CN116334310A - 一种甲型流感病毒核酸检测试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种用于检测甲型流感病毒的引物组合及试剂盒，该引物组合以M1基因上CDS区域中第79‑338位核苷酸序列作为靶标序列，制备出的甲型流感病毒检测试剂或试剂盒，灵敏度高，从试验数据看出，检测限低至100 copies/mL，有助于在感染早期病毒载量较低时检测出患者的感染情况，便于临床上在患病前期就进行医学干预；结合胶体金层析技术，检测过程无需借助仪器设备，结果直观，判读简单，而且成本低，适合在基层医疗单位推广。

Description

一种甲型流感病毒核酸检测试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种甲型流感病毒核酸检测试剂及试剂盒，属于体外诊断试剂技术领域。
背景技术
甲型流感是最常见的季节性流感（seasonal influenza），其病原体为甲型流感病毒，其为目前全球活动的主要流感病毒。甲型流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），根据其表面抗原HA（haemagglutinin，血凝素）和NA（neuraminidase，神经氨酸酶）的抗原特性和序列特征可分为多种亚型，包括HA的18种抗原亚型（H1~H18）、NA的11种抗原亚型（N1~N11）。甲型流感病毒易变异，其编码HA和（或）NA的核苷酸序列容易发生突变，从而导致HA和（或）NA的抗原表位发生变化，致使人群原有的特异性免疫力失效，形成甲型流感传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行的特点。虽然流感具有自限性，但对免疫力低下人群（如幼儿、孕妇和老年人等）仍可能造成致命危害。如果在流感发病后24~48小时内给予抗病毒治疗，可有效对抗流感。因此，甲型流感的早期快速精确诊断对于及时干预治疗和控制疾病的传播至关重要。
环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，简称LAMP）技术是一种核酸扩增新方法，针对目标基因的6个或8个区域设计4种或6种引物，在链置换DNA聚合酶的作用下以恒定温度进行反应。LAMP反应扩增效率极高，在15~60min内便可以达到109~1010个数量级的扩增，可有效缩短检测时长。传统的流感病毒的检测手段，如血清学检测和抗原检测，虽然时间短、要求低，但灵敏度低，容易造成假阳性。荧光定量PCR检测方法虽然灵敏度较高，但存在仪器（荧光定量PCR仪）和场所（专业实验室和检测人员）限制，不利于推广。LAMP技术仅使用恒温就可高效扩增核酸，简化了对仪器和场所的需求，可应用于快速诊断。
现有技术中，中国专利CN113106089A，公开了一种使用LAMP技术检测甲型流感的引物探针组合及恒温扩增试剂盒，其检测灵敏度为500 copies/mL；中国专利CN101818207A公开了一种包含甲型流感H1N1检测的引物探针及试剂盒，但该专利仅能检测H1N1亚型的流感病毒，且检测限为7750 copies/mL。因此，为了实现甲型流感的早期快速精确诊断和及时治疗，需进一步提高检测灵敏度。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供了一种甲型流感病毒核酸检测试剂及试剂盒，能对甲型流感病毒进行快速检测，且灵敏度高。
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的是，提供一种用于检测甲型流感病毒靶标序列的引物组合在制备甲型流感病毒核酸检测试剂中的应用。本发明选择甲型流感病毒序列中高度保守的基质蛋白（Matrix protein 1，后简称M1）的编码区CDS序列作为靶标序列，公开了该引物组合的序列。具体地，所述靶标序列为甲型流感病毒M1基因上CDS区域中第79-338位核苷酸序列，其中，F3区为第79-101位核苷酸序列，F2区为第122-143位核苷酸序列，F1区为第173-196位核苷酸序列，B1c区为第221-242核苷酸序列，B2c区为第276-297核苷酸序列，B3c区为第317-338位核苷酸序列；
引物组合包括外引物对FluA F和FluAB、内引物对FluA FIP和FluA BIP以及环引物对FluA LF和FluA LB，其中，FluA F具有与F3区相同的核苷酸序列，FluA B具有与B3c区反向互补的核苷酸序列；FluA FIP具有F1区反向互补的核苷酸序列以及与F2区相同的核苷酸序列，FluA BIP具有与B1c区相同的核苷酸序列以及与B2c区反向互补的核苷酸序列；环引物对FluA LF和位于F2区位和F1区之间的第148-168的核苷酸序列反向互补、FluA LB和位于B1c区和B2c区之间的第250-261位的核苷酸序列相同。
进一步，外引物对FluA F和FluAB的碱基序列分别如SEQ IDNO:1-2所示：
