CN116349603A

CN116349603A - 多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法

Info

Publication number: CN116349603A
Application number: CN202310482750.6A
Authority: CN
Inventors: 钱丽华; 阮松林; 尹舒雅
Original assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Current assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-05-03
Filing date: 2023-05-03
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2043-05-03
Also published as: CN116349603B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，包括以下步骤：1)、从成熟的多花黄精果实中获取多花黄精种子，将多花黄精种子进行清洗和消毒；2)、将步骤1)所得的消毒后多花黄精种子切开，取出白色种胚放置于萌发培养基上，进行黑暗培养，待胚根膨大形成小球茎产生芽后转入光照培养，从而获得不定芽；萌发培养基为1/2MS+25～30g·L^‑1蔗糖+5.5～7.0g·L^‑1琼脂+0.1～0.3mg·L^‑1TDZ。本发明以多花黄精种子为材料，剥取种胚在适宜的培养基上进行培养，实现快速萌发，获得较高的萌发率，同时同步实现芽的增殖，可大大缩短多花黄精种苗组培生产周期。

Description

多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法。

背景技术

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)，是中国药典收录药材黄精的三种基源植物之一，其根状茎具有补气养阴，健脾、润肺、益肾的功效。经分析明确黄精含有糖类(含11.74％)、氨基酸、盐酸、蒽醌类、皂苷、木质素、生物碱、微量元素、色素和挥发性物质,药典明确黄精多糖作为黄精质量控制标准之一。现代药理研究表明具有降血糖、抗氧化、增强免疫、防治动脉粥样硬化、减轻全脑缺血-再灌注损伤等药理作用，临床主要用于提高免疫力、抗衰老等，具有显著的疗效。

近年来，随着黄精药用价值和营养保健等多功能价值不断被挖掘，黄精原料的需求量日益增加，仅依靠野生资源的采挖已远不能满足市场需求，且野蛮采挖会导致其野生资源枯竭，不利于黄精产业的可持续发展。多花黄精的繁殖主要为有性繁殖(种子繁殖)和无性繁殖(根茎繁殖)两种方式，但长期的自留根茎繁殖不但繁殖系数低、要消耗大量的药材同时会造成品质下降、病虫害的发生，种子繁殖则由于存在较强的综合休眠的特性，9月底果实收获后种子胚虽然形态上表现出成熟的特征，但种胚还未发育完全，还需要经过一段时间(即后熟)才具备发芽能力，自然条件下萌发率低，出苗周期长且不整齐，黄精人工栽培种源大多仍然来自于野生资源，其种苗问题已然成为限制黄精大面积人工栽培的瓶颈问题。本发明针对上述问题，提出一种多花黄精种子快速萌发及增殖的方法，以解决多花黄精种子深度休眠、萌发慢及不整齐的问题，推动多花黄精种苗产业发展。

专利CN114731952B提供了一种多花黄精人工种子及其制备方法，利用多花黄精种子消毒后接种在启动培养基中获得无菌苗，切取叶片培养获得愈伤组织，然后经液体悬浮培养后转固体培养获得体细胞胚，然后将体细胞胚与人工胚乳混合放入人工种皮中制成人工种子，萌发率可以达到90％，所述体细胞胚的获得需要利用多花黄精种子无菌萌发获得无菌苗的叶片进行诱导，多花黄精无菌苗的获得是第一步，且愈伤组织悬浮培养易污染且无法大规模生产。

专利CN114731952B的实施例1的步骤1)具体如下：将多花黄精种子用洗衣粉溶液洗3遍，用水清洗3遍，吸干表面水分后，在无菌环境中用75％的酒精消毒30s，再用0.10％的氯化汞消毒5min，用无菌水冲洗3遍，切下胚轴的下端(与氯化汞接触的一端)后将种子接种到多花黄精启动培养基(MS+6-BA 0.2mg/L+2,4-D 0.2mg/L+GA3 2.0mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖28g/L；pH5.9)中，培养得到多花黄精无菌苗。该专利中未明确切下胚轴下端部分的数据，而且多花黄精未萌发的种子是无法判胚轴的位置的，且该专利也未明确在多花黄精启动培养基中培养多久可以萌发并发育成无菌苗。

