CN116333931A - 一种增香降粘菌剂及其在再造烟叶浓缩液中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增香降粘菌剂及其在再造烟叶浓缩液中的应用。该增香降粘菌剂通过以下方法制备而成：(1)菌体的培养与富集：将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24327的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HNYJ‑1单菌落用接种环接种到LB液体培养基中，培养，得到原始种子；(2)菌体梯度诱导获得增香降粘菌剂。该增香降粘菌剂用于制备增香降粘的再造烟叶浓缩液。经过增香降粘菌剂处理后再造烟叶浓缩液中蛋白、果胶以及淀粉的含量减少，纤维基本无变化，粘度降低；同时，再造烟叶浓缩液中醇类、醛酮类和酯类香味物质含量增加明显，杂环类物质升高，香味物质总量提升。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种增香降粘菌剂及其在再造烟叶浓缩液中的应用。
背景技术
造纸法再造烟叶是利用烟草物质(烟梗、烟末、碎烟片等)为主体原料，通过提取、打浆、浓缩、抄造、涂布和干燥等工艺，将烟草原料加工而成的烟草制品，对卷烟品牌的发展及卷烟品质的稳定提升发挥着至关重要的作用。烟草物质经过水提后，提取液经过浓缩形成浓缩液，固形物经过压片形成片基，将烟草浓缩液均一的涂布在片基上，从而制备成再造烟叶。片基为再造烟叶提供骨架结构，浓缩液为再造烟叶提供主要香味成分。然而目前大部分再造烟叶加工过程中的浓缩液普遍存在两方面的问题：一是再造烟叶浓缩液的香味成分不足，二是浓缩液粘度大使得片基涂布率低，且易导致设备堵塞，无法满足再造烟叶生产企业更高的加工要求及产品品质需求。
浓缩液中香味物质来源于烟草物质，在制备过程中由于提取率低和高温浓缩损失等原因，导致浓缩液中香味物质含量不足；浓缩液粘度大主要是由于浓缩液中多糖、果胶、淀粉、蛋白质等大分子物质较多造成的，降低大分子物质含量可以有效降低浓缩液的粘度。在实际生产工艺过程中就此问题曾开展过多方面的实验工作：通过外加香料改善香味不足，但成本较高且一般不够协调；通过改善物料运送机装置、碳化硅超滤膜净化再造烟叶浓缩液来解决粘度问题，但实际效果不是很理想，没有从根本上对症结问题进行研究。
微生物降解大分子具有绿色、高效等特点，选择合适的微生物处理浓缩液，一方面可以降解大分子物质降低粘度，另一方面可以转化大分子物质形成香味成分。目前利用微生物来增加造纸法再造烟叶工艺中浓缩液香气、降低浓缩液粘度的相关报道较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种增香降粘菌剂及其在再造烟叶浓缩液中的应用，其克服了现有技术的上述缺陷。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种增香降粘菌剂，所述增香降粘菌剂通过以下方法制备而成：
(1)菌体的培养与富集：
将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24327的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HNYJ-1单菌落用接种环接种到LB液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，得到原始种子；
(2)菌体梯度诱导获得增香降粘菌剂：
(21)选择粘度为82cp±0.5cP的浓缩液，用纯水进行稀释，获得体积比为30％和70％的浓缩液；
(22)将体积为V1的原始种子离心去上清，菌体沉淀后全部放置于体积为V1的30％浓缩液中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，离心后去上清，溶解于体积为80％V1的去离子水中，得到一级诱导种子，并等分为2份，1份留存备用，1份继续诱导；
(23)将其中1份一级诱导种子与体积为V2的70％浓缩液中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，离心后去上清，溶解于体积为80％V2的去离子水中，得到二级诱导种子，并等分为2份，1份留存备用，1份继续诱导；
(24)将其中1份二级诱导种子于4℃静置放置6-48h，然后与体积为V3的100％浓缩液混合，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，离心去上清，溶解于体积为80％V3的去离子水中，得到三级诱导种子，
所述一级诱导种子、所述二级诱导种子以及所述三级诱导种子即为增香降粘菌剂。
优选地，步骤(1)中，原始种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养12h。
优选地，步骤(2)中，一级诱导种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养24h，二级诱导种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养18h，三级诱导种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养12h。
优选地，步骤(2)中，V2/V1＝V3/V2＝40％。
一种利用增香降粘菌剂制备增香降粘的再造烟叶浓缩液的方法，包括以下步骤：
向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为2％的三级诱导种子，设置温度25-40℃、50-200r/min搅拌发酵6-36h，发酵结束后，得到增香降粘的再造烟叶浓缩液；或者