FluA F:5’-AGACTTGARGATGTCTTTGCTGG-3’,
FluA B: 5’-TTGGCCCCATGGAATGTTATCT-3’;
内引物对FIP和BIP的碱基序列分别如SEQ ID NO:3-4所示：
FluAFIP: 5’-GCGTGAACACAAAYCCYAAGATYCCTCTCATGGAATGGCTAAAGAC-3’,
FluABIP: 5’-TGCAGCGTAGACGCTTTGTYCACAGTTTAACTGCYYTRTCCATG-3’
环引物对FluALF和FluA LB的碱基序列如SEQ ID NO:5-6所示:
FluA LF: 5’-AGTCAGAGGTGACARGATTGG-3’,
FluA LB: 5’-CTCAATGGGAATGGGGAYCC-3’;
其中，FluAFIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LF的5’端标记有生物素Biotin，或者FluA FIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin，或者FluA BIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin。
作为本发明的第二个目的，提供一种用于甲型流感病毒核酸检测的试剂，至少包括用于检测甲型流感病毒靶标序列的引物组合；其中，所述靶标序列为甲型流感病毒M1基因上CDS区域中第79-338位核苷酸序列，其中，F3区为第79-101位核苷酸序列，F2区为第122-143位核苷酸序列，F1区为第173-196位核苷酸序列，B1c区为第221-242核苷酸序列，B2c区为第276-297核苷酸序列，B3c区为第317-338位核苷酸序列；
引物组合包括外引物对FluA F和FluAB、内引物对FluA FIP和FluA BIP以及环引物对FluA LF和FluA LB，其中，FluA F具有与F3区相同的核苷酸序列，FluA B具有与B3c区反向互补的核苷酸序列；FluA FIP具有F1区反向互补的核苷酸序列以及与F2区相同的核苷酸序列，FluA BIP具有与B1c区相同的核苷酸序列以及与B2c区反向互补的核苷酸序列；环引物对FluA LF和位于F2区位和F1区之间的第148-168的核苷酸序列反向互补、FluA LB和位于B1c区和B2c区之间的第250-261位的核苷酸序列相同。
进一步，外引物对FluA F和FluAB的碱基序列分别如SEQ IDNO:1-2所示：
FluA F:5’-AGACTTGARGATGTCTTTGCTGG-3’,
FluA B: 5’-TTGGCCCCATGGAATGTTATCT-3’;
内引物对FIP和BIP的碱基序列分别如SEQ ID NO:3-4所示：
FluAFIP: 5’-GCGTGAACACAAAYCCYAAGATYCCTCTCATGGAATGGCTAAAGAC-3’,
FluABIP: 5’-TGCAGCGTAGACGCTTTGTYCACAGTTTAACTGCYYTRTCCATG-3’
环引物对LF和LB的碱基序列如SEQ ID NO:5-6所示:
FluA LF: 5’-AGTCAGAGGTGACARGATTGG-3’,
FluA LB: 5’-CTCAATGGGAATGGGGAYCC-3’;
其中，FluAFIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LF的5’端标记有生物素Biotin，或者FluA FIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin，或者FluA BIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin。
作为本发明的第三个目的，本申请提供一种甲型流感病毒核酸检测试剂盒，包括权利要求上述的用于甲型流感病毒核酸检测的试剂。
进一步，所述核酸检测试剂盒还包括环介导等温扩增反应液和检测卡。
进一步，所述环介导等温扩增反应液包括等温扩增缓冲液、dNTP、BstDNA聚合酶，逆转录酶。
进一步，等温扩增缓冲液包括Tris-HCl、 (NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Tween-20。
进一步，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；底板为PVC板；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为：C线、T线，其中C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体。
进一步，所述biotin-BSA的浓度为3.2mg/mL，兔抗FAM抗体的浓度为0.15mg/mL。
