CN116355098A - 三特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三特异性抗体及其应用。所述三特异性抗体包含分别靶向Claudin18.2、免疫检查点和细胞因子或其受体的三种蛋白功能域；相邻蛋白功能域之间以连接子连接，或直接连接。本发明的三特异性抗体保留了与靶点的结合活性，并且具有良好的体内药效；并且分子量小，结构类似常规IgG，有完整的Fc，为下游生产纯化工艺提供便利，节约成本；此外，本发明的三特异性抗体与正常抗体分子量大小接近，使其更易于进入肿瘤组织，达到杀伤肿瘤的效果，更适合用于抗肿瘤药物的开发，为肿瘤治疗提供了更好的选择。

Description

三特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种三特异性抗体及其应用。
背景技术
细胞连接密蛋白(密蛋白，Claudin或CLDN)在人、鼠等物种中都有表达，是细胞间层密封关联蛋白，在控制对细胞层间离子流、维持细胞极性和细胞间信号转递具有重要作用。CLDN家族蛋白已经发现的有29种之多，CLDN18就是其中之一。CLDN18有两个同源分子，分别称为密蛋白18.1(CLDN18.1)和密蛋白18.2(CLDN18.2)。人密蛋白18.1(hCLDN18.1)和人密蛋白18.2(hCLDN18.2)高度同源，氨基酸同源性高达92％。hCLDN18.2在正常组织表达非常有限，仅见于胃黏膜分化上皮细胞，但在胃癌包括转移胃癌组织有特别的高表达(Sahin U.et al.Claudin-18splice variant 2is a pan-cancer target suitable fortherapeutic antibody delveopment.Clin Cancer Res.2008；14(23):7642-34)。进一步发现，CLDN18.2在不同癌症，包括大约70％的胃癌、50％的胰腺癌、30％的食道癌、25％的肺癌和卵巢癌等的患者组织都有表达。因此，CLDN18.2早已经成为理想的肿瘤患者标记物和抗肿瘤药物开发靶点，特别是靶向CLDN18.2的抗体开发用于肿瘤治疗，但因为靶点的特殊性，开发针对CLDN18.2治疗性抗体非常困难。人CLDN18.2蛋白全长261个氨基酸，见NCBI公开序列NP_001002026.1claudin-18isoform 2，其中1-23为信号肽。CLDN18.2蛋白是一个跨膜蛋白，有两个膜外区域分别为信号肽后面大约55个氨基酸的胞外区1(Extracellularloop 1，ECL1)和23个氨基酸ECL2。这一结构和人CLDN18.1非常相似，而且人CLDN18.2和人CLDN18.1的ECL2区域则完全相同。因而针对人CLDN18.2蛋白靶点抗体的开发，需要寻找针对人CLDN18.2蛋白的ECL1区域或空间结构的抗体。
此外，针对人CLDN18.2膜蛋白的抗体发挥其功效至少包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长，通过和病人免疫细胞的效应作用，包括抗体依赖细胞毒性(ADCC)，和补体依赖细胞毒性(CDC)效应细胞介导的杀伤肿瘤细胞作用。
转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)信号通路是一个包含众多成员的多功能细胞因子的大家族，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及其他信号蛋白。TGF-β三种亚型的一级结构相似度较高，同源性达到70-80％。它们都具有信号肽、一个LAP结构域和一个由112-114个氨基酸残基组成的C末端区域，这一肽段经蛋白水解、释放后成为成熟的TGF-β分子，成熟的TGF-β蛋白二聚体化生成25KDa的活性蛋白。TGF-β都具有9个半胱氨酸残基，其中8个在分子内形成二硫键，从而形成TGF-β超家族的半胱氨酸结(cysteine knot)结构特征。第9个半胱氨酸与另一个TGF-β蛋白的对应半胱氨酸形成二硫键，从而形成具有功能的二聚体。TGF-β主要通过调节细胞的生长、增殖、分化、迁移和凋亡等过程，参与介导组织与器官的正常生长和发育、机体的免疫反应等生物过程。活化的TGF-β释放后再与其他因子形成丝氨酸/苏氨酸激酶复合物，最终与TGF-β受体结合，激活下游信号通路。TGF-β受体下游信号通路可分为经典通路(SMAD通路)和DAXX依赖凋亡通路。当人体细胞出现癌变时，肿瘤微环境中的基质细胞和肿瘤浸润区巨噬细胞就会分泌TGF-β。TGF-β的肿瘤抑制作用源自其诱导多个基因表达的能力，这些基因参与抑制细胞增殖、诱导凋亡、激活自噬、通过基质成纤维细胞抑制生长因子的信号、抑制炎症，以及抑制血管生成。这些作用维持了正常组织内的动态平衡，防止肿瘤形成的早期阶段。不过，TGF-β对恶变前癌细胞施加的压力，会迫使肿瘤细胞通过突变等手段避开TGF-β的抑制作用。首先，TGF-β信号可作用于肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞，减弱了TME中固有免疫细胞的抗肿瘤能力、抑制CD8+T细胞的功能并促进肿瘤逃逸免疫监管；其次，TGF-β信号可以通过诱导HMGA2、Snail1/2等转录因子的表达，诱发上皮-间质转化(EMT)，进而逃逸凋亡作用；另外，TGF-β表达上调，也会促进VEGF-A等因子的分泌，刺激新生血管生成，从而为癌细胞的生长和转移提供助力。近期的研究还表明，TGF-β信号通路还与肿瘤细胞的耐药性相关。比如，它可以使肿瘤细胞避开一些化疗药物的杀伤作用，它也可以通过上调蛋白激酶Cα(PKCα)表达增强肿瘤细胞的耐药性。
针对CLDN18.2靶点目前有9个单抗(安斯泰来的Zolbetuximab、恺兴生命科技的AB011、奥赛康的ASKB589、迈博斯的TST001、明济生物的M108、天广实的MIL93、礼新生物的LM-102、创胜集团的NBL-015和恒瑞医药的SHR-A1904)、3个双特异性抗体(安进/百济的CD3×Claudin 18.2、齐鲁制药的CD3×Claudin 18.2和启愈生物的PD-L1×Claudin 18.2)在临床阶段，尚无多特异性抗体公布。目前，已有的抗体仅靶向CLDN18.2靶点或者包括CLDN18.2在内的2个肿瘤靶点，不能靶向更多的通路或者肿瘤微环境中促进肿瘤进展或增强免疫的因子，临床效果有限。
发明内容
本发明所要解决的是技术问题是克服现有技术中缺少同时靶向三个不同通路或免疫调节因子的缺陷，提供一种三特异性抗体及其应用。本发明同时靶向三个不同靶点，可作为肿瘤细胞与免疫细胞的衔接器，同时解除免疫细胞的免疫抑制、解除肿瘤微环境的免疫抑制，并可在肿瘤细胞周围招募更多的免疫细胞，取得了更好的协同疗效的同时避免了非肿瘤特异的副作用。
发明人通过对三特异性抗体分子的结构进行创新性的设计、筛选，发现三特异性分子中序列的改变及其连接方式的改变对三特异性分子都有显著影响，所述影响不仅体现在三特异性分子的靶点结合活性和药效上，还体现在三特异性分子的表达量、纯化难易程度上。发明人在对大量抗体的筛选过程中，意外地发现特定结构的三特异性抗体分子不仅保留甚至提高了对各靶点的结合活性，保留了对PD-1/PD-L1信号通路的阻断效果，分子量接近甚至小于双特异性抗体，组织渗透性好，从而增强了药效，还具有较高的表达量，并且结构简单，具有正常抗体一样完整的Fc，易于纯化，一步亲和纯化后质量较好，后续纯化工艺简单，生产成本低。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明的第一方面提供一种三特异性抗体，其包含分别靶向Claudin18.2、免疫检查点和细胞因子或其受体的三种蛋白功能域；相邻蛋白功能域之间以连接子连接，或直接连接；
其中，靶向Claudin18.2的蛋白功能域包括轻链可变区VL1和重链可变区VH1，靶向免疫检查点的蛋白功能域包括轻链可变区VL2和重链可变区VH2；所述VL1和VH1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和6所示；所述细胞因子选自白细胞介素(IL)例如IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和转化生长因子β(TGF-β)家族例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3，所述细胞因子受体为TGF-βRI或TGF-βRII。
在本发明一些实施方案中，所述免疫检查点为免疫细胞检查点；较佳地，所述免疫细胞检查点为PD-1或PD-L1；更佳地，所述VL2和VH2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和8所示，或如SEQ ID NO:9和10所示。
在本发明一些实施方案中，所述IL-10和TGF-βRII的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示。
本发明中，所述三特异性抗体还包括恒定区，所述恒定区包括轻链恒定区和/或重链恒定区。
在本发明一些实施方案中，所述重链恒定区为hIgG1或hIgG4的重链恒定区。
和/或，所述轻链恒定区包括κ链或λ链。
和/或，三种蛋白功能域各为2份。
在本发明一些较佳实施方案中，所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域的N端连接所述靶向免疫检查点的蛋白功能域的C端，或，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域的N端连接所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域的C端。
和/或，所述重链恒定区的N端连接所述靶向免疫检查点的蛋白功能域或靶向免疫检查点的蛋白功能域的C端，所述重链恒定区的C端连接所述靶向细胞因子或其受体的蛋白功能域的N端；所述重链恒定区的C末端氨基酸优选为A。