向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为0.5-10％的一级诱导种子，添加体积分数为0.1-5％的二级诱导种子，混合均匀后，设置温度25-40℃、50-150r/min搅拌发酵6-36h；再添加体积分数为0.1-5％的三级诱导种子，设置温度25-40℃、50-200r/min继续搅拌发酵6-36h，发酵结束后，得到增香降粘的再造烟叶浓缩液。
一种增香降粘的再造烟叶浓缩液中的应用。经过增香降粘菌剂处理后再造烟叶浓增香降粘菌剂在制备缩液中蛋白和淀粉的含量减少，果胶和纤维基本无变化，粘度降低。经过增香降粘菌剂处理后，再造烟叶浓缩液中醇类、醛酮类和酯类香味物质含量增加明显，杂环类物质升高，香味物质总量提升。
一种增香降粘的再造烟叶浓缩液在烟叶中的应用。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
(1)克雷伯氏菌HNYJ-1可以针对性降解蛋白和果胶，从而降低再造烟叶浓缩液粘度。增香降粘菌剂处理后再造烟叶浓缩液中淀粉的含量减少，纤维基本无变化，粘度降低。
(2)通过增香降粘菌剂处理后，再造烟叶浓缩液的整体品质提高明显。经过增香降粘菌剂处理后，再造烟叶浓缩液中醇类、醛酮类和酯类香味物质含量增加明显，杂环类物质升高，香味物质总量提升。
具体实施方式
现在将详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
本申请利用克雷伯氏菌HNYJ-1制备增香降粘菌制剂，所用增香降粘菌剂为克雷伯氏菌，该克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HNYJ-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.24327，保藏时间为2022年1月17日。
实施例1菌体的培养与富集
将降粘菌(克雷伯氏菌HNYJ-1)单菌落用接种环接种到LB液体培养基中，于25-40℃(最优30℃)，100-200r/min(最优150r/min)的摇床中培养6-36h(最优12h)，得到原始种子。
实施例2菌体的梯度诱导
(1)选择粘度为82cp±0.5cp(泊)的浓缩液，用纯水进行稀释，获得体积比为30％和70％的浓缩液。
(2)将体积为V1的原始种子离心去上清，菌体沉淀后全部放置于体积为V1的30％浓缩液中，于25-40℃(最优30℃)，100-200r/min(最优150r/min)的摇床中培养6-36h(最优24h)，离心后去上清，溶解于体积为80％V1的去离子水中，得到一级诱导种子，并等分为2份，1份留存备用，1份继续诱导；
(3)将其中1份一级诱导种子与体积为V2的70％浓缩液中，于25-40℃(最优30℃)，100-200r/min(最优150r/min)的摇床中培养6-36h(最优18h)，离心后去上清，溶解于体积为80％V2的去离子水中，得到二级诱导种子，并等分为2份，1份留存备用，1份继续诱导；
(4)将其中1份二级诱导种子于4℃静置放置6-48h(最优18h)，然后与体积为V3的100％浓缩液(未稀释的浓缩液)混合，于25-40℃(最优30℃)，100-200r/min(最优150r/min)的摇床中培养6-36h(最优12h)，离心去上清，溶解于体积为80％V3的去离子水中，得到三级诱导种子。(其中，V2/V1＝V3/V2＝40％)
实施例3再造烟叶浓缩液发酵处理
方案1(仅仅添加三级诱导种子)：
向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为2％的三级诱导种子，设置温度25-40℃(最优30℃)、50-200r/min(最优150r/min)搅拌发酵6-36h(最优12h)。
发酵结束后，得到增香降粘下效果的再造烟叶浓缩液。
方案2(选择逐级添加三个级别的诱导种子)：
(1)向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为0.5-10％(最优1％)的一级诱导种子，添加体积分数为0.1-5％(最优0.5％)的二级诱导种子，混合均匀后，设置温度25-40℃(最优30℃)、50-150r/min(最优100r/min)搅拌发酵6-36h(最优12h)。
(2)再添加体积分数为0.1-5％(最优0.5％)的三级诱导种子，设置温度25-40℃(最优30℃)、50-200r/min(最优150r/min)继续搅拌发酵6-36h(最优12h)。
发酵结束后，得到增香降粘下效果的再造烟叶浓缩液。发酵结束后无需灭菌，可直接用于涂布，在再造烟叶成型工艺中有高温的过程，可达到灭菌的效果。
应用例1
选择河南卷烟工业烟草薄片有限公司的TS-006(中间香型)再造烟叶浓缩液作为试验样品。
(1)设置未发酵再造烟叶浓缩液为CK，仅仅在再造烟叶中添加2％体积比例的去离子水。
(2)向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为2％的三级诱导种子，设置温度30℃、150r/min搅拌发酵12h，发酵处理后的再造烟叶浓缩液为T1。
(3)向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为1％的一级诱导种子以及体积分数为0.5％的二级诱导种子，混合均匀后，设置温度30℃、100r/min搅拌发酵12h。再添加体积分数为0.5％的三级诱导种子，30℃、150r/min继续搅拌发酵12h，处理后的再造烟叶浓缩液记为T2。
结果分析：
对再造烟叶浓缩液蛋白、果胶、淀粉、纤维素含量和粘度进行检测，结果见表1。并对再造烟叶浓缩液中性香味成分含量进行检测，结果见表2。
经过增香降粘菌剂处理后，再造烟叶浓缩液中蛋白、果胶以及淀粉的含量大幅减少，纤维基本无变化，粘度降低明显。可见克雷伯氏菌HNYJ-1可以针对性降解蛋白、果胶以及淀粉，从而降低再造烟叶浓缩液粘度。