作为本发明的第四个目的，本申请提供了上述的试剂或试剂盒在甲型流感病毒非疾病类诊断中的应用。
本发明所达到的有益技术效果：本申请以M1基因上CDS区域中第79-338位核苷酸序列作为靶标序列，制备出的甲型流感病毒检测试剂或试剂盒，灵敏度高，从试验数据看出，检测限低至100 copies/mL，可以初期就能检测出患者的感染情况，便于临床上在患病前期就进行医学干预；结合胶体金层析技术，检测过程无需借助其他仪器，结果直观，判读简单，而且成本低，适合在基层医疗单位推广。
附图说明
图1本发明之试验例1检测效果图；
图2本发明之试验例3特异性检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下面结合附图和实施例对本发明专利进一步说明。
实施例1甲型流感病毒检测引物组合及试剂盒
本发明选择甲型流感病毒序列中高度保守的基质蛋白的编码区CDS序列作为靶标序列，公开了该引物组合的序列。具体地，所述靶标序列为甲型流感病毒M1基因上CDS区域中第79-338位核苷酸序列，其中，F3区为第79-101位核苷酸序列，F2区为第122-143位核苷酸序列，F1区为第173-196位核苷酸序列，B1c区为第221-242核苷酸序列，B2c区为第276-297核苷酸序列，B3c区为第317-338位核苷酸序列；
引物组合包括外引物对FluA F和FluAB、内引物对FluA FIP和FluA BIP以及环引物对FluA LF和FluA LB，其中，FluA F具有与F3区相同的核苷酸序列，FluA B具有与B3c区反向互补的核苷酸序列；FluA FIP具有F1区反向互补的核苷酸序列以及与F2区相同的核苷酸序列，FluA BIP具有与B1c区相同的核苷酸序列以及与B2c区反向互补的核苷酸序列；环引物对FluA LF和位于F2区位和F1区之间的第148-168的核苷酸序列反向互补、FluA LB和位于B1c区和B2c区之间的第250-261位的核苷酸序列相同。引物组合的碱基序列如表1所示。
表1 引物组合的碱基序列表
SEQ NO 引物名称 序列（5'to 3'）
1 FluA F AGACTTGARGATGTCTTTGCTGG
2 FluA FIP GCGTGAACACAAAYCCYAAGATYCCTCTCATGGAATGGCTAAAGAC
3 FluA LF AGTCAGAGGTGACARGATTGG
4 FluA BIP TGCAGCGTAGACGCTTTGTYCACAGTTTAACTGCYYTRTCCATG
5 FluA B TTGGCCCCATGGAATGTTATCT
6 FluA LB CTCAATGGGAATGGGGAYCC
其中，作为示例性的一个具体实施例，FluA FIP的5’端标记FAM基团，FluA LF的5’端标记生物素（Biotin）。
一种甲型流感病毒检测试剂盒，包括上述的引物组合的混合液、环介导等温扩增反应液和检测卡。所述环介导等温扩增反应液包括等温扩增缓冲液、dNTP、BstDNA聚合酶，逆转录酶。等温扩增缓冲液包括Tris-HCl、 (NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Tween-20。
所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；底板为PVC板；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为：C线、T线，其中C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体。
实施例2甲型流感病毒检测过程
1.本申请可检测各种样本，为了更好的说明本申请的检测效果，现选用上述咽拭子样本和鼻拭子样本进行举例说明。
2.样本处理过程如下：
a）咽拭子样本：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆无菌拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子放入无菌采样液管中，尾部弃去，旋紧管盖。
b）鼻拭子样本：用拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根拭子以同样的方式采集另一侧鼻孔。将每侧拭子放入同一无菌采样液管中，尾部弃去，旋紧管盖。
3.核酸提取：取200uL待测样本，使用天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（货号DP315），按照说明书提取待测样本RNA。
4.试剂配置：取1.5 mL离心管(RNase-Free，灭菌)配制反应体系，等温扩增PCR反应液、逆转录酶、引物组合混合液加入后，涡旋振荡10秒，离心待用，20uL/管分装至PCR反应管中（无菌和RNase-Free），用毕等温扩增PCR反应液、逆转录酶和引物混合液立即放入-18℃以下冻存。各组分浓度如表2所示。
