡传染性支气管炎病毒产生的结构蛋白抗体。实验结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
附图说明
图1为本发明实施例1中健康细胞与病变细胞对比结果图，其中，左图为健康细胞图，右图为病变细胞。
图2为本发明实施例1中重组蛋白的Western Blot检测结果图。
图3为本发明实施例1中重组蛋白的亲和层析HistrapTMHP和SDS-PAGE检测图。
图4为本发明实施例1中分子筛Hiload16/600SuperdexTM200PG和SDS-PAGE检测图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备
一、穿梭载体的设计与构建
采用生物信息学方法对鸡传染性支气管炎具有免疫原性的结构蛋白S基因进行精确分析，根据实验室分离到的IBVQX流行毒株S基因序列，截取其21-569位氨基酸对应的核苷酸序列，其N端加入起始密码子ATG，末端加入6×His标签CATCATCATCATCACCAC及终止密码子TAA序列，进行昆虫细胞密码子优化，送至生物公司进行合成，并通过同源重组的方式连接至pFastBac1载体中，获得pFastBac1-S。二、阳性Bacmid质粒的筛选及重组杆状病毒获得
1、取穿梭载体pFastBac1-S 5μg，转化DH10Bac感受态，冰上孵育30min，42℃热激90s，冰上孵育5min，加入无抗LB培养基，37℃摇床190rpm培养4h，取10μl菌液涂布三抗平板(LB平板含：50μg/ml卡那霉素kanamycin,7μg/ml庆大霉素gentamicin,10μg/ml四环霉素tetracycline,100μg/ml Bluo-gal,和40μg/ml IPTG.)，37℃恒温培养箱培养48h，待蓝白斑明显后，挑取白斑加入三抗LB培养基进行过夜培养。
2、收集菌液，12000rpm离心收集菌体，采用异丙醇沉淀法提取重组Bacmid，用分光光度计检测Bacmid质粒浓度，重组Bacmid质粒浓度为4000ng/μl。
3、准备sf9细胞，待其密度长至2.5×106/ml，铺6孔板，每孔细胞个数为1×106个，取重组Bacmid质粒2.5μg和5μg两个浓度，用CellfectionII Reagent进行转染，转染后置于27℃恒温培养箱培养72-96h，待细胞膨大，折光率降低，收获上清作为P0代病毒，病变结果如图1所示。
三、重组杆状病毒的扩繁及蛋白的表达
1、准备悬浮培养的sf9细胞，待其密度长至2.5×106/ml，按0.1％比例接种P0代病毒，置于27℃，120rpm悬浮培养，72-96h后待细胞膨大，折光率降低，收获上清作为P1代病毒，并按此方法连续传至4代-5代，4代-5代作为蛋白表达用种毒。
2、准备悬浮培养的hi5细胞，待其密度长至2.5×106/ml，按0.1％比例接种P4或P5代病毒，置于27℃，120rpm悬浮培养，72-96h后待细胞膨大，折光率降低，收获上清，用抗His标签抗体进行Western Blot检测蛋白表达情况，结果显示重组S蛋白已正确分泌表达，大小在72KDa左右，如图2所示。
四、重组S蛋白的纯化
1、hi5细胞接种重组杆状病毒72-96h，待细胞膨大，折光率降低，收获培养物，8000rpm离心30min，收集细胞上清，用0.22μm水性滤膜过滤，除去小的细胞碎片，备用。
2、用超纯H2O清洗His预装柱，清洗5个柱体积，然后用结合Buffer处理预装柱，5个柱体积，处理完毕后，将抽滤的细胞上清结合His柱，直至结合完毕，然后用洗脱Buffer进行洗脱，洗脱完毕的重组蛋白制样，进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果显示，蛋白已正确表达，如图3和图4所示，经分光光度计检测，其表达水平为45mg/L。
实施例2鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制备
鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括：
(1)包被有鸡传染性支气管炎病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。
(2)阳性对照血清：是以鸡传染性支气管炎病毒人工感染后采集鸡血清，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。
(3)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)(无鸡传染性支气管炎病毒病原体)鸡血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。
(4)酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡IgG(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号D110205-0100)作为原液进行1:5000倍稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。
(5)样品稀释液：为含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。
(6)底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)。
(7)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(8)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(9)20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。
根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板(2块，96孔/块)，用于血清样品的稀释。
其中，包被有鸡传染性支气管炎病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：将实施例1制备的纯化抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100ng抗原，2～8℃放置8～12小时，使抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。实施例3鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性试验
一、鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法
1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用，液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。
5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡IgG抗体。
9、温育：置37℃温箱，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
11、显色：每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
12、检测结果的判定：测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
(1)阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。
(2)阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。
(3)临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值。
待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。
二、对已知阳性血清的敏感性试验
使用实施例2的方法制备了五批鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒(批次ZMIBV-01、ZMIBV-02、ZMIBV-03、ZMIBV-04、ZMIBV-05)，各批次的包被抗原分别为不同批次纯化的S抗原。分别依照上述鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对鸡传染性支气管炎活疫苗(乾元浩生物股份有限公司豪威生物药厂提供)免疫后鸡血清50份进行敏感性试验，实验结果见表1，本发明的鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒ZMIBV-01、ZMIBV-02、ZMIBV-03、ZMIBV-04、ZMIBV-05分别检测出49份、48份、49份、49份、49份，结果表明本试剂盒对50份已知阳性血清的敏感性依次为98％、96％、98％、98％、98％。