在本发明一些更佳实施方案中，所述VL1、VH1、VL2、VH2的结构从N端至C端依次为VL1-VH1-VH2-VL2、VH1-VL1-VL2-VH2、VL2-VH2-VL1-VH1或VH2-VL2-VH1-VL1；或，所述VL1、VH1、VL2、VH2的结构从N端至C端依次为VL1-VL2-VH2-VH1或VL2-VL1-VH1-VH2。
或者，所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域为scFv结构，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域为Fab’结构；或，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域为scFv结构，所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域为Fab’结构；所述scFv从N端自C端依次为VH1-VL1、VH2-VL2、VL1-VH1或VL2-VH2，所述scFv的C端连接在所述Fab’的N端。
在本发明一些实施方案中，所述VL1和VH1通过第一连接子相连。
和/或，靶向Claudin18.2的蛋白功能域与靶向免疫检查点的蛋白功能域通过第二连接子相连。
和/或，所述重链恒定区与所述靶向细胞因子或其受体的蛋白功能域通过第三连接子相连。
和/或，所述VL2和VH2通过第四连接子相连。
和/或，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域与所述重链恒定区通过第五连接子相连。
本发明中，所述第一连接子为(G4S)3或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本发明中，所述第二连接子为(G4S)、(G4S)3或(G2S)2。
本发明中，所述第三连接子为(G4S)3或(G2S)4。
本发明中，所述第四连接子为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本发明中，所述第五连接子为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或(G4S)。
在本发明一些具体的实施方案中，所述三特异性抗体的轻链的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明一些具体的实施方案中，所述三特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的第二方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如第一方面所述的三特异性抗体。
本发明的第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如第二方面所述的核酸。
本发明的第四方面提供一种转化体，所述转化体包含如第二方面所述的核酸或如第三方面所述的重组表达载体。
本发明的第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述的三特异性抗体。
本发明的第六方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如第一方面所述的三特异性抗体、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的转化体或如第五方面所述的药物组合物。
本发明的第七方面提供一种套装药盒，所述套装药盒包括药盒A和药盒B；
其中，所述药盒A包括如第一方面所述的三特异性抗体或者如第五方面所述的药物组合物；所述药盒B包括其他治疗剂。
较佳地，所述药盒A与药盒B的施用时间不分先后或者先施用所述药盒A。
较佳地，所述治疗剂为与所述药盒A的三特异性抗体具有协同作用的治疗剂；
更佳地，所述治疗剂为小分子药物、大分子药物或化疗药物。
本发明中，所述小分子药物为本领域治疗肿瘤的小分子药物，优选选自吉非替尼、伊马替尼、埃克替尼或索拉菲尼。
本发明中，所述大分子药物为本领域治疗肿瘤的大分子药物，优选选自英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、依那西普、非格司亭或培非格司亭。
本发明中，所述化疗药物为本领域治疗肿瘤的化疗药物，优选选自顺铂、卡铂、吉西他滨、培美曲塞、紫杉醇、奥沙利铂或氟尿嘧啶。
本发明的第八方面提供一种如第一方面所述的三特异性抗体、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的转化体或如第五方面所述的药物组合物在制备靶向Claudin18.2、免疫检查点例如PD-1/PD-L1和细胞因子或其受体例如TGF-β和/或IL-10的药物中的应用。
本发明的第九方面提供一种给药装置，所述给药装置包含：(1)用于对有需要的受试者施用如第五方面所述的药物组合物的输注模块，以及(2)任选的药效监控模块。
本发明的第十方面提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用如第一方面所述的三特异性抗体、如第五方面所述的药物组合物或如第九方面所述的给药装置。
较佳地，所述疾病包括实体瘤和血液瘤。
更佳地，所述实体瘤选自结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、肝癌、上皮鳞状细胞癌、食道癌、直肠癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和神经胶质瘤；所述血液瘤选自急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的三特异性抗体使用了基于常规抗体IgG结构的新的抗体结构，可靶向多种类型的靶点，保留了与各靶点的结合活性，并且具有良好的体内药效；例如，在优选实施方案中，所述三特异抗体保留了相应的单克隆抗体的结合活性，能有效阻断PD-1和PD-L1的结合，解除肿瘤微环境中Treg、TGF-β的免疫抑制；并且同时阻断CLDN18.2、PD-1/PD-L1和TGF-β三条通路，比双特异性抗体和单克隆抗体联合给药有更好的药效。
本发明的三特异性抗体分子量小，甚至小于常规的双特异性抗体；并且结构类似常规IgG，有完整的Fc，为下游生产纯化工艺提供便利，节约成本。
此外，本发明的三特异性抗体与正常抗体分子量大小接近，使其更易于进入肿瘤组织，达到杀伤肿瘤的效果，更适合用于抗肿瘤药物的开发，为肿瘤治疗提供了更好的选择。
附图说明
图1为本发明三特异抗体结构示意图。
图2为本发明三特异抗体LB4096和LB4066冻融后SEC-HPLC检测图谱。
图3为本发明三特异抗体与各靶点的结合活性结果示意图。
图4为本发明三特异抗体的抗肿瘤活性结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例所用的抗原或购自如下不同公司：上海近岸科技有限公司TGF-βⅠ(Cat#CA59)，泰州市百英生物科技有限公司IL10RA-his(Cat#B138201)、重组人PD-L1/mFc(Cat#B1576)或Biolegend的Biotin anti-human IL10(Cat#501502)或由本发明表达纯化得到。
人PD-1(hFc/his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_005009.2，全长288个氨基酸，其中第1-20位为信号肽；ECD(extracellular domain，胞外结构域)为第21-167位氨基酸。
人PD-L1(hFc/his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_054862.1，全长290个氨基酸，其中第1-18位为信号肽；ECD为第19-239位氨基酸。
实施例所用抗体，LC121系上海健信生物利用杂交瘤平台自主研发的抗CLDN18.2的单克隆抗体；LB4012为LC121与TGF-βRⅡ胞外结构域连接而成的双功能融合蛋白，其他针对各靶点的抗体，序列均来自于drug bank。
实施例所用his tag抗原为在C端连接6×his。
实施例中，所述LC121的轻链可变区序列为：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:5)
所述LC121的重链可变区序列为：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)
实施例1抗原、抗体的克隆、表达和纯化
表达使用pTT5载体(Biovector，Cat#102762)。将所要表达的重组蛋白、抗体轻、重链序列克隆到pTT5载体上，经瞬时转染HEK293F细胞(Life Technologies Cat#11625019)表达，后纯化得到。
具体地，293F细胞在SMM 293-TⅡExpression Medium(北京义翘神州科技股份有限公司，Cat#M293TⅡ)培养基中扩培。瞬转开始48h前，调节细胞浓度至1×106cell/mL，于摇床中培养48h，培养条件为36.5℃，6％CO2，120rpm。转染前再次镜检存活率>95％，细胞浓度在4×106cells/mL。
准备300mL细胞，在15mL Gibco FreeStyle 293Expression Medium(Gibco，Cat#12338018)中分别溶入重链、轻链质粒90μg和60μg(如果是重组蛋白，单个质粒用量为150μg)，0.22μm过滤除菌。再取15mL FreeStyle 293Expression Medium，溶入1mg/mL PEI(Polysciences，Inc，Cat#23966-2)600μL后静置5min。把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10min，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液，37℃，8％CO2摇床培养5天收样，8000g离心10min取上清进行纯化。