说明：上述步骤1)所得的“多花黄精无菌苗”可以实现扩繁，但该专利中没有扩繁的措施和手段，该专利主要的目的是制备人工种子，所得的无菌苗仅仅是利用其叶片来诱导愈伤组织，从而培养获得体细胞胚，作为人工种子的组成部分。该专利只描述了萌发率、成苗率和转化率，但没有明确每颗人工种子能萌发几株苗，从试验图片看，大多种子只能萌发一株苗，因而没有实现增殖。

专利CN114731952B步骤4)所得的“多花黄精人工种子”能用于培育成植株而不能实现扩繁。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，缩短多花黄精萌发时间，且可实现萌发和增殖同步，缩短组培周期。

为解决上述技术问题，本发明提供一种多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，包括如下步骤：

1)、从成熟的多花黄精果实中获取多花黄精种子，将多花黄精种子进行清洗和消毒；

2)、将步骤1)所得的消毒后多花黄精种子(完整种子)切开(沿种孔边切开)，取出白色种胚放置(直接放置)于萌发培养基上，进行黑暗培养，待胚根膨大形成小球茎产生芽后(胚根膨大形成小球茎且产生高度为10～15mm的芽)转入光照培养，从而获得不定芽；

萌发培养基为1/2MS+25～30g·L^-1蔗糖+5.5～7.0g·L^-1琼脂粉+0.1～0.3mg·L^- ¹TDZ；所述黑暗培养和光照培养温度均为25±2℃，光照培养光周期12h·d^-1；

说明：黑暗培养3～5d即开始萌动，而后继续于黑暗培养，直至胚根膨大形成小球茎产生高度为10～15mm芽；整个黑暗培养时间约为10±1天左右。

作为本发明的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法的改进：步骤2)的光照培养时间20～55d(优选45～55d)。

作为本发明的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法的进一步改进，还包括如下的步骤3)：

将增殖获得的不定芽接种于壮苗生根培养基上培养1.5～2个月，光照培养温度25±2℃，光周期12h·d^-1。

此步骤培养结束后，即可移栽驯化。

作为本发明的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法的进一步改进，步骤1)为：

将9月底成熟的多花黄精果实密封堆积直至果皮果肉能被搓洗掉(轻易搓洗掉)，从而获得多花黄精种子，将多花黄精种子用洗洁精稀释液浸泡30±5min，清水洗净，用吸水纸吸干种子表面水分；

在无菌超净台上将所得的种子用75％(体积％)酒精表面消毒60～120s，然后用无菌水洗涤(洗涤2～4次)，转入无菌瓶中，加入0.1％(质量％)升汞消毒10～20min，用无菌水洗涤(洗涤5～7次)；待用。

作为本发明的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法的进一步改进，所述步骤3)的壮苗生根培养基为MS+2mg·L^-1NAA+0.1％AC。

作为本发明的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法的进一步改进，所述萌发培养基为1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉+0.2mg·L^-1TDZ。

本发明通过对多花黄精种子进行切割，取出胚，脱离了胚乳和种皮中发芽抑制物质对种子萌发的抑制以及机械障碍，实现了胚的快速萌发和增殖一步化，从而实现种苗规模化生产。

本发明所得的不定芽能用于培育成植株并实现扩繁。

本发明为今后缩短多花黄精种子萌发和培育周期，为组培种苗产业化繁育奠定了良好的基础。

本发明具有如下技术优势：

1、本发明克服技术偏见，取消变温沙藏层积处理实现后熟以及采用赤霉素、CTK以打破种子休眠的常规技术方法，因为通过上述常规打破种子休眠的方法，多花黄精种子萌发和出苗周期还是很长，光沙藏时间至少需要3个月以上。

多花黄精种子属于综合休眠种子，胚需要后熟才能萌发，本发明在种皮和胚乳中存在抑制萌发的物质以及未成熟胚是多花黄精种子发芽困难的主要原因，因此通常采用上述手段来解决发芽困难问题的基础上，认为机械障碍可能也是导致多花黄精种子发芽困难的原因，因此采取将完整种子切开，取出白色种胚进行培养，可以脱离坚硬胚乳和种皮的机械障碍以及某些化学物质对发芽的抑制，也不需要后熟阶段，从而实现快速萌发。

2、采用离体胚培养时，本发明所述的培养基配方在实现快速萌发的同时还实现大量增殖，实现萌发和增殖一步化，进一步缩短了组培周期。

3、专利CN114731952B需要四个步骤才能获得人工种子，进而获得萌发的多花黄精种苗，而本发明只需一步即可实现多花黄精种子快速萌发和增殖，两步获得多花黄精种苗，为多花黄精种苗生产奠定良好的基础。

