CN116350681A - 一种水苦荬提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水苦荬提取物及其制备方法和应用。该水苦荬提取物中包含环烯醚萜苷类活性成分，该环烯醚萜苷类活性成分中包含毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II；所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为40‑90％；所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.0‑5.0):1；所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.1‑3.0)。本发明中明确了水苦荬药材提取物的活性成分，制备得到质量稳定的有效部位，明确了药效的物质作用基础，有效提升了用药安全性。

Description

一种水苦荬提取物及其制备方法和应用
本申请要求申请日为2021年12月28日的中国专利申请CN202111627147X的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明涉及一种水苦荬提取物及其制备方法和应用。
背景技术
心力衰竭，简称心衰，是指在适量静脉回流的情况下，由于心肌舒张和/或收缩功能障碍，心排血量不足以维持组织代谢需要而引起的以循环功能障碍为主的综合征。据统计，全球心衰患者数量已高达6430万，其中发达国家的心衰患病率约为1～2％。据我国最新流行病学调查显示，心衰患病率在过去15年间增加了44％，在≥35岁的居民中，心衰的患病率为1.3％，即大约1370万人罹患心衰，并且随着我国人口老龄化持续加剧，心衰的发病率想必会进一步提高，加重公共卫生医疗负担。
近年来，中医药联合西药常规治疗心衰的优势渐显，如芪苈强心胶囊首次被《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》列入中医中药治疗方案。然而，目前常用的中成药或者复方药物大多是以原药材或者粗提物为原料，其有效成分、无效成分以及毒性成分不明确，存在处方剂量大、服用不方便和安全性低等问题。为了解决上述问题，一类以中药主要活性成分为原料的现代中成药进入市场，如用于心脑血管疾病的银杏内酯注射液、注射用丹参多酚酸等，但目前尚无用于心衰治疗的口服现代中成药。
目前有基于临床治疗慢性心力衰竭的验方的有效成分提取研究[1]，通过水煮鹿角、红花、补骨脂、淫羊藿、山茱萸、女贞子和沉香7味原料药组成的中药复方，从中提取得到羟基红花色素、马钱苷、补骨脂苷、异补骨脂苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛、特女贞苷、沉香四醇8种有效成分，但其没有除去非有效部分，上述问题依旧存在。另一方面，也有从单味药材中得到具有心肌保护作用的组分组合物[2]，例如由杜仲总黄酮、杜仲环烯醚萜和杜仲木质素组成的组合物，然而，比起这类组合物，单一有效部位更容易明确物质基础，生产成本以及工艺难度更低，也更容易进行质量控制。
开发物质基础基本明确、作用机理相对清楚、疗效确切、安全性高的中药有效部位药物具有重要的社会意义和广阔的市场前景。已有文献报道了北水苦荬含有一系列环烯醚萜类成分[3,4]，其中胡黄连苷II可通过减少活性氧产生的机制改善线粒体功能，从而抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡[5]，因此值得进一步研究其活性成分以获得更安全有效的抗心衰有效部位。
现有技术中还公开了一种用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位、制备方法及从中分离有效成分的方法(CN104840451A，2015.08.19)，其以姜黄科植物毛郁金(Curcuma aromatica salisb.)的干燥根茎为药用部位，经有机溶剂提取，提取物经分离、纯化得到含有倍半萜类成分的有效部位，有效部位中倍半萜类成分的含量大于50％，药理实验研究表明莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮和及总提取物均有显著治疗心肌缺血作用，可明显减小缺血所致大鼠心肌损伤心肌梗塞区范围，对冠脉结扎大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用。该专利涉及到5种制备方法，其中4种方法涉及到除乙醇以外的有机溶剂，在生产工艺过程中需要考察有机溶剂残留，生产成本以及环保成本较高，另一种大孔树脂分离的方法得到的有效部位中活性成分的含量为54.06％，仍有较大一部分物质基础未能阐明。
参考文献如下：
[1]一种抗慢性心衰中药复方有效成分的提取方法。公开号CN113181201A，公开日：2021.07.30；
[2]一种具有心肌保护作用的杜仲组分组合物及其制剂。公开号CN104435067A，公开日：2015.03.25；
[3]Harput U S,Varel M,Nagatsu A,et al.Acylated iridoid glucosidesfrom Veronica anagallis-aquatica[J].Phytochemistry,2004,65(14):2135-2139；
[4]Su B N,Zhu Q X,Jia Z J.Aquaticol,a novel bis-sesquiterpene fromVeronica anagallis-aquatica[J].Tetrahedron Letters,1999,40(2):357-358；
[5]Li J,Yu S,Mo D,et al.PicrosideⅡinhibits hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte apoptosis by ameliorating mitochondrial functionthrough a mechanism involving a decrease in reactive oxygen speciesproduction.[J].International Journal of Molecular Medicine,2015,35(2):446-452。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中治疗心肌缺血的药物要么治疗效果欠佳、要么物质作用基础不明确的缺陷，而提供了一种水苦荬提取物及其制备方法和应用。本发明中明确了水苦荬提取物的活性成分，制备得到了质量稳定的有效部位，明确了药效的物质作用基础，有效提升了用药安全性。
对于水苦荬提取物，本发明通过制备液相从水苦荬乙醇提取物(例如北水苦荬75％乙醇提取物)中制备得到环烯醚萜苷有效部位，并利用高速逆流色谱技术从中分离得到毛蕊花甙(Verproside)、梓苷(Catalposide)、胡黄连苷II(Picroside II)三个活性成分，并在体内外验证了其抗心衰药效和安全性。
本发明提供了一种水苦荬提取物，所述水苦荬提取物中包含环烯醚萜苷类活性成分，所述环烯醚萜苷类活性成分中包含毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II；其中：
所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为40-90％；
所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.0-5.0):1；