抗体纯化：将样品高速离心去除杂质，用PBS pH7.4平衡含有Protein A(Mabselect,GE Healthcare Life Science,Cat#71-5020-91AE)的重力柱(生工生物，Cat#F506606-0001)，2～5倍柱体积冲洗。将样品过柱，控制流速，保留时间为5min。用5～10倍柱体积的PBS(生工生物，Cat#B548117-0500)冲洗柱子。再用pH 3.5 0.1M乙酸洗脱目的蛋白，后用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，酶标仪测定浓度。
His Tag蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质；平衡镍柱(Ni smart beads 6FF，常州天地人和生物科技有限公司，Cat#SA036010)，用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS(pH7.4)溶液平衡镍柱，2～5倍柱体积冲洗。将待纯化上清过柱。控制流速，使其保留时间为5min。漂洗杂蛋白：使用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS(pH7.4)溶液冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。用含有250mM咪唑0.5M NaCl的PBS(pH7.4)洗脱目的蛋白。
Buffer置换：将洗脱、中和后的hFc tag或洗脱的his tag蛋白过超滤管(MerckMillipore，Cat#UFC500308)，12000g离心10min，如体积较大，可反复离心直至所有蛋白均浓缩，加入PBS，离心2次，尽量去除残留的buffer，将超滤管倒置在新的收集管中，低速离心1min后，再补加1mL PBS，测定浓度，分装、储存备用。
实施例2纯化蛋白SEC-HPLC纯度检测
配制流动相A：50mM PB(phosphate buffer，磷酸缓冲液)，100mM L-精氨酸盐酸盐，pH6.8；流动相B：0.5M Na2SO4，pH3.0；将流动相A与B及超纯水用0.22μm滤膜过滤后，置于超声脱气仪中脱气20min。
用1mL注射器吸取300μL待测样品经0.22μm滤膜过滤到上样套管中，将套管放置于进样瓶中。将进样瓶按照上样顺序依次放入样品盘中。打开电脑与色谱仪，设置好程序后用超纯水冲洗管路20min，0.5mL/min。将色谱柱按流动方向安装，用流动相A平衡色谱柱140min，0.5mL/min。依据蛋白浓度进行等量上样(上样总量60μg，总体积不超过100μL)，每个样品运行时间30min，0.5mL/min。进样结束后，用流动相A冲洗柱子30min，0.5mL/min。用0.5M Na2SO4(pH3.0)冲洗柱子5-10CV(column volume，柱体积)，0.3mL/min(保护柱与分析柱分别拆下来，单独清洗，防止保护柱中洗脱的杂质进入分析柱，各冲洗5～10CV)。向柱子中加入0.1M PB(pH6.7，含0.1M Na2SO4+0.05％NaN3)，室温避光保存。将两通装入仪器，用水冲洗约20min，流速1mL/min。关闭仪器和电脑。
实施例3高表达细胞株构建及细胞活性(ELISA)检测
本实施例所用的高表达细胞株CHO-K1-802系本发明人通过本公司的稳定细胞株构建平台自行构建完成，具体构建过程如下：实验开始第1天，将293T细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Cat#GNHu17)接种于两个6cm培养皿，7.5×105细胞/皿。第2天将包装质粒pGag-pol和pVSV-G(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)和克隆有人CLDN18.2基因的质粒pBE802各4μg加入OPTI-MEM(Thermofisher Scientific，Cat#31985070)，使最终体积为200μL，另准备200μL OPTI-MEM加入36μL转染试剂fectin(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#F210)，二者混匀，室温放置5min，然后将混合物(每皿各200μL)滴加入培养好的293T细胞。第3天将293T细胞培养液换为4mL DMEM高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#L130KJ)。第4天将5×105个CHO-K1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Cat#SCSP-507)接种于10cm培养皿。第5天收集293T细胞上清(病毒)，用0.45μm滤膜过滤至CHO-K1细胞，同时加入10μg/mL polybrene(上海翊圣生物科技有限公司，Cat#40804ES76)，混匀后放置培养箱，3～4h后将培养基换为含10％(v/v)FBS的DMEM/F12(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#L310KJ)。第7天将细胞传代，从第8天开始，细胞中加入10μg/mL puromycin(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#S250J0)进行筛选。2～3天后细胞大量死亡，更换培养基继续培养，直到细胞不再死亡时，细胞大量扩增，筛选单克隆细胞株，扩培，冻存保种。
本实施例所用的人CLDN18.2(pBE802)的氨基酸序列NP_001002026.1，全长261个氨基酸，第1-261位为本实施例构建的CHO-K1 CLDN18.2+细胞系所表达的蛋白序列。人CLDN18.2序列中，1-6位、102-122位和196-261位氨基酸为胞内区；7-27位、81-101位、123-143位和175-195位氨基酸为跨膜区，28-80/144-174位氨基酸为胞外区。
CLDN18.2+细胞结合活性(ELISA)检测：
将上述实施例得到的人CLDN18.2高表达的单克隆细胞株扩培后，按10×104细胞/孔铺96孔板，37℃培养箱过夜贴壁后去除上清，每孔加入100μL免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司，Cat#P0098)，室温固定半小时。100μL 1×PBS(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#B320)洗一次，加入230μL 5％(m/v)牛奶，37℃封闭3小时，230μL 0.05％(v/v)PBST洗3次。每孔加入50μL，起始浓度为10μg/mL，5倍梯度稀释的待测抗体或阳性对照抗体。37℃孵育1小时，230μL 0.05％PBST洗5次。加Anti-human Fc-HRP(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-003)1:2500 50μL/孔37℃孵育1小时，PBST洗5遍，每孔加入50μLTMB(Surmodic，Cat#TTMB-1000-01)，室温显色，加入50μL/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪MultiskanGO(Thermo，型号：51119200)读OD450，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例4三特异性抗体与各靶点蛋白结合活性检测(ELISA)
用pH7.4的PBS缓冲液将人PD1(his)、PD-L1(his)和TGF-β1等蛋白分别稀释至2μg/mL，以50μL/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat#CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％(m/v)脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液230μL/孔，37℃孵育箱中孵育3小时或4℃过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(1×PBS pH7.4，含0.05％(v/v)Tweeen-20)洗板5次后，每孔加入50μL、起始浓度为50nM，5倍梯度稀释的待测抗体，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入1:2500稀释的Anti-human Fc-HRP二抗(Jackson Immuno Research，Cat#109-035-003)，50μL/孔，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，每孔加入50μL TMB显色底物(KPL，Cat#52-00-03)，室温显色10-15min，每孔加入50μL 1M H2SO4终止反应，用MultiSkan Go酶标仪(ThermoFisher，型号：51119200)读OD450，计算EC50值，根据各抗体EC50值与阳性对照EC50的接近程度挑选结合活性高的克隆。
实施例5三特异性抗体双夹心ELISA活性检测
将实施例3中得到的hCLDN18.2+高表达的单克隆细胞株按10×104细胞/孔铺96孔板，固定并封闭后，230μL 0.05％(v/v)PBST洗3次。每孔加入50μL，起始浓度为50nM，5倍梯度稀释的待测抗体或阳性对照抗体。37℃孵育1小时，230μL 0.05％(v/v)PBST洗5次。加Biotin anti-human IL10，37℃孵育1小时，230μL 0.05％(v/v)PBST洗5次，每孔加入50μL/孔1:1000稀释的Streptavidin-HRP(Genscript，Cat#M00091)，37℃孵育1小时，PBST洗5遍，每孔加入50μL TMB(Surmodic，Cat#TTMB-1000-01)，室温显色，加入50μL/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪MultiskanGO(Thermo，型号：51119200)读OD450，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例6抗PD-1或PD-L1抗体阻断PD1和PD-L1结合活性实验