综上，本发明以多花黄精种子为试验材料，剥取种胚在适宜的培养基上进行培养，实现快速萌发，获得较高的萌发率，同时同步实现芽的增殖，可大大缩短多花黄精种苗组培生产周期。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同培养基配方对多花黄精种子萌发的影响；

图2为种子不同处理方式对多花黄精种子萌发及增殖的影响；

图3为多花黄精不定芽生根。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、培养基的筛选：

(1)种子预处理：

将成熟的多花黄精果实密封堆积直至果皮果肉能被轻易搓洗掉，从而获得多花黄精种子，将多花黄精种子用洗洁精稀释液(100毫升自来水加5ml洗洁精混合)浸泡30min，清水洗净，用干净的吸水纸吸干种子表面水分，待用；

(2)种子的消毒：在无菌超净台上将种子用75％(体积％)酒精表面消毒90s，然后用无菌水洗涤3次，转入无菌瓶中，加入0.1％(质量％)升汞消毒15min，用无菌水洗涤6次，待用；

(3)萌发培养基的设计和配制

以不添加任何植物生长激素的基础培养基1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉(M₀)作为对照；在此基础培养基的基础上分别添加不同浓度的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)、ZT、TDZ(噻苯隆)进行萌发试验。

具体为：

M₀：1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉；

M₁：1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+0.2mg·L^-1ZT；

M₂：1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉+1.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA；

M₃：1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉+1.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA+0.2mg·L^-1TDZ；

M₄：1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉+0.2mg·L^-1TDZ。

(4)种子处理与接种：

将消毒好的完整种子沿着种孔边切开，将带有1/2胚乳的具胚种子接种于M₀～M₄培养基中，将种子切面朝下或朝上放置于萌发培养基上，朝下放置时以胚能接触到培养基即可，朝上放置时则需要将其嵌入培养基以胚接触到培养基即可，黑暗培养一段时间(15天)后，此时胚根膨大形成小球茎且产生高度为10 -15mm的芽；而后转入光照培养。

每个处理接种种子数量45～50粒。所述黑暗培养温度为25±2℃；光照培养条件为温度25±2℃、光周期12h·d^-1，光照强度为23μmol·m^-2·s^-1，光照培养时间为15天。

(5)总计培养30d后(黑暗培养15天+光照培养15天)，测定每个处理的种子发芽率。所得结果如下表1，具体各处理发芽情况如图1。

表1不同外源激素处理多花黄精种子萌发情况

处理	平均发芽率％
		CK(M₀)	85.79±6.16
M₁	76.49±12.82
		M₂	71.91±16.99
M₃	83.70±8.96
		M₄	82.25±19.42

发芽率＝发芽的种子数量/播种的种子数量×100％

从发芽率来看，M₀、M₃、M₄ 30d发芽率较高，分别达到85.79％±6.16％、83.70％±8.96％和82.25％±19.42％，但M₀中芽无增殖，M3和M4处理中均有芽增殖，从扩繁角度来看，M3和M4均可作为多花黄精种子萌发和扩繁的培养基配方。

实施例2、多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法

(1)种子预处理和消毒同实施例1。

(2)培养基的设计和配制：采用实施例1中筛选出的萌发率较高且能实现芽增殖的培养基配方之一M₄。

(3)种子处理与接种：任选以下三种方式之一：

方法A：将消毒好的完整种子不切割直接接种于萌发培养基，将种子一半嵌入M₄培养基中以吸取水分和营养，黑暗培养一段时间(约50天，此时胚根膨大形成小球茎产生高度为10-15mm的芽)后转入光照培养。

方法B：将消毒好的完整种子沿着种孔边切开，将带有1/2胚乳的具胚种子接种于M₄培养基中，将种子切面朝下或朝上放置于M₄培养基上，朝下放置时以胚能接触到M₄培养基即可，朝上放置时则需要将其嵌入M₄培养基以胚接触到培养基即可，黑暗培养一段时间后(约15天，此时胚根膨大形成小球茎产生高度为10-15mm的芽)转入光照培养。

方法C(本发明)：将消毒好的多花黄精种子(完整种子)沿种孔的方向切开，取出白色种胚直接放置于M₄培养基上，黑暗培养一段时间(10天)后，此时胚根膨大形成小球茎且产生高度为10 -15mm的芽；而后转入光照培养。