表2反应体系中各组分配比
序号 组分 浓度
1 FluA F 0.17uM
2 FluA FIP 0.67uM
3 FluA LF 0.33uM
4 FluA BIP 0.67uM
5 FluA B 0.17uM
6 FluA LB 0.33uM
7 dNTP 1.16mM
8 Tris-HCl 16.67mM
9 (NH4)2SO4 8.33mM
10 KCl 12.5mM
11 MgSO4 1.67mM
12 Tween-20 0.08%
13 Bst聚合酶 8U
14 反转录酶 4.5U
5.加样：将提取的核酸移取10uL到PCR反应管中，盖紧管盖、离心、转移至PCR检测区。
6.PCR扩增：将PCR反应管放入等温扩增的样品槽或热水浴中，60℃反应30min。
7.准备检测卡：将检测卡从铝箔袋中取出，放置于干燥的水平台面上。
8.加样检测：使用移液器取20uL样本扩增产物至检测卡加样孔中，再加入四滴（约80~120uL）层析缓冲液，2~3min内读取结果。
9.检测及结果判定：
质量控制标准：
C线（质控线）出现红色的线证明检测卡有效。
T线（检测线）出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。
结果判定标准：
C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；
C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；
C线没有出现红色的线，说明检测卡失效。
试验例1甲型流感病毒检测效果试验
利用实施例1所示的引物组合，按照实施例2中的方法对甲型流感病毒H3N2和H1N1的混合物进行检测，重复检测10次，检测结果如图1所示，其中，甲型流感病毒混合物的浓度约为500copies/mL。
从图1所示结果可以看出，10次检测的结果均显示甲型流感病毒阳性，且显色均一，具有良好的检测一致性。
试验例2甲型流感病毒检测试剂盒灵敏度
将四种亚型甲型流感病毒（H1N1、H3N2、H5N1、H7N9）分别配制浓度为2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL、100 copies/mL、75 copies/mL和50copies/mL的溶液作为待测样本，每个梯度浓度重复测试5次，检测结果如表3所示。
表3 本申请试剂盒检测限检测结果
Figure SMS_1
由表3可知，采用本申请的试剂盒，甲型流感病毒的四个亚型在不同的浓度梯度下均可以检出，其中浓度为2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL、和100 copies/mL时全部检出，75 copies/mL和50 copies/mL浓度时可以部分检出。由此可知，本申请的试剂盒，对甲型流感病毒的检出灵敏度高，浓度为100 copies/mL时，检出率为100%。
试验例3甲型流感病毒检测试剂盒的特异性试验
选取5种病源微生物的共计10例待测样本进行特异性检测，其中，包括四种亚型的甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N9各1例，乙型流感病毒（Influenza B virus，FluB）2例，副流感病毒（Parainfluenza Virus，PIV）2例，呼吸道合胞病毒（Respiratory SyncytialVirus，RSV）1例，腺病毒（adenovirus，ADV）1例，各待测样本的病原微生物浓度为500copies/mL。检测结果如图2所示，其中，第一排从左至右依次为甲型流感病毒的四个亚型H1N1、H3N2、H5N1、H7N9；第二排从左至右依次为2例乙型流感病毒、2例副流感病毒、1例呼吸道合胞病毒和1例腺病毒。
由图2可以看出，4例甲型流感病毒样本的检测结果均为阳性，其余为阴性，由此可知，本申请可以排除不同病原微生物的干扰，精准的检测出甲型流感病毒。
以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种用于检测甲型流感病毒靶标序列的引物组合在制备甲型流感病毒核酸检测试剂中的应用，其特征在于：
所述靶标序列为甲型流感病毒M1基因上CDS区域中第79-338位核苷酸序列，其中，F3区为第79-101位核苷酸序列，F2区为第122-143位核苷酸序列，F1区为第173-196位核苷酸序列，B1c区为第221-242核苷酸序列，B2c区为第276-297核苷酸序列，B3c区为第317-338位核苷酸序列；
引物组合包括外引物对FluA F和FluA B、内引物对FluA FIP和FluABIP以及环引物对FluA LF和FluA LB，其中，FluA F具有与F3区相同的核苷酸序列，FluA B具有与B3c区反向互补的核苷酸序列；FluA FIP具有F1区反向互补的核苷酸序列以及与F2区相同的核苷酸序列，FluA BIP具有与B1c区相同的核苷酸序列以及与B2c区反向互补的核苷酸序列；环引物对FluA LF和位于F2区位和F1区之间的第148-168的核苷酸序列反向互补、FluA LB和位于B1c区和B2c区之间的第250-261位的核苷酸序列相同。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