用pH7.4的PBS缓冲液将人PD1(his)稀释至2μg/mL，以50μL/孔加入96孔酶标板(Corning，Cat#CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用1×PBS稀释的5％(m/v)脱脂牛奶封闭液230μL/孔，37℃孵育箱中封闭3小时或4℃过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(1×PBS，pH7.4，含0.05％(v/v)Tweeen-20)洗板5次后，稀释PD-L1/mFc至0.4μg/mL，取30μL稀释的PD-L1/mFc和30μL适当浓度起始，3倍梯度稀释的待测抗体混匀后，取50μL至包被的PD1板中，37℃孵育箱中孵育1小时，洗板5次后每孔加入50μL 1:2500稀释的Goat anti-mouse IgG(H+L)-HRP二抗(Jackson，Cat#115-035-003)，37℃孵育1小时，后PBST洗5遍，每孔加入50μL TMB(Surmodic Cat#TTMB-1000-01)显色，加入50μL/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪MultiskanGO(Thermo，型号：51119200)读OD450，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例7三特异性分子设计
本发明人利用自主研发的抗CLDN18.2抗体序列，及抗PD-1或抗PD-L1抗体及肿瘤相关的细胞因子或细胞因子受体进行了多种三特异抗体的设计。所设计的三特异抗体的通式如表1、表2和图1所示。
表1含轻、重链的三特异性抗体设计(通式1)
方案 含轻链的序列 含重链的序列
1 T1(peptide)n1-T2VL-LC-T1(peptide)n2 T1(peptide)n3-T2VH-HC-T3(peptide)n4
2 T2(peptide)n1-T1VL-LC-T2(peptide)n2 T2(peptide)n3-T1VH-HC-T3(peptide)n4
3 T1(peptide)n1-T2VL-LC-T2(peptide)n2 T1(peptide)n3-T2VH-HC-T3(peptide)n4
4 T2(peptide)n1-T1VL-LC-T1(peptide)n2 T2(peptide)n3-T1VH-HC-T3(peptide)n4
表2仅含重链的三特异性抗体设计(通式2)
方案 含重链的序列
1 T1(peptide)n1-T2(peptide)n2-Fc-T3(peptide)n3
2 T2(peptide)n1-T1(peptide)n2-Fc-T3(peptide)n3
3 T1(peptide)VD1n1-T2(peptide)n2-T1(peptide))VD2n3-Fc-T3(peptide)n4
4 T1(peptide))VD2-T2(peptide)n2-T1(peptide)VD1n3-Fc-T3(peptide)n4
5 T2(peptide)VD1n1-T1(peptide)n2-T2(peptide)VD2n3-Fc-T3(peptide)n4
6 T2(peptide)VD2n1-T1(peptide)n2-T2(peptide)VD1n3-Fc-T3(peptide)n4
表1中，含轻链的序列指该序列除了包括轻链序列以外，还可以包括与轻链序列连接的peptide；含重链的序列指该序列除了包括重链序列以外，还可以包括与重链序列连接的peptide。表2中含重链的序列是指该序列包含有重链恒定区序列，还包含与恒定区序列连接的peptide。其中，T1代表针对靶点1(比如CLDN18.2)的第一蛋白功能域，T2代表针对靶点2(非CLDN18.2)的第二蛋白功能域，T3代表针对靶点3的第三蛋白功能域。T1(peptide)代表针对靶点1的蛋白功能域序列；T2(peptide)代表针对靶点2的蛋白功能域序列，T3(peptide)代表针对靶点3的蛋白功能域序列，T1(peptide)VD1、T1(peptide)VD2、T2(peptide)VD1和T2(peptide)VD1分别代表T1(peptide)和T2(peptide)蛋白功能域的结构域1和结构域2。所述peptide代表细胞因子、细胞因子受体、细胞因子/受体融合蛋白、scFv等；本发明一些具体的实施例中，T1(peptide)、T2(peptide)优选为针对靶点1和靶点2的单克隆抗体的scFv功能域；在一些具体实施例中，T3(peptide)优选为针对靶点3的细胞因子、细胞因子受体或细胞因子/受体融合蛋白等。(peptide)n1、(peptide)n2、(peptide)n3、(peptide)n4中的n1、n2、n3、n4分别为自然数，可以是0、1、2、3等，在本发明的具体实施例中，表1中每个方案中的n1、n2、n3中至少1个数值为1，n4为1。表2中每个方案中的n1、n2、n3和n4均为1。表1和表2中，VL代表针对靶点1或者靶点2的抗体轻链可变区序列；VH代表针对靶点1或者靶点2的抗体重链可变区序列。LC代表轻链(κ或者λ)的恒定区序列，优选人轻链恒定区序列；HC代表重链恒定区序列，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的恒定区序列(缩写为HC-IgG1、HC-IgG2、HC-IgG3、HC-IgG4)，优选人的重链恒定区序列(HC-hIgG1或者HC-hIgG4)，Fc代表重链恒定区CH2和CH3区域。方案中，重链恒定区C末端均通过连接子连接T3蛋白序列N末端，其C末端末位氨基酸K可以突变，优选突变为A。由此，在表1的方案1中，T2为免疫球蛋白，T1、T3为peptide；在方案2中，T1为免疫球蛋白，T2、T3为peptide；在方案3、4中，免疫球蛋白两端的peptide和T3代表的peptide分别针对不同的靶点。在表2方案1和2中，T1、T2和T3为针对不同靶点的peptide；在方案3、4中，针对靶点1和靶点2的两个蛋白功能域的结构域1或结构域2串联后与针对靶点2和靶点1的结构域2或结构域1串联，表达后折叠为针对靶点2和靶点1的蛋白功能域，T3为peptide；在方案5、6中，针对靶点2和靶点1的两个功能域的结构域1或结构域2串联后与针对靶点1和靶点2的抗体结构域2或结构域1串联，表达后折叠为针对靶点1和靶点2的蛋白功能域，T3为peptide；在本发明的一些具体实施例中，T1(peptide)、T2(peptide)优选地为针对靶点1和靶点2的单克隆抗体的scFv；在本发明的一些具体实施例中，T3(peptide)优选地为针对靶点3的细胞因子、细胞因子受体或细胞因子/受体融合蛋白等。
所述peptide为scFv时，
表1中，scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链C末端或N末端或免疫球蛋白重链的N端或C末端；或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链C末端或N末端或免疫球蛋白重链的N端或C末端。
表2中，所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的针对另一靶点的scFv的轻链可变区N末端或C末端或重链可变区C末端或N末端；或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的针对另一靶点的scFv的轻链可变区N末端或C末端或重链可变区C末端或N末端。
需说明的是，当上述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区时，其连接方式为轻链可变区的C末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的N末端连接，从而将scFv轻链可变区的N末端和重链可变区的C末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和或重链连接或另一scFv的轻链可变区或重链可变区连接。在本发明中，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的C末端通过连接子与免疫球蛋白轻链的N末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的C末端与免疫球蛋白重链的N末端连接；当其连接针对另一靶点的scFv时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的C末端通过连接子与另一scFv中重链可变区的N末端连接，或在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的N末端与另一功能区的轻链可变区的C末端连接，重链可变区的C末端与另一功能区的重链可变区的N末端连接。
当所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区时，其连接方式为轻链可变区的N末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的C末端连接，从而将scFv轻链可变区的C末端和重链可变区的N末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和或重链连接或另一scFv的轻链可变区或重链可变区连接。在此情况下，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与免疫球蛋白轻链的C末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接；当其连接针对另一靶点的scFv时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与另一scFv的重链可变区C末端连接，或在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与另一功能区重链可变区的C末端连接，轻链可变区的C末端与另一功能区轻链可变区的N末端连接。