经过增香降粘菌剂处理后，再造烟叶浓缩液中醇类、醛酮类和酯类香味物质含量增加明显，杂环类物质略有升高，香味物质总量提升。可见，通过增香降粘菌剂处理后，再造烟叶浓缩液的整体品质提高明显。
同时添加三种诱导种子处理的T2烟叶改善效果比仅仅添加三级诱导种子处理的T1烟叶要好。但是T1烟叶改善效果也不差(仅略逊色于T2烟叶改善效果)。因此可以根据具体需求选择诱导种子添加方案：仅仅添加三级种子处理工艺简单，性价比较高，而同时添加一、二、三级别的诱导种子处理虽较为复杂，但处理效果更佳。
表1再造烟叶浓缩液发酵前后大分子物质和粘度变化
注：粘度单位用泊(cP)表示(1cP＝1mPa·s)。
表2再造烟叶浓缩液中主要香味物质成分分析(含量μg/mL)
| 样品 | 醇类 | 酸类 | 醛酮类 | 酯类 | 酚类 | 杂环类 | 总计 |
| CK | 468.27 | 108.65 | 276.78 | 79.68 | 121.18 | 53.38 | 1107.94 |
| T1 | 512.45 | 113.86 | 343.58 | 182.63 | 107.82 | 56.02 | 1316.36 |
| T2 | 539.83 | 125.22 | 353.89 | 207.38 | 105.37 | 71.08 | 1402.77 |
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (8)
1.一种增香降粘菌剂，其特征在于，所述增香降粘菌剂通过以下方法制备而成：
(1)菌体的培养与富集：
将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24327的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HNYJ-1单菌落用接种环接种到LB液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，得到原始种子；
(2)菌体梯度诱导获得增香降粘菌剂：
(21)选择粘度为82cp±0.5cP的浓缩液，用纯水进行稀释，获得体积比为30％和70％的浓缩液；
(22)将体积为V1的原始种子离心去上清，菌体沉淀后全部放置于体积为V1的30％浓缩液中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，离心后去上清，溶解于体积为80％V1的去离子水中，得到一级诱导种子，并等分为2份，1份留存备用，1份继续诱导；
(23)将其中1份一级诱导种子与体积为V2的70％浓缩液中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，离心后去上清，溶解于体积为80％V2的去离子水中，得到二级诱导种子，并等分为2份，1份留存备用，1份继续诱导；
(24)将其中1份二级诱导种子于4℃静置放置6-48h，然后与体积为V3的100％浓缩液混合，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，离心去上清，溶解于体积为80％V3的去离子水中，得到三级诱导种子，
所述一级诱导种子、所述二级诱导种子以及所述三级诱导种子即为增香降粘菌剂。
2.根据权利要求1所述的增香降粘菌剂，其特征在于，步骤(1)中，原始种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养12h。
3.根据权利要求1所述的增香降粘菌剂，其特征在于，步骤(2)中，一级诱导种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养24h，二级诱导种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养18h，三级诱导种子的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养12h。
4.根据权利要求1所述的增香降粘菌剂，其特征在于，步骤(2)中，V2/V1＝V3/V2＝40％。
5.一种利用权利要求1-4任一所述的增香降粘菌剂制备增香降粘的再造烟叶浓缩液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为2％的三级诱导种子，设置温度25-40℃、50-200r/min搅拌发酵6-36h，发酵结束后，得到增香降粘的再造烟叶浓缩液；或者
向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为0.5-10％的一级诱导种子，添加体积分数为0.1-5％的二级诱导种子，混合均匀后，设置温度25-40℃、50-150r/min搅拌发酵6-36h；再添加体积分数为0.1-5％的三级诱导种子，设置温度25-40℃、50-200r/min继续搅拌发酵6-36h，发酵结束后，得到增香降粘的再造烟叶浓缩液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述增香降粘菌剂处理后再造烟叶浓缩液中蛋白和淀粉的含量减少，果胶和纤维基本无变化，粘度降低。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，经过增香降粘菌剂处理后，再造烟叶浓缩液中醇类、醛酮类和酯类香味物质含量增加明显，杂环类物质升高，香味物质总量提升。
8.根据权利要求5所述的增香降粘的再造烟叶浓缩液在烟叶中的应用。
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| CN202310238683.3A CN116333931A (zh) | 2023-03-14 | 2023-03-14 | 一种增香降粘菌剂及其在再造烟叶浓缩液中的应用 |
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