所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.1-3.0)。
本发明中，所述水苦荬提取物可为本领域常规的车前科植物北水苦荬(Veronicaanagallis-aquatica L.)及水苦荬(Veronica undulata Wall.)的全草的提取物；优选地，所述水苦荬提取物为车前科植物北水苦荬Veronica anagallis-aquatica L.及水苦荬Veronica undulata Wall.的地上部分的提取物。
其中，所述北水苦荬可为产自云南省大理州漾濞县的北水苦荬，也可为产自云南省大理市的北水苦荬。
本发明中，所述水苦荬提取物可采用下述方法制得：将水苦荬粗提物经柱层析洗脱，即可；其中：
所述柱层析中的吸附剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
所述洗脱的流动相为水和乙腈。
其中，所述水苦荬粗提物可为本领域常规的水苦荬粗提物，例如体积分数为0-95％(例如70-80％，再例如75％)乙醇提取得到的提取物。
所述水苦荬粗提物可采用下述方法制得：将植物药材水苦荬和提取溶剂混合，经加热提取、过滤得滤液，制得；所述提取溶剂可为体积分数为0-95％的乙醇。
所述植物药材水苦荬可经过粉碎预处理再经加热提取。所述粉碎可为粉碎至30目。
所述提取溶剂可为体积分数为70-80％的乙醇，例如体积分数为75％的乙醇。
所述植物药材水苦荬的质量g和所述提取溶剂的体积mL之比可为本领域常规的比例，例如1:(5-15)，再例如1:10。
所述加热提取的温度可为92-98℃，例如95℃。
所述加热提取的方式可为加热回流提取。
所述加热提取的次数可为一次或两次及以上。
所述加热提取的时间可为1-3h，例如2h。当所述加热提取的次数为两次次及以上时，所述加热提取的单次时间可为1-3h，例如2h。
所述过滤的筛网目数可为200目。
所述滤液还可按照本领域常规手段进行浓缩、干燥。所述浓缩可为65℃±5℃旋蒸浓缩至稠膏。所述干燥可为真空干燥。
其中，所述水苦荬粗提物在经柱层析洗脱前可用水溶解。所述水苦荬粗提物在溶解后可经过滤除去不溶物。
其中，所述吸附剂的粒径可为5-15μm，例如10μm。
其中，所述柱层析的柱温可为20-30℃，例如25℃。
其中，所述柱层析中的柱子可为DAC50柱。
其中，所述洗脱可为梯度洗脱。
优选地，当所述洗脱为梯度洗脱时，流动相A为水，流动相B为乙腈；以所述流动相A和B的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序如下：
在0-10min，所述流动相A的体积为95％；
在10-20min，所述流动相A的体积由95％递减至90％；
在20-60min，所述流动相A的体积由90％递减至50％。
当采用上述梯度洗脱的程序时，可接取24-40min的洗脱液。
其中，所述流动相的流速可为50-90mL/min，例如70mL/min。
其中，所述洗脱后所得的洗脱液，可按本领域常规手段进行后处理，例如，先经减压浓缩除去乙腈，再经冷冻干燥得到固体有效部位。
本发明中，优选地，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.5-4.8):1，例如(3.56-4.75):1，再例如3.56:1或4.75:1。
本发明中，优选地，所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.3-2.8)，例如1:(0.33-2.5)，再例如1:0.33或1:2.5。
本发明中，优选地，所述毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II的质量比为4.75:1:2.5或3.56:1:0.33。
本发明中，优选地，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(4.0-5.0):1，所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.3-3.0)。
本发明中，优选地，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.0-5.0):1，所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.31-2.5)。
本发明中，所述毛蕊花甙和梓苷的质量比可为(4.0-5.0):1或(3.0-4.0):1，例如4.75:1或3.56:1。
本发明中，所述梓苷和胡黄连苷II的质量比可为1:(0.31-3.0)，例如1:0.33或1:(2.0-3.0)，还例如1:2.5。
本发明中，所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比优选为40-80％，例如40-50％、50-80％或50-70％，还例如44％或66％。
本发明中，所述毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为30-50％，例如32％、38％。所述重量百分比的计算中，不包含所述水苦荬提取物中所含有的溶剂。
本发明中，所述梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为5-15％，例如8％或9％。所述重量百分比的计算中，不包含所述水苦荬提取物中所含有的溶剂。
本发明中，所述胡黄连苷II在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为1-40％，例如3％或20％。
优选地，当所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为50-80％(例如66％)时，毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为30-50％(例如38％)，梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为5-15％(例如8％)，胡黄连苷II在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为10-30％(例如20％)。
优选地，当所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为40-80％(例如44％)时，毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为30-50％(例如32％)，梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为5-15％(例如9％)，胡黄连苷II在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为1-20％(例如3％)。
本发明还提供了一种水苦荬提取物的制备方法，其包括下述步骤：将水苦荬粗提物经柱层析洗脱，即可；其中：
所述柱层析中的吸附剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
所述洗脱的流动相为水和乙腈。
本发明中，所述水苦荬提取物可为本领域常规的玄参科植物北水苦荬Veronicaanagallis-aquatica L.及水苦荬Veronica undulata Wall.的全草的提取物，优选为地上部分的提取物。
本发明中，所述水苦荬粗提取物可采用下述方法制得：将植物药材水苦荬和提取溶剂混合，经加热提取、过滤得滤液，即可；所述提取溶剂可为体积分数为0-95％的乙醇。
