CN116355804A - 一种治疗多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌及其应用，所述罗伊氏乳杆菌的具体名称为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR10，保藏编号为CGMCC No.24409，能够使患有多囊卵巢综合征的小鼠体内激素水平回调至正常水平，回升胆汁酸含量，并缓解多囊卵巢综合征的相关症状，且其效果显著好于其他菌株，可用于制备具有相应功效的药物。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种治疗多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌及其应用。
背景技术
多囊卵巢综合征(PCOS)是一种常见的异质性内分泌疾病，在全球育龄妇女中发病率很高。这种疾病是女性不孕症的主要原因，其定义为卵巢功能障碍、卵泡成熟障碍和卵巢激素调节障碍的组合，表现为高雄激素血症和黄体生成素(LH)分泌过多。PCOS患者表现为囊性卵泡积聚，卵巢基质厚度增加，黄体减少，并伴有卵巢颗粒细胞排列松散。肠道微生物群已被证明是维持宿主健康的关键要求，包括代谢稳态、免疫和肠道屏障功能。
肠道微生物群的生态失调与PCOS的进展有关。与健康女性相比，PCOS患者肠道微生物多样性降低，并伴随着特异性相对丰度的变化拟杆菌门和厚壁菌门。肠道微生物群的改变与PCOS女性高雄激素血症相关，这暗示了睾酮在肠道微生物群结构中的潜在作用。胆汁酸是肝脏中产生的胆固醇衍生的内源性代谢物。初级胆汁酸是胆固醇分解代谢的直接产物，充当来自肠道菌群的酶的底物，然后转化为次级胆汁酸，通过肠肝循环返回肝脏。胆汁酸、肠道微生物群和代谢紊乱之间的联系意味着胆汁酸可以参与调节与PCOS相关的代谢紊乱。KEGG分析表明，PCOS妇女胆汁酸代谢途径发生改变。PCOS个体的循环结合初级胆汁酸水平增加，这与高雄激素血症呈正相关。这些数据表明，改善肠道微生物群和胆汁酸代谢可能是治疗PCOS的一种有前途的方法。
益生菌、益生元或合生元的营养干预是改善肠道微生物群和代谢疾病的有效方法，但本领域对于益生菌、肠道微生物群-胆汁酸轴和PCOS之间的关系仍知之甚少，是否能够通过益生菌来缓解PCOS症状，这一点仍需本领域技术人员进行进一步探究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提一种治疗多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌的具体名称为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR10，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24409，保藏日期为2022年02月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明提供一种罗伊氏乳杆菌LR10菌剂，所述罗伊氏乳杆菌LR10菌剂由包括如下步骤的方法制得：将如第一方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10接种于培养基中于35-40℃下培养，即得。
上述35-40℃中的具体数值例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地，所述培养基包括MRS培养基。
优选地，所述MRS培养基中的组分以浓度计包括蛋白胨8-12g/L、牛肉膏8-12g/L、葡萄糖15-20g/L、乙酸钠1-3g/L、酵母粉2-6g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、K2HPO4 1-3g/L、MgSO4 0.02-0.2g/L、MnSO4 0.01-0.1g/L或半胱氨酸氨酸盐0.1-1g/L中的任意一种或至少两种的组合。
上述8-12g/L中的具体数值例如8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L等。
上述15-20g/L中的具体数值例如15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L等。
上述1-3g/L中的具体数值例如1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.7g/L、2g/L、2.2g/L、2.5g/L、2.7g/L、3g/L等。
上述2-6g/L中的具体数值例如2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L等。
上述0.02-0.2g/L中的具体数值例如0.02g/L、0.04g/L、0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.14g/L、0.16g/L、0.18g/L、0.2g/L等。
上述0.01-0.1g/L中的具体数值例如0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L等。
上述0.1-1g/L中的具体数值例如0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L等。
优选地，所述培养的时间为18-24h，例如18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h等。