所述peptide为细胞因子、细胞因子受体时，所述细胞因子、细胞因子受体等N末端或C末端与连接子连接，所述连接子再与免疫球蛋白重链恒定区C末端和或重链可变区N末端或轻链恒定区C末端或轻链可变区N末端连接，在一些具体的实施例中，所述细胞因子或细胞因子受体优选地与重链恒定区的C末端连接；在一些具体的实施例中，所述细胞因子或细胞因子受体优选IL10和TGF-βRⅡ的胞外结构域(以下简称TGF-βRⅡ)。
所述连接子可以为(G4S)m，所述的m优选为0～10之间的整数。进一步优选地，所述连接子为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3，和/或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser；所述连接子可以为GGSGGSGGSGGS；当peptide通过连接子连接于重链或轻链恒定区C端时，连接子优选GGSGGSGGSGGS；所述连接子可以为VEGGSGGSGGSGGSGGVD，所述连接子可以为GGSGGS，所述scFv的数量为一对，对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链。
本发明所用抗CLDN18.2抗体序列系本发明人利用杂交瘤平台自行筛选所得，具体过程见专利CN110606891A。
上述三特异性抗体设计涉及的各个靶点抗体序列，除了本发明所述anti-CLDN18.2抗体序列外，其它的靶点抗体序列来自已经公开的抗体序列。包括：抗PD-1抗体Nivolumab/Opidivo(简称Nivo)和Pembrolizumab/Keytruda(简称Pem)；抗PD-L1抗体Atezolizumab/Tecentriq(简称Atezo)、Durvalumab/Imfinzi(简称Durv)和Avelumab/Bavencio(简称Avel)等。Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab和Avelumab等序列都能从www.drugbank.ca等公开资源查到。细胞因子和细胞因子受体序列均能从Uniprot或NCBI等公开资源查到。
实施例中，所述Nivo的轻链可变区序列为：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:7)
所述Nivo的重链可变区序列为：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)
所述Atezo的轻链可变区序列为：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:9)
所述Atezo的重链可变区序列为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)
所述IL10的序列为：
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:11)所述TGF-βRⅡ的胞外结构域序列为：
GIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ IDNO:12)
实施例8三特异性抗体分子设计和质量评价
本发明针对CLDN18.2和PD-1或PD-L1及细胞因子或细胞因子受体等三个靶点，利用不同的结构通式设计了不同序列结构的三特异抗体，见下表3和表4。
表3含重链和轻链的三特异性抗体
Figure BDA0003439942570000151
Figure BDA0003439942570000161
*：κ链表示轻链为人IgG的κ型轻链恒定区。#：表示IgG1或IgG4的C末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸K突变为A。以下重链C末端引入scFv的设计均将最末端K突变为A。
表4仅含重链序列的三特异性抗体
Figure BDA0003439942570000162
Figure BDA0003439942570000171
☆：Fc的C末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸K突变为A。以下Fc的C末端引入scFv的设计均将最末端K突变为A。
按本发明实施例1中所述的克隆表达纯化方法，分别克隆表达、纯化上述三特异抗体，纯化后抗体用本发明实施例2中所述的SEC-HPLC蛋白纯度检测方法检测各三特异抗体的纯度，同时根据纯化所得到的蛋白量计算各抗体的表达量(重力柱纯化，收率按100％计算)，结果如表5所示。
表5三特异性抗体的表达量和SEC-HPLC纯度汇总
Figure BDA0003439942570000172
Figure BDA0003439942570000181
NA：代表纯化出的蛋白量过少，不足以检测SEC-HPLC。
上述结果表明，本发明设计的针对CLDN18.2和PD1或PD-L1及TGF-βRⅡ或IL10的三特异抗体表达产量和纯度差别很大。针对相同靶点的相同的抗体序列与细胞因子或细胞因子受体组合的三特异抗体，结构不同，表达量和质量(纯度)也不同，如LB4064(表达量：98.17mg/L；纯度：90.05％)、LB4066(表达量：95.63mg/L；纯度：89.75％)和LB4073(表达量：72.3mg/L；纯度：58.76％)等。或者，同一种结构模式中，同样含有重、轻链结构的三特异性抗体，TGF-βRⅡ或IL10序列和位置相同，IgG形式抗体和scFv形式抗体互换，则表达量和纯度不同，如LB4062(表达量：57.9mg/L；纯度：72.77％)和LB4064(表达量：98.17mg/L；纯度：90.05％)；及LB4076(表达量：8.64mg/L；纯度：62.14％)和LB4077(表达量：30.05mg/L；纯度：86.99％)等。同样地，以抗PD-L1抗体为IgG形式，抗CLDN18.2抗体为scFv形式，仅scFv的位置不同，表达量和抗体纯度不同，如LB4064(表达量：98.17mg/L；纯度：90.05％)和LB4164(表达量：59.87mg/L；纯度：60.46％)。或者，同一种结构模式下，且结构相同，scFv位置相同，抗CLDN18.2抗体的序列相同，TGF-βRⅡ的序列和位置相同，仅抗PD-L1或抗PD-1的序列不同，三特异性抗体的表达量和纯度也不同，如LB4064(表达量：98.17mg/L；纯度：90.05％)和LB4264(表达量：179.4mg/L；纯度：92.04％)和LB4364(表达量：124.67mg/L；纯度：98.49％)及LB4069(表达量：0.18mg/L；纯度：纯化所得蛋白过少，未能检测纯度)和LB4070(表达量：1.16mg/L；纯度：61.66％)。
在仅含有重链的结构模式下，TGF-βRⅡ或IL10位置相同，抗CLDN18.2抗体和抗PD-1或PD-L1抗体同时为scFv形式，scFv连接顺序不同，抗体的表达量和纯度不同，如LB4067(表达量：4.13mg/L；纯度：62.55％)和LB4068(表达量：0.29mg/L；纯度：纯化所得蛋白量过少，未能检测纯度)；或者LB4074(表达量：0.17mg/L；纯度：纯化所得蛋白量过少，未能检测纯度)和LB4075(表达量：4.4mg/L；纯度：78.05％)等。
更加意外地发现，同一结构模式下，抗CLDN18.2抗体scFv和抗PD-L1抗体scFv序列相同，连接顺序相同，TGF-βRⅡ序列和位置相同，仅Fc与TGF-βRⅡ之间的连接子序列不同，抗体表现不同，例如LB4096在-80℃冻融一次后SEC-HPLC纯度急剧下降，仅有35.63％的单体存在，而LB4066冻融后纯度几乎无变化(89.75％vs 89.15％)，表现较稳定(结果如图2所示)。
实施例9三特异性抗体分子活性评价
根据上述表达量和纯度优选出部分三特异抗体分子，用前述实施例3、实施例4和实施例5中的方法检测其与稳定表达CLDN18.2的CHO-K1-802细胞系及PD-1或PD-L1和TGF-β和抗IL10抗体的结合活性，结果如表6、表7和图3所示。
表6针对CLDN18.2、PD-L1/PD-1和TGF-β设计的三特异性抗体的结合活性评价
Figure BDA0003439942570000191
表7针对CLDN18.2、PD-1和IL10-Receptor设计的三特异性抗体的结合活性评价
Figure BDA0003439942570000192
NA：未能计算出EC50及相对阳性抗体EC50的变化倍数。#：括号里面的数值为相同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体或双特异性抗体的结合活性EC50。*：同样实验条件下，三特异抗体和对应的单克隆抗体或双特异性抗体的结合活性EC50的比值。比值越大，说明所设计的三特异抗体对单靶点或双靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的三特异抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体或双特异抗体相比减弱了1倍；比值在2以内(实验误差范围)，说明结合活性没有受到影响。
图3和表6中是本发明优选的针对抗CLDN18.2抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体和TGF-βRⅡ设计的不同结构的三特异抗体分子与各靶点的结合活性评价结果。表7中是本发明优选的针对抗CLDN18.2抗体、抗PD-1抗体和IL10设计的不同结构的三特异性抗体分子与各靶点结合活性评价结果。