所述植物药材水苦荬可经过粉碎预处理再经加热提取。所述粉碎可为粉碎至30目。
所述提取溶剂可为体积分数为70-80％的乙醇，例如体积分数为75％的乙醇。
所述植物药材水苦荬的质量g和所述提取溶剂的体积ml之比可为本领域常规的比例，例如1:(5-15)，再例如1:10。
所述加热提取的温度可为92-98℃，例如95℃。
所述加热提取的方式可为加热回流提取。
所述加热提取的次数可为一次或两次及以上。
所述加热提取的时间可为1-3h，例如2h。当所述加热提取的次数为两次次及以上时，所述加热提取的单次时间可为1-3h，例如2h。
所述过滤的筛网目数可为200目。
所述滤液还可按照本领域常规手段进行浓缩、干燥。所述浓缩可为65℃±5℃旋蒸浓缩至稠膏。所述干燥可为真空干燥。
本发明中，所述水苦荬粗提物在经柱层析洗脱前可用水溶解。所述水苦荬粗提取物在溶解后可经过滤除去不溶物。
本发明中，所述吸附剂的粒径可为5-15μm，例如10μm。
本发明中，所述柱层析的柱温可为20-30℃，例如25℃。
其中，所述柱层析中的柱子可为DAC50柱。
本发明中，所述洗脱可为梯度洗脱。
其中，优选地，当所述洗脱为梯度洗脱时，流动相A为水，流动相B为乙腈；以所述流动相A和B的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序如下：
在0-10min，所述流动相A的体积为95％；
在10-20min，所述流动相A的体积由95％递减至90％；
在20-60min，所述流动相A的体积由90％递减至50％。
当采用上述梯度洗脱的程序时，可接取24-40min的洗脱液。
本发明中，所述流动相的流速可为50-90mL/min，例如70mL/min。
本发明中，所述洗脱后所得的洗脱液，可按本领域常规手段进行后处理，例如，先经减压浓缩除去乙腈，再经冷冻干燥得到固体有效部位。
本发明还提供了一种水苦荬提取物，其采用上述方法制得。
本发明还提供了一种所述水苦荬提取物在制备治疗和/或预防心力衰竭的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗和/或预防心力衰竭的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述水苦荬提取物。
术语“心力衰竭”是指在适量静脉回流的情况下，由于心肌舒张和/或收缩功能障碍，心排血量不足以维持组织代谢需要而引起的以循环功能障碍为主的综合征，集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。
术语“治疗有效量”是指为缓解个体的心力衰竭的症状所需要的量。对每种具体情况中的个体要求调节剂量。该剂量可以在较宽范围内变化，其取决于许多因素如待治疗病症的严重性、患者的年龄和总体健康状况、患者正用于治疗的其他药物、给药的途径和形式以及医生的偏好和经验。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
从单味中药材水苦荬的提取物(例如75％乙醇提取物)中通过制备液相制备得到了主要由三个活性成分构成的环烯醚萜苷有效部位，在体外细胞水平上验证了对心肌细胞氧糖剥夺损伤的保护作用，在异丙肾上腺素诱导心衰小鼠模型和左冠状动脉前降支结扎心衰小鼠模型上验证了体内抗心衰药效，并通过亚急毒实验验证了其安全性。
附图说明
图1为OGD模型下模型组、阳性对照组和有效部位组的细胞存活率。
图2为有效部位对新生SD大鼠原代心肌细胞的作用；其中，图A为OGD模型下细胞存活率；图B为跳动次数-时间曲线。
图3为异丙肾上腺素造模小鼠的心脏病理切片。
图4为心梗手术造模小鼠的心脏切片Masson染色(15x)。
图5为有效部位以6g/kg剂量进行持续两周的连续给药后，小鼠的重要脏器外观图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：有效部位的制备
批次一：北水苦荬(Veronica anagallis-aquatica L.)75％乙醇提取物采用下述方法制得：取植物药材北水苦荬(Veronica anagallis-aquatica L.)约3kg(产地为云南省大理州漾濞县)，粉碎过30目，用10倍量75％乙醇(g/ml)在95℃条件下回流提取3次，每次2小时，提取液过滤200目，合并后65℃±5℃旋蒸浓缩至稠膏，真空干燥后粉碎得提取物粉末715g。
取上述北水苦荬(Veronica anagallis-aquatica L.)75％乙醇提取物粉末300g，用水溶解后过滤除去不溶物；滤液于DAC50柱(C18，300g，10μm)上进行制备。以水为流动相A，乙腈为流动相B；流速70mL/min，梯度洗脱程序见表1，检测波长254nm，柱温25℃，进样量1L(进样量1L是指进样1L的75％醇提物滤液)。接取24-40min的洗脱液，减压浓缩至乙腈除尽，经冷冻干燥得到固体有效部位42g。
表1：有效部位制备的梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
10 95 5
20 90 10
60 50 50
批次二：植物药材北水苦荬(Veronica anagallis-aquatica L.)产自云南省大理市，其余条件同批次一。经冷冻干燥得到固体有效部位38g。
实施例2：环烯醚萜苷类活性成分的分离
配置乙酸乙酯-正丁醇-水两相溶剂，分相。以上相为固定相泵入半制备型逆流色谱(TBE-300C，上海同田)主机内，以800rpm的转速和3.0mL/min流速泵入下相作为流动相，进行体系平衡。平衡达到完全平衡，用下相溶剂溶解批次一的固体有效部位样品，开始进样，每次进样300mg。样品在主机内进行分离，经过检测器检测收集分离样品馏分。
经HPLC检测，毛蕊花甙纯度为95.2％、梓苷纯度为99.2％、胡黄连苷II纯度为95.5％。
实施例3：对三种活性成分的结构鉴定
用核磁共振方法(氢谱、碳谱)、质谱(ESI-高分辨)等波谱方法对实施例2中分离得到的成分进行结构确证。结构表征数据如下。
毛蕊花甙1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.40(d,J＝2.2Hz,1H),7.36(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),6.83(d,J＝8.3Hz,1H),6.42(dd,J＝5.9,1.8Hz,1H),5.10(d,J＝9.5Hz,1H),5.04(dd,J＝8.2,1.3Hz,1H),4.95(dd,J＝6.0,4.4Hz,1H),4.62(d,J＝7.8Hz,1H),3.92(d,J＝13.3Hz,1H),3.74–3.70(m,2H),3.68(d,J＝1.3Hz,1H),3.44–3.41(m,1H),3.19(t,J＝9.0Hz,1H),3.16(td,J＝7.2,3.5Hz,1H),3.07–3.04(m,1H),3.04–3.01(m,1H),2.54(ddt,J＝12.1,6.1,1.9Hz,4H),2.48(dd,J＝9.6,7.7Hz,1H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ166.12,151.40,145.65,141.61,122.63,120.40,116.82,115.87,102.25,98.32,93.43,79.96,77.93,76.89,73.90,70.74,66.23,61.87,58.95,58.70,42.28,35.66；HRMS(ESI)m/zcalcd for C22H26NaO13 +[M+Na]+521.1266,found 521.1272.