每个处理接种种子数量45～50粒。待胚根膨大形成小球茎产生芽后转入光照培养，所述黑暗培养温度为25±2℃，光照培养条件为温度25±2℃、光周期12h·d^-1。

发芽率＝发芽的种子数量/播种的种子数量×100％。

培养30d(从黑暗培养的第1天开始起算)，测定每个处理的种子发芽率，60d(从黑暗培养的第1天开始起算)观察增殖情况(如图2)或成苗情况。结果：

方法C萌发率最高，达到100.00％，且有70.83％的芽出现了增殖，增殖倍数达到5以上。方法B其次，发芽率达到60％左右，仅8％的芽有增殖，增殖倍数小于3。方法A萌发最慢，萌发率仅为14％，且无芽增殖。

表2不同种子处理方式对多花黄精种子萌发和增殖的影响

增殖倍数＝培养后不定芽数/发芽的种子数×100％

方法C实现了多花黄精种子既快速萌发并增殖的目的，将萌发和增殖这两个组培步骤合二为一，从而可以缩短组培周期。

(4)、将方法C增殖获得的不定芽(从黑暗培养之日起起算，总计培养60天所得的不定芽)接种壮苗生根培养基上光照培养1.5～2个月(如图3)，然后按照已公开的《多花黄精组织培养体系的建立》(何艳，2019)进行移栽驯化。所述壮苗生根培养基参照《多花黄精组培育苗技术》(陈龙胜等，2018)，具体为：MS+2mg·L^-1NAA+0.1％AC。光照培养温度25±2℃，光周期12h·d^-1。

所得结果为：所移栽的多花黄精组培苗成活率可达到90％以上。

对比例1、将实施例2中的M₄培养基分别改成M₃培养基、M₀培养基、M₂培养基，仅仅按照方法C(离体胚)进行实验，其余等同于实施例2。所得结果如下：

当使用M₀培养基时，无增殖；

当使用M₂培养基时，发芽率为82％。

当使用M3培养基时，发芽率为100％，增殖倍数约为2.5。

对比例2、设置如下培养基：

培养基Ⅰ：MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂粉+0.2mg·L^-1TDZ。

以上述培养基Ⅰ替代M₄培养基，其余等同于实施例2的方法C。

两种培养基中多花黄精种子发芽率、增殖率相当，但从培养基成本角度来看，1/2MS培养基跟MS培养基相比由于大量元素减半从而成本更低，所以在多花黄精种苗规模化生产中选择1/2MS培养基更节约生产成本。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，其特征在于包括如下步骤：

2)、将步骤1)所得的消毒后多花黄精种子切开，取出白色种胚放置于萌发培养基上，进行黑暗培养，待胚根膨大形成小球茎产生芽后转入光照培养，从而获得不定芽；

萌发培养基为1/2MS+25～30g·L^-1蔗糖+5.5～7.0g·L^-1琼脂+0.1～0.3mg·L^-1TDZ；所述黑暗培养和光照培养温度均为25±2℃，光照培养光周期12h·d^-1。

2.根据权利要求1所述的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，其特征在于：步骤2)的光照培养时间20～55d。

3.根据权利要求2所述的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，其特征在于：步骤2)的光照培养时间45～55d。

4.根据权利要求1～3任一所述的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，其特征在于还包括如下的步骤3)：

5.根据权利要求4所述的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，其特征在于所述步骤1)为：

将成熟的多花黄精果实密封堆积直至果皮果肉能被搓洗掉，从而获得多花黄精种子，将多花黄精种子用洗洁精稀释液浸泡30±5min，清水洗净，用吸水纸吸干种子表面水分；

在无菌超净台上将所得的种子用75％酒精表面消毒60～120s，然后用无菌水洗涤，转入无菌瓶中，加入0.1％升汞消毒10～20min，用无菌水洗涤。

6.根据权利要求5所述的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，其特征在于：所述步骤3)的壮苗生根培养基为MS+2mg·L^-1NAA+0.1％AC。

7.根据权利要求1～6任一所述的多花黄精种子无菌快速萌发及增殖的方法，其特征在于：所述萌发培养基为1/2MS+30g·L^-1蔗糖+6.0g·L^-1琼脂+0.2mg·L^-1TDZ。