优选地，所述培养后还包括离心，收集菌体。
优选地，所述离心的转速为700-1500rpm，离心的时间为5-15min。
优选地，所述收集菌体后还包括与保护剂混合，所述保护剂包括甘油。
第三方面，本发明提供一种复合菌剂，所述复合菌剂中包括如第一方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10和格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG08，所述格氏乳杆菌LG08的保藏编号为CGMCC No.16131，保藏日期为2018年07月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
优选地，所述罗伊氏乳杆菌LR10与格氏乳杆菌LG08的活菌数之比为(1-9):(1-3)。
上述(1-9)中的具体数值例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9等。
上述(1-3)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3等。
优选地，所述复合菌剂中还包括保护剂，所述保护剂包括甘油。
第四方面，本发明提供如第一方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10、如第二方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂或如第三方面所述的复合菌剂在制备治疗/缓解多囊卵巢综合征的药物中的应用。
第五方面，本发明提供如第一方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10、如第二方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂或如第三方面所述的复合菌剂在制备调节激素紊乱的药物中的应用，所述激素包括睾酮、黄体生成素、孕酮、雌二醇或催乳素中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述调节激素紊乱包括降低睾酮水平、降低黄体生成素水平、提高孕酮水平、提高雌二醇水平或提高催乳素水平中的任意一种或至少两种的组合。
所述调节激素紊乱的药物可以以口服或注射的方式施加于动物模型中，用于进行与睾酮、黄体生成素、孕酮、雌二醇或催乳素相关的基础研究中。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10、如第二方面所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂或如第三方面所述的复合菌剂在制备促进胆汁酸分泌的药物中的应用，所述胆汁酸包括石胆酸、牛磺胆酸或牛磺鹅去氧胆酸中的任意一种或至少两种的组合。
所述促进胆汁酸分泌的药物可以以口服或注射的方式施加于动物模型中，用于进行与石胆酸、牛磺胆酸或牛磺鹅去氧胆酸分泌相关的基础研究中。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明首次筛选得到一株可用于治疗多囊卵巢综合征的菌株：罗伊氏乳杆菌LR10，并通过动物实验对其功效进行了验证：
胆汁酸代谢途径是肠道微生物群和PCOS之间的潜在机制。肠道微生物群具有多种代谢功能，包括合成、代谢和重吸收胆汁酸的能力。通过建立动物模型试验对胆汁酸的定量分析发现，补充益生菌可逆转PCOS小鼠的胆汁酸水平。患有多囊卵巢综合征的小鼠体内各激素含量发生了严重失衡，出现大量囊状卵泡，黄体数减少，且肝脏内各胆汁酸的含量发生了大幅度降低；采用LR10干预，能够显著回调激素水平(下调总睾酮及黄体生成素的含量，上调孕酮、雌二醇、催乳素的含量)，各胆汁酸(石胆酸、牛磺胆酸钠盐、牛磺鹅去氧胆酸)的含量也得到了显著回升，多囊病变中的囊状卵泡数显著降低，黄体有所增加，多囊卵巢综合征的相关症状得到了显著缓解，且其效果显著好于其他菌株。
另外，LG08对于缓解多囊卵巢综合征也有比较显著的效果，但稍差于LR10，不过将其与LR10复配后，却取得了比LR10单菌株更好的效果，这可能是因为两种菌株能够互相促进彼此的生长代谢活动，因此在回调激素水平、提高肝脏中胆汁酸含量、治疗多囊卵巢综合征方面取得了协同增效的作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所有的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
本实施例进行菌株的筛选：
选取采集的四川省成都市金堂县发酵香肠样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基上，在37℃培养72h后，挑取3株不同形态菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落分别在37℃下使用MRS液体培养基扩培，再使用质量浓度为40％的甘油进行保藏。针对保藏的3株单菌进行体外生理特性试验筛选，择出一株对低pH和胆汁盐有抵抗能力(体外人工模拟)、胃肠道上皮细胞粘附能力强、抑菌能力最优的单菌株，添加冷冻保护液至-80℃生物冰箱中保存。
实施例2
本实施例对实施例1中筛选得到的最优的单菌株进行16S rRNA分子生物学鉴定及理化性质分析：