梓苷1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.88–7.83(m,2H),6.89–6.85(m,2H),6.43(dd,J＝6.0,1.9Hz,1H),5.11(d,J＝9.6Hz,1H),5.06(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),4.96(dd,J＝6.0,4.4Hz,1H),4.62(d,J＝7.8Hz,1H),3.92(d,J＝13.2Hz,1H),3.75–3.68(m,3H),3.43(dd,J＝11.9,6.9Hz,1H),3.22–3.14(m,2H),3.04(dt,J＝12.9,8.8Hz,2H),2.56(tdd,J＝8.0,4.5,2.0Hz,1H),2.48(dd,J＝9.6,7.7Hz,1H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ166.03,162.93,141.60,132.19,120.17,115.95,102.25,98.33,93.42,80.05,77.94,76.89,73.90,70.74,66.26,61.87,58.93,58.67,42.26,35.61；HRMS(ESI)m/z calcd for C22H26NaO12 +[M+Na]+505.1316,found 505.1319.
胡黄连苷II 1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.52(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.46(d,J＝2.1Hz,1H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),6.43(dd,J＝6.0,1.9Hz,1H),5.11(d,J＝9.7Hz,1H),5.06(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),4.97(dd,J＝6.0,4.4Hz,1H),4.62(d,J＝7.8Hz,1H),3.92(d,J＝13.2Hz,1H),3.82(s,3H),3.75–3.69(m,3H),3.43(dd,J＝11.9,7.0Hz,1H),3.20(t,J＝8.9Hz,1H),3.16(ddd,J＝9.3,6.9,2.1Hz,1H),3.07–3.01(m,2H),2.58(tdd,J＝8.0,4.5,2.0Hz,1H),2.48(dd,J＝9.6,7.7Hz,1H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ166.10,148.05,141.56,124.34,115.79,113.11,102.30,98.31,93.41,80.13,77.94,76.89,73.90,70.74,66.29,61.88,58.91,58.69,56.11,42.28,35.62；HRMS(ESI)m/z calcd for C23H28NaO13 +[M+Na]+535.1422,found 535.1429.
实施例4：有效部位中环烯醚萜苷的含量检测分析
精密称取毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II对照品适量，加甲醇溶解制成1mg/mL的对照品溶液。同时精密称取制备的有效部位适量(实施例1批次一中的经冷冻干燥后获得的固体有效部位)加甲醇溶解制成1mg/mL的供试品溶液。采用Waters Alliance 2695高效液相色谱和Unitray C18(150×4.6mm i.d.,5.0μm,
Figure BDA0004024478630000092
华谱新创科技有限公司)，以水为流动相A，乙腈为流动相B，流速1mL/min，梯度洗脱程序见表2，检测波长254nm，柱温25℃，对照品进样量1μL，供试品进样量10μL，各取三次分析结果取峰面积平均值。测得批次一的固体有效部位中：毛蕊花甙含量为38％、梓苷含量为8％、胡黄连苷II含量为20％。
表2：分析梯度洗脱程序
Figure BDA0004024478630000091
Figure BDA0004024478630000101
表3：批次一的有效部位中三个活性成分含量测定
化合物 标准品峰面积 有效部位峰面积 含量(mg/mL)
毛蕊花甙 956061 3611735 0.38
梓苷 3388043 2730279 0.08
胡黄连苷II 1228229 2469599 0.20
采用和批次一中的固体有效部分相同的环烯醚萜苷的含量检测分析方法，测得批次二的固体有效部位中：毛蕊花甙含量为32％(0.32mg/mL)、梓苷含量为9％(0.09mg/mL)、胡黄连苷II含量为3％(0.03mg/mL)。
实施例5：活性成分和有效部位在体外氧糖剥夺(OGD)模型下对H9c2(2-1)细胞的保护作用
5.1实验方法
将培养好的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)消化计数后按8000/孔的数量接种至96孔板中，待细胞长至70-80％密度后，把活性成分母液(活性成分母液是指毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II三个化合物分别溶解后制得的母液)和实施例1中经冷冻干燥后获得的批次一固体有效部位、批次二固体有效部位稀释成所需浓度加入到孔板中进行预处理，12小时后，将造模组的培养基替换成含对应浓度活性成分、固体有效部位的PBS溶液，各造模组活性成分的种类、浓度，以及固体有效部位的种类、浓度，和预处理时相同(单独的活性成分和有效部位稀释液，从造模前12小时开始到造模6小时后结束，一直与细胞共孵育)，并将孔板置于缺氧小室中，N2置换空气后将缺氧小室放回细胞培养箱继续培养6小时。对照组细胞继续放在细胞培养箱中正常培养。造模结束后，弃上清，每孔加入100μL CCK-8检测液，37℃培养箱内避光孵育2小时，用酶标仪检测450nm波长下的吸光值(OD值)。
5.2数据处理
细胞存活率(％)＝[(ODOGD处理组-OD溶剂对照)/(OD正常对照组-OD溶剂对照)]×100％。用GraphPadPrism 7软件统计分析实验结果，以平均值±标准误差表示实验结果，组间比较采用Unpaired t检验。*：显著性差异相对于模型组。