结果表明，针对抗CLDN18.2抗体和抗PD-L1抗体Atezo和TGF-βRⅡ设计的不同结构的三特异性抗体均能够保留其相应的对照抗体对各个靶点的结合活性，如LB4064和LB4066，与三个靶点蛋白的结合EC50均与相应的阳性对照抗体接近，其比值均在2倍以内。将抗PD-L1的抗体用抗PD-1抗体Nivo替换，针对不同结构设计的三特异性抗体分子活性差异较显著，如LB4077、LB4078和LB4079；或者将Fc C端的TGF-βRⅡ替换为IL10对抗体分子的活性影响也较大，如LB4067。更加意外地发现，同是抗CLDN18.2抗体和抗PD-L1抗体的scFv和TGF-βRⅡ组成的三特异性抗体，scFv不同的连接顺序(即不同的位置)，对Atezo的活性影响较抗CLDN18.2抗体要小的多，如LB4065和LB4066，LB4065中，Atezo scFv在外侧，抗CLDN18.2抗体的scFv在内(N端连接Atezo scFv，C端连接Fc)，LB4066中，抗CLDN18.2抗体的scFv在外侧，Atezo的scFv在内，LB4065与CLDN18.2的结合活性较阳性抗体下降3.85倍，而LB4066与CLDN18.2和PD-L1的结合活性均与相对应的阳性抗体接近，其与三个靶点结合的EC50改变均在1倍以内。说明scFv的不同位置对抗CLDN18.2抗体的活性影响较大，对Atezo的活性影响较小。
同时发现，scFv重链和轻链之间的连接子及与IgG连接的连接子对活性影响不显著，如LB4064和LB4084。
本发明设计的三特异抗体数据表明，同样的抗CLDN18.2抗体和抗PD-1或PD-L1抗及TGF-βRⅡ或IL10，不一样的结构模式，所设计的三特异性抗体活性差别显著；同一结构模式中，scFv的位置不同，或者scFv连接顺序不同，所设计的三特异性抗体分子的活性差异显著；同一种结构模式中，同样的scFv位置，不同的抗PD-L1或PD-1抗体序列，所设计的三特异性抗体分子的活性差异同样显著；同样的序列，不同连接子设计的三特异性抗体的质量差异显著。
这些数据表明，本发明所设计的三特异抗体，其序列不同，scFv和抗体位置及连接子序列等不同，结构不同，活性不同，质量不同。合适的结构模式，合适的位置、合适的序列及合适的连接子设计得到能针对三个靶点活性及质量很好的三特异抗体，这些三特异抗体结构类似常规IgG，有完整的Fc，让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行，因而工艺简单，具有生产成本低的优势。因序列连接方式、位置、连接子大小、序列不同的组合得到活性功能和质量各异，同时能识别多个靶点的，且分子量同正常抗体大小接近，类似抗体的结构，但能同时识别多(例如三)靶点的特异抗体，本发明称之为Sequence-based IgG likeTrispecific antibody，即序列特异的IgG结构样三特异抗体(ST-Body)。
将上述保留了三个靶点活性的抗体分子，综合表达量、SEC-HPLC纯度及稳定性等数据进行优选后，针对PD-1或PD-L1靶点进行功能(阻断抗原和相应配体结合实验)评估，结果见表8。
表8三特异性抗体阻断PD-1和PD-L1结合活性评价
Figure BDA0003439942570000211
#括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体阻断抗原和配体结合活性的IC50。*：IC50改变倍数，即三特异抗体和对应的单克隆抗体(对照抗体)的IC50的比值。比值越大，说明所设计的三特异抗体对单靶点的功能活性减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的三特异抗体对靶点功能活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内为实验误差范围，即活性没有受到影响。
上述功能活性结果表明，本发明设计的三特异抗体，阻断抗原与相应配体结合的活性变化与结合活性变化一致，如LB4077，其结合人PD-1的活性较Nivo稍有减弱(下降2.89倍)，阻断人PD-L1和人PD-1的结合活性稍有减弱(与相对应的单抗相比，阻断活性下降3.63倍)。其他设计LB4064、LB4066和LB4084均保留了对PD-L1靶点的功能活性。
这些数据表明，本发明设计的三特异抗体的表达量、质量、活性和功能均是结构和序列特异的。
本发明针对抗CLDN18.2抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体及IL10或TGF-βRⅡ胞外结构域所设计的三特异抗体部分优选序列如下(下划线为连接子)：
LB4064轻链序列：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQ ID NO:1)
LB4064重链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*(SEQ ID NO:2)
LB4066序列：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSVEG GSGGSGGSGGSGGVDDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKGGGGSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGSGGSGGSGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*(SEQ ID NO:4)
“*”表示终止子。
其中，SEQ ID NO:3：VEGGSGGSGGSGGSGGVD。
实施例10优选的三特异性抗体体内药效评价
为了进一步评估本发明优选的三特异性抗体人源化抗体的活性，用C57BL/6JNifdc雌性小鼠(购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证编号：SCXK(浙)2019-0001)建立动物药效模型，对本发明优选的三特异性抗体LB4064和LB4066进行了体内药效评估。
MC38-804细胞(高表达鼠CLDN18.2的小鼠结肠癌细胞，上海健信构建)培养于含10％(v/v)胎牛血清(Gibco，货号：10270-106)、10mM HEPES(Gibco，货号：15630-080)的DMEM高糖培养基中(Hyclone，货号：SH30243.01)，在含5％(v/v)CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养。C57BL/6JNifdc雌性小鼠，5只/笼饲养于SPF级环境，温度20～25℃；湿度40％～60％，自由进食进水，定期更换垫料。待MC38-804细胞长至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，用0.25％胰酶消化，收集细胞，用RPMI1640培养基洗涤细胞两次，并用RPMI1640培养基进行重悬计数，最后用RPMI1640培养基与基质胶按2:1的比例进行重悬，调整细胞浓度为10×106细胞/mL用于接种。接种MC38-804细胞悬液(1×106个)100μL于小鼠左肋部皮下，挑选肿瘤细胞长至体积约110-120mm3大小后随机分组，每组7只。
待测样品与阳性对照用PBS配制，无菌。Blank组为PBS。LB4012(抗CLDN18.2单克隆抗体与TGF-βRⅡ胞外结构域组成的双功能融合蛋白，由上海健信自主研发)为双特异抗体阳性对照组，抗PD-L1抗体(Atezo)+LB4012为联合用药阳性对照组，LB4064和LB4066为待测药物组。给药方式为腹腔注射。LB4012组给药剂量为8mg/kg，注射体积为200μL/只；抗PD-L1抗体+LB4012组给药剂量为(6.7+8)mg/kg，注射体积为(100+100)μL/只；LB4064给药剂量分别为5.15mg/kg和10.3mg/kg；LB4066给药剂量分别为9mg/kg和4.5mg/kg，注射体积均为(100+100)μL/只，(各组给药剂量为等摩尔)。各组给药频率均为2次/周，连续给药1.5周。
各剂量组给药当天为第0天。每次给药前测量体重、肿瘤体积，并记录数据。本次实验实际给药周期1.5周，测量周期24天。根据给药后24天测量得到的数据，用下述计算公式计算肿瘤相对体积和抑瘤率(Tumor Growth Inhibtion,TGI)，结果如表9所示。以给药后天数为横坐标，以肿瘤相对体积为纵坐标作图，结果如图4所示。
肿瘤大小计算公式：肿瘤体积TV(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)；肿瘤相对体积(RTV)＝T/T0或者C/C0。相对肿瘤增长率(T/C％)＝100％×(T-T0)/(C-C0)；抑瘤率(TGI)＝(1-T/C)×100％；其中T0、T分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；C0、C分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。
表9三特异性抗体给药后24天肿瘤相对体积及TGI计算结果
Figure BDA0003439942570000241
***：代表P<0.01
表9结果表明，C57BL/6JNifdc雌性小鼠MC38结肠癌动物模型中，本发明优选三特异抗体分子不同剂量给药组对肿瘤生长均表现出明显的抑制作用。低剂量组LB4064抑瘤作用与联合给药组相当，且明显优于LB4012双特异抗体组，高剂量组抑瘤效果优于联合给药组，抑瘤率达59％；更优的是，LB4066低剂量组的抑瘤效果已显著优于联合给药组，抑瘤率可达90％，基本可以完全抑制肿瘤的生长并使肿瘤有逐渐消退的趋势；且高剂量组的药效与低剂量组药效一致，如图4所示。单独的抗PD-L1抗体因为无靶点作用，在该模型中无药效，所以未单独设立对照组。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海健信生物医药科技有限公司