将保藏的菌株取出，按3％比例接种于装有30mL MRS液体培养基的离心管中，37℃下培养24h后离心(10000rpm，5min)，去掉上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物和无菌水进行PCR扩增，并将扩增产物送至中国科学院微生物研究所进行测序鉴定。该菌株经测序分析后的16S rDNA序列，如SEQ ID No.1所示。将该序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示此菌株为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌LR10。
SEQ ID No.1：
ATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATA
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ATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGC
TTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAAT
GGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCT
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ACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGT
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AACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCC
GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG
AGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCATTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAG。
根据API细菌鉴定标准利用API 50CHL培养基(基础培养基，由48种可发酵碳水化合物的API 50CH试验条组成)和API 50CH试验条对检测菌株进行糖发酵反应判读检测其碳源利用能力。该方法原理是利用需测定的菌株制成悬液接种在每个试验条小管里，经过培养，能够被利用的碳源管会因其发酵产酸，pH下降，从而使指示剂变色。
最后结果得到，罗伊氏乳杆菌LR10可利用碳源为：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖和葡萄糖酸盐。
实施例3
本实施例探究罗伊氏乳杆菌LR10缓解多囊卵巢综合征的效果：
将四周大的未交配雌性CIR小鼠(上海实验动物中心提供)关在温度受控的房间(22±2℃)中，处于12:12的光暗循环中一周后随机分为PCOS组与对照组。对照组(n＝10)每天用大豆油载体注射。PCOS组皮下注射溶解在大豆油中的DHEA(脱氢表雄酮，6mg/100g体重)连续20天，以建立PCOS动物模型。PCOS小鼠表现出无周期/不规则的卵巢周期，将其随机分为5组，每组10只：按照如下给药方式连续24天灌胃。
模型组；不给药；
LR10组；LR10菌剂(LR10活菌数为200CFU/100g体重)灌胃，每天一次；
LG08组：LG08菌剂(LG08活菌数为200CFU/100g体重)灌胃，每天一次；
LR10+LG08组：复合菌剂(LR10与LG08的活菌数之比为2:1，总活菌数200CFU/100g体重)灌胃，每天一次；
LR10+格氏乳杆菌ATCC 19992：复合菌剂(LR10与ATCC 19992的活菌数之比为2:1，总活菌数200CFU/100g体重)，皮下注射，每天一次；
单菌剂的制备方法：将菌株(LR10、LG08或ATCC 19992)接种(接种量2％)于MRS培养基中于37℃下进行培养22h，得到培养液；离心(1000rpm，8min)，得到各菌体；菌体溶于保护剂(保护剂中溶质是甘油，质量浓度为10％，溶剂是纯化水)，得到相应的单菌剂。
将各单菌剂按需求混合即得复合菌剂。
活菌数检测方法参照：国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
MRS培养基配方：蛋白胨9.00g/L、牛肉膏8.50g/L、葡萄糖16.00g/L、乙酸钠1.50g/L、酵母粉3.60g/L、柠檬酸氢二铵1.30g/L、K2HPO4·3H2O 2.00g/L、MgSO4·7H2O 0.10g/L、MnSO4 0.03g/L、半胱氨酸氨酸盐0.20g/L，使用去离子水溶解，再加入1.50mL吐温80，定容至1L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
在研究结束时，采集血液后处死小鼠。切除卵巢、肝脏用于进一步分析。
(1)血清性激素含量测定
将每只小鼠的0.5mL血样以1000g在4℃下离心15分钟取上清以收集血清，至于20℃备用。使用相应的ELISA试剂盒(Cloud-Clone Corp，Houston，TX，USA)测量血清样品中的各激素含量：孕酮(PROG)、雌二醇(E2)、总睾酮(T)、黄体生成素(LH)和催乳素(PRO)，计算各组平均值，列于表1。
表1
(2)卵巢囊状卵泡计数
将小鼠解剖收集两侧卵巢，进行和卵巢多囊样变观察，进行黄体、囊状卵泡计数，对比每组间的黄体和囊状卵泡平均数，结果见表2。
表2
(3)肝脏中胆汁酸含量分析