5.3实验结果
各活性成分在OGD模型下对心肌细胞生存率的影响结果见图1、表4-1、表4-2、表4-3。结果显示模型组细胞存活率较正常对照组降低至36.4％，说明OGD损伤严重，造模成功。三个环烯醚萜苷活性成分在一定浓度下可明显提高细胞存活率，表明分离得到的三个化合物确实有心肌细胞保护作用。
表4-1
药物种类 给药浓度 细胞存活率(％)
不给药，模型组 / 36.36±0.77
尼可地尔 100μM 41.07±1.27**
毛蕊花甙 1μM 38.67±0.50
毛蕊花甙 25μM 43.49±1.77**
毛蕊花甙 50μM 47.07±1.33****
毛蕊花甙 100μM 50.03±0.59****
梓苷 1μM 38.03±0.28
梓苷 25μM 43.56±2.25**
梓苷 50μM 44.52±0.71****
梓苷 100μM 45.76±1.08****
胡黄连苷II 1μM 43.76±1.89**
胡黄连苷II 25μM 45.87±1.44***
胡黄连苷II 50μM 49.95±1.30****
胡黄连苷II 100μM 56.51±2.16****
表4-2
药物种类 给药浓度 细胞存活率(％)
不给药，模型组 / 54.48±1.61
尼可地尔 100μM 60.57±0.95*
有效部位(批次一) 100μg/mL 69.29±2.83**
有效部位(批次一) 200μg/mL 73.56±1.86***
有效部位(批次一) 400μg/mL 74.66±2.23***
有效部位(批次二) 100μg/mL 67.41±2.32**
有效部位(批次二) 200μg/mL 72.24±0.94***
有效部位(批次二) 400μg/mL 73.45±0.75***
基于表4-1和4-2，根据：(给药组细胞存活率-模型组细胞存活率)/(100-模型组细胞存活率)，这一指标可知，相比于单体组，有效部位组实现了更为优异的心肌细胞保护效果。
表4-3
Figure BDA0004024478630000121
实施例6：批次一的固体有效部位在体外氧糖剥夺(OGD)模型下对H9c2(2-1)细胞的保护作用
6.1实验方法
将培养好的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)消化计数后按80000/孔的数量接种至12孔板中，待细胞长至70-80％密度后，把有效部位母液(实施例1中的经冷冻干燥后获得的批次一的固体有效部位)稀释成所需浓度加入到孔板中进行预处理，12小时后，将造模组的培养基替换成含对应浓度有效部位的PBS溶液，并将孔板置于缺氧小室中，N2置换空气后将缺氧小室放回细胞培养箱继续培养6小时。对照组细胞继续放在细胞培养箱中正常培养。
6.1.1活性氧(ROS)含量检测：造模结束后，弃上清，加入DCFH-DA工作液覆盖细胞，37℃细胞培养箱内避光孵育30min；用无血清培养液洗涤细胞1～2次，使用荧光显微镜拍摄(480nm波长激发)。
6.1.2乳酸脱氢酶(LDH)含量检测：造模结束后，取各孔上清液于96孔板中，避光条件下加入LDH工作液50μL，37℃避光孵育30min，每孔加入50μL终止液，用酶标仪检测490nm波长下OD值。
6.1.3结晶紫染色：造模结束后，弃上清，将待染细胞置于冰上，用预冷PBS清洗细胞两次，每次3-5min；用预冷的甲醇固定细胞10min，吸除甲醇，加入0.5％结晶紫染液覆盖细胞，孵育10min；回收结晶紫染液，清水清洗已染细胞至染液洗脱完毕；室温待干，于显微镜下拍摄。
6.2数据处理
LDH释放倍数＝(OD测试孔-OD对应溶剂对照)/(OD模型组-OD对应溶剂对照)；ROS荧光强度和结晶紫染色面积用ImageJ定量。用GraphPad Prism 7软件统计分析实验结果，以平均值±标准误差表示实验结果，组间比较采用Unpaired t检验。#：显著性差异相对于正常对照组，*：显著性差异相对于模型组。
6.3实验结果
如表5-1所示，对照组细胞基本没有活性氧生成，而经过OGD处理的细胞均有活性氧产生，而200μg/mL和400μg/mL有效部位处理组细胞产生的活性氧较模型组显著减少，尤其400μg/mL有效部位处理组，表明有效部位可通过减少活性氧的产生来发挥细胞保护作用。批次一的固体有效部位稀释后的液体中，毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II的实际浓度如表5-2所示。
表5-1
Figure BDA0004024478630000131
表5-2
Figure BDA0004024478630000132
如表6所示，OGD处理后模型组LDH的释放量较正常对照组显著增加，而各个浓度有效部位处理的细胞LDH释放量较模型组显著下降，体现了对心肌细胞的保护作用。
表6
Figure BDA0004024478630000133
如表7所示，模型组的染色面积相较于对照组明显减少，表明细胞量显著减少，经有效部位处理的组别染色面积相较于模型组增多，且呈现浓度依赖性，有效部位400μg/mL处理组的细胞数量最多，即对细胞的保护作用最显著。
表7
Figure BDA0004024478630000141
实施例7：批次一的固体有效部位对新生SD大鼠原代心肌细胞的作用
7.1实验方法
取出生1-3天的新生SD大鼠的心脏，用磷酸缓冲盐冲洗血迹；用眼科剪将心脏剪成糜状组织块后加入II型胶原酶37℃水浴消化，重复三次，组织块消化完全后过200目筛网；过筛后的细胞液1000rpm离心5分钟，弃上清，用心肌细胞专用培养基将细胞重悬并转移至培养皿中于37℃培养箱内培养90分钟，吸取悬液重新接种于另一培养皿中，加入0.1mM的5-BrdU后继续于37℃培养箱内培养。每48小时换一次液。
7.7.1细胞存活率检测：将提取的原代大鼠心肌细胞消化计数后按1.6万/孔的数量接种至48孔板中，待细胞生长48小时后，把批次一的固体有效部位溶解后的母液稀释成所需浓度加入到孔板中进行预处理，6小时后，将造模组的培养基替换成含对应浓度有效部位(实施例1批次一中的经冷冻干燥后获得的固体有效部位，固体有效部位稀释后的液体中，毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II的实际浓度如表5-2所示)的PBS溶液，并将孔板置于缺氧小室中，N2置换空气后将缺氧小室放回细胞培养箱继续培养3小时。造模结束后，弃上清，每孔加入100μL CCK-8检测液，37℃培养箱内避光孵育4小时，用酶标仪检测450nm波长下的吸光值(OD值)
