CN116515776A - 一种克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1在再造烟浓缩液中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种克雷伯氏菌胞外酶Eyj‑1在再造烟浓缩液中的应用，该克雷伯氏菌胞外酶Eyj‑1通过以下方法制备：(1)种子液制备：将克雷伯氏菌接种培养，得种子液；(2)微生物产酶发酵：种子液与再造烟叶浓缩液混合，培养得种子；加入烟末，继续震荡得发酵液；(3)胞外酶的制备：将发酵液离心去沉淀，得胞外酶粗酶，胞外酶粗酶与无水硫酸铵混合，去沉淀得上清A；A与无水硫酸铵混合后，去沉淀留上清B；B分离得胞外酶，即Eyj‑1。本申请增香浓缩液香气含量整体提升明显，蛋白和果胶的物质含量降低明显，粘度降低；醇类、醛酮类和酚类化学物质含量提升，总香味成分提升18.15％，可有效提升烟叶的吸食品质。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1在再造烟浓缩液中的应用。
背景技术
造纸法再造烟叶是利用烟草物质(烟梗、烟末、碎烟片等)为主体原料，通过提取、打浆、浓缩、抄造、涂布和干燥等工艺，将烟草原料加工而成的烟草制品，对卷烟品牌的发展及卷烟品质的稳定提升发挥着至关重要的作用。
再造烟叶浓缩液是由烟叶经水提取后浓缩而成，为再造烟叶提供主要香气来源。但再造烟叶通常存在大分子含量过高、香气含量较少等问题，导致其在涂布时粘度过高，涂布后制备的再造烟叶香气不足。
一些微生物产生的酶可以有效降解浓缩液中的大分子物质，以及转化产生香味成分，是改善浓缩液品质的重要手段。微生物可分泌数量众多的酶类，分为胞内酶和胞外酶，胞外酶主要包括一些大分子降解酶类和小部分具有增香功能的酶类，但也包含一些对浓缩液品质没有增益效果甚至起副作用的酶类，因此有必要对微生物产生的酶类中对浓缩液品质起正作用的酶进行纯化，从而更为高效的改善浓缩液品质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1在再造烟浓缩液中的应用，克雷伯氏菌HNYJ-1产生胞外酶，通过简单的分离纯化方法制备胞外酶，用来处理再造烟叶浓缩液，提高其品质。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液的制备：
将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24327的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HNYJ-1单菌落用接种环接种到LB液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，即得到种子液；
(2)微生物产酶发酵：
种子液与10％浓度的再造烟叶浓缩液按照0.5％-10％：1的体积比混合，先在25-40℃条件下，100-300r/min培养12-72h，得到种子；
在无菌环境下加入提前灭菌的烟末，按照每毫升种子液加入0.1g烟末的添加量，将其继续放置于25-40℃条件下，100-300r/min继续震荡12-72h，得到发酵液；
(3)胞外酶的制备：
将发酵液在4000r/min，4℃条件下低温离心20min，去除沉淀的菌体，得到胞外酶粗酶。胞外酶粗酶与无水硫酸铵按照1:0.2～0.4的质量比在4℃环境中混合，去除沉淀，得到上清A；
上清A与无水硫酸铵按照1:0.4～0.8的质量比在4℃环境中混合，去除沉淀，留上清，得上清B；
上清B采用DEAE-FF阴离子交换柱进行分离，平衡缓冲液为20mmol/L的Tris-HCl(pH 8.5)，洗脱开始后留取未挂柱的穿透组分，经过透析后，得到HNYJ-1胞外酶，命名为Eyj-1。
优选地，上述技术方案中，步骤(1)中，原始种子液的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养12h。
优选地，上述技术方案中，步骤(2)中，每毫升种子液加入0.1g烟末的添加量，将其继续放置于30℃条件下，220r/min继续震荡24h，得到发酵液。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)中，胞外酶粗酶与无水硫酸铵按照1:0.25的质量比混合。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)中，上清A与无水硫酸铵按照1:0.5的质量比混合。
一种克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1在再造烟浓缩液中的应用。
利用克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1制备增香浓缩液，制备方法如下：
将再造烟浓缩液与胞外酶Eyj-1按照质量比1:0.5％-1:10％混合，于40℃-50℃之间任意温度条件下静置1-12h，期间每隔0.5h缓慢搅拌一次，使其充分反应，得到增香浓缩液。
优选地，上述技术方案中，浓缩液与胞外酶Eyj-1按质量比1:1％混合，静置时间为3h。
优选地，上述技术方案中，增香浓缩液中蛋白和果胶的物质含量降低明显，粘度降低。醇类、醛酮类和酚类化学物质含量提升，烟叶的吸食品质提升。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
本申请的经过处理后的浓缩液香气含量整体提升明显，蛋白和果胶的物质含量降低明显，粘度降低了16.19％。醇类、醛酮类和酚类化学物质含量提升，总香味成分提升18.15％，可有效提升烟叶的吸食品质。
附图说明
图1为DEAE-FF阴离子交换柱色谱图。
具体实施方式
现在将详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
一种克雷伯氏菌HNYJ-1胞外酶在再造烟浓缩液中的应用，该克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HNYJ-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.24327，保藏时间为2022年1月17日。
实施例1种子液制备