利用LC/MS定量分析肝脏中各种胆汁酸的含量，提取待检测小鼠肝脏组织中的脂肪酸进行甲酯化处理后上样LC/MS。LC/MS使用Acquity UPLC BEH C18柱进行。样品进样体积为5μL，柱温为40℃。流动相由A相：甲酸(0.01％水溶液)和B相：乙腈组成，流速为0.25mL/min。梯度洗脱后，样品通过质谱仪在多反应模式(MRM)下以负电喷雾电离进行分析。得到各胆汁酸的含量：石胆酸(LCA)、牛磺胆酸(TLCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)见表3。
表3
结果显示；与对照组的健康小鼠相比，模型组患有多囊卵巢综合征的小鼠体内各激素含量发生了严重失衡，出现大量囊状卵泡，黄体数减少，且肝脏内各胆汁酸的含量发生了大幅度降低；采用单菌剂或组合菌剂干预后，能够显著回调激素水平(下调总睾酮及黄体生成素含量，上调孕酮、雌二醇、催乳素的激素含量)，各胆汁酸(石胆酸、牛磺胆酸钠盐、牛磺鹅去氧胆酸)的含量也得到了显著回升，多囊病变中的囊状卵泡数显著降低，黄体有所增加，其中LR10的效果显著好于其他菌株。
另外，LG08对于缓解多囊卵巢综合征也有比较显著的效果，但稍差于LR10，不过将其与LR10复配后，却取得了比LR10单菌株更好的效果，这可能是因为两种菌株能够互相促进彼此的生长代谢活动，因此在回调激素水平、缓解多囊病变以及提高肝脏中胆汁酸含量方面取得了协同增效的作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种治疗多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种治疗多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌的具体名称为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR10，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24409，保藏日期为2022年2月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种罗伊氏乳杆菌LR10菌剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌LR10菌剂由包括如下步骤的方法制得：将如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LR10接种于培养基中于35-40℃下培养，即得。
3.如权利要求2所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂，其特征在于，所述培养基包括MRS培养基。
4.如权利要求2或3所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂，其特征在于，所述培养的时间为18-24h；
优选地，所述培养后还包括离心，收集菌体；
优选地，所述收集菌体后还包括与保护剂混合，所述保护剂包括甘油。
5.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中包括如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LR10和格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG08，所述格氏乳杆菌LG08的保藏编号为CGMCC No.16131，保藏日期为2018年7月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
6.如权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌LR10与格氏乳杆菌LG08的活菌数之比为(1-9):(1-3)。
7.如权利要求5或6所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中还包括保护剂，所述保护剂包括甘油。
8.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LR10、如权利要求2-4中任一项所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂或如权利要求5-7中任一项所述的复合菌剂在制备治疗/缓解多囊卵巢综合征的药物中的应用。
9.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LR10、如权利要求2-4中任一项所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂或如权利要求5-7中任一项所述的复合菌剂在制备调节激素紊乱的药物中的应用，其特征在于，所述激素包括睾酮、黄体生成素、孕酮、雌二醇或催乳素中的任意一种或至少两种的组合。
10.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LR10、如权利要求2-4中任一项所述的罗伊氏乳杆菌LR10菌剂或如权利要求5-7中任一项所述的复合菌剂在制备促进胆汁酸分泌的药物中的应用，其特征在于，所述胆汁酸包括石胆酸、牛磺胆酸或牛磺鹅去氧胆酸中的任意一种或至少两种的组合。
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