7.1.2细胞跳动次数统计：将提取的新生SD大鼠心肌细胞均匀得接种于6个35mm培养皿中，分为两组，37℃，5％ CO2细胞培养箱培养24h换液继续培养24h，待细胞均匀复跳；批次一的固体有效部位组加入样品母液使终浓度为200μg/mL，正常对照组加入等量DMSO作为对照；加入后立马在显微镜下观察采集细胞跳动视频(15s)，每皿采集5个细胞，每组共采集15个细胞；拍摄结束后立马将细胞放回培养箱；按上述操作同样采集给药后12h，24h，36h和48h的跳动视频，统计每个视频中细胞跳动次数。
7.2数据处理
细胞存活率(％)＝[(ODOGD处理组-OD溶剂对照)/(OD正常对照组-OD溶剂对照)]×100％。用GraphPadPrism 7软件统计分析实验结果，以平均值±标准误差表示实验结果，组间比较采用Unpaired t检验。#：显著性差异相对于对照组，*：显著性差异相对于模型组。
7.3实验结果
如图2A、表8所示，经3小时OGD损伤后，模型组的原代细胞存活率降至49.2％，造模成功，不同浓度的有效部位处理后，都显著提高了细胞的存活率，并且呈现出明显的浓度依赖性，有效部位400μg/mL组将细胞存活率提高到75.1％。证实了有效部位对原代心肌细胞的OGD损伤有很好的保护作用，确实是减少了细胞的死亡，因为原代心肌细胞不会增殖。
表8
药物种类 给药浓度 细胞存活率(％)
不给药，模型组 / 49.15±1.31
尼可地尔 100μM 53.68±0.37*
有效部位(批次一) 100μg/mL 62.30±2.06**
有效部位(批次一) 200μg/mL 67.26±0.37***
有效部位(批次一) 400μg/mL 75.13±2.36***
如图2B、表9所示，随着新生SD大鼠原代心肌细胞培养时间的加长，心肌细胞自主搏动的频次会自然下降。有效部位处理可以使原代心肌细胞维持更高频率的跳动，而心肌细胞节律性的跳动是心脏收缩舒张的动力来源，因此能够推测有效部位具有在不利条件下维持心脏收缩舒张功能的潜力。
表9
Figure BDA0004024478630000151
实施例8：批次一的固体有效部位对异丙肾上腺素(ISO)诱导心衰小鼠的治疗作用
8.1实验方法
7周龄的C57雄鼠分为4组(正常对照组、模型组、有效部位0.15g/kg组和有效部位0.6g/kg组)，每组10只老鼠。每天上午灌胃给药(实施例1中的经冷冻干燥后获得的批次一的固体有效部位和实施例1中的75％乙醇提取物)，对照组和模型组给等量饮用水，上午和下午各皮下注射盐酸异丙肾上腺素一次，第1-2天剂量为40mg/kg，第3-7天剂量为20mg/kg，第8-14天剂量为10mg/kg，对照组注射等量生理盐水。第15天采用Visual-Sonics Vevo3100小动物高分辨率显微超声成像系统评价各组实验小鼠的心脏结构及功能，第16天解剖小鼠取心脏制心脏切片，切片进行HE染色和Masson染色。
8.2数据处理
采用Vevo软件取3个心动周期，测量收缩期室间隔厚度(IVSs)、舒张期室间隔厚度(IVSd)、左心室收缩期内径(LVIDs)、左心室舒张期内径(LVIDd)、左心室收缩期后壁厚度(LVPWs)、左心室舒张期后壁厚度(LVPWd)，计算射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、左心室收缩末容量(LVESV)和左心室舒张末容量(LVEDV)，用imageJ定量纤维化面积，用GraphPadPrism 7软件统计分析实验结果，以平均值±标准误差表示实验结果，组间比较采用Unpaired t检验。#：显著性差异相对于对照组，*：显著性差异相对于模型组。
8.3实验结果
如表10-1、表11结果所示，模型组的小鼠心功能较正常小鼠显著减退，具体表现为射血分数和短轴缩短率下降，左心室收缩末容量和左心室舒张末容量增大，纤维化面积增加。有效部位高低剂量给药组均能显著改善盐酸异丙肾上腺素造成的心功能减退，采用与有效部位高剂量组同等剂量治疗的75％乙醇提取物组的小鼠并没有表现出药效，虽然在先专利(申请号：CN202011417172.0)公开了中药水莴苣抗心衰新用途中水莴苣(即北水苦荬)75％乙醇提取物0.6g/kg剂量在异丙肾上腺素诱导模型下表现出了显著药效，但是可以看到该在先专利和本发明中异丙肾上腺素诱导剂量和频次不同，本发明采用一天两次异丙肾上腺素刺激，且单日给药总剂量更高，同时考虑到粗提物中有效成分含量受药材采收季节、炮制等影响，有效成分尚不明确，无法检测有效成分含量进行质量控制，导致在本次实验中75％乙醇提取物出现阴性结果，而本发明中的有效部位活性成分明确，可以进行质量控制，克服了药效不稳定的问题且药效更佳，在更低剂量下表现出药效。
结合病理切片的结果，如图3所示，模型组的小鼠心脏切片HE染色显示有明显的炎性浸润(箭头所指)，Masson染色显示心脏纤维化严重，造成了明显的器质性损伤，0.15g/kg剂量组略微减轻了炎症反应和纤维化，0.6g/kg高剂量组则很好得缓解了炎症反应和纤维化，表现出更优的药效，75％乙醇提取物组效果跟有效部位(批次一)0.15g/kg剂量组相当。
表10-1：心功能指标
Figure BDA0004024478630000161
Figure BDA0004024478630000171
表10-2
Figure BDA0004024478630000172
表11
Figure BDA0004024478630000173
实施例9：批次一固体有效部位对心梗手术(MI)构建心衰小鼠的治疗作用
9.1实验方法