外引物对FluA F和FluAB的碱基序列如SEQ ID NO:1-2所示；
内引物对FluA FIP和FluABIP的碱基序列如SEQ ID NO:3-4所示；
环引物对FluA LF和FluALB的碱基序列如SEQ ID NO:5-6所示；
其中，FluA FIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LF的5’端标记有生物素Biotin，或者FluAFIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin，或者FluABIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin。
3.一种用于甲型流感病毒核酸检测的试剂，其特征在于：至少包括用于检测甲型流感病毒靶标序列的引物组合；其中，所述靶标序列为甲型流感病毒M1基因上CDS区域中第79-338位核苷酸序列，其中，F3区为第79-101位核苷酸序列，F2区为第122-143位核苷酸序列，F1区为第173-196位核苷酸序列，B1c区为第221-242核苷酸序列，B2c区为第276-297核苷酸序列，B3c区为第317-338位核苷酸序列；
引物组合包括外引物对FluA F和FluA B、内引物对FluA FIP和FluABIP以及环引物对FluA LF和FluA LB，其中，FluA F具有与F3区相同的核苷酸序列，FluA B具有与B3c区反向互补的核苷酸序列；FluA FIP具有F1区反向互补的核苷酸序列以及与F2区相同的核苷酸序列，FluA BIP具有与B1c区相同的核苷酸序列以及与B2c区反向互补的核苷酸序列；环引物对FluA LF和位于F2区位和F1区之间的第148-168的核苷酸序列反向互补、FluA LB和位于B1c区和B2c区之间的第250-261位的核苷酸序列相同。
4. 根据权利要求3所述的用于甲型流感病毒核酸检测的试剂，其特征在于：外引物对FluA F和FluA B的碱基序列如SEQID NO:1-2所示；
内引物对FluA FIP和FluABIP的碱基序列如SEQ ID NO:3-4所示；
环引物对FluA LF和FluALB的碱基序列如SEQ ID NO:5-6所示；
其中，FluA FIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LF的5’端标记有生物素Biotin，或者FluAFIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin，或者FluABIP的5’端标记有FITC或FAM基团、FluA LB的5’端标记有生物素Biotin。
5.一种甲型流感病毒核酸检测试剂盒，包括权利要求3-4任一项所述的用于甲型流感病毒核酸检测的试剂。
6.根据权利要求5所述的甲型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述核酸检测试剂盒还包括环介导等温扩增反应液和检测卡。
7. 根据权利要求6所述的甲型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增反应液包括等温扩增缓冲液、dNTP、Bst DNA聚合酶，逆转录酶。
8.根据权利要求7所述的甲型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：等温扩增缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Tween-20。
9.根据权利要求6所述的甲型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；底板为PVC板；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为：C线、T线，其中C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体。
10.根据权利要求9所述的甲型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述biotin-BSA的浓度为3.2mg/mL，兔抗FAM抗体的浓度为0.15mg/mL。
11.权利要求3-4任一项所述的试剂或权利要求6-10任一项所述的试剂盒在甲型流感病毒非疾病类诊断中的应用。
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