胞外酶的制备条件为：将克雷伯氏菌HNYJ-1单菌落用接种环接种到LB液体培养基中，于25-40℃(最优30℃)，100-200r/min(最优150r/min)的摇床中培养6-36h(最优12h)，即得到种子液。
实施例2微生物产酶发酵
种子液与10％浓度的浓缩液按照0.5％-10％：1(最优2％：1)的体积比混合，先在25-40℃(最优30℃)条件下，100-300r/min(最优220r/min)培养12-72h(最优24h)，得到种子。
在无菌环境下加入提前灭菌的烟末，按照每毫升种子液加入0.1g烟末的添加量，将其继续放置于25-40℃(最优30℃)条件下，100-300r/min(最优220r/min)继续震荡12-72h(最优24h)，得到发酵液。
实施例3胞外酶的制备
发酵液在4000r/min，4℃条件下低温离心20min，去除沉淀的菌体，得到胞外酶粗酶。胞外酶粗酶：无水硫酸铵按照1:0.2～0.4(最优1:0.25)的质量比在4℃环境中混合，去除沉淀，得到上清A；上清A：无水硫酸铵按照1:0.4～0.8(最优1:0.5)的质量比在4℃环境中混合，去除沉淀，留上清，得上清B；
上清B采用DEAE-FF阴离子交换柱进行分离，平衡缓冲液为20mmol/L的Tris-HCl(pH 8.5)，洗脱开始后留取未挂柱的穿透组分，经过透析后，得到HNYJ-1胞外酶，命名为Eyj-1。
实施例5浓缩液处理
按照浓缩液与胞外酶Eyj-1为1:0.5％-1:10％的质量比混合(最优1:1％)，于40℃-50℃之间任意温度条件下静置1-12h(最优3h)，期间每隔0.5h缓慢搅拌一次，使其充分反应。反应完毕后，得到增香浓缩液。
应用例1
选择河南卷烟工业烟草薄片有限公司的TS-005(清香型)再造烟叶浓缩液作为试验样品。设置未经过处理的再造烟叶浓缩液为CK，添加胞外酶Eyj-1的再造烟叶浓缩液为T，添加量为浓缩液体积比的1％，40℃处理3h。对浓缩液中大分子物质含量和香气成分进行GC-MS检测，大分子物质变化见表1，可检出的香气物质结果见表2。从结果来看，经过处理后的T浓缩液香气含量整体提升明显，蛋白和果胶的物质含量降低明显，粘度降低了16.19％。醇类、醛酮类和酚类化学物质含量提升，总香味成分提升18.15％，可有效提升烟叶的吸食品质。
表1再造烟叶浓缩液酶处理前后大分子物质和粘度变化
表2再造烟叶浓缩液酶处理前后香味成分变化(μg/mL)
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (9)
1.一种克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子液的制备：
将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24327的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HNYJ-1单菌落用接种环接种到LB液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，即得到种子液；
(2)微生物产酶发酵：
种子液与10％浓度的再造烟叶浓缩液按照0.5％-10％：1的体积比混合，先在25-40℃条件下，100-300r/min培养12-72h，得到种子；
在无菌环境下加入提前灭菌的烟末，按照每毫升种子液加入0.1g烟末的添加量，将其继续放置于25-40℃条件下，100-300r/min继续震荡12-72h，得到发酵液；
(3)胞外酶的制备：
将发酵液在4000r/min，4℃条件下低温离心20min，去除沉淀的菌体，得到胞外酶粗酶。胞外酶粗酶与无水硫酸铵按照1:0.2～0.4的质量比在4℃环境中混合，去除沉淀，得到上清A；
上清A与无水硫酸铵按照1:0.4～0.8的质量比在4℃环境中混合，去除沉淀，留上清，得上清B；
上清B采用DEAE-FF阴离子交换柱进行分离，平衡缓冲液为20mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)，洗脱开始后留取未挂柱的穿透组分，经过透析后，得到HNYJ-1胞外酶，命名为Eyj-1。
2.根据权利要求1所述的克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，原始种子液的培养条件为：温度30℃，转速150r/min的摇床培养12h。
3.根据权利要求1所述的克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，每毫升种子液加入0.1g烟末的添加量，将其继续放置于30℃条件下，220r/min继续震荡24h，得到发酵液。
4.根据权利要求1所述的克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，胞外酶粗酶与无水硫酸铵按照1:0.25的质量比混合。
5.根据权利要求1所述的克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，上清A与无水硫酸铵按照1:0.5的质量比混合。
6.一种根据权利要求1-5任一所述制备方法制备得到的克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1在再造烟浓缩液中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用克雷伯氏菌胞外酶Eyj-1制备增香浓缩液，其特征在于，制备方法如下：
将再造烟浓缩液与胞外酶Eyj-1按照质量比1:0.5％-1:10％混合，于40℃-50℃之间任意温度条件下静置1-12h，期间每隔0.5h缓慢搅拌一次，使其充分反应，得到增香浓缩液。
8.根据权利要求6所述的增香浓缩液，其特征在于，浓缩液与胞外酶Eyj-1按质量比1:1％混合，静置时间为3h。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，增香浓缩液中蛋白和果胶的物质含量降低明显，粘度降低了16.19％；醇类、醛酮类和酚类化学物质含量提升，总香味成分提升18.15％，烟叶的吸食品质提升。
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