8-10周的C57雄鼠适应性饲养后，用异氟烷辅助麻醉对小鼠颈部及左胸位置进行脱毛，后将小鼠仰位固定，剪开颈部皮肤，分离开肌肉层使气管暴露，将气管导管经口插入，连接呼吸机，待小鼠自主呼吸与呼吸机同步后，将小鼠调整至右侧卧位，术区碘酒消毒，以第2至第3肋间为手切口，依次切开皮肤，胸大肌，暴露肋骨，打开胸膜，用开胸器扩胸，将心包剪开充分暴露心脏，在肺动脉圆锥与左心耳交界向下2～3mm处用无创缝合线结扎左冠状动脉前降支，以结扎部位以下出现心肌颜色变苍白、搏动减弱作为判断造模成功标志。造模后将相邻肋骨紧密缝合轻轻挤压胸壁，排出胸腔内的气体，缝好皮肤，用碘伏消毒。假手术组缝合线穿过心脏但不结扎。手术组小鼠术后第二天随机分成4组(手术组、有效部位0.15g/kg组、有效部位0.6g/kg组(实施例1中的经冷冻干燥后获得的批次一的固体有效部位)、阳性药LCZ696 0.06g/kg组)，每组9只老鼠。药物治疗组每天灌胃给药，假手术组和手术组灌胃给等体积的饮用水，持续14天。术后第15天采用Visual-Sonics Vevo 3100小动物高分辨率显微超声成像系统评价各组实验小鼠的心脏结构及功能，第16天解剖小鼠取心脏称重计算心体比，制心脏切片进行Masson染色。
9.2数据处理
采用Vevo软件测量IVSs、IVSd、LVIDs和LVIDd，取其平均值并计算EF％、FS％、LVESV LVEDV，用GraphPad Prism 7软件统计分析实验结果，以平均值±标准误差表示实验结果，组间比较采用Unpaired t检验，生存曲线采用Log-rank检验。#：显著性差异相对于对照组，*：显著性差异相对于模型组。
9.3实验结果
如表13结果所示，手术组的小鼠未经药物治疗，存活率仅为42.9％，心体比较假手术组小鼠显著升高，且心功能显著减退。有效部位低剂量给药组未能提高心梗小鼠的生存率也未能改善心功能，但0.6g/kg高剂量组显著提高了MI手术小鼠的存活率(100％)，改善小鼠心功能，降低心体比，且效果均优于阳性药。结合病理切片的结果，如图4、表12所示，0.6g/kg高剂量组还可以减轻心脏纤维化。综合来看，有效部位表现出强于临床一线使用的化学药的药效。固体有效部位稀释后的液体中，毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II的实际含量如表10-2所示。
表12
Figure BDA0004024478630000181
表13：生存率、心体比及心功能指标
Figure BDA0004024478630000182
Figure BDA0004024478630000191
实施例10：批次二的固体有效部位亚急毒评价
10.1实验方法
ICR小鼠饲养至体重约25g后随机分为两组，正常对照组(Control)、有效部位给药组(HL0877i-6g/kg)，每组10只，雌雄各半。每天给小鼠灌胃给6g/kg剂量有效部位(实施例1中的经冷冻干燥后获得的批次二的固体有效部位)(该剂量下，毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II是实际浓度依次为1.92g/kg、0.54g/kg、0.18g/kg)，正常对照组灌胃给等量饮用水。连续给药14天。每天观察小鼠的毒性反应情况和死亡情况，记录每日体重。给药第14天处死各组小鼠，解剖，肉眼观察小鼠各重要脏器是否病变，同时对心、肝、脾、肺、肾进行称重，脏器/体重计算脏体比。
10.2数据处理
用GraphPad Prism 7软件统计分析实验结果，以平均值±标准偏差表示实验结果，组间比较采用TWO-wayANOVA检验。
10.3实验结果
以有效剂量10倍剂量(6g/kg)进行持续两周的连续给药，实验期间无小鼠死亡，无明显毒性反应。如图5、表14所示，小鼠每日体重与正常对照组无异。第15天解剖小鼠，重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的颜色、质地、形态均与正常对照组无异，脏器与体重的比值也无显著差异。由此可见，有效部位的安全窗口在10倍以上，安全性佳。
表14
Figure BDA0004024478630000192
Figure BDA0004024478630000201
注：上表中体重的计算天数是以给药当天为0天计，也即，1天即为给药后第1天。
实施例11
水苦荬提取物：其制备方法同实施例1中批次一的75％乙醇提取物的制备方法，最终制得经冷冻干燥得到固体提取物。
(2)验证上述提取物在体外氧糖剥夺(OGD)模型下对H9c2(2-1)细胞的保护作用实验方法、数据处理同实施例5。
(3)实验结果
水苦荬提取物在OGD模型下对心肌细胞生存率的影响结果见表15。结果显示模型组细胞存活率较正常对照组降低至33.95％，说明OGD损伤严重，造模成功。水苦荬提取物在一定浓度下可明显提高细胞存活率，表明水苦荬提取物确实有心肌细胞保护作用。
表15
药物种类 给药浓度 细胞存活率(％)
不给药，模型组 / 33.95±1.14
尼可地尔 100μM 41.35±1.14*
水苦荬(批次一) 10μg/mL 45.02±0.90**
水苦荬(批次一) 50μg/mL 48.39±1.13***
水苦荬(批次一) 100μg/mL 57.11±1.65***

Claims (10)

1.一种水苦荬提取物，其特征在于，所述水苦荬提取物中包含环烯醚萜苷类活性成分，所述环烯醚萜苷类活性成分中包含毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II；其中：
所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为40-90％；
所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.0-5.0):1；
所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.1-3.0)。
2.如权利要求1所述的水苦荬提取物，其特征在于，所述水苦荬提取物满足下述条件中的一种或多种：
①所述水苦荬提取物为车前科植物北水苦荬(Veronica anagallis-aquatica L.)及水苦荬(Veronica undulata Wall.)的全草的提取物，例如地上部分的提取物；
②所述水苦荬提取物采用下述方法制得：将水苦荬粗提物经柱层析洗脱，即可；其中：
所述柱层析中的吸附剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
所述洗脱的流动相为水和乙腈。
3.如权利要求1所述的水苦荬提取物，其特征在于，所述水苦荬提取物满足下述条件中的一种或多种：
①所述水苦荬粗提物采用下述方法制得：将植物药材水苦荬和提取溶剂混合，经加热提取、过滤得滤液，制得；所述提取溶剂可为体积分数为0-95％的乙醇；
②所述水苦荬粗提物在经柱层析洗脱前用水溶解，所述水苦荬粗提物在溶解后经过滤除去不溶物；