表1鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性检测结果
试剂盒批号 检出率 敏感性
ZMIBV-01 49/50 98％
ZMIBV-02 48/50 96％
ZMIBV-03 49/50 98％
ZMIBV-04 49/50 98％
ZMIBV-05 49/50 98％
三、最低检测限量试验
选取鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体阳性的鸡血清，分别进行1:20、1:100、1:200、1:400、1:800倍稀释，使用实施例2制备的五批鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒ZMIBV-01、ZMIBV-02、ZMIBV-03、ZMIBV-04、ZMIBV-05，依照上述鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对稀释鸡血清进行检测，结果表明，本发明试剂盒可以检测到1:400倍稀释的阳性血清。表2中，阳性对照：是以鸡传染性支气管炎病毒人工感染后采集鸡血清，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。阴性对照：是无特定病原体(SPF)鸡血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。临界值(Cut-off值)＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值。
表2鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的最低检测限结果
Figure BDA0004050410860000111
实施例4鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验
使用实施例2中的五批试剂盒依照实施例3中所述的鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对50份鸡阴性血清(乾元浩生物股份有限公司豪威生物药厂提供)、2份禽流感(AI)阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)、2份新城疫(ND)阳性血清、2份鸡马立克氏病(MD)阳性血清、2份鸡传染性法氏囊(IBD)阳性血清均购自中国兽医药品监察所，分别进行检测。
试剂盒的特异性检测结果如下表(表3)显示，其中表3为一个批次的结果。对50份鸡阴性血清的检测结果显示，ZMIBV-001、ZMIBV-002、ZMIBV-003、ZMIBV-004、ZMIBV-005试剂盒的特异性均为100.0％。对2份禽流感(AI)阳性血清、2份新城疫(ND)阳性血清、2份鸡马立克氏病(MD)阳性血清、2份鸡传染性法氏囊(IBD)阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此五个试剂盒对这8份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。
表3鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果
Figure BDA0004050410860000112
Figure BDA0004050410860000121
实施例5鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒保存期试验
将实施例2制备的试剂盒分别置于4℃和室温条件下保存，分别在第1、第2、第3、第4、第5个月后，使用试剂盒对现有阳性血清样品和阴性血清按照实施例3中的使用方法进行检测，测试试剂盒的保存期。
经过对试剂盒进行检测，4℃条件下存放，阳性率稳定，阳性样品和阴性样品的检测结果与先前保持一致，而室温条件下放置的试剂盒阳性率显著下降。这说明本发明制备的基于鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的ELISA抗体检测试剂盒在4℃条件下可以稳定保存，在室温条件下保存超过一个月其有效性显著降低，结果见表4。
表4鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒保存期试验结果
Figure BDA0004050410860000131
Figure BDA0004050410860000141
通过上述实施例可以证明，本发明提供的一种鸡传染性支气管炎病毒S蛋白ELISA抗体检测试剂盒，具有使用简单方便、敏感性高且特异性强的优点，可以进行批量检测IBV抗体，是IBV抗体检测的可靠工具。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白，其特征在于，所述结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述结构蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.含有权利要求2所述核苷酸序列的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、重组载体、昆虫细胞；
所述重组载体为质粒或病毒载体。
4.权利要求1所述的结构蛋白或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的生物材料在检测鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体或制备鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白检测试剂盒中的应用。
5.一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗；所述酶联反应板包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.权利要求5所述鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述结构蛋白溶于碳酸盐溶液，然后加到酶联反应板，2～8℃放置8～12小时，使抗原与酶联反应板充分结合，向反应孔中加入含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后保存。
7.权利要求5所述的鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：平衡、配液、设定、待测标本预稀释、加样、温育、洗板、加酶、温育、洗板和显色。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，
阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效；阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效；临界值＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值；
待测样本测定的OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检样本测定的OD450nm值<临界值者判为阴性。
9.权利要求1所述结构蛋白抗原的制备方法，其特征在于，包括：将SEQ ID NO.2所述的基因序列进行人工合成目的基因片段，通过同源重组方式连至pFastBac1载体中，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性穿梭载体，将穿梭载体转化到DH10Bac感受态细胞，蓝白斑筛选阳性重组Bacmid；
阳性Bacmid转染无血清悬浮培养的sf9细胞，收获培养上清，即为P0代病毒；向sf9细胞按1％-1‰比例接种P0代重组杆状病毒，获得P4或P5代病毒；向hi5细胞按1％-1‰比例接种P4或P5代病毒；
收集细胞上清，水性滤膜过滤，细胞上清结合His柱，洗脱后获得鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原。
10.一种鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，使用权利要求5-6任一项所述的鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，进行鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体的检测。
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