<120> 三特异性抗体及其应用
<130> P21015654C
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB4064
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 2
<211> 855
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB4064
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr
165 170 175
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro
210 215 220
Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
245 250 255
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
260 265 270
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu
275 280 285
Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
290 295 300
Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
305 310 315 320
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
325 330 335
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
370 375 380
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
405 410 415
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
420 425 430
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
435 440 445
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
450 455 460
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
465 470 475 480
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
485 490 495
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
500 505 510
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
515 520 525
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
530 535 540
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
545 550 555 560
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
565 570 575
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
580 585 590
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
595 600 605
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
610 615 620
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
625 630 635 640
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
645 650 655
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
660 665 670
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
675 680 685
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly
690 695 700
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile
705 710 715 720
Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp
725 730 735
Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val
740 745 750
Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser
755 760 765
Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp
770 775 780
Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro
785 790 795 800
Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys
805 810 815
Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys
820 825 830
Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu
835 840 845
Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
850 855
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 3
Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Val Asp
<210> 4
<211> 881
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB4066
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro
290 295 300
Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
325 330 335
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp
340 345 350
Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Val Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
385 390 395 400
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
405 410 415
Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
420 425 430
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
435 440 445
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
450 455 460
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr
465 470 475 480
His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
485 490 495
Gly Gly Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
500 505 510
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
515 520 525
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
530 535 540
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
545 550 555 560
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
565 570 575
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
580 585 590
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
595 600 605
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
610 615 620
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
625 630 635 640
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
645 650 655
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