③所述吸附剂的粒径为5-15μm，例如10μm；
④所述柱层析的柱温为20-30℃，例如25℃；
⑤所述柱层析中的柱子为DAC50柱；
⑥所述洗脱为梯度洗脱；
当所述洗脱为梯度洗脱时，优选地，流动相A为水，流动相B为乙腈；以所述流动相A和B的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序如下：
在0-10min，所述流动相A的体积为95％；
在10-20min，所述流动相A的体积由95％递减至90％；
在20-60min，所述流动相A的体积由90％递减至50％；
⑦所述流动相的流速为50-90mL/min，例如70mL/min；和
⑧所述洗脱后所得的洗脱液，先经减压浓缩除去乙腈，再经冷冻干燥得到固体有效部位。
4.如权利要求3所述的水苦荬提取物，其特征在于，所述水苦荬粗提物的制备方法满足下述条件中的一种或多种：
①所述植物药材水苦荬经过粉碎预处理再经加热提取；所述粉碎可为粉碎至30目；
②所述提取溶剂为体积分数为70-80％的乙醇，例如体积分数为75％的乙醇；
③所述植物药材水苦荬的质量g和所述提取溶剂的体积ml之比为1:(5-15)，例如1:10；
④所述加热提取的温度为92-98℃，例如95℃；
⑤所述加热提取的方式为加热回流提取；
⑥所述加热提取的次数为一次或两次及以上；
⑦所述加热提取的时间为1-3h，例如2h；当所述加热提取的次数为两次次及以上时，所述加热提取的单次时间可为1-3h，例如2h；
⑧所述过滤的筛网目数为200目；和
⑨所述滤液进行浓缩、干燥；所述浓缩可为65℃±5℃旋蒸浓缩至稠膏；所述干燥可为真空干燥。
5.如权利要求1-4中任一项所述的水苦荬提取物，其特征在于，所述水苦荬提取物满足下述条件中的一种或多种：
①所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.5-4.8):1，例如(3.56-4.75):1，再例如3.56:1或4.75:1；
②所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.3-2.8)，例如1:(0.33-2.5)，再例如1:0.33或1:2.5；
优选地，所述毛蕊花甙、梓苷和胡黄连苷II的质量比为4.75:1:2.5或3.56:1:0.33；
③所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为40-80％，例如40-50％或50-80％，还例如44％或66％；
④所述毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比为30-50％，例如32％、38％；
⑤所述梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比为5-15％，例如8％或9％；
和⑥所述胡黄连苷II在所述水苦荬提取物中的重量百分比为1-40％，例如3％或20％；
优选地，当所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为50-80％时，毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为30-50％，梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为5-15％，胡黄连苷II在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为1-40％；例如当所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为66％时，毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为38％，梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为8％，胡黄连苷II在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为20％；例如，当所述环烯醚萜苷类活性成分在所述水苦荬提取物中的重量百分比为44％时，毛蕊花甙在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为32％，梓苷在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为9％，胡黄连苷II在所述水苦荬提取物中的重量百分比可为3％。
6.如权利要求1-4中任一项所述的水苦荬提取物，其特征在于，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(4.0-5.0):1，所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.3-3.0)；
或者，所述毛蕊花甙和所述梓苷的质量比为(3.0-5.0):1，所述梓苷和所述胡黄连苷II的质量比为1:(0.31-2.5)；
或者，所述毛蕊花甙和梓苷的质量比为(4.0-5.0):1或(3.0-4.0):1，例如4.75:1或3.56:1；
或者，所述梓苷和胡黄连苷II的质量比为1:(0.31-3.0)，例如1:0.33或1:(2.0-3.0)，还例如1:2.5。
7.一种水苦荬提取物的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：将水苦荬粗提物经柱层析洗脱，即可；其中：
所述柱层析中的吸附剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
所述洗脱的流动相为水和乙腈。
8.如权利要求7所述的水苦荬提取物的制备方法，其特征在于，所述的水苦荬提取物的植物来源同权利要求2中所述的水苦荬提取物的植物来源；
和/或，所述的水苦荬提取物的制备方法同权利要求2-4中任一项所述的水苦荬提取物的制备方法。
9.一种水苦荬提取物，其采用如权利要求7或8所述的水苦荬提取物的制备方法制得。
10.一种如权利要求1-6和9中任一项所述的水苦荬提取物在制备治疗和/或预防心力衰竭的药物中的应用。
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