660 665 670
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
675 680 685
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
690 695 700
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
705 710 715 720
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Ser Gly
725 730 735
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys
740 745 750
Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
755 760 765
Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp
770 775 780
Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
785 790 795 800
Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn
805 810 815
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
820 825 830
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
835 840 845
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
850 855 860
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro
865 870 875 880
Asp
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> LC121
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC121
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nivo
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nivo
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Atezo
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Atezo
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL10
<400> 11
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 12
<211> 137
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGF-beta R
<400> 12
Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135

Claims (10)

1.一种三特异性抗体，其特征在于，其包含分别靶向Claudin18.2、免疫检查点和细胞因子或其受体的三种蛋白功能域；相邻蛋白功能域之间以连接子连接，或直接连接；
其中，靶向Claudin18.2的蛋白功能域包括轻链可变区VL1和重链可变区VH1，靶向免疫检查点的蛋白功能域包括轻链可变区VL2和重链可变区VH2；所述VL1和VH1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和6所示；所述细胞因子选自白细胞介素IL例如IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TGF-β家族例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3，所述细胞因子受体为TGF-βRI或TGF-βRII。
2.如权利要求1所述的三特异性抗体，其特征在于，所述免疫检查点为免疫细胞检查点；较佳地，所述免疫细胞检查点为PD-1或PD-L1；更佳地，所述VL2和VH2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和8所示，或如SEQ ID NO:9和10所示；
和/或，所述IL-10和TGF-βRII的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
3.如权利要求1或2所述的三特异性抗体，其特征在于，所述三特异性抗体还包括恒定区，所述恒定区包括轻链恒定区和/或重链恒定区；
较佳地，所述重链恒定区为hIgG1或hIgG4的重链恒定区；和/或，所述轻链恒定区包括κ链或λ链；和/或，三种蛋白功能域各为2份；
更佳地，所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域的N端连接所述靶向免疫检查点的蛋白功能域的C端，或，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域的N端连接所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域的C端；和/或，所述重链恒定区的N端连接所述靶向免疫检查点的蛋白功能域或靶向免疫检查点的蛋白功能域的C端，所述重链恒定区的C端连接所述靶向细胞因子或其受体的蛋白功能域的N端；所述重链恒定区的C末端氨基酸优选为A；
进一步更佳地：
所述VL1、VH1、VL2、VH2的结构从N端至C端依次为VL1-VH1-VH2-VL2、VH1-VL1-VL2-VH2、VL2-VH2-VL1-VH1或VH2-VL2-VH1-VL1；或，所述VL1、VH1、VL2、VH2的结构从N端至C端依次为VL1-VL2-VH2-VH1或VL2-VL1-VH1-VH2；
或者，所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域为scFv结构，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域为Fab’结构；或，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域为scFv结构，所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域为Fab’结构；所述scFv从N端自C端依次为VH1-VL1、VH2-VL2、VL1-VH1或VL2-VH2，所述scFv的C端连接在所述Fab’的N端。
4.如权利要求3所述的三特异性抗体，其特征在于，所述VL1和VH1通过第一连接子相连；和/或，靶向Claudin18.2的蛋白功能域与靶向免疫检查点的蛋白功能域通过第二连接子相连；和/或，所述重链恒定区与所述靶向细胞因子或其受体的蛋白功能域通过第三连接子相连；和/或，所述VL2和VH2通过第四连接子相连；和/或，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域与所述重链恒定区通过第五连接子相连；
较佳地，所述第一连接子为(G4S)3或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和/或，所述第二连接子为(G4S)、(G4S)3或(G2S)2；和/或，所述第三连接子为(G4S)3或(G2S)4；和/或，所述第四连接子为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和/或，所述第五连接子为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或G4S。
5.如权利要求1～4任一项所述的三特异性抗体，其特征在于，所述三特异性抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
或者，所述三特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～5任一项所述的三特异性抗体。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求6所述的核酸。
8.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求6所述的核酸或如权利要求7所述的重组表达载体。
9.一种套装药盒，其特征在于，所述套装药盒包括药盒A和药盒B；
其中，所述药盒A包括如权利要求1～5任一项所述的三特异性抗体；所述药盒B包括其他治疗剂；
较佳地，所述药盒A与药盒B的施用时间不分先后或者先施用所述药盒A；和/或，所述治疗剂为与所述药盒A的三特异性抗体具有协同作用的治疗剂；
更佳地，所述治疗剂为小分子药物、大分子药物或化疗药物；
进一步更佳地，所述小分子药物选自吉非替尼、伊马替尼、埃克替尼或索拉菲尼；所述大分子药物选自英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、依那西普、非格司亭或培非格司亭；所述化疗药物选自顺铂、卡铂、吉西他滨、培美曲塞、紫杉醇、奥沙利铂或氟尿嘧啶。
10.一种如权利要求1～5任一项所述的三特异性抗体、如权利要求6所述的核酸、如权利要求7所述的重组表达载体或如权利要求8所述的转化体在制备靶向Claudin18.2、免疫检查点例如PD-1/PD-L1和细胞因子或其受体例如TGF-β和/或IL-10的药物